ROBSON LEANDRO SCHACKER

AVALIAO DO PERFIL DOS CIDOS GRAXOS DA SRIE MEGA 3 EM MEXILHES DA ESPCIE Perna-perna (L.) POR CROMATOGRAFIA GASOSA E ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Florianpolis SC 2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA UFSC CENTRO DE CINCIAS FSICAS E MATEMTICAS DEPARTAMENTO DE QUMICA

AVALIAO DO PERFIL DOS CIDOS GRAXOS DA SRIE MEGA 3 EM MEXILHES DA ESPCIE Perna-perna (L.) POR CROMATOGRAFIA GASOSA E ESPECTROMETRIA DE MASSAS

ROBSON LEANDRO SCHACKER

Dissertao de Mestrado apresentada ao programa de Ps-Graduao em Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina, como parte dos requisitos para a obteno do ttulo de Mestre em Qumica.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Augusto dos Santos Madureira Co-orientadora: Prof. Dra. Aim Rachel Magenta Magalhes

FLORIANPOLIS SC 2007

iii ROBSON LEANDRO SCHACKER

AVALIAO DO PERFIL DOS CIDOS GRAXOS DA SRIE MEGA 3 EM MEXILHES DA ESPCIE Perna-perna (L.) POR CROMATOGRAFIA GASOSA E ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Esta dissertao foi julgada e aprovada para a obteno do ttulo de Mestre em Qumica no Programa de Ps-Graduao em Qumica da Universidade Federal de Santa Catarina

Florianpolis, Fevereiro de 2007

________________________________ Prof. Dr. Faruk Jose Nome Aguilera Coordenador do Programa

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________ Prof. Dr. Luiz Augusto dos Santos Madureira Orientador

__________________________________ Prof. Dr. Miguel Soriano Balparda Caro

__________________________________ Prof. Dr. Antnio Carlos Joussef

__________________________________ Prof. Dr. Gustavo Amadeu Micke

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AGRADECIMENTOS

O presente trabalho contou com a participao de pessoas especiais, as quais agradeo a colaborao; so elas:

Prof. Dra. Aim Rachel Magenta Magalhes Prof. Dr. Luiz Augusto dos Santos Madureira Joo Renato de Mendona Strelau Luciano Henrique Campestrini Gilmar Conte Angelo Ruzza Cesar Alexandro de Silva Funcionrios da Central de Anlises Membros da Banca

Agradeo especialmente famlia, pelo apoio, carinho e compreenso.

Aos meus pais Pedro e Janete pelo amor, carinho e dedicao; sentimentos cujo significado no tenho palavras suficientes para descrever . Aos familiares pelo apoio e incentivo.

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SUMRIO

LISTA DE ABREVIATURAS..........................................................................................x RESUMO.........................................................................................................................xi ABSTRACT...................................................................................................................xii 1. INTRODUO.............................................................................................................1 2. REVISO BIBLIOGRFICA......................................................................................8 2.1. Gorduras.....................................................................................................................8 2.2. Lipdios.......................................................................................................................9 2.3. cidos orgnicos e graxos........................................................................................12 2.4. cidos graxos saturados...........................................................................................13 2.5. cidos graxos insaturados........................................................................................15 2.5.1. cidos graxos monoinsaturados............................................................................16 2.5.2. cidos graxos di-insaturados.................................................................................17 2.6. cidos graxos polinsaturados e a rancidez oxidativa...............................................18 2.6.1. famlia mega-3.....................................................................................................21 2.7. Bivalves como fonte de mega-3.............................................................................23 2.7.1. Classe bivalvia.......................................................................................................24 2.7.2. Mexilhes..............................................................................................................25 2.8. Anlise de cidos graxos de lipdios.........................................................................27 3. MATERIAIS E MTODOS........................................................................................29 3.1. Amostras...................................................................................................................29 3.1.1. Apresentao das amostras....................................................................................29 3.1.2. Aquisio das amostras.........................................................................................29 3.1.3.Coleta......................................................................................................................30 3.1.4. Separao tecido-valva..........................................................................................31 3.1.5. Processamento prvio das amostras ps-coleta.....................................................32 3.2. Materiais e equipamentos da extrao......................................................................33 3.3. Padres de anlise.....................................................................................................34 3.4. Equipamentos de anlise..........................................................................................34 3.5. Limpeza da vidraria..................................................................................................35 3.6. Preparo e extrao das amostras para anlise...........................................................36 3.6.1. Extrao dos lipdios totais (Etapa 1)....................................................................36

vii 3.6.2. Saponificao e separao dos neutros (Etapa 2)..................................................37 3.6.3. Preparao dos steres metlicos (Etapa 3)............................................................39 a) Sub-etapa 3.1. Esterificao com reagente BF3 em metanol...................................39 b) Sub-etapa 3.2. Esterificao com reagente cloreto de acetila em metanol..............41 3.7. Testes prvios...........................................................................................................42 3.8. Testes de fracionamento dos extratos.......................................................................42 3.9. Injees.....................................................................................................................43 3.9.1. Injees das pores extradas nos testes..............................................................44 3.9.2. Preparo e injeo dos padres...............................................................................44 3.9.3. Injeo das amostras..............................................................................................46 3.9.4. Injeo das amostras para identificao por espectro de massas...........................46 4. RESULTADOS E DISCUSSO.................................................................................47 4.1. Classificao de amostragem....................................................................................47 4.2. Preparos ps-coleta...................................................................................................48 4.3. Padres e equipamentos empregados.......................................................................49 4.4. Procedimentos pr- anlise.......................................................................................49 4.5. Injees e dados com base nos testes prvios...........................................................50 4.6. Identificao por espectrometria de massas dos steres preparados........................52 4.7. Identificao e quantificao por cromatografia gasosa dos steres preparados......57 4.7.1. Identificao e resposta quantitativa.....................................................................57 4.7.2. Anlise quantitativa das amostras..........................................................................62 4.7.2.1. Comparao entre mtodos de esterificao......................................................63 4.7.2.2. Anlise das amostras provenientes das quatro coletas.......................................65 4.7.3. Interpretao dos resultados para as coletas..........................................................67 5. CONCLUSO.............................................................................................................73 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................................74 ANEXOS.........................................................................................................................85 Anexo I. Frmulas...........................................................................................................86 Anexo II. Mapas..............................................................................................................87 Anexo III. Local de coleta e espinheis............................................................................88 Anexo IV. Estrutura dos steres de cidos graxos...........................................................89

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SUMRIO DE TABELAS

Tabela 1. Caractersticas dos lipdios na alimentao.......................................................9 Tabela 2. Classificao dos lipdios................................................................................10 Tabela 3. Caractersticas e ocorrncia dos principais cidos graxos saturados...............14 Tabela 4. Caractersticas e ocorrncia dos principais cidos graxos monoinsaturados..............................................................................................................17 Tabela 5. Caractersticas dos mexilhes tomados como amostra....................................29 Tabela 6. Perodos e dados das coletas de mexilhes tomados como amostras..............30 Tabela 7. Reagentes usados no procedimento de extrao..............................................33 Tabela 8. Padres usados na anlise do leo de mexilho..............................................34 Tabela 9. Concentraes das solues padro, em mg L-1 .............................................45 Tabela 10. steres identificados nas seis amostras analisadas por espectrometria de massas..............................................................................................................................57 Tabela 11. Fatores de resposta e mdias para os padres utilizados na verificao de resposta do detector.........................................................................................................60 Tabela 12. Mdias dos fatores de resposta para cada ster componente da mistura AOCS- 07N........................................................................................................61 Tabela 13. Dados para a comparao dos mtodos de esterificao empregados nas duas fraes das duas primeirascoletas....................................................................63 Tabela 14. Mdia dos valores mdios (em percentagem) entre duplicatas para cada coleta de seis indivduos..................................................................................................65 Tabela 15. Mdias gerais das quatro coletas agrupadas..................................................66 Tabela 16 - Mdias dos valores mdios de temperatura da gua do mar baseados no ms anterior e atual da coleta..................................................................................................67

ix SUMRIO DE FIGURAS

Figura 1. Exemplo de estrutura de um triglicerdeo..................................................11 Figura 2. Reao de saponificao de um triglicerdeo.............................................12 Figura 3. Biossntese do cido palmtico...................................................................13 Figura 4. Esquema da sntese dos cidos polinsaturados da famlia mega 6 ..........19 Figura 5. Biossntese dos steres de cidos mega-3 ...............................................22 Figura 6. Representao da forma de fixao do mexilho atravs do bisso............25 Figura 7. Etapa 1, fluxograma do procedimento de extrao dos lipdios totais.... ..37 Figura 8. Etapa 2, fluxograma do procedimento de saponificao dos neutros........38 Figura 9. sub-etapa 3.1. fluxograma do procedimento de esterificao com BF3/metanol..............................................................................................................40 Figura 10. sub-etapa 3.2. fluxograma do procedimento de esterificao com cloreto de acetila/metanol......................................................................................................41 Figura 11. Cromatogramas de ons totais da mistura de steres do padro AOCS007N (a) e de uma das amostras do extrato de mexilho (b)....................................53 Figura 12. Espectros de massas do pico de nmero 5 (cromatograma da figura 11) para o padro AOCS-007N (a) e para a amostra (b).................................................54 Figura 13. Espectros de massas do (a) ster metil cis-9,12-octadecadienoato (linoleato) disponvel na biblioteca NIST, e (b) o espectro obtido de uma amostra de mexilho....................................................................................................................56 Figura 14. Cromatogramas da mistura de padres AOCS-007N, analisados com coluna polar CBP20...................................................................................................59 Figura 15. Cromatograma parcial com a seqncia para as amostras do leo dos mexilhes...................................................................................................................62 Figura 16. Grfico de linha-coluna para os dados da Tabela 11...............................68 Figura 17. Mdias dos percentuais agrupados por coleta..........................................69 Figura 18. Grfico de colunas e linhas em dois eixos para os cidos mega3.......................................................................................................................70 Figura 19. Grfico de colunas e linhas em dois eixos com os valores de percentuais dos cidos e coeficientes de variao........................................................................71 Figura 20. Grfico de colunas para os valores dos coeficientes de variao dos cidos em cada coleta................................................................................................72

LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA AGPs AGT CG-EM CLA CoA DHA DIC EPA LDL PEG PGI3 PTV TXA3 e TXA2 VLDL

Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria cidos graxos polinsaturados cidos graxos trans Cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas cido linolico conjugado Coenzima-A cido docosahexaenico Detector por ionizao em chama cido eicosapentaenico Lipoprotenas de Baixa Densidade Polietilenoglicol Prostaglandina Programed Temperature Vaporization Tromboxano tipo A3 e A2 Lipoprotena de muito baixa densidade

xi RESUMO

Estudos sobre a composio lipdica encontrada em determinadas espcies de organismos podem ser teis na investigao dos processos metablicos que ocorrem com esses organismos. O conhecimento sobre essa composio tambm contribui para o entendimento sobre as reaes fisiolgicas que a ingesto desses organismos pode causar na espcie humana. Atualmente, muito tem se falado sobre os benefcios causados pela ingesto de lipdios contendo cidos da famlia mega-3, no apenas no que diz respeito preveno de doenas, mas tambm no sentido de manuteno das funes corpreas. Com o objetivo de estudar a composio lipdica dos cidos graxos em leo de organismos marinhos, nesse trabalho apresentada uma metodologia para preparar, identificar e determinar o percentual dos cidos graxos presentes no leo de mexilhes da espcie perna perna, coletados em diferentes perodos do ano, com o uso da cromatografia gasosa e a espectrometria de massas como tcnicas analticas. Foi dada nfase na determinao dos cidos graxos da famlia mega-3 por causa de suas aes comprovadas no metabolismo humano. Os resultados obtidos permitiram testar a eficincia dos procedimentos empregados, criar um perfil para os cidos mega-3 e discutir algumas possveis relaes entre os percentuais desses cidos e as variaes de temperatura da gua do mar, durante as coletas. Revelou-se com os resultados, que o perfil dos cidos graxos dos mexilhes da espcie perna perna apresenta os cidos: 14:0, 15:0, 16:0, 16:1 (n 6), 17:0, 18:0, 18:1 (n 9), 18:1 (n 7), 18:2 (n 6), 18:3 (n 3), 20:1 (n 9), 20:5 (n 3) e 22:6 (n 3). Foi encontrado uma quantidade significativa de cidos mega-3 (29 42%), embora ocorra uma grande quantidade de alguns cidos saturados.

xii ABSTRACT

Studies regarding lipid composition of specific species can be useful for the investigation of metabolic processes occurring with these species. The knowledge about this composition also contributes to understand possible physiologic reactions that can occur with the ingestion of such organisms. The benefits to the human health brought by the ingestion of lipids reach with omega-3 acids are well known, particularly to prevent diseases. The aim of this study was to develop a simple methodology to prepare, identify and determine by gas chromatography and mass spectrometry the percentage of fatty acids in the oil composition of mussels (perna perna species). The organisms were collected during different periods of the year. The results showed the relative distribution of fatty acids (omega-3) is dependent of the sea water temperature. The following saturated and poliunsaturated fatty acids were identified: 14:0, 15:0, 16:0, 16:1 (n 6), 17:0, 18:0, 18:1 (n 9), 18:1 (n 7), 18:2 (n 6), 18:3 (n 3), 20:1 (n 9), 20:5 (n 3) e 22:6 (n 3). In the mussel extracts the percentage of omega-3 fatty acids varied from 29 to 42%.

1 1. INTRODUO Os alimentos sempre fizeram parte essencial da propagao da vida tanto para os homens como para outros seres viventes. Uma busca incessante pela sobrevivncia tornou a alimentao uma prioridade em todas as formas de vida existentes em nosso planeta. Quando os homens primitivos comearam a utilizar suas mentes para criar utenslios, melhoraram suas habilidades para caar e conseguir alimentos, comeando assim uma odissia para obter a sua dieta bsica, sem a qual nossa espcie no cruzaria o umbral que nos fez evoluir. Guerras foram criadas para assegurar a sobrevivncia dos povos e manter as suas necessidades alimentares. Hoje, quatro milhes de anos depois que um ser trocou as rvores pela savana, onde poderia buscar alimento com mais facilidade, ainda lutamos contra o mesmo inimigo, a falta de alimentos saudveis para assegurar o bem estar de nosso corpo (Ordez, 2005). No de hoje que se conhece a importncia de uma alimentao saudvel, tambm no recente a preocupao das pessoas em cultivar e aprimorar novas categorias de alimentos. O topo da cadeia alimentar nos dias atuais, constitudo de uma infinidade de produtos, principalmente cereais como a soja, milho, feijo e outros. O Brasil evoluiu nos ltimos anos em desenvolvimento da produo de gros como os de soja e milho devido a trabalhos com melhoramento gentico, que aumentaram a produtividade das lavouras; a gentica fundamental para a biotecnologia, cujos benefcios esto ligados com o desenvolvimento sustentvel, que implica na maior produo de alimentos para suprir as carncias nutricionais da populao (Costa e Borm, 2003). Processos avanados de desidratao e refrigerao so usados atualmente para conservar os alimentos, mecanismos de controle de pH, pasteurizao e esterilizao viabilizam a atividade antimicrobiolgica necessria para conservar os alimentos; fumaa e gases tambm so utilizados para o mesmo fim (Arajo, 1999). Pesquisas com melhoramento gentico e conservao de alimentos esto corroborando para a qualidade de vida e disponibilidade de alimentos mais saudveis na dieta, refletindo assim a importncia de expandir o conhecimento sobre o potencial alimentar do planeta. Talvez o legado da alimentao humana esteja nos oceanos, um ambiente ainda pouco explorado. Eles cobrem cerca de 70 % da superfcie terrestre, suas guas contm

2 uma enorme quantidade de organismos das mais variadas formas, que superam o ambiente terrestre em termos de classes ou filos. Somente o Brasil possui cerca de 8.000 km de litoral, tornando-o um pas com privilgios na explorao dos recursos sustentveis do mar (Mello e Palma, 2000). Nos oceanos podem ser encontrados animais com as mais variadas formas de alimentao, alguns deles so seres adaptados a condies extremas de captao de alimento como nas aberturas hidrotrmicas em locais de atividade vulcnica submarina. Essas fendas vulcnicas so ecossistemas repletos de moluscos que atingem grande tamanho corporal e so pouco estudados, alguns eram desconhecidos pela cincia at pouco tempo atrs. As habilidades dos animais marinhos viverem em condies que anteriormente no se acreditava que fossem possveis, trazem uma nova perspectiva de como os oceanos so ricos em recursos ainda no aproveitados pelo homem (Nielsen, 2002). Quando se fala em recursos alimentares dos oceanos, a primeira imagem que formada na mente, com toda certeza a do peixe, esse alimento rico nos tem dado sustento por muitas eras. H dcadas ele tem sido usado como fonte de vitaminas A e D, encontradas em grande quantidade no leo do fgado. Porm, uma nova viso de alimento tem dado um grande impulso no consumo de peixe aps o incio do desenvolvimento da cincia nutricional; o peixe passou a ser considerado um alimento funcional, com um grande potencial nutritivo. A carne de peixe est sendo recomendada como fonte de protena de alto valor biolgico e o peixe inteiro como fonte de clcio e fsforo. Devido alta digestibilidade das protenas, os peixes magros tm sido recomendados pelos mdicos para pessoas que consomem grandes quantidades de carboidratos. Mas sem dvida, o efeito mais marcante do consumo do peixe, reside no fato de conter baixo teor de colesterol e alto teor de cidos graxos polinsaturados, sendo assim recomendado nas dietas especiais para pessoas com problemas das coronrias (O Lan online). Porm, os cidos polinsaturados no so encontrados apenas em peixes, muitos organismos de origem marinha possuem uma grande quantidade desses cidos, eles esto presentes em moluscos, crustceos, mamferos, microalgas e outros (Kkel e Hyvrinen, 1998). Nos ltimos tempos tm-se verificado um interesse crescente em determinados alimentos, contendo componentes com atividades fisiolgica e biolgica, como os cidos polinsaturados, chamados alimentos funcionais. O termo alimento funcional usado para designar alimentos naturais ou processados contendo ingredientes que melhoram

3 determinadas funes corporais. A designao apareceu pela primeira vez na dcada de 80, para alimentos no modificados tais como a carne e leite, que representam os exemplos mais simples de alimentos naturais, considerados como funcionais, uma vez que so ricos nos componentes com atividade fisiolgica como cidos graxos mega-3 e 6 (Mateus, 2002 e referncias). Na literatura pode ser encontrada uma srie de informaes sobre a ao de alguns cidos graxos polinsaturados mega3 em certas etapas de desenvolvimento do ser humano. Esses cidos podem ser provenientes diretamente da alimentao (produtos ricos em cidos graxos polinsaturados mega-3), como tambm ser formados a partir de precursores da mesma srie metablica presente em uma dieta. O consumo ou a ingesto dos precursores de uma srie mega-3 pode depender da etapa de desenvolvimento, do estado nutricional, das necessidades fisiolgicas destes cidos graxos e das necessidades por parte de tecidos especficos do corpo, como membranas ou rgos (Borges e Waitzberg, 1995). cidos graxos das famlias mega 3 e 6 so considerados essenciais, pois no podem ser sintetizados pelo organismo humano. Existem diversas fontes desses cidos, mas em organismos de origem marinha que os cidos graxos polinsaturados mega 3 so relativamente abundantes. Eles so sintetizados pelas algas, micro-algas e componentes do fitoplncton, a partir de precursores de menor tamanho molecular, pois tais organismos tm a capacidade de alongar e dessaturar (introduzir duplas ligaes) os cidos graxos com estruturas simples (Chaney, 1998). Para animais de origem marinha como crustceos e bivalves, a presena desses cidos essenciais deve-se a capacidade que esses organismos tm em metaboliz-los a partir de precursores de menor complexidade, como o caso do cido alfa linolnico, precursor da srie mega-3, que pode ser incorporado aos tecidos destes animais como parte da dieta ou tambm pode ser sintetizado por eles (CUNHA, 2001 e referncias). Segundo referncias como Jorge et al. (1997), a possibilidade de que o aumento do consumo de cidos polinsaturados mega-3, principalmente os metablitos EPA e DHA, possam interagir contra o desenvolvimento de doenas cardiovasculares, decorreu das observaes de Bang et al. (1976) e Dyerberg et al. (1975), considerando a baixa incidncia de doenas cardiovasculares em esquims da Groenlndia que ingeriam altos teores de

4 cidos graxos polinsaturados, principalmente mega-3, na sua alimentao. As causas propostas para esse fenmeno incluem desde modificaes favorveis nos nveis de lipdios plasmticos, alteraes hepticas no metabolismo do colesterol, at reduo da captao do colesterol pelo fgado. Posteriormente os estudos que avaliaram o efeito do EPH e DHA sobre o perfil lipdico, de um modo geral, demonstraram reduo das VLDL (lipoprotenas de densidade muito baixa) e da trigliceridemia. Entretanto, o principal efeito dos cidos graxos mega-3 sobre as doenas coronrias parece estar ligado a sua ao sobre a agregao plaquetria, reduo na produo de um forte agente agregador (TXA2) que forma cogulos. Os cidos desta famlia podem colaborar tambm com a preveno de doenas, como cncer de mama, prstata, clun, eczemas e psorase, inflamaes e hipertenso alm de evitar artrites e ajudar na formao de tecidos de alguns rgos e do crebro (Connor, 2000) (Pardini et al., 2005 e referncias). Morelatto (1998) e Moschen (2000) trabalharam, respectivamente, com o uso de enriquecimento dos cidos polinsaturados na rao de sunos e larvas de vrias espcies de peixes cultivadas industrialmente. uma prtica comum a utilizao do procedimento chamado de enriquecimento de rao, em que se incorporam nutrientes ao alimento antes deles serem fornecidos aos animais; tambm pode ocorrer enriquecimento em larvas que sero consumidas vivas. Alimentos enriquecidos com EPA e DHA so empregados com grande sucesso na larvicultura, melhorando a sobrevivncia, crescimento e metamorfose de vrias espcies de animais cultivados. Contribui tambm para uma menor incidncia de deformaes, melhora na pigmentao e na resistncia ao estresse. Uma fonte de cidos polinsaturados, que ainda no utilizada com freqncia, so os moluscos marinhos (ostras e mexilhes). Eles possuem uma considervel quantidade desses cidos, porm seu consumo, comparado com o peixe, ainda pequeno. No existe um hbito alimentar de ingerir carne de moluscos, por isso, receitas a base desses animais no aparecem com freqncia na mesa dos brasileiros. A gordura do mexilho ou da ostra tambm pode ser utilizada para enriquecimento de raes, como as empregadas nos trabalhos citados acima. Uma vantagem que o uso dos moluscos traria diminuio da pesca predatria, pois tanto o mexilho quanto a ostra podem ser criados em cativeiros apropriados ao longo da costa.

5 Da mesma forma que o peixe, o consumo de ostras e mexilhes no algo recente, tanto o cultivo como o hbito de comer moluscos, j figurava entre os primeiros povos civilizados do mundo; os romanos por exemplo, exploravam o comrcio de caracis e possuam escravos para cuid-los. Foi um romano, Sergius Orata, quem primeiro teve a idia de fazer um parque para criao de ostras. Conta-se que, para receber Marco Antnio, Clepatra mandou preparar um banquete, no qual serviu ao general romano seu prato preferido, uma sopa de mariscos regada a vinho branco. Desde o tempo dos romanos, em Portugal j se utilizavam mtodos para conservao de frutos do mar, ostras e mexilhes eram conservados em barris, para consumo futuro. Na poca da independncia dos Estados Unidos, os imigrantes franceses que se estabeleceram no litoral criaram um prato de mariscos que famoso at hoje. No Brasil colonial, relatos antigos revelam que os povos indgenas consumiam marisco e ostras com freqncia, um hbito que se conservou at os dias atuais, porm em pouca escala devido facilidade de obteno do peixe, na pesca predatria industrial (Ornellas, 2000). Na Espanha o cultivo de moluscos como atividade econmica, foi estabelecido na dcada de 40 e espalhou-se por toda a Europa, sia e Amrica do Sul. No Brasil, as primeiras pesquisas datam da dcada de 60. Hoje a produo de bivalves est centrada nos estados do Rio de Janeiro, So Paulo e Santa Catarina, representando uma atividade com grande perspectiva de desenvolvimento comercial. A espcie perna-perna merece destaque nesse contexto, sendo considerado como um dos mitildeos de maior abundncia no litoral brasileiro, este bivalve foi motivo de grande parte das pesquisas na rea alimentcia realizadas com moluscos dessa famlia (Saln, 2005). O mexilho perna-perna tem sido utilizado tambm em pesquisas de cunho ambiental, como biomarcador de poluio por metais ou microorganismos, mas pouco tem se estudado sobre a composio de sua gordura, apenas no que diz respeito quantidade total de lipdeos (Tramonte et al., 2003). So raros os trabalhos que incluem uma anlise do perfil lipdico desse bivalve, normalmente apenas a quantidade total de lipdios informada como dado nutricional; porm, a qualidade dos lipdios demonstrada apenas com o estudo do perfil dos cidos graxos. Segundo Medeiros (2001), que estudou o mexilho Perna-perna; a composio dos cidos mega 3 nesse organismo pode chegar a 32,21 % na fmea, se for considerado os percentuais dos cidos graxos comumente encontrados em leo animal. Este valor

6 encontrado relativamente alto se comparado com outros animais marinhos ( Maia et al., 1993). Portanto, o mexilho um organismo que possui uma considervel quantidade de mega 3, segundo essa referncia. Com a divulgao de estudos sobre polinsaturados em mexilhes Perna-perna, pode-se abrir caminho para outros tipos de utilizao desse bivalve, como a extrao do leo ou de alguns cidos graxos especificamente. A anlise da composio da gordura ou leo de organismos como o mexilho, peixe e outros, um processo delicado que envolve uma srie de procedimentos analticos. Quem recebe um laudo de composio percentual de gordura, muitas vezes, no imagina quantos procedimentos diferentes so aplicados para se chegar a um resultado satisfatrio. Normalmente o trabalho de extrao, preparo, injeo e anlise dos resultados leva semanas para ser realizado. Como um exemplo da complexidade da metodologia aplicada, pode ser citado os mtodos padres AOAC (1995) e normas analticas do instituto Adolfo Lutz (1985), que so normalmente adotados pela legislao e utilizados pela indstria. Muito embora existam outras metodologias, as duas citadas acima so as mais utilizadas em trabalhos de pesquisa e ambas concordam que, para fins de anlise, a tcnica com resultados mais precisos a cromatografia gasosa. Para tal, utiliza-se um cromatgrafo equipado com detector por ionizao em chama e uma coluna de polietilenoglicol (PEG), considerada como a de melhor separao para os steres metlicos preparados dos cidos graxos. A aparelhagem bsica no difere muito, porm alguns acessrios podem ser teis tanto na identificao como na quantificao; um espectrmetro de massas e o uso de padres so bons exemplos disso (Eder, 1995). Portanto, existem inmeras possibilidades de aperfeioar algumas das metodologias mais conhecidas, simplesmente mudando acessrios no equipamento. Outra forma de obter um resultado satisfatrio melhorar os procedimentos de extrao e derivatizao que so empregados rotineiramente de forma que seja possvel extrair mais gordura com menos interferentes, assim como realizar derivatizaes que no causem dvidas durante a quantificao. Este ltimo de importncia fundamental para a preciso dos resultados. Pode-se dizer ento que a cromatografia gasosa um mtodo analtico essencial para o trabalho com cidos graxos proveniente de leos e graxas e a eficincia desse mtodo o que faz com que supere todos os outros. Considerando todos estes fatos, o presente trabalho tem por finalidade avaliar o perfil lipdico do leo de mexilho,

7 empregando uma srie de procedimentos para a obteno, preparo, identificao e quantificao dos steres provenientes dos cidos graxos que compem esse leo. Tambm so relatados aqui detalhes dos procedimentos de identificao por espectrometria de massas, que so de extrema importncia para uma identificao positiva dos diferentes cidos presentes. O mesmo vlido para a parte de quantificao por cromatografia gasosa, na qual a avaliao da resposta do detector consiste na preciso dos resultados almejados.

2. REVISO BIBLIOGRFICA

2.1. Gorduras A rotina diria dos seres vivos requer um grande consumo de energia. As gorduras geram mais do que o dobro de energia que os carboidratos, por isso so mais adequadas ao armazenamento de reservas energticas. Para animais que no se movem como ostras e mariscos, o glicognio faz o papel de substncia de reserva, e a gordura ocupada para outras funes metablicas. Para animais que se movem como as aves migratrias, o total de gordura pode atingir 40 a 50 % do peso corpreo. A migrao das aves seria impossvel sem a gordura que fornece o combustvel para seu movimento, pois o armazenamento de glicognio associado a grande quantidade de gua nas clulas, o que corresponderia a uma massa corprea maior, dificultando a movimentao pelo ar. Para o homem, as gorduras tem um importante papel na dieta, pois como alimento fazem com que uma refeio provoque maior plenitude gstrica, causando uma sensao de saciedade e aumentando o sabor dos alimentos. As gorduras possuem vrias funes no organismo, so componentes do tecido adiposo, que serve de isolamento e proteo dos rgos internos, e funcionam como veculos para o transporte de vitaminas lipossolveis (Marzzoco e Torres, 1999; Nielsen, 2002). As gorduras e outras substncias gordurosas so classificadas na categoria de lipdios, devido ao fato de possurem insolubilidade em gua e solubilidade em solventes orgnicos, como clorofrmio, ter e outros. As gorduras so constitudas principalmente por misturas de triglicerdios, que contm cidos graxos com diferentes nmeros de insaturaes e tamanhos de cadeias. Gorduras que possuem cidos graxos com cadeias menores ou mais insaturadas tendem a formar pontos de fuso mais baixos; gorduras lquidas temperatura ambiente so, em geral, chamadas de leos (Mitchell et al., 1978). Animais marinhos, algas e plncton possuem lipdios ricos em cidos graxos polinsaturados de cadeias longas (20-22 tomos de carbono). Os leos desses organismos

9 tendem a formar complexos arranjos de cidos graxos com composio varivel. Fatores ambientais e metablicos como as diferentes estaes do ano, tipo de alimentao, localizao geogrfica e tipo caracterstico de espcie, influenciam na variao dos percentuais desses cidos. Segundo referncias que comentam o caso particular do leo de peixe, a faixa de variao do EPA pode ser entre 4 e 30% e o DHA entre 2 e 25%. Estes dois cidos graxos representam os polinsaturados de maior importncia entre os lipdios oriundos de organismos marinhos (Rego, 2003 e referncias).

2.2. Lipdios Compostos relacionados com gorduras, leos e ceras so constitudos por lipdios das mais diferentes classificaes. H compostos lipdicos polares que constituem algumas membranas e outros apolares que integram as mais variadas funes corpreas. No geral, os lipdios so classificados como grupos de compostos heterogneos encontrados em alimentos e organismos que possuem propriedades em comum, incluindo a insolubilidade em gua e a capacidade de ser usado pelos organismos vivos (Mahan, 1998). Juntamente com as protenas e carboidratos, os lipdios formam um grupo de macronutrientes que podem ser sintetizados pelo organismo, realizando funes energticas, estruturais e hormonais. Os leos das sementes, por exemplo, fornecem energia para a biossintese dos processos de germinao das plantas; j as ceras protegem algumas espcies contra parasitas e previnem a evaporao excessiva de gua (Raven et al., 2001). No mbito alimentcio, os lipdios possuem varias caractersticas apreciveis que os tornam compostos de elevado valor nutricional, a presena deles em alguns alimentos fundamental para fornecer o paladar e as qualidades fsicas, como pode ser observado na Tabela 1 (Dutra e Marchini, 2003). Tabela 1- Caractersticas dos lipdios na alimentao Caractersticas dos lipdios em alimentos Aparecem em inmeros alimentos de interesse econmico, como leite e manteiga.

10 Proporcionam o dobro de energia que os demais macronutrientes So veculos para vitaminas que compem diversos alimentos Melhoram a palatabilidade dos alimentos Diminuem o volume da alimentao Aumentam o tempo de digesto Fornecem cidos graxos essenciais

A diferena entre as classes de lipdios est ligada a suas composies qumicas e propriedades fsicas. Uma das classes mais importantes de lipdios a denominada por lipdios simples. Esta classe de grande importncia para a cincia nutricional, uma vez que inclui os triglicerdeos, sendo estes os constituintes de maior proporo nos leos de origem natural. A classificao geral para todos os lipdios pode ser encontrada na Tabela 2. Tabela 2- Classificao dos lipdios a) Simples: cidos graxos Gorduras neutras: steres de cidos graxos com glicerol mono, di e triglicerdeos Ceras: steres de cidos graxos com lcool de alto peso molecular steres esterol (ex: ster colesterol) ster no esterol (ex: steres de vitamina A) b) Compostos: Fosfolipdios Glicolipidio Lipoprotena c) Derivados de lcoois (esteris e hidrocarbonetos)

Os triglicerdeos so compostos derivados de steres de cidos graxos com o glicerol. Na natureza os triglicerdeos encontram-se na forma mista, sendo que os trs cidos ligados ao glicerol so diferentes ou somente dois so iguais. A estrutura de um

11 triglicerdeo est representada na Figura 1, para exemplificar o formato complexo da molcula.

Figura 1. Exemplo de estrutura de um triglicerdeo.

A digesto dos lipdios ingeridos pelos organismos ocorre no trato gastrointestinal, onde so emulsificados, hidrolisados e absorvidos. Devido a pouca solubilidade dos lipdios em meio aquoso, sua incorporao prejudicada por formarem grandes aglomerados, dificultando a ao das enzimas. Para facilitar a digesto so liberados sais biliares no intestino, empregados como agentes emulsificantes; a parte apolar desses sais interage com os lipdios hidrofbicos, que so finalmente dispersos no meio aquoso. Algumas enzimas hidrolticas, como as lipases, promovem a hidrlise para uma posterior absoro dos cidos graxos pelas clulas do intestino (Hopfer, 1998; Berg et al., 2002). Fora do organismo a reao de hidrolise dos triglicerdeos pode ser realizada com o emprego de hidrxido de sdio ou potssio, que produz o glicerol e uma mistura de sais de cidos carboxlicos de cadeias longas; esta reao recebe o nome particular de saponificao. A representao da reao de saponificao pode ser visualizada na Figura 2.

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Figura 2. Reao de saponificao de um triglicerdeo

2.3. cidos orgnicos e graxos Para a qumica, os cidos sempre tiveram elevado valor como objeto de estudo. Carl Wilhelm Scheele, um renomado qumico sueco, realizou a descoberta de vrios compostos de natureza cida em meados de 1786. Dentre os 15 a 20 mil experimentos atribudos a ele, est a descoberta dos cidos carboxlicos como o cido tartrico e outros, embora o cido frmico j fosse conhecido desde 1500 (Fiorucci et al, 2002). cidos graxos possuem, em geral, de 4 a 24 tomos de carbono unidos a um grupo carboxila nico. Tambm so as unidades fundamentais da maioria dos lipdios existentes nos leos e gorduras. Difereciam-se entre si pela extenso da cadeia, presena e posio das duplas ligaes. Os de cadeia menor so solveis em gua, mas com o aumento do comprimento da cadeia esta propriedade diminui. No ocorrem livremente nas clulas, mas sim combinados a diferentes classes de lipdios, a partir dos quais podem ser liberados por hidrlise qumica ou enzimtica. Quando encontrados na natureza, quase sempre apresentam cadeias lineares e um nmero par de tomos de carbono. Essas condies refletem o caminho percorrido em sua rota biossinttica, pela qual formado inicialmente o cido palmtico (saturado com 16 tomos de carbono), a partir do qual os outros cidos so derivados.

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A biossintese dos cidos graxos de grande importncia para o estudo dos lipdios, pois a formao dos cidos graxos deriva das condies metablicas dos seres vivos; ela acontece principalmente no tecido adiposo, onde uma molcula de acetil-coenzima-A e sete molculas de malonil-coenzima-A so reunidas para sintetizar o cido palmtico (Lehninger, 1995; Alberts et al., 2006). A reao simplificada apresentada abaixo (Figura 3).

Figura 3. Biossntese do cido palmtico (lado superior direito, em vermelho).

2.4. cidos graxos saturados Embora a maior parte dos cidos graxos saturados utilizados pelos animais, principalmente os mamferos, seja incorporada pela dieta, uma parte produzida pela rota biossinttica resumida na Figura 3. Entre os cidos graxos saturados, de ocorrncia em gorduras, destacam-se o cido mirstico (com 14 tomos de carbono), o palmtico (com 16) e o cido esterico (com 18). Suas caractersticas e ocorrncia podem ser observadas na Tabela 3 (Vianni e Braz-filho, 1996).

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Tabela 3- Caractersticas e ocorrncia dos principais cidos graxos saturados cidos Mirstico (14:0) Palmtico (16:0) Caractersticas e ocorrncia Componente de 15-30 % da gordura do coco e 16 % na semente de palma. Manteiga 9-11 % e 8-12 % da Gordura do leite. Gordura de baleia 8 %. Ocorre praticamente em toda gordura de origem animal e vegetal. Componente de 45 % do leo de palma, 30-50 % no leo de dend. leo de semente de algodo 22 %,Banha e sebo 20-30 %. Gordura humana 25 % e de baleia 12 %. leo de amendoim 11 % e leo de girassol 7 %. Ocorre na maioria dos leos vegetais. Componente de 38 % da manteiga do cacau e 12% do leite. leo de semente de linho 7 % e leo de noz 5 %.

Esterico (18:0)

Os cidos saturados compem a maioria das gorduras slidas e normalmente esto associados ao aumento do nvel de colesterol, principalmente os cidos mirstico e palmtico (Shcaefer et al., 2001). Os cidos fazem diminuir os receptores de LDL (Lipoprotenas de Baixa Densidade, que so ricas em colesterol), aumentando a concentrao do colesterol e dessa lipoprotena no sangue. Como so as LDL que transportam o colesterol para os tecidos perifricos, uma diminuio dos receptores implica na diminuio do processo degradativo dos mesmos (Williams, 1997). Embora ocorra uma srie de fatores que desincentivam o uso dos cidos saturados na dieta, a presena desses cidos em alguns alimentos necessria para dar o sabor caracterstico de cada variedade comercializada, como o caso do queijo, no qual os saturados esto presentes em grande quantidade (Sanchez, 2004). Para o metabolismo dos seres humanos, o cido palmtico tem importante funo, pois o principal cido produzido nos msculos esquelticos e est envolvido com o fornecimento de energia, juntamente com o restante dos cidos graxos; a queima de gordura

15 nesses msculos durante um forte esforo fsico preserva outras fontes de energia, como o glicognio que est presente em quantidade limitada; portanto os cidos graxos possibilitam manter uma atividade fsica por tempo prolongado, sendo essenciais para a pratica de exerccios (Curi, 2003). Tambm de grande importncia o cido esterico, principalmente para os vegetais. No geral, ele pode aparecer em diversas partes da planta como nas clulas do caule, frutos e sementes estando ligado s vrias formas de lipdios. precursor do cido olico, outro cido muito comum em leos, cujos metablitos so os cidos considerados essenciais (Lopes et al., 1999; Borges et al., 2000).

2.5. cidos graxos insaturados cidos graxos insaturados podem ser definidos como cidos monocarboxlicos contendo uma ou mais ligaes duplas entre dois carbonos localizados na poro hidrocarbnica da molcula. No geral, tanto os cidos saturados como os insaturados so representados pela simbologia que indica a letra C, seguida pelo nmero de carbonos totais dos cidos e, no caso dos insaturados, o nmero de duplas-ligaes antecedida por dois pontos: , desta maneira o cido palmtico que contem 16 carbonos e nenhuma insaturao representado simplesmente por C16:0 e o cido olico que contem 18 carbonos e uma insaturao representado por C18:1 ; mas essa representao no traz informao sobre a posio da dupla-ligao, costuma-se utilizar a letra grega delta seguida pelo sobrescrito com o nmero do carbono da dupla-ligao, ( 9 para o cido olico) (Wardlaw, 1995). Outra forma de representao para a posio das duplas-ligaes em cidos insaturados considera uma caracterstica comum entre alguns desses cidos. Essa representao baseada no carbono denominado mega, que se localiza no final da cadeia hidrocarbnica que constitui o cido, ou seja, o carbono terminal do lado oposto ao grupo carboxila. Aos cidos que possuem a dupla ligao localizada no nono carbono ( contados apartir do grupo metil terminal (carbono mega)), designa-lhes o nome de mega 9, que pode ser representado por n-9 ; esta representao levou ao agrupamento desses cidos,

16 que podem ser mono, di ou polinsaturados, em sries ou famlias com o mesmo nome (mega 9) (Moretto, 2002).

2.5.1. cidos graxos monoinsaturados Nos cidos graxos, o alongamento da cadeia e a dessaturao (insero de duplasligaes) so promovidos por uma srie de complexas reaes enzimticas. Basicamente ocorre uma reao de alongamento, onde uma malonil CoA (coenzima-A) doa dois tomos de carbono para o novo cido. Como a biossintese produz primeiramente o palmitato, a malonil CoA leva a formao do estearato, esse por sua vez segue duas rotas possveis: 1) continua sendo alongado at cidos saturados de cadeias longas (20, 24 ou mais tomos de carbono); 2) pode ocorrer dessaturao para produzir cidos mono, di ou polinsaturados. A dessaturao comea com o palmitato, porm isso conduz ao cido palmitoleico (monoinsaturado do cido palmtico (C16:0)); j o estearato conduz ao cido olico (C18:1) e da, para os demais derivados insaturados (C18:2, 18:3 e etc.). Os dois primeiros cidos insaturados (16:1(9) e 18:1(9)) que resultam da dessaturao em sistemas biolgicos de mamferos, so pertencentes famlia mega 7 e 9 porque no existem enzimas para catalisar outras duplas-ligaes entre os carbonos (mega 7-9) e o agrupamento metila terminal (Campbell, 2000). As caractersticas e ocorrncia dos cidos mais importantes deste grupo podem ser observadas na Tabela 4.

17 Tabela 4- Caractersticas e ocorrncia dos principais cidos graxos monoinsaturados cidos Caractersticas e ocorrncia

Palmitolico Seu percentual normalmente baixo em leos e gorduras. leo de baleia 7-18 % (16:1) Banha 1-4 % e manteiga 2-6 % . Olico (18:1) amplamente distribudo na gordura natural Funciona como precursor do cido linolico e outros cidos essenciais. Gordura de origem bovina e ovina 35-40 % e milho 35-50 %. leo de algodo 12- 40 % e mamona 5-10 %. Encontrado no leo de peixe (Arenque) 10-20 % leo de baleia 5-20% Colza 5 %

Ercico (22:1)

2.5.2. cidos graxos di-insaturados So compostos que possuem duas insaturaes ao longo da cadeia hidrocarbnica, alguns deles podem ser encontrados em algumas gorduras naturais, no entanto, o cido mais abundante dessa categoria o cido linolico (18:2). Os mamferos no possuem a capacidade de produo desse cido; os vegetais sim, a partir da dessaturao do cido olico (18:1 9). O ismero formado na dessaturao biossinttica dos vegetais normalmente o cis-9,12 . Isso significa que as duplas-ligaes se localizam nos carbonos 9 e 12, conforme a numerao oficial, que atribui uma seqncia crescente a partir do carbono da carboxila (nmero 1). Assim o ismero formado pode ser representado por 18:2 (9,12). Esse cido pertence famlia mega 6 e aparece constantemente em leos vegetais como soja, milho, canola e outros. Sua predominncia nos vegetais evidente como mostra o trabalho de Reda et al. (2005) com as sementes de citros usados na fabricao de sucos, em que a quantidade atinge 43 % (c. linolico) do percentual de cidos graxos identificados no limo. Os animais marinhos e alguns microorganismos tambm produzem o cido linolico, mas para o homem ele o primeiro de uma srie de cidos graxos essenciais necessrios ao organismo e obtidos somente atravs da dieta. cidos graxos essenciais so

18 indispensveis sade porque fazem parte da membrana celular, alm de serem necessrios para o transporte do colesterol, produo de energia, funcionamento do crebro entre outras funes (Moura, 1998; Carvalho et al., 2003 e referncias). cido linolico conjugado ou CLA o nome dado a uma mistura de ismeros do cido linolico (18:2 - 9,12 ), essa mistura inclui o cido cis-9, trans-11; trans-7, cis-9 e trans-11, cis-13. So produtos da biohidrogenao do rmen pela bactria butyrovibrio fibrisolvens e esto presentes nas carnes de ruminantes e em produtos lcteos. Segundo Werner et al. (1992), o CLA possui uma atividade anticarcinognica comprovada em cobaias, para vrios tipos de tumores como leucemia, prstata e etc. Estudos como esses comprovam a utilidade dos cidos di-insaturados, principalmente do cido linolnico e seus derivados, na alimentao humana e animal.

2.6. cidos graxos polinsaturados e a rancidez oxidativa O termo polinsaturado empregado para nomear os cidos graxos com mais de uma insaturao, isso inclui os cidos di-insaturados. Porm, o termo mais bem empregado para definir uma srie de cidos com vrias insaturaes, como o caso dos derivados do cido linolnico. So muito conhecidos pela abreviao em ingls de poliunsatured fat acids (PUFAs) ou em portugus para cidos graxos polinsaturados (AGPs). Duas das principais famlias de cidos graxos polinsaturados de ocorrncia natural so as mega 3 e 6 (Anjo e referncias, 2004). cidos dessas duas famlias so produzidos por alguns animais marinhos, algas, microalgas e vegetais, sendo dessaturados a partir dos metablitos do cido esterico (saturado com 18 carbonos). A diferena entre os polinsaturados produzidos por vegetais e animais reside no tamanho da cadeia. Animais como peixes produzem cidos graxos polinsaturados com cadeias longas, enquanto nos vegetais eles so de cadeias mdias. So chamados de cidos essenciais porque no podem ser sintetizados pelo organismo humano, que no possuem enzimas para sintetizar os cidos linolico (18:2 n 6) e linolnico (18:3 n 6 ou n 3). Aps a ingesto e absoro desses cidos na dieta, ocorre o alongamento e dessaturao at seus metablitos de cadeia longa. Esse processo ocorre nos animais e nos homens, e representa importante papel nos seus metabolismos,

19 pois os cidos produzidos interferem na atividade das enzimas ligadas s membranas alm de uma srie de outros fatores associados presena dos AGPs. A sntese dos polinsaturados comea com a presena do cido linolico (18:2 n 6). Este por sua vez d origem apenas aos metablitos da famlia mega 6, uma vez que as duas famlias mega 6 e 3 no podem se interconverter no organismo humano. Os cidos da famlia mega 6 so encontrados em vrios alimentos, principalmente o cido linolico (18:2 n 6) em leos vegetais como soja, amendoim, aafro e outros. O mais notvel representante dessa famlia, o cido -linolnico, est presente em grande quantidade em leos como o de fgado de bacalhau. Tambm possvel encontr-lo em microalgas verdes como a Spirulinas (Macedo e Alegre, 2001). Um esquema da sntese dos cidos da famlia mega 6 est representado na Figura 4, para os steres dos cidos.

Figura 4. Esquema da sntese dos cidos polinsaturados da famlia mega 6.

Existem vrios benefcios associados com os cidos graxos polinsaturados e o consumo desses cidos altamente recomendado. Porm, os AGPs so significativamente vulnerveis aos processos degradativos que atingem todos os tipos de cidos graxos insaturados, principalmente aqueles com maior nmero de insaturaes. A degradao

20 diminui a vida til, gerando produtos indesejveis do ponto de vista nutricional (Osawa, 2005). Degradao por oxidao um fenmeno muito comum que ocorre entre os nutrientes que compem os alimentos. Esse tipo de deteriorao pode acontecer principalmente entre a frao lipdica, alterando diversas propriedades, como o valor nutricional, qualidade sensorial (sabor, aroma, textura e cor) e toxicidade (Kubow, 1993; Donnelly e Robinson, 1995). Essas reaes so causadas pelo oxignio atmosfrico, perxido, metais e outros agentes oxidantes. Os perxidos so os primeiros produtos formados na oxidao e seus intermedirios so os radicais livres. Por definio, radical livre uma espcie qumica que apresenta nmero mpar de eltrons livres, resultante de uma quebra homoltica de ligao qumica. Esta espcie altamente reativa, pode se formar por calor, luz e radiao. Ao se formar em um meio que contenha cidos graxos, os radicais atacam principalmente o carbono alfa, vizinho ao carbono da dupla-ligao dos insaturados, liberando o hidrognio e um radical alilico do cido graxo, que reage com o oxignio para formar um radical peroxil (ROO). Esse radical funciona como propagador da reao radicalar quando remove o hidrognio alfa de outro cido insaturado, e o resultado um hidroperxido (ROOH) e outro radical. O produto da degradao dos hidroperxidos forma aldedos, lcoois e cidos de cadeia menor, que constituem o rano, da o nome rancidez oxidativa (Bobbio e Bobbio, 2001). Uma perda expressiva pode ser causada no contedo dos cidos graxos polinsaturados com a rancidez. Em tecidos de animais ela acontece rapidamente com o psmortem, necessitando o emprego de tcnicas como o uso de anti-oxidantes (carotenides, cido ctrico, vitamina E e outros) (Halliwell, 1997; Simic e Javanovic, 1994). Outra maneira de inibir a oxidao lipdica evitar condies que favoream a degradao como a temperatura alta, incidncia de luz, abundncia de oxignio e umidade. Para isso pode ser empregado o processo de liofilizao ou criossecagem, que consiste em retirar a gua do tecido ou alimento, usando temperatura e presso tais que a gua sublima, sem afetar o contedo lipdico, que permanece congelado e sob vcuo. O processo de liofilizao evita a oxidao lipdica porque, no caso de tecidos vivos pos-mortem, realizado com material previamente congelado, no qual existe pouco oxignio em funo

21 da presso e isso impede a ao das enzimas e outros fatores que afetam a estabilidade dos cidos graxos polinsaturados (Evangelista, 1998).

2.6.1. Famlia mega-3 Os cidos pertencentes a essa famlia possuem sua ltima insaturao no terceiro carbono, contados do grupo metila terminal, e so sintetizados a partir do cido linolnico (C18:3 9,12,15), seu bioprecursor, tambm desta famlia. Tal cido fornece como metablitos os cidos de maior importncia desta srie que so os cidos eicosapentaenico (EPA) e o cido docosahexaenico (DHA). Esses cidos fazem parte da estrutura dos fosfolipdios que integram as membranas e a matriz estrutural de todas as clulas, influenciam vrias funes nas membranas como ligaes de hormnios e atividades associadas com enzimas transportadoras ( Wu et al, 1996). Tambm so encontrados no crebro e na retina, contribuindo com o desenvolvimento da viso e funes neurais. Muitas so as utilidades dos cidos mega 3 nas funes corporais, alguns autores como Carvalho et al. (2003) informam que a administrao de cidos graxos polinsaturados, principalmente os megas 6 e 3, demonstram efeito benfico contra processos inflamatrios e alrgicos, como eczema, asma e artrite reumatide. Tambm relatam a importncia do seu efeito para sndromes pr-menstrual, diabetes e funes imunolgicas. Segundo Calder (2003), os cidos mega 3 tm apresentado resposta para pacientes que passaram por cirurgias, atuando no sistema de imunidade, contra processos inflamatrios. Embora os efeitos causados pelo consumo de mega 3 sejam benficos, existem algumas restries quanto quantidade consumida. Steinhart e Biernoth (2001) informam que, no ano de 1992, a British Nutrition, no Reino Unido, recomendava doses de EPA e DHA em torno de 1.25 gramas no total, juntamente com 2 gramas de cido linolico. Existe portanto, uma relao entre mega 3 e 6, que deve ser respeitada para que os benefcios sejam atingidos. Cada enfermidade necessita de diferentes pores desses cidos, mas para as necessidades dirias a relao mega 3/mega 6 1:2 em gramas, recomendada em 2004

22 pela ANVISA (Lima et al, 2000; Kim et al, 2005). A relao entre as duas famlias de megas (3 e 6) parece estar relacionada com a sntese dos eicosanides. Eicosanides so compostos com atividade biolgica, derivados do cido araquidnico, compreendem os compostos que incluem as prostaglandinas, tromboxanas e leucotrienos. So hormnios que agem prximos s clulas onde foram sintetizados. Esto envolvidos nas funes reprodutivas, inflamaes, febres e formao das plaquetas. Quando cidos das duas famlias so ingeridos, eles competem pelas mesmas enzimas, e ocorre um desequilbrio na produo dos eicosanides. Caso haja doses excessivas de uma das famlias, a preferncia das enzimas pelos mega 3, da a razo das limitaes na ingesto de grande quantidade desses cidos (Champe et al, 2002). Um dos motivos pelos quais os cidos graxos mega-3 so fisiologicamente singulares no combate a doenas cardacas a produo de tromboxano TXA3, um fraco agente agregador plaquetrio, e prostaglandina PGI3, um forte anti-agregador. Estes eicosanides derivam da bioconverso do cido eicosapentanico (EPA) e atua contra a ao de fortes agregadores de plaquetas como o tromboxano TXA2, que um dos metablitos sintetizados a partir do cido araquidnico, como mencionado no pargrafo acima. Podem atuar ainda inibindo a converso deste cido para tromboxano TXA2, uma vez que, a biossntese dos eicosanides depende da disponibilidade das enzimas que agem sobre os cidos das duas famlias mega 3 e 6 (Mahan, 1998). Segue abaixo a figura com a biossntese dos steres de cidos mega-3 e seus respectivos eicosanides.

Figura 5. Biossntese dos steres de cidos mega-3 e seus respectivos eicosanides.

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Existem inmeras fontes de cidos graxos mega 3 na natureza, so encontrados em animais, vegetais e microrganismos. A fonte mais citada so os peixes, principalmente os de guas mais frias (Justi et al., 2005 e referncias). Alguns autores afirmam que quando h um decrscimo na temperatura ocorre um aumento no nmero de insaturaes. O mecanismo para esse fenmeno pode estar relacionado com uma adaptao para manter constante o estado fluido das membranas, motivo pelo qual se afirma que a temperatura est intimamente ligada a mudanas nos percentuais dos polinsaturados em peixes marinhos. No entanto, as concluses destes autores no permitiram encontrar relaes entre a reduo da temperatura e o aumento dos cidos mega-3, quando os mesmos trabalharam com alevinos de tilpia do nilo (oreonchromis niloticus), submetidos a controles de temperatura de 23 at 32 oC. O fato dos leos de peixe, moluscos e algas conterem uma grande quantidade de mega 3, deriva desta converso por alongamento e dessaturao da cadeia, uma vez que organismos como o do peixe possuem a propriedade de interconvero entre as famlias megas.

2.7. Bivalves como fonte de mega-3 cidos da famlia mega-3 so muito comuns em organismos marinhos, no s em peixes de guas profundas, mas tambm so integrantes de outros organismos que necessitam deles para alguns processos metablicos. Eles podem ser encontrados em maior ou menor quantidade, dependendo do estado fsico, fase reprodutiva ou de outros fatores individuas de cada espcie. Por isso existe a necessidade de observar as caractersticas morfolgicas e fisiolgicas dos animais em estudo para determinar quais as possveis mudanas em seu ciclo de vida que alteram a composio dos cidos graxos. No uma tarefa fcil, principalmente em animais migrantes como algumas espcies de peixes. Por outro lado, os bivalves apresentam-se como animais de vida sedentria, muitos deles vivem presos superfcie ou so de vida livre, possuindo a capacidade de nadar, porm este

24 recurso utilizado mais para livrar-se de predadores (Ruppert, 1996). Caso se queira estudar as mudanas biolgicas dos cidos devido sazonalidade ou outros fatores, os bivalves parecem ser uma boa opo, j que sua vida sedentria pode ser monitorada nos ambientes onde costumam se desenvolver.

2.7.1. Classe bivalvia A classe bivalvia tambm conhecida pelos nomes de Pelecypoda ou Lamellibranchia, composta por animais que apresentam uma concha com duas valvas em formatos ovalides. Possuem brnquias de grande proporo, que tem as funes de coleta de alimento e troca gasosa. No geral, brnquias so rgos respiratrios semelhantes aos pulmes, mas com o lado onde ocorrem as trocas gasosas voltado para o exterior. As brnquias dos bivalves funcionam tambm como uma peneira para partculas que ficam suspensas na gua. Desta forma, sua funo est mais ligada alimentao do que propriamente a trocas gasosas. Acredita-se que os bivalves modernos tenham evoludo de uma classe de moluscos ancestrais extintos, chamado rostrocnquio. Inicialmente eles eram escavadores rasos, pradaptados para filtrao de alimentos e pertenciam ao grupo dos protobrnquios (apenas um par de brnquias) que encontram-se representados por algumas espcies hoje, mas seus fsseis remontam dos perodos Ordoviciano ou talvez Cambriano da era Paleozica (570 a 280 milhes de anos atrs). Sua evoluo deu origem aos lamelibrnquios, bivalves bem adaptados filtrao, que possuem brnquias dobradas em forma de U, com maior tamanho, possibilitando que esses animais consigam alimento mais facilmente. A evoluo da filtrao possibilitou que os lamelibrnquios dominassem a fauna dos bivalves desde ento, colonizando outros habitats que eram inabitveis aos seus ancestrais protobrnquios. Atualmente os lamelibrnquios abrangem animais to comuns como os mexilhes e as ostras (Nielsen, 2002) (Ruppert, 1996).

25 2.7.2. Mexilhes O mexilho o nome empregado para designar diversas espcies de bivalves pertencentes famlia Mytilidea. Dentro dessa famlia podem ser encontradas diversas espcies de indivduos propcios ao consumo humano, dois dos mais comuns so os do gnero mytilus (mytilus edulis) e perna (perna perna). Esse primeiro encontrado no litoral do Rio Grande do Sul e em muitos outros lugares do mundo. O mexilho da espcie perna perna encontra-se distribudo pela costa atlntica da Amrica do Sul, em uma faixa que se estende da Venezuela at o Uruguai, so muito abundantes entre o Rio de Janeiro e Santa Catarina, onde so encontrados em grande nmero nos costes rochosos. Este animal tipicamente de habitats onde possam prenderse a substratos duros como rochas, madeira de cais e estacarias. A habilidade de escalar os substratos se deve a presena de uma srie de cordas produzidas pela glndula bissal, que capaz de secretar uma protena que endurece aps alguns minutos de formao (Figura 6).

Figura 6- Representao da forma de fixao do mexilho atravs do bisso. Essa espcie considerada como o maior mitilideo brasileiro, podendo atingir 140 mm de comprimento nas valvas. So diicos (dois sexos separados), no apresentam dimorfismo sexual externo, ou seja, e necessrio abrir as valvas para classific-los como

26 macho ou fmea (Henriques e referncias, 2004). Uma vez aberta s valvas, possvel identificar o sexo dos indivduos pela colorao de um grande tecido que se acomoda no interior da valva, denominado de manto. Para o caso das fmeas o manto de colorao avermelhada. O ciclo sexual dos mexilhes perna perna apresenta-se em dois estgios iniciais de desenvolvimento das gnadas (clulas que produzem gametas) e um terceiro de maturidade sexual. O ultimo estgio dividido em trs sub-estgios nomeados como IIIA, IIIB e IIIC. No primeiro sub-estgio (IIIA) se encontra um manto bastante espesso e repleto de gametas (Magalhes e referncias, 1998). Este o sub-estgio que foi estudado no presente trabalho. Pode-se dizer que o cultivo de moluscos no uma atividade recente. No Brasil as primeiras pesquisas sobre mitilicultura foram realizadas pela USP, e extenderam-se at Santa Catarina devido s pesquisas realizadas pela UFSC nos ltimos vinte anos, que iniciaram com os primeiros trabalhos com ostras e mexilhes, pelos doutores Carlos Rogrio Poli e Aim Rachel Magenta Magalhes. Atualmente, segundo Tramonte et al. (2003), Santa Catarina o maior produtor nacional de mexilhes e ostras, respondendo por 95% da produo brasileira de moluscos. Em Florianpolis os mexilhes so cultivados em alguns locais propcios da ilha de Santa Catarina como em Sambaqui e no Ribeiro da Ilha. O cultivo realizado em espinheis, localizados prximos costa. Cada espinhel contm um determinado conjunto de cordas verticais presas horizontalmente a uma grande corda principal, essa por sua vez flutua com o auxilio de bias. Deste modo, as colnias de mexilhes ficam imersas durante todos os perodos de mars baixas ou altas. Em anexo pode ser encontrada uma representao dos espinhis e os mapas para localizao dos dois pontos de cultivo, citados acima (Curtius, et al., 2003). Bivalves como o Perna-perna so bioatratores de diversidade e considerados como um importante membro da cadeia alimentar, fornecendo alimento para aves, peixes e mamferos marinhos. Tem sido utilizado em pesquisas de cunho ambiental, como biomarcador de poluio por metais ou microrganismos. Mas pouco tem se estudado sobre a composio de sua gordura, apenas no que diz respeito quantidade total de lipdios (Tramonte et al., 2003). Alguns trabalhos com o de Passi et al. (2002) e Medeiros (2001) informam sobre a quantidade de mega-3 e os demais cidos que integram o perfil lipdico dos mexilhes. Porm, no h informaes suficientes na literatura para se concluir que o

27 leo de mexilho est sendo empregado em escala industrial para a obteno de cidos graxos mega-3, no Brasil. Pesquisas com cidos graxos de mexilho da espcie perna perna so raras, normalmente se encontra algumas referncias com outras espcies de mitilideo como o Mytilus edulis e tambm algumas espcies de ostras.

2.8. Analise de cidos graxos de lipdios So muitos os mtodos para se avaliar lipdios e seus cidos graxos constituintes. Uma variante nesses procedimentos a forma de extrao e preparo das amostras que sero analisadas. No geral, um tipo bsico de extrao pode ser usado para a obteno dos lipdios totais de vrios tipos de materiais slidos como sementes trituradas, tecidos secos e at ossos. Para materiais lquidos a extrao difere um pouco, mas normalmente segue o mesmo principio das amostras slidas. As metodologias mais utilizadas para amostras contendo gorduras so as gravimtricas, na qual uma mistura de solventes orgnicos usada para extrair os lipdios totais, sendo evaporado em seguida, deixando apenas a matria gordurosa que pesada e armazenada. O mtodo de Soxhlet o mais conhecido entre os mtodos de extrao, no apenas para retirar lipdios, mas todos os compostos que possam ser arrastados pelo solvente extrator (Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz, 1985). Inegavelmente esse mtodo eficiente para gorduras, porm seu longo perodo de aquecimento (4 a 8 horas) torna-o um mtodo lento para um nmero grande de amostras que so analisadas todos os dias em laboratrios. Outros mtodos mais rpidos so empregados hoje, a maioria deles utiliza uma mistura de solventes. Os cidos graxos livres so obtidos aps a extrao dos lipdios totais por uma reao de saponificao direta dos extratos. Emprega-se um procedimento padro com hidrxido de sdio ou potssio em meio alcolico. So raros os casos em que outros saponificantes so utilizados, principalmente porque os mtodos como AOAC (1995) sugerem estes reagentes.

28 Os cidos livres podem ser analisados diretamente por algumas tcnicas, ou modificados para atender os quesitos de sensibilidade de alguns aparelhos empregados em analises, como o cromatgrafo gasoso.

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3. MATERIAIS E MTODOS

3.1. Amostras

3.1.1. Apresentao das amostras As amostras consistem em mexilhes, cujas caractersticas principais esto listadas na Tabela abaixo. Tabela 5- Caractersticas dos mexilhes tomados como amostra Nomes populares Caractersticas Marisco ou mexilho Classe BIVALVIA (LINN, 1758) Ordem MYTILOIDA (FRUSSAC, 1822) Famlia MYTILIDAE (RAFINESQUE, 1815) Gnero perna Espcie perna perna (LINN, 1758) Cultivo: espinheis de cordas Local de cultivo: Sambaqui, Florianpolis-SC Outras : ver Introduo

Dados retirados de (Magalhes, 1998 e referncias citadas)

3.1.2 Aquisio das amostras As aquisies seguiram um padro, tanto no perodo de coleta como no perfil dos indivduos coletados. Tentou-se manter um perodo de coleta em intervalos de dois meses, conforme a disponibilidade de material e condies climticas favorveis. As aquisies foram realizadas em 4 etapas, todas no perodo da manh e no mesmo local, de acordo com o que segue (Tabela 6):

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Tabela 6- Perodos e dados das coletas de mexilhes tomados como amostras Data e hora 23/11/05- 09:30h 08/02/06- 09:00h 05/04/06- 10:00h 08/06/06- 09:30h Etapa Primeira coleta Segunda coleta Terceira coleta Quarta coleta Local Sambaqui Sambaqui Sambaqui Sambaqui

3.1.3. Coleta Inicialmente as coletas dos mexilhes ocorreram em dias de mar calmo. Os pontos de coleta localizavam-se prximos costa, porm foi necessrio o uso de uma pequena embarcao para se ter acesso aos espinheis, onde se encontravam as cordas com os mexilhes. Aleatoriamente, escolheram-se de 3 a 4 cordas, com animais de tamanho adequado; as cordas possuiam uma grande quantidade de indivduos, aglomerados em 1 ou 2 pontos bem definidos. Retornando para a praia, as cordas foram lavadas com auxlio de um jato de gua; as incrustaes de cada animal foram retiradas com um cutelo, aps os mesmos serem separados das cordas, quando ento, o bisso, que fixa o animal na corda, foi arrancado manualmente. Os mexilhes foram separados por tamanho, sendo que os menores (5 cm aproximadamente) eram guardados para produo de sementes. Entre animais de vrios tamanhos, adotou-se um padro entre 8 e 10 cm, para os animais selecionados. Usaram-se luvas, avental e botas de borracha para a realizao desse trabalho. No total foram coletados 24 animais (mais um extra em cada coleta) de acordo com as etapas mencionadas no item 3.1.2.; todas foram classificadas pela Profa. Dra. Aim Rachel Magenta Magalhes (co-orientadora deste trabalho), e se encontravam no estgio IIIA de seu ciclo reprodutivo (estgio cheio). Para tal seleo, foram separados entre 20 e 30 animais de tamanhos apropriados. Todos receberam uma limpeza prvia em suas valvas, com escova e gua corrente, disponvel no local. O restante do bisso foi retirado com uma tesoura; para a abertura das valvas se fez necessrio o corte do msculo adutor com uma

31 faca no serrilhada. A gua inter-valvar foi retirada sobre corrente de gua em abundncia. Realizou-se a classificao dos animais por sexo e ciclo reprodutivo; somente 6 fmes no estgio IIIA foram classificadas, no restante encontravam-se machos e animais parasitados que, em ambos os casos, no serviam aos padres deste trabalho. A necessidade de padronizao das amostras decorre das diferentes condies que os mexilhes podem ser encontrados em cultivo. Entre os animais coletados e separados, que possuam tamanhos adequados, encontravam-se machos e fmeas em seus diferentes estgios reprodutivos. Ressalta-se que tambm so encontrados animais parasitados de ambos os sexos. A identificao s possvel se o animal estiver com suas valvas abertas, o que significa que vrios animais tm que ser abertos para a identificao de suas condies. Por isso adotou-se uma quantidade mnima de animais, mas todos eles com a maior quantidade de fatores padronizveis possveis (tamanho, sexo, ciclo reprodutivo, local geogrfico e etc.). Nesse trabalho foi adotado a quantidade de seis animais para representar uma leva de indivduos que se encontram em determinadas condies de temperatura e ambiente, no s para identificar as diferenas entre cada leva, mas para observar a variao do perfil dos cidos graxos como um todo, ou seja, a suas amplitudes no total das levas. Esse ultimo, se deve ao fato da ocorrncia de variao significativa no perfil dos cidos graxos, sendo esta, esperada, devido ao prprio metabolismo do ser individual, como pode ser observado em Maia e Amaya (1993) e Hansel (2000).

3.1.4. Separao tecido-valva O passo seguinte foi a retirada de toda a parte mole do animal, atravs da raspagem da parte interna das valvas, com uma esptula, sendo todo o material (tecido) removido, incluindo a musculatura interna. As valvas foram separadas em recipientes plsticos numerados. As partes moles do mexilho foram armazenadas em potes especiais para conservao de alimentos, tambm numerados em combinao com as suas respectivas valvas. Todos os recipientes continham tampas e permaneceram totalmente fechados, sem possibilidade de contato entre as amostras; em nenhum momento o material de manuseio

32 foi misturado, tudo permaneceu sem possibilitar troca de fluidos entre os animais. Os materiais de manuseio foram lavados e secados constantemente, durante a separao do tecido. Posteriormente os recipientes contendo todas as amostras foram acondicionados em uma caixa de isopor contendo gelo, na qual permaneceram por aproximadamente uma hora durante o transporte do local de coleta (Sambaqui) at o laboratrio (Trindade). Prosseguiuse ento para a etapa de processamento das amostras.

3.1.5. Processamento prvio das amostras ps-coleta Imediatamente aps a chegada no laboratrio as partes moles das amostras foram submetidas aos procedimentos abaixo: 1. Os recipientes foram retirados do isopor e colocados no congelador; eram retirados conforme requisitados para o passo seguinte. Devido ao gelo estar em sacos plsticos fechados, o interior do isopor se encontrava seco assim como os recipientes que nele permaneciam armazenados. 2. Uma a uma, as partes moles foram retiradas de seus respectivos recipientes e colocados em um gral (limpo com gua destilada, etanol PA e seco em estufa a 100 oC). 3. Nitrognio lquido teve que ser adicionado diretamente em cima das amostras para facilitar o seccionamento dos tecidos moles, que procedeu com uma esptula de ao. Aps a separao das partes, nitrognio foi adicionado novamente. Um pistilo foi usado para macerar as partes fragmentadas, que seguiram para um balo ( previamente pesado), aps serem recongelados com nitrognio. Pesou-se o conjunto aps 30 minutos de descongelamento. Repetiram-se todos os passos anteriores para as demais amostras. 4. Os bales foram tampados com papel alumnio e mantidos no congelador por 24 horas. 5. Aps este perodo, os bales seguiram ao liofilizador, no qual permaneceram por 12 horas sob vcuo; retirou-se os bales, que voltaram para o congelador por

33 mais 12 horas. Mais uma vez, foram levados ao liofilizador, permanecendo por mais 12 horas. 6. O tempo de permanncia no liofilizador foi suficiente para obter uma poro de material seco, que foram pesados e macerados, sendo ento, armazenados em tubos de vidro lacrados; permaneceram ali at sua utilizao no procedimento seguinte. 7. Para o caso das valvas cada par foi retirado de seus recipientes e deixados para secar a temperatura ambiente por 12 horas. Posteriormente foram pesados e medidos.

3.2. Materiais e equipamentos da extrao Os reagentes usados na extrao e preparo das amostras de mexilho esto listados na Tabela 7. Tabela 7- Reagentes usados no procedimento de extrao Nome Trifluoreto de Boro Hexano Metanol DCM Clorofrmio HCl Cloreto de acetila KCl KOH Na2SO4 Tolueno Pureza 14% (em metanol) 95% (HPLC) 99,9% (HPLC) 99,9% (HPLC) 99.9% (ABSOLV) 37% (P.A) 99% 99,5% 85% - lentilhas 99% - anidro (P.A) 99,98% (ABSOLV) Fabricante Sigma Mallinckrodt Mallinckrodt Mallinckrodt Vetec Q. F. Ltda Quimex Fluka Vetec Q. F. Ltda Vetec Q. F. Ltda Vetec Q. F. Ltda Tedia

34 Os equipamentos de laboratrio utilizados durante a extrao do leo foram : ultrassom (Unique), centrfuga (Fanem), vortex (Phoenix), rota-evaporador (Fisatom) e liofilizador (Heto).

3.3. Padres de anlise Os padres utilizados nas anlises do leo extrado esto listados na Tabela 8. Esses padres foram escolhidos tendo em vista a bibliografia consultada (AOAC, 1995; Medeiros, 2001; Passi, 2002).

Tabela 8- Padres usados na anlise do leo de mexilho Nome Estearato de metila AOCS- 007N (mix de steres) Pureza 99% 99% Fabricante Nacalai Tesque INC AccuStandard Sigma Sigma Sigma Sigma Fluka

ster metlico do cido cis- 95% 5,8,11,14,17-Eicosapentaenico ster metlico do cido cis- 98% 4,7,10,13,16,19- Docosahexaenico ster metlico do cido Linolnico 99% cido. cis-11-eicosanoico cis-13-docosenoato de metila 99% 97%

O padro AOCS-007N contm os steres: miristato, palmitato, estearato, oleato, linoleato, linolenato, araquidato, eicosenoato, docosanoato, erucidato e tetracosanoato.

3.4. Equipamentos de anlise Abaixo segue uma lista dos equipamentos e acessrios para anlise do leo extrado dos mexilhes:

35 1. Cromatgrafo gasoso (CG): modelo GC-17A, marca SHIMADZU, com programa CLASS-GC10 verso 1.3; equipado com detector por ionizao em chama (DIC). 2. Cromatgrafo gasoso (CG-EM): modelo TRACE GC ULTRA, marca THERMOFINNIGAN, com programa XCALIBUR verso 1.4; equipado com detector de massas, modelo POLARIS-Q, do mesmo fabricante. 3. Injeo manual, com micro-seringa (volume de 1,8 L). 4. Programao de temperatura (no1): 100 oC; 8 oC min-1 at 250 oC; isoterma 20 minutos. Split 1:40 com gs de arraste (N2) e fluxo na coluna em 1.31 mL min-1. 5. Coluna: CBP20, SHIMADZU; 100% polietilenoglicol (25 m x 0,25 mm de dimetro interno e 0,25 m de espessura da fase estacionria). 6. Programao de temperatura (no2): 100 oC, 8 oC min-1 at 300 oC; isoterma 20 minutos. Split 1:50 com gs de arraste (He) e fluxo na coluna em 1.4 mL/minuto. 7. Coluna: RTX-5MS, 5%-difenil, 95%-dimetilpolisiloxano (30 m x 0,25 mm de dimetro interno e 0,25 m de espessura da fase estacionria).

3.5. Limpeza da vidraria Todos os vidros de material no aferido ficaram imersos durante 30 minutos em uma soluo a 25% de detergente neutro em gua fervida. Cada vidro recebeu uma lavagem com soluo hidroalcolica ( 100 g de KOH por litro de soluo etanol/gua destilada (9:1) (v/v)). Seguiu-se um enxge com gua corrente e gua destilada. A secagem foi realizada em estufa 100 oC; e depois calcinado a 400 oC em uma mufla. A vidraria aferida ficou imersa 24 horas em soluo de detergente neutro; posteriormente recebeu 2 lavagens com a soluo hidroalcolica citada acima. Lavou-se com gua corrente e gua destilada; aps secagem, em temperatura ambiente, realizaramse trs lavagens com acetona e diclorometano, antes da sua utilizao (Normas Analticas do Instituto Adolfo Lutz, 1985).

36 3.6. Preparo e extrao das amostras para anlise O preparo e extrao das amostras a partir do material liofilizado ocorreu em trs etapas; seis amostras de cada coleta, em duplicata, foram usadas para extrao do leo. Manipulou-se seis amostras de cada vez em cada etapas da extrao. Em paralelo, um padro de controle (controle 1), contendo apenas 1,225 mg do cido cis-11-eicosanico teve que ser usado para estimar o rendimento das etapas; este padro percorreu o mesmo caminho das amostras, como segue nos itens abaixo. Tambm foi utilizado uma mistura (mistura 1) dos padres 5-colestan-3-ol e cido cis-11-eicosanoico como controle do processo de separao dos compostos denominados neutros; para cada conjunto de seis amostras manipuladas, uma amostra desse padro seguiu o mesmo procedimento.

3.6.1. Extrao dos lipdios totais (Etapa 1 ) Pesou-se aproximadamente 200 mg do liofilizado, respeitando as normas da metodologia padro AOAC (1995), baseado no percentual de gorduras totais j estudado (Magalhes, 1998). As amostras foram transferidas para um tubo de ensaio com tampa, sendo adicionados 4 mL da mistura dos solventes metanol/clorofrmio (1:2) (Folch, 1956). Os tubos foram agitados no vortex por dois minutos, sendo ento colocados no ultrassom onde permaneceram por vinte minutos, para a extrao dos lipdios totais. Aps os vinte minutos, os tubos foram centrifugados e o lquido passado para outros tubos de ensaio limpos e secos; efetuou-se este procedimento com mais 4 mL e outras duas vezes, com 2 mL, para garantir a extrao dos lipdios. As quatro pores contendo os lipdios foram secas em um rota-evaporador, adaptado para evaporar o solvente no prprio tubo de ensaio, com banho controlado na temperatura de 50-60 oC . Um fluxo corrente de nitrognio gasoso foi aplicado aos tubos que continham o extrato e os mesmos foram fechados e lacrados com filme (Dannenberger et al., 2004; Meier et al., 2006). Permaneceram no congelador ( 10oC) at serem requeridos na etapa seguinte.

37 O mesmo procedimento empregado para as amostras tambm foi realizado para os padres de controle; os padres referidos aqui so os denominados: controle 1 e mistura 1, ambos mencionados em 3.6.. Segue abaixo um fluxograma dessa etapa.

Figura 7. Etapa 1, fluxograma do procedimento de extrao dos lipdios totais.

3.6.2. Saponificao e separao dos neutros (Etapa 2 ) Uma reao de saponificao dos lipdios totais foi efetuada com 4 mL de soluo KOH/MeOH (0,5 mol L-1) no tubo de ensaio contendo os extratos. Estes tubos permaneceram fechados em estufa por uma hora a 60 oC. Ao extrato saponificado foi adicionado 4 mL de hexano para a separao dos compostos no saponificveis, como os esteris. Repetiu-se o procedimento por mais duas vezes para total separao. As trs pores de hexano, juntas, foram lavadas com 4 mL da mesma soluo de hidrxido; separou-se a fase alcolica, que retornou ao tubo contendo os extratos saponificados; foi utilizando uma centrfuga e uma pipeta Pasteur para separar e recolher essa fase aquosa. Recolheu-se 1 mL da fase hexnica para testes, essa fase recebeu uma etiqueta nomeada como neutro, e continha o nome e nmero da amostra da qual foi separada.

38 Para que os sais orgnicos passassem para a forma cida, uma soluo de HCl 2,0 mol L-1 foi adicionada at pH 1. Seguiu-se uma adio de 4 mL de hexano para extrair os cidos e separ-los da fase aquosa, que foi descartada depois de duas outras extraes com hexano. Os extratos foram separados em centrfuga (2 minutos) e coletados, passando para tubos de ensaio limpos e secos. O volume de hexano foi reduzido para aproximadamente 1 mL, em rota-evaporador, e seco completamente com nitrognio gasoso. Os extratos secos foram separados em duas fraes, de igual volume, atravs da adio de hexano (3x 1mL), que foi evaporado posteriormente com nitrognio gasoso (Eder, 1995; ISO, 2002). Os tubos contendo os extratos separados receberam um lacre e uma etiqueta com o nome da amostra e o nmero da frao (1 e 2); seguiram para o congelador, onde permaneceram at serem requeridos na etapa seguinte. O processo de separao, em fraes, no ocorreu para o padro do cido cis-11-eicosanoico (controle 1) e nem para a mistura de padres (mistura 1) ; os mesmos permaneceram com suas massas originais.

Figura 8. Etapa 2, fluxograma do procedimento de saponificao e separao dos neutros.

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3.6.3. Preparao dos steres metlicos (Etapa 3) A preparao dos steres metlicos dos cidos graxos, separados em duas fraes de mesma massa, seguiram por duas sub-etapas distintas. A frao de nmero 1 seguiu a sub-etapa 3.1- com reagente BF3/metanol, e a frao de nmero 2 seguiu a sub-etapa 3.2-com reagente cloreto de acetila/metanol. Somente as fraes das amostras da primeira e segunda coleta passaram pelas duas sub-etapas. As fraes das amostras pertencentes s duas ltimas coletas seguiram apenas a sub-etapa 3.1. Do mesmo modo, as replicatas de todas as amostras seguiram apenas a sub-etapa 3.1.; nenhuma replicata passou pela esterificao com cloreto de acetila, embora tenham sido separadas em duas fraes. O padro do cido cis-11-eicosanico (controle 1) foi esterificado somente com BF3/metanol; esse cido percorreu todas as etapas desde a extrao Segue abaixo a descrio das sub-etapas de esterificao e seus respectivos fluxogramas.

a) Sub-etapa 3.1. Esterificao com reagente BF3 em metanol O preparo dos steres metlicos das fraes, com o reagente BF3 em metanol, procedeu de acordo com a metodologia padro e as demais referncias (AOAC, 1995; Kang et al., 2005). Inicialmente a concentrao do reagente esterificante original foi alterada de 14 para 7% com a adio de metanol. Os tubos contendo os extratos secos receberam 2 mL do reagente esterificante; permaneceram fechados e em repouso durante uma hora na estufa a 60 oC. Depois de 5 minutos em temperatura ambiente, a reao foi interrompida com 2 mL de uma soluo de NaCl 10% (p/v). Agitou-se os tubos durante 2 min, seguido por uma adio de 2 mL de DCM; os tubos foram agitados por mais 2 min e centrifugados por 3

40 min. Separaram-se as fases, tomando cuidado para pipetar apenas o DCM, que permanece em baixo da fase aquosa. O procedimento foi repetido por mais duas vezes, e a fase contendo os steres seguiu para uma micro-coluna de sulfato de sdio anidro, sendo eluida com mais 6 mL de DCM. Evaporou-se o solvente em rota-evaporador, com banho de 50-60
o

C, at um volume de aproximadamente 1 mL; esse solvente restante foi evaporado com

nitrognio gasoso. Novamente os tubos contendo os steres secos receberam etiquetas com identificao e lacre; permaneceram em congelador (-10 oC ) at sua utilizao. Ao mesmo tempo, um padro de controle (controle 2) contendo o cido cis-11eicosanico seguiu todo o procedimento descrito nessa etapa. Uma quarta adio de 2 mL de DCM, foi aplicada apenas para o mesmo, sendo separada das outras trs. importante no confundir esse controle 2 com o controle 1, esse ultimo passou por todas as etapas, enquanto o controle 2, foi introduzido apenas nessa etapa de esterificao, embora ambos sejam compostos pelo mesmo padro.

Figura 9. Sub-etapa 3.1., fluxograma do procedimento de esterificao com BF3 / metanol.

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b) Sub-etapa 3.2. Esterificao com reagente cloreto de acetila em metanol A reao de esterificao para a frao 2 foi efetuada com 3 mL de soluo cloreto de acetila em metanol gelado (1:10), adicionada no tubo contendo os cidos juntamente com 1 mL de tolueno. Esta soluo permaneceu em estufa durante cinco horas a 60 oC. Aps cinco horas, os tubos contendo os steres receberam 2 mL de diclorometano e 1 mL de soluo 10% de KCl (m/v); esta mistura foi centrifugada e separada, tomando-se a fase inferior e descartando-se a fase superior aps outras duas extraes. Posteriormente o extrato foi submetido a uma coluna de sulfato de sdio anidro, e eluito com 10 mL de diclorometano; os eluatos, contendo os steres, foram recolhido em tubos e concentrados para 1 mL em rota-evaporador com banho de 50-60 oC, e levados a secura com fluxo de nitrognio gasoso. Os tubos foram lacrados e etiquetados, permanecendo no congelador ( 10 oC) at sua utilizao (Hansel, 2000; Palmquist, 2003).

Figura 10. Sub-etapa 3.2, fluxograma do procedimento de esterificao com cloreto de acetila / metanol.

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3.7. Testes prvios Antes da aplicao dos procedimentos descritos nos itens anteriores (etapas 1 a 3), ocorreu uma simulao para a otimizao da metodologia de extrao, saponificao e esterificao; para tal, escolheu-se aleatoriamente trs amostras liofilizadas da primeira coleta (indivduos diferentes), que foram particionadas em trs fraes de mesma massa (200 mg). Os passos para os testes prvios seguem como descrito no item 3.8.; esse procedimento referente apenas s trs amostras teste e suas trs fraes.

3.8. Testes de fracionamento dos extratos Realizou-se uma extrao dos lipdios totais, como descrito na etapa 1, porm com algumas modificaes saber: 1. A extrao dos lipdios totais foi realizada com trs adies de 4 mL da mistura de solventes (MeOH/CHCl3 , 1:2), sobre 200 mg de tecido liofilizado. Coletou-se os 4 mL da terceira, aps a separao da parte slida no ultrassom. Esse procedimento foi empregado para trs amostras (uma de cada indivduo). Todos os trs extratos seguiram o restante da primeira Etapa (Etapa 1, como descrito no item 3.6.1.), eles receberam uma etiqueta com os nomes: amostra-teste 1,2 e 3, respectivamente. 2. Para outras trs amostras (uma de cada indivduo), repetiu-se o procedimento acima, porem, coletando a quarta adio da mistura de solventes (MeOH/CHCl3 , 1:2), sobre 200 mg de tecido liofilizado. As trs primeiras fraes foram rejeitadas; as trs coletas da quarta adio, seguiram o restante da primeira etapa (etapa 1), como descrito no item (3.6.1.). 3. Para as ultimas trs amostras (uma de cada indivduo), procedeu-se como descrito em 3.2.3.1.(2x 4mL +2x 2mL), porem uma quinta adio de 2 mL (MeOH/CHCl3, 1:2) foi realizada e coletada, seguindo o restante da etapa 1. As quatro primeiras fraes foram combinadas, para cada amostra individualmente, recebendo os nomes de testes 1, 2 e 3.

43 4. Todas as pores mencionadas acima passaram pela Etapa 2 (item 3.6.2.), na qual trs alteraes foram realizadas: 1) coletou-se uma quarta adio de 2 mL de hexano na retirada dos neutros (aplicado apenas para as trs amostras denominadas de testes 1,2 e 3 (item acima); 2) coletou-se uma quarta adio, tambm de 4mL de hexano, na retirada dos cidos, aps a adio de HCl (aplicado apenas para as trs amostras denominadas de testes 1,2 e 3 (item acima); 3) no houve separao de fraes ao final da etapa 2, aps os cidos serem secos com nitrognio gasoso. 5. Todas as pores seguiram para a Etapa 3 (item 3.6.3.); nessa etapa elas foram esterificadas apenas com o reagente BF3/metanol (sub-etapa 3.1.). Coletou-se uma quarta adio de 2 mL de DCM, na parte de separao dos steres, que se encontravam na fase metanlica (aplicado apenas para as trs amostras denominadas de testes 1,2 e 3 (item acima). Nota: As pores dos testes totalizaram 15 amostras, que permaneceram no congelador (-10 o C) por uma semana, at suas respectivas anlises no cromatgrafo a gs.

3.9. Injees Previamente, escolheu-se trs amostras extradas conforme descrito em 3.8. (item 1 dos testes) para empregar na otimizao das condies de anlise. Elas eram compostas pelas amostras denominadas de amostras-teste 1, 2 e 3. Foram injetadas utilizando as programaes de temperaturas citadas pela metodologia AOAC (1995), que recomenda o uso de uma coluna carbowax 20MM, com programao de temperatura inicial de 170 oC at temperatura final de 225 oC, com rampa de 1 oC min-1. As mesmas amostras foram injetadas com a programao no 1, citada em 3.4. item 4. Em ambos os casos, o cromatografo (CG-17A) e a coluna (CBP20) utilizada, esto indicados em 3.4. item 1 e 5. As temperaturas do injetor e detector foram ajustadas para 280 e 300 oC, e foram mantidas nesses valores. A cada 20 injees eram trocados o liner e o septo. Todos os

44 liners usados eram para injees com split, e foram lavados com uma mistura de solventes (acetona/etanol (1:1)) em ultrassom. Manipulou-se esses acessrios com pina, evitando uma possvel contaminao. Foram realizados testes de pureza para os solventes hexano, clorofrmio, metanol e DCM; todos concentrados cinqenta vezes (em rota-evaporador) e injetados nas mesmas condies acima.

3.9.1. Injees das pores extradas nos testes

Todas as pores escolhidas para caracterizar os testes foram injetadas antes da montagem da metodologia apresentada em 3.6.; essas pores incluem as amostras nomeadas como: amostra-teste (1,2 e 3) e teste (1,2 e 3). Tambm incluem as adies extras, realizadas na preparao dos testes descritos nos cinco itens de 3.3.. Injetou-se 1.8 L de cada poro, anteriormente diluda com 400 L de soluo contendo o padro interno cis-13-docosenoato de metila em hexano. A programao de temperatura (no 1) e coluna (CBP20) utilizadas so dadas em 3.2.2.2., nos itens 4 e 5. Mais detalhes sobre os testes podero se encontrados aps a apresentao dos resultados.

3.9.2. Preparo e injeo dos padres Inicialmente, trs padres de steres metlicos e um padro de mistura de steres foram preparados em cinco concentraes diferentes. Os trs primeiros receberam uma quantidade de padro interno (metil cis-13-docosenoato), cuja concentrao final era sempre igual (320 mg.L-1), para todas as cinco concentraes dos trs padres. A Tabela abaixo mostra as concentraes dos padres preparados de acordo com as recomendaes da metodologia (Ribani et al., 2004).

45 Tabela 9- Concentraes das solues padro, em mg L-1, preparadas a partir de solues estoque nmero 1 2 3 4 5 ML 677 507 338 169 085 EPA 1575 1350 1125 0900 0675 DHA 1715 1470 1225 0980 0735 MIX 5693 3795 2846 2277 1897

ML: linolenato de metila EPA: ster metlico do cido cis- 5,8,11,14,17- eicosapentaenico DHA: ster metlico do cido cis- 4,7,10,13,16,19- docosahexaenico MIX: AOCS-007N

Injetou-se, em triplicata, todos os padres mencionados acima, nas condies dadas em 3.4., no cromatgrafo gasoso (CG-17A) com programao de temperatura (no 1) e coluna (CBP20) relacionados nos itens 1, 4 e 5, respectivamente. Da mesma forma, uma soluo padro de 5-colestan-3-ol (colesterol), com 300 mg.L-1, tambm foi preparada e injetada. A coluna utilizada nesse ltimo caso diferente da empregada para os padres de steres, com baixa polaridade (RTX-5MS). A programao de temperatura usada a de no 2. Ao mesmo tempo, duas amostras de cada padro de steres e mais uma de 5colestan-3-ol (colesterol), foram injetadas no espectrmetro de massas (CG-EM), com programao de temperatura (no 2) e coluna (RTX-5MS) dados nos itens 6 e 7 (ver 3.4.). Tomou-se cuidados extremos com a limpeza da micro-seringa, usada nas injees. A cada nova injeo a mesma era lavada 10 vezes hexano grau PA, e 20 vezes com hexano ultrapuro. Todos os fluxos de sada, como o split e a purga do septo, foram conferidos antes das injees e aps as mesmas. Nesse caso, um bolhmetro era usado para as medidas.

46 3.9.3. Injeo das amostras As amostras dos steres metlicos preparadas a partir do leo de mexilho, que se encontravam congeladas, foram retiradas do congelador e diludas com uma soluo contendo o padro interno cis-13-docosenoato em hexano (320 mg L-1). A diluio era realizada nas duas fraes (1 e 2-esterificadas com os dois mtodos) das amostras, e nas fraes de nmero 1 das replicatas; as fraes de nmero 2 de todas as replicatas permaneceram no congelador, e no foram injetadas priori. Utilizou-se o cromatgrafo gasoso (GC-17A), com programao de temperatura (no 1) e coluna (CBP20), dados nos itens 4 e 5 (ver 3.4.), para injetar todas as fraes (1 e 2) das amostras e as fraes (no 1) de suas replicatas.

3.9.4. Injeo das amostras para identificao por espectro de massas

Escolheu-se seis amostras, alternando entre as fraes derivatizadas com BF3 e cloreto de acetila (fraes 1 e 2 das amostras), para servirem como amostras de caracterizao dos steres metlicos, por identificao pelo espectro de masssas dessas amostras. Para este caso em particular, fez-se uso de uma coluna RTX-5MS, instalada CGEM, com a programao de temperatura de no 2 (ver 3.4., itens 1, 2, 6 e 7). As mesmas seis amostras foram injetadas no cromatgrafo gasoso ( CG-17A ) com as condies de programao de temperatura e coluna, aplicadas no CG-EM.

47

4. RESULTADOS E DISCUSSO

4.1. Classificao de amostragem De acordo com Magalhes (1998), um mexilho parasitado por Bucephalus, que o parasita encontrado nos animais rejeitados nesse trabalho, pode alterar a composio dos cidos graxos, principalmente os de cadeia longa, que so de grande importncia para as membranas dos bivalves. Segundo Medeiros (2001), pode ocorrer uma pequena variao na quantidade dos cidos graxos, principalmente os cidos EPA e DHA, para sexos diferentes. A fmea aparentemente apresenta maior quantidade de mega 3. As informaes desses dois autores foram adotadas no critrio de seleo dos mexilhes classificados no presente trabalho. Por este motivo os mexilhes parasitados e os machos foram rejeitados. Quanto s medidas de comprimento, encontraram-se valores mdios na ordem de 8,97 0,28 e 4,38 0,10 cm para comprimento e espessura das valvas, respectivamente. As valvas tinham massa de 29,2 1,4 g, em mdia, o que corresponde a aproximadamente 62 % da massa total do animal. A massa mida, dos tecidos moles, forneceu uma mdia de 17,6 0,8 g, e quando liofilizada diminuiu seu valor para 21 % (em mdia), indicando uma umidade de aproximadamente 79 %, que est de acordo com a bibliografia consultada, na qual a umidade encontra-se na faixa de aproximadamente 72 a 85 % ( Furlan, 2004). Em relao s datas de coleta, foi adotado um critrio que envolve oito meses, de novembro de 2005 at junho de 2006. Esses meses representam adequadamente a ascenso e queda de temperatura que ocorre de outubro a maro e de abril a agosto, respectivamente. Essa tendncia de variao de temperatura foi baseada nos anos anteriores a 2006. Para efeito de calculo, as mdias de temperatura da gua do ms anterior e do ms de coleta, foram usadas para criar uma nova mdia de temperatura, nica para a coleta em questo, que representasse adequadamente a variao de temperatura sofrida pelos mexilhes. Os dados de temperatura so fornecidos pelo Laboratrio de Cultivo de Moluscos Marinhos de Santa Catarina (LCMM), que fornece os valores das mdias baseadas em medidas

48 quinzenais, retiradas no local de coleta (Sambaqui). Os valores mencionados acima sero avaliados no decorrer dessa discusso.

4.2. Preparos ps-coleta Aps os trabalhos de campo, iniciaram-se os procedimentos de preparo das amostras. Nessa etapa, foram tomados cuidados com a degradao ps-mortem, por isso, o material mido foi manipulado com rapidez, pois a degradao da gordura ocorre relativamente mais rpido em presena de gua, uma vez que as enzimas lipolticas como Lipases e fosfolipases atuam em presena de gua ou emulso lipideo-gua. A rancidez hidroltica poderia prejudicar a anlise do material mido, pois os cidos no degradam de maneira uniforme, os polinsaturados so degradados mais rapidamente que os demais (Paques e Macedo, 2006). Detectou-se um problema na fase de seccionamento da amostra mida, antes do congelamento e liofilizao; este foi identificado na primeira amostra teste, ou seja, a amostra extra, que era coletada junto com as seis amostras principais, sendo que esta amostra teste era previamente manipulada, para otimizar os procedimentos. O problema em questo foi resolvido com uma pequena quantidade de nitrognio lquido, que foi adicionado diretamente sobre a amostra. Desta maneira os tecidos congelavam-se instantaneamente, possibilitando o corte de pequenos fragmentos de tecido congelado. Adicionou-se nitrognio, durante a macerao, at que as partes moles do mexilho ficassem maceradas por completo. Sem o uso de nitrognio lquido no seria possvel a macerao, pois o tecido no se romperia facilmente e a gordura formaria uma emulso com a gua presente em abundncia nos tecidos, que no se liofilizariam. Durante a liofilizao, um recongelamento teve que ser realizado, para evitar que a amostra ficasse descongelada pelas 12 horas seguintes. No foram necessrios mais do que um recongelamento, pois o vcuo procedente do aparelho de liofilizao evita o descongelamento da amostra por um grande perodo de tempo. Durante todo o processo de liofilizao, os bales permaneceram envoltos em papel alumnio, para evitar tanto o aumento de temperatura interna do balo como uma possvel fotodegradao, que embora

49 no ocorra facilmente nesta condio de vcuo, no deve ser descartada a priori, pois o processo de liofilizao demorou aproximadamente 36 horas no total, somando-se o recongelamento (Arajo, 1999). Depois de liofilizado e lacrado, o tecido seco est protegido contra os processos oxidativos.

4.3. Padres e equipamentos empregados Os padres dos steres metlicos analisados nesse trabalho foram selecionados aps consultar as referncias citas no item de materiais (3.3.). Inicialmente foram adquiridos os padres de steres dos cidos EPA, DHA e -Linolnico (objetivos principais da discusso). O padro AOCS-007N (mistura de steres) foi usado para auxilir na identificao dos cidos sob a forma de steres. Quanto aos equipamentos utilizados para anlise, pode-se dizer que foram utilizados conforme sua disponibilidade. A coluna polar CBP20 no pode ser acoplada no CG-EM por motivos tcnicos; por conseqncia disso, uma coluna RTX-5MS teve que ser usada nesse equipamento para que fosse possvel identificar os cidos presentes nos padres e nas amostras.

4.4. Procedimentos pr-anlise Antes da anlise do leo proveniente dos mexilhes, uma serie de procedimentos analticos tiveram que ser empregados. Alguns deles sero discutidos neste item, e compreendem a parte de extrao e preparo das amostras (3.6.). Para a extrao das amostras de leo de mexilho, utilizou-se uma poro do material liofilizado, pesado sempre em dobro, cuidando sempre para que a massa da amostra e sua duplicata fossem exatas. Dentre os mtodos de extrao de gorduras, optou-se pelo de Folch (1951), que utiliza solventes e agitao para extrair a gordura de todas as classes de lipdeos no geral. Este mtodo muito usado, embora j tenha sofrido varias modificaes durante os ltimos

50 anos (ex: Christie, 1990). Segundo Pacheco (2005), ocorrem reaes qumicas de rancidez em leos durante o armazenamento e processamento, como no caso do peixe, que contem grande quantidade de polinsaturados. Temperaturas altas aceleram estas reaes, por isso os mtodos como extrao por soxhlet foram rejeitados. O uso do ultrassom foi particularmente importante nesse trabalho, pois a permanncia da amostra sobre forte vibrao nesse aparelho garante uma extrao mais efetiva da gordura. Aps trmino do processo de extrao dos lipdios totais, os extratos secos foram pesados e em mdia os valores extrados correspondem a 0,055 0,009 g. Tal valor informa que a massa desse extrato 29 % do valor total de massa do tecido seco, utilizado na extrao. Uma observao importante aqui que este extrato total de lipdios no sofreu nenhuma purificao, est no estado bruto. Motivo pelo qual o valor percentual alto e no deve ser confundido com o leo puro, que aparece em algumas referncias.

4.5. Injees e dados com base nos testes prvios Todos os procedimentos empregados nos itens 3.6.1. at 3.6.3., foram baseados nos resultados obtidos com os testes prvios comentados no item 3.7. As amostras oriundas desses testes tiveram que ser injetadas no cromatgrafo aps otimizao das condies de analise, que foram realizadas tambm com trs amostras preparadas nos testes. O resultado das injees mostrou que o tempo de corrida dado pela metodologia AOAC (1995) demasiadamente grande para os steres metlicos, especificamente para o presente trabalho. A comparao dos valores estimados com os valores obtidos utilizando a programao de temperatura (no 1) citada em 3.4. revelou melhora na separao, provocada pela rampa de 1oC min-1 no suficiente para separar completamente alguns steres por completo. Logo se preferiu a programao mais rpida, que no afeta a separao e economiza tempo de corrida. Aps aperfeioar as condies, pde-se obter as informaes necessrias para otimizar o processo de extrao; os resultados dos testes, aps injeo dos mesmos, so dados abaixo:

51 1. Todo o solvente apresentou um grau de pureza suficiente para no provocar erros sistemticos nas amostras, ou seja, no foram observados picos de contaminantes na regio cujos tempos de reteno correspondem aos encontrados nas amostras. 2. As primeiras trs amostras-testes (1,2 e 3) injetadas foram diludas apenas com hexano. Uma posterior injeo com as mesmas amostras, secas com nitrognio e rediluidas em hexano contendo o padro cis-13-docosenoato de metila, provou que no havia pico na regio de tempo de reteno onde aparece esse padro, utilizado aqui como padro interno. Logo, o padro mencionado pode ser utilizado com segurana nas amostras. Fica claro ento, que o referido padro (identificado por P.I) respeita todos os quesitos inerentes ao citado pelas referncias, quanto ao uso correto deste tipo de padro (Alves e Moraes, online) 3. As amostras-testes, provenientes da terceira adio do solvente de extrao (3.8. item 1), demonstraram que trs adies desse solvente so insuficientes para extrair totalmente os lipdios do tecido, mesmo quando se utiliza o ultrassom; seus cromatogramas apresentavam picos de baixa intensidade na regio de tempo de reteno dos steres. Porm, quando so feitas quatro extraes (3.8. item 2) nenhum pico quantificvel identificado nos cromatogramas, para as trs amostras em questo; o mesmo pode ser dito para a quinta adio do solvente de extrao (3.8. item 3). Portanto, foi adotado o uso de quatro extraes para as amostras principais. 4. O teste de separao dos neutros, demonstrado em 3.8. (item 4), provou que trs adies de 2 mL de hexano suficiente para separar os neutros dos saponificaveis; o cromatograma em questo apresentava apenas um pico, identificado como sendo o colesterol (5-colestan-3-ol). O mesmo aconteceu com a mistura de pades identificada como mistura 1 (3.6.), em que as trs adies foram suficientes para separar totalmente o colesterol do outro padro de cido cis-11-eicosanico.

52 5. Outro teste com resultados positivos foi o da extrao dos cidos aps a adio de HCl (3.8., item 4). As trs adies de hexano so suficientes para recuperar todos os cidos presentes aps a saponificao dos mesmos. 6. O teste da quarta adio de DCM, na fase de separao dos steres obtidos aps a sub-etapa 3.1. (esterificao), comprovou que trs extraes com este solvente so suficientes para retirar todos os steres da fase metanlica na qual eles so preparados. Novamente, os cromatogramas dessa quarta adio de DCM no continham picos quantificveis na regio de tempo de reteno dos steres. 7. Da mesma maneira, o teste de branco no demonstrou qualquer contaminao capaz de interferir na anlise das amostras. No foram identificados picos nos cromatogramas do branco para a regio de tempo de reteno dos steres. O branco formado pelo solvente de extrao (clorofrmio/metanol, 2:1) que percorreu todas as etapas empregadas para os demais testes dados em 3.8.

4.6. Identificao por espectrometria de massas dos steres preparados As seis amostras selecionadas para a identificao dos steres metlicos foram injetados manualmente no CG-EM, atravs de uma microsseringa de 10 L. O modo full scan de escaneameto foi preferido, pois no se conhecia o perfil de intensidade das massas (foi usado um analisador de massas do tipo armadilha de ons, ion trap). Ocorreram algumas dificuldades para a identificao dos steres devido ao perfil de intensidade relativa dos fragmentos ser diferente dos encontrados nas bibliotecas mais conhecidas (NIST e AMDS). Essas bibliotecas possuem banco de dados com espectros obtidos, na maioria dos casos, com o quadrupolo (Silverstein e Webster, 2000). Uma alternativa para minimizar esse problema foi o uso do padro AOCS-007N, com o objetivo de identificar a maioria dos steres. A Figura 11 mostra dois cromatogramas de ons totais. O primeiro pertence a mistura de steres AOCS-007N e o segundo a uma das seis amostras, escolhida como exemplo. Na Figura 12 so apresentados os espectros de massas do pico 5.

53

a)

(Tempo, min)

b)

(Tempo, min)

Figura 11. Cromatogramas de ons totais da mistura de steres do padro certificado AOCS-007N (a) e de uma das amostras do extrato de mexilho (b).

54

a)
A B U N D N C I A

b)
A B U N D N C I A

Figura 12. Espectros de massas do pico de nmero 5 (cromatograma da Figura 11) para o padro AOCS-007N (a) e para amostra (b); mbos pertence ao estearato de metila

55 Existe uma grande semelhana entre estes dois fragmentogramas relacionados acima. Pelo fato do analisador de massas desse aparelho ser do tipo que concentra os fragmentos mais pesados, pode-se notar a presena do on molecular em m/z 298, pertence ao estearato de metila. O estearato encontrado em quase todos os tipos de gordura e quimicamente muito estvel se comparado com os insaturados. Por isso usado como padro. possvel encontrar espectros do estearato em todas as bibliotecas disponveis. Porm, no espectro obtido pelo modo ion trap nota-se a ausncia do pico base m/z 74, que caracterstico de todos os steres metilicos saturados e corresponde ao rearranjo McLafferty (Kitson et al., 1996). Outro ponto conflitante refere-se ao pico m/z 87, que tambm caracterstico de steres. Silverstein e Webster (2000) argumentam que esse pico sempre mais intenso que seus homlogos formados por intervalos de massa de 14 unidades. Apenas os steres saturados apresentaram esta diferena. Para os cidos com insaturaes, os espectros de massas apresentaram um perfil mais parecido com os encontrados nas bibliotecas. A Figura 13 exemplifica a semelhana entre os dados obtidos e a referncia NIST, para o ster cis-9,12-octadecadienoato de metila (linoleato).

a)

A B U N D N C I A

56

b)

A B U N D N C I A

Figura 13. Espectros de massas do (a) ster cis-9,12-octadecadienoato de metila (linoleato), disponvel na biblioteca NIST, e (b) o espectro obtido do extrato de uma das amostras de mexilho. Os steres cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoato de metila e cis-4,7,10,13,16,19docosahexaenoato de metila, foram identificadas com a injeo dos padres dessas duas substncias puras, contendo tambm o padro interno P.I, para correo do tempo de reteno. Esse caso semelhante ao apresentado para os insaturados e suas identificaes no apresentaram maiores dificuldades. Na amostra da Figura 11b, esses dois picos so respectivamente os de maior intensidade, que aparecem entre os tempos de reteno 20 e 22 minutos. Uma anomalia acontece com o ster linolenato de metila. Embora o padro AOCS007N contenha este cido, a coluna utilizada no foi capaz de separ-lo e seu pico foi encoberto pelo ster cis-9-octadecenoato de metila (oleato). Logo, esse ster no foi identificado por espectrometria de massas.

57 Apesar das diferenas citadas, foi possvel identificar, com clareza, grande semelhana quanto aos espectros de massas dos picos numerados de 1 a 6 (Figura 11b). Todos os espectros possuem a maioria dos picos de massas iguais aos dados pela biblioteca, apenas com abundncia relativa diferentes, no caso dos saturados. Juntando-se todos os dados acima foi possvel identificar, na amostra, os steres cujos nomes so dados na Tabela 10. Tabela 10 - steres identificados nas seis amostras analisadas por espectrometria de massas n Rep. do cido 1 2 3 4 5 6 7 8 9 14:0 15:0 16:1 (n 6) 16:0 17:0 18:2 (n 6) 18:1 (n 9) 18:1 (n 7) 18:0 Nomes dos steres metlicos tetradecanoato (miristato) pentadecanoato cis-9-hexadecenoato (palmitoleato) heptadecanoato (palmitato) heptadecanoato (margarato) cis-9,12-octadecadienoato (linoleato) cis-9-octadecenoato (oleato) cis-11-octadecenoato (vacenato) octadecanoato (estearato) cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoato cis-11-eicosenoato cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoato

10 20:5 (n 3) 11 20:1 (n 9) 12 22:6 (n 3)

4.7. Identificao e quantificao por cromatografia gasosa dos steres preparados

4.7.1. Identificao e resposta quantitativa A anlise por cromatografia gasosa com detector por ionizao em chama seguiu-se identificao dos compostos por espectrometria de massas e testes prvios. Inicialmente

58 teve-se que comparar a seqncia de eluio no CG-EM com a seqncia obtida no CGDIC. Foi testado primeiramente a mistura de padres AOCS-007N, usada como referncia para os tempos de reteno. Nesse caso, utilizou-se uma coluna apolar RTX-5MS, igual coluna utilizada no CG-EM. A ordem de eluio foi semelhante, inclusive com tempos de reteno relativo ao P.I, pois as rampas de aquecimento empregadas em ambos os casos foram idnticas (8 oC min-1). Os resultados obtidos com essa comparao foram usados para checar as diferenas nas razes de rea (ster/P.I) de cada componente dessa mistura em funo do tipo de detector empregado, espectrmetro de massas (EM) ou ionizao em chama (DIC). Houve uma diferena nas respostas de, no mximo, 10 % que no gera problemas para a identificao dos steres, pois a quantidade dos mesmos diferente na mistura, no sendo confundida simplesmente por uma diferena de 10 % no valor da razo. Como os resultados dessa comparao so inerentes s diferenas de detector, e no de coluna, o passo seguinte foi a troca dessa coluna apolar pela coluna polar, que tem por finalidade separar os steres oriundos do leo dos mexilhes. O mesmo calculo de razo entre reas (ster/ P.I) realizado para a comparao de resposta dos detectores, tambm foi utilizado para comparar as duas colunas de polaridade diferente. Nenhuma diferena significativa foi encontrada aqui que pudesse influenciar negativamente na identificao dos steres injetados na coluna polar. importante lembrar que est sendo comparada a mistura AOCS-007N injetada na coluna RTX-5MS (apolar) e CBP20 (polar), com a mesma rampa de 8 oC min-1, no mesmo cromatgrafo. Foi melhor a separao dos steres com a coluna polar CBP20, devido aos seguintes fatores: 1. Essa coluna mais eficiente para separar os steres com massas que diferem de duas unidades como, por exemplo, os steres dos cidos 18:1 e 18:2 (no foi observada a coeluio que ocorria entre eles na coluna apolar). Na figura 11a aparece a coeluio desses steres identificados pelos nmeros 4 e 3, respectivamente. 2. Nessa coluna ocorre uma inverso na ordem de eluio, com aumento do tempo de reteno em funo do aumento do grau de insaturao. Observouse tambm uma melhora de 40 % no fator de separao () dos steres dos cidos 18:1 (n 9) e 18:1 (n 7), calculados em relao a P.I.

59 3. O pico correspondente ao ster do cido -linolnico foi identificado, o que no era possvel quando se usava a coluna apolar. possvel observar na figura 11a, que apenas dez compostos so separados pela coluna apolar enquanto que na coluna polar, aparecem onze compostos (Figura 14).

Tempo (min) Figura 14. Cromatograma da mistura de padres AOCS-007N, analisado com uma coluna polar CBP20. Os cidos so: 1) 14:0; 2) 16:0; 3) 18:0; 4) 18:1 (n 9); 5) 18:2 (n 6); 6) 18:3 (n 3) ; 7) 20:0; 8) 20:1 (n 9); 9) 22:0; 10) 22:1 (n 9); 11) 24:0.

Aps identificar a seqncia, procedeu-se a injeo dos padres conforme relatado em 3.9.2.. As cinco concentraes dos padres de steres dos cidos 18:3 (n 3), 20:5 (n 3) e 22:6 (n 3), foram usadas para a obteno das curvas de calibrao para os trs compostos, os valores do coeficiente de correlao (R2) foram: 0,9999; 0,9991 e 0,9994 respectivamente ; calculados segundo Barbeta (2006). Essas curvas foram usadas para verificar a linearidade das concentraes empregadas, que representam a faixa de concentrao em que os respectivos steres aparecem nas amostras. Como os valores de R2 (> 0,95) so utilizados para descrever modelos lineares de distribuio de dados, relacionando-se matematicamente com o coeficiente de correlao de Pearson, pode-se notar que os dados possuem uma boa linearidade na faixa de concentrao empregada.

60 Portanto, os valores da razo (rea do padro / rea do P.I) foram utilizados para a obteno do fator resposta para esses steres (Chui e Zucchini, 2001). A Tabela abaixo mostra os valores obtidos para as mdias dos fatores resposta (Fr) dos referidos steres, calculados pela seguinte equao (Gonalves, 2001):

Eq. 1

Fr =

AP.CPI API.CP

Onde: AP= rea do padro API= rea do padro interno Cp= concentrao do padro CPI= concentrao do padro interno

Tabela 11 - Fatores de resposta e mdias para os padres utilizados na verificao de resposta do detector Concentrao 1 2 3 4 5 Mfr (C.V.) Fr (ML) 0,746 0,741 0,742 0,762 0,759 0,750 (1,30) Fr EEPA 0,730 0,720 0,728 0,724 0,739 0,725 (0,75) Fr EDHA 0,760 0,765 0,779 0,777 0,777 0,772 (1,10)

ML: linolenato de metila EEPA: ster metlico do cido cis- 5,8,11,14,17- eicosapentaenico EDHA: ster metlico do cido cis- 4,7,10,13,16,19- docosahexaenico Mfr: mdia dos fatores de resposta C.V: coeficiente de variao dos (Fr)

No foi possvel montar as curvas para os steres do padro AOCS-007 porque se trata de uma mistura j contendo o ster utilizado como P.I, em quantidade prestabelecida. No entanto, as cinco diluies dessa mistura foram usadas para estimar o fator de resposta (Fr) para todos os componentes da mistura. Os valores mdios e os coeficientes de variao so dados na Tabela 12.

61 Tabela 12 - Mdias dos fatores de resposta para cada ster componente da mistura AOCS07N Saturao Representao MFr C.V do cido Saturados 14:0 0,983 0,46 16:0 18:0 20:0 22:0 24:0 Monoinsaturados Dinsaturados 18:1 (n 9) 20:1 ( n 9) 18:2 (n 6) 0,995 0,990 0,999 1,000 0,997 0,993 0,993 0,804 0,50 0,76 0,20 0,41 0,45 0,48 0,73 0,57

MFr: mdia dos fatores de resposta C.V: coeficiente de variao dos Fr para as diluies

Uma informao importante destaca-se nesse conjunto de dados da Tabela 12. Para cada diluio a resposta do detector se manteve linear em relao s reas dos steres, pois os coeficientes de variao so pequenos, indicando que a diluio no afeta a resposta individual de cada componente da mistura. Com isso pode ser feita uma estimativa para se poder empregar a mdia dos fatores resposta na anlise das amostras de leo de mexilho. Outro fato observado a tendncia dos steres com mais de uma insaturao possurem fatores resposta relativamente diferentes dos demais. Segundo Ribani et al. (2004), os parmetros de quantificao podem ser calculados com os dados de desvio padro de resposta e coeficiente angular da curva analtica. Seguindo esta lgica, foram calculados os limites de deteco e quantificao para o ster do cido EPA, cujos valores so 6,01 mg L-1 e 18,20 mg L-1, respectivamente. Sendo esse ster o composto que apresenta o menor fator de resposta, possvel admitir que os limites quantificveis para os demais steres, sejam menores, porem, a faixa de trabalho deve ser superior aos limites dados acima.

62 4.7.2. Analise quantitativa das amostras Aps definio de todos os parmetros do item 4.7.1., teve inicio as injees das amostras provenientes das quatro levas (para detalhes da injeo, ver 3.9.3.). Obtendo-se os cromatogramas de todas as amostras e suas duplicatas. Foi necessrio encontrar a seqncia de eluio comparando-a com os dados j obtidos para os padres. Os resultados foram comparados com os reportados na literatura (AOAC, 1995; Passi et al., 2002) que trazem a seqncia de eluio para colunas com o mesmo tipo de fase de usada nesse trabalho. As seqncias dos steres combinam-se perfeitamente, inclusive para os ismeros de posio de insaturao como: 18:1 n9 e 18:1n7. Apresenta-se abaixo um cromatograma para exemplificar o perfil dos steres do leo dos mexilhes. Todas as amostras, sem exceo, possuem os mesmos steres identificados no cromatograma da Figura 15.

Tempo (min) Figura 15. Cromatograma parcial com a seqncia de eluio para as amostras do leo dos mexilhes. Os cidos so: 1) 14:0; 2) 15:0; 3) 16:0; 4) 16:1 (n 6); 5) 17:0; 6) 18:0; 7) 18:1 (n 9); 8) 18:1 (n 7); 9) 18:2 (n 6); 10) 18:3 (n 3) ; 11) 20:1 (n 9); 12) 20:5 (n 3); 13) 22:6 (n 3). Coluna polar CBP20.

63

4.7.2.1. - Comparao entre mtodos de esterificao Comparou-se as doze primeiras amostras, esterificadas pelos dois mtodos, com o objetivo de obter informaes sobre a eficincia da extrao e o efeito da temperatura na formao dos steres, pois a esterificao com cloreto de acetila requer um tempo maior de aquecimento, o que poderia prejudicar a recuperao dos steres de cidos polinsaturados (Tabela 13). Tabela 13 - Dados para a comparao dos mtodos de esterificao empregados nas duas fraes das duas primeiras coletas n cido 1 2 3 4 5 6 7 8 9 14:0 15:0 16:0 16:1 (n 6) 17:0 18:0 18:1 (n 9) 18:1 (n 7) 18:2 (n 6) M1 5,76 1,34 28,63 13,79 1,92 6,30 3,08 3,69 1,91 1,87 2,27 15,61 13,83 M2 5,95 1,40 28,47 13,87 1,83 6,25 3,15 3,74 1,86 1,90 2,21 15,68 13,69 M1-2 5,86 1,37 28,55 13,83 1,87 6,28 3,11 3,72 1,88 1,89 2,24 15,64 13,76 C.V. 2,29 3,20 0,40 0,39 3,13 0,60 1,66 0,88 1,92 1,50 1,96 0,32 0,76

10 18:3 (n 3) 11 20:1 (n 9) 12 20:5 (n 3) 13 22:6 (n 3)

M1: mdia das amostras esterificadas com cloreto de acetila/metanol M2: mdia das amostras esterificadas com BF3/metanol M1-2: mdia entre M1 e M2 C.V: coeficiente de variao entre as mdias M1 e M2

Nota: M1 e M2 so mdias percentuais das razes rea do ster / rea do P.I, sem a correo do fator resposta, que desnecessrio para essa comparao entre mtodos.

64 Com os dados de diferena entre as razes (rea do ster / rea do P.I) para cada frao (1 e 2, esterificadas com mtodos diferentes) das doze amostras individuais, pode ser aplicado um teste t para dados pareados. O teste visa comparar as mdias (entre duplicatas das fraes 1 e 2) para obter a significncia entre os valores. O clculo foi realizado segundo Barbeta (2006), e o valor encontrado para t menor do que o valor tabelado para uma probabilidade de significncia igual a 0,05. Isso indica que h diferenas significativas entre as mdias. O coeficiente de variao das mdias totais (M1 e M2) das fraes 1 e 2 possui valores significativos porque reflete a diferena entre os valores individuais que compem as mdias. Por este motivo se usa o teste pareado, que se baseia apenas nas diferenas entre mdias das duplicatas para as fraes 1 e 2. Aplicou-se esse teste para todas as amostras, considerando as diferenas entre as mdias das duplicatas de ambas as fraes (1 e 2). Os valores so muitos e no sero mostrados. A preciso entre os dois mtodos comparada utilizando o teste F de Snedecor, no qual os valores das varincias so comparados para probabilidade de significncia de 0,05. Para esse teste foi utilizada a mdia das varincias de cada ster individualmente, ou seja, para cada duplicata criou-se uma varincia. A mdia entre elas foi calculada para cada ster individualmente. O valor de F foi calculado para cada ster das fraes (1 e 2) esterificada com os diferentes mtodos. Em todos os casos o valor de F calculado ficou abaixo do valor tabelado, indicando que os dois mtodos de esterificao possuem precises comparveis, o que no ocorreu com as mdias das duplicatas (fraes 1 e 2) para cada amostra (Murry, 2000). possvel dizer ento que os mtodos tm precises comparveis, devido s condies uniformes, tanto na formao dos steres, pelos reagentes, quanto na resposta do aparelho de anlise (CG), para cada mtodo individualmente. Porm ocorre uma diferena considervel quando se compara as mdias das duplicatas de cada amostra esterificada entre os dois mtodos, para nvel de significncia de 0,05. Os valores das mdias totais, dados na Tabela 13 indicam que a diferena ocorre ao acaso, pois no houve queda nos valores percentuais dos polinsaturados que pudesse sugerir uma relao entre o maior tempo de aquecimento e a degradao ou no durante a esterificao dos mesmos. Para um melhor resultado, poderia ter sido usado uma mistura de padres de cidos, caso esta estivesse disponvel.

65

4.7.2.2. Analise das amostras provenientes das quatro coletas Finalmente, todas as amostras das quatro coletas puderam ser analisadas e comparadas, coleta por coleta. A Tabela abaixo traz os resultados na forma de mdias dos valores mdios entre duplicatas de mesma amostra, separados em quatro grupos denominados pelas letras A, B, C e D empregadas para designar as quatro coletas realizadas em diferentes perodos do ano. Tabela 14. Mdia dos valores mdios (em percentagem) entre duplicatas para cada coleta de seis indivduos cido 14:0 15:0 16:0 17:0 18:0 18:1 (n 9) 18:1 (n 7) 18:2 (n 6) 18:3 (n 3) 20:1 (n 9) M_A 5,36 1,19 25,47 1,66 5,33 3,40 1,82 2,18 C.VA 9,62 3,06 4,31 4,54 2,79 3,83 7,44 7,22 4,01 8,11 M_B 5,82 1,36 25,22 12,64 1,71 5,29 1,59 3,88 1,73 1,27 1,35 20,72 17,42 C.VB 5,16 5,00 3,74 3,99 5,72 5,03 21,64 6,77 8,54 5,34 11,26 4,44 4,64 M_C 7,52 1,36 30,54 13,00 1,89 6,98 1,46 4,22 1,79 1,28 1,75 15,52 12,67 C.VC 9,30 11,54 10,94 1,40 13,72 14,48 12,02 4,75 11,05 12,41 15,52 22,83 18,81 M_D 7,11 1,39 25,84 12,15 1,70 5,64 1,03 4,06 1,45 1,14 1,97 22,25 14,25 C.VD 12,88 14,15 8,45 5,36 11,89 12,54 14,39 5,70 13,30 7,46 8,16 9,99 12,94

16:1 (n 6) 11,80 10,18

2,34 22,43

1,82 10,36

20:5 (n 3) 19,84 22:6 (n 3) 17,79

A, B, C, D: referente s quatro coletas realizadas em diferentes periodos do ano. M: referente mdia dos valores mdios entre duplicatas de mesma amostra C.V (%): referente ao coeficiente de variao para cada coleta A, B, C, D

Todas as mdias das duplicatas utilizadas para criar as mdias correspondentes a cada coleta foram calculadas a partir dos valores das razes entre reas (ster/P.I). Esses

66 valores foram corrigidos com a aplicao do fator resposta para todos os steres individualmente, pois cada um deles possui o valor do fator resposta dado na Tabela 12, com exceo dos steres dos cidos 15:0, 17:0 e 18:1 (n 7). Para esses ltimos, calculou-se uma mdia dos fatores de resposta mdios (Tabela 12), baseado na semelhana de suas estruturas. Para os steres dos cidos 15:0 e 17:0 foi aplicado o fator resposta dos steres de cidos saturados. J os fatores dos monoinsaturados foram aplicados no clculo do fator de resposta corrigido para o ster do cido 18:1 (n 7). seguro aplicar esse clculo porque o fator resposta para os grupos no varia significativamente, como comprovam os coeficientes de variao dos steres na Tabela 12. Com os valores de razo corrigidos pelo fator resposta, tornou-se possvel calcular o percentual dos steres em cada duplicata, de cada amostra injetada. Logo, os valores de M_A, M_B, M_C e M_D que se encontram na Tabela 14 so as mdia dos valores mdios entre duplicatas, em percentagem, para cada coleta de mexilho feita ao longo do ano. No possvel aplicar uma comparao estatstica para nveis de probabilidade que sejam confiveis para admitir uma significncia entre as mdias. Tentativas de aplicao do teste F e t no resultaram em valores que demonstrassem um aumento ou reduo tendenciosa no percentual para algum ster. Os valores aparentemente esto orientados ao acaso. Com os valores de mdias das coletas, dados na Tabela 14, foram criadas as mdias gerais para as quatro coletas agrupadas. A tabela seguinte mostra esses valores e as amplitudes (menor e maior valor) entre as quatro coletas. Tabela 15 - Mdias gerais das quatro coletas agrupadas n 1 2 3 4 5 cido 14:0 15:0 16:0 16:1 (n 6) 17:0 Mdias Gerais 6,45 1,32 26,77 12,40 1,74 Intervalo de confiana 1,64 0,15 4,02 0,84 0,16 Amplitude 5,36 7,52 1,19 1,39 25,22 - 30,54 11,80 13,00 1,66 1,89

67 6 7 8 9 10 11 12 13 18:0 18:1 (n 9) 18:1 (n 7) 18:2 (n 6) 18:3 (n 3) 20:1 (n 9) 20:5 (n 3) 22:6 (n 3) 5,81 1,61 3,89 1,70 1,38 1,82 19,58 15,53 1,27 0,87 0,56 0,27 0,48 0,56 4,59 3,94 5,29 6,98 1,03 2,34 3,40 4,22 1,45 1,82 1,14 1,82 1,35 2,18 15,52 22,25 12,67 17,79

4.7.3. Interpretao dos resultados para as coletas Para compreender melhor a distribuio dos dados, encontrados para cada coleta, foram criados alguns grficos utilizando o programa Excel 2000. Os dados empregados para construir os grficos esto na tabela 14. Tambm foi utilizado um conjunto de mdias calculados com base nas mdias de temperaturas, da gua do mar, retiradas da pgina do Laboratrio de Cultivo de Moluscos Marinhos (LCMM). Essas mdias foram calculadas considerando o ms anterior e o ms da coleta, para melhor representatividade da variao de temperatura sofrida pelos mexilhes. Os valores esto na tabela abaixo (Tabela 16).

Tabela 16 - Mdias dos valores mdios de temperatura da gua do mar baseados no ms anterior e atual da coleta Bimestre Ms anterior 1 2 3 4 outubro janeiro maro maio Ms da coleta novembro Fevereiro Abril Junho Mdias 20,82 27,13 25,66 18,88 C.V 4,92 0,05 10,17 1,99

68 Os dados da Tabela 16 so empregados no grfico de linha-columa mostrado abaixo (Figura 16).

30 mdias das temperaturas 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 bimestres mdias bimestrais C.V

Figura 16. Grfico de linha-coluna para os dados da Tabela 16 No grfico da Figura 9 fica evidenciado o aumento das temperaturas no segundo e terceiro bimestre, em comparao com o quarto bimestre, quando ocorreu a menor mdia de temperatura. A linha do coeficiente de variao demonstra que houve uma queda acentuada iniciando no primeiro ms do segundo bimestre e prolongando-se at o final do quarto bimestre. O perodo escolhido para as quatro coletas reflete consideravelmente as diferentes variaes de temperaturas durante o ano. Caso exista uma relao entre as alteraes dos perfis dos cidos graxos e a temperatura, deveria acontecer do segundo para o quarto bimestre. Para localizar uma possvel tendncia dos cidos graxos variarem conforme a temperatura, foi construdo um grfico de colunas, no qual possvel visualizar as mdias dos percentuais encontrados, dadas na Tabela 15, para cada coleta relacionada com as temperaturas bimestrais (Figura 17)

69

35 30 25 20 15 10 5 0 1 3 5 7 9 11 nmeros dos cidos 13

coleta 1 coleta 2 coleta 3 coleta 4

Figura 17 - Mdias dos percentuais agrupadas por coleta. Os cidos so: 1) 14:0; 2) 15:0; 3) 16:0; 4) 16:1 (n 6); 5) 17:0; 6) 18:0; 7) 18:1 (n 9); 8) 18:1 (n 7); 9) 18:2 (n 6); 10) 18:3 (n 3) ; 11) 20:1 (n 9) ;12) 20:5 (n 3); 13) 22:6 (n 3). Visualmente, pode ser notado uma uniformidade em relao ao perfil dos cidos. No ocorrem anomalias que mostrem um aumento diferenciado em qualquer grupo. Isso acontece principalmente com os cidos que esto presentes em menor quantidade. O perfil se mantm, o cido de nmero cinco (17:0), por exemplo, no se torna maior em quantidade do que o cido de nmero onze (20:1). Um aumento na quantidade dos cidos saturados, principalmente os de nmero par de carbonos, parece ter ocorrido durante as duas ltimas coletas. Os maiores valores de percentuais desses cidos aconteceram justamente no terceiro bimestre, que apresentou a maior variao de temperatura entre seus meses. Foi o perodo de queda acentuada, no qual a temperatura passou de 27,5 para 23,81
o

C, e da por diante diminuiu at o valor mnimo do perodo de coleta. Nota-se tambm que,

para os dois ltimos bimestres o percentual dos cidos saturados de nmeros pares de carbono aumentou sempre proporcionalmente em relao aos dois primeiros bimestres, e na terceira coleta eles so mais abundantes do que na quarta, considerando os trs cidos pares saturados, uniformemente. No observado o mesmo aumento para os de nmero mpar como 15:0 e 17:0. Em contrapartida, os cidos polinsaturados parecem ter sofrido uma queda durante os meses de temperatura menor. Para o cido 18:3 (n 3), a queda nos percentuais muito pequena para ser percebida, em funo do baixo valor percentual desse cido, mas para os

percentual

70 cidos EPA e DHA a queda nos percentuais pode ser notada na terceira coleta. Na quarta coleta os valores voltaram a aumentar. possvel perceber a diferena entre os cidos mega 3 (EPA, DHA e 18:3), se forem agrupados e relacionados separadamente em um grfico de colunas e linhas, indicando-se as variaes de temperaturas bimestrais no segundo eixo, como apresentado a seguir (Figura 18).

temperaturas percentuais dos cidos 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 bimestres 30 25 20 15 10 5 0 temperaturas mdias bimestrais

18:3(n3) EPA DHA Temp

Figura 18 - Grfico de colunas e linhas em dois eixos para os cidos mega 3 (n 3) Nota-se que o percentual de EPA sempre maior do que o de DHA. Esse padro observado tambm em 96 % dos 24 indivduos analisados, apenas um deles apresentou o contrrio. Esse fato passaria despercebido se fosse analisado um conjunto de amostras nas quais vrios animais so unidos em uma amostra s, como realizado em alguns trabalhos. Observando a linha de temperatura em relao ao terceiro bimestre, pode-se perceber uma reduo nos percentuais de EPA e DHA, que aumentam novamente no quarto semestre. Nesse ltimo semestre, as temperaturas no sofrem uma queda acentuada, a diferena entre os meses que integram esse bimestre no passam de 1,2 % da mdia, ou seja, a estabilidade de temperatura elevada. Algumas similaridades entre as variaes nos percentuais dos cidos puderam ser observadas com a anlise dos coeficientes de variao. Graficamente notado uma pequena semelhana entre os perodos de coleta, como mostram os grficos abaixo:

71

C.V 35 30 20 percentuais dos cidos 25 valores de C.V 20 15 10 5 5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 nmeros dos cidos 0 15 M_A M_B M_C M_D C.VA C.VB C.VC C.VD 25

10

Figura 19 - Grfico de colunas e linhas em dois eixos com os valores de percentuais dos cidos e coeficientes de variao. Na Figura 19 aparece a significncia do coeficiente de variao em funo das quatro diferentes coletas. De acordo com esse grfico, ocorrem variaes desiguais nos percentuais dos cidos, no entanto, algumas semelhanas sutis so percebidas. As linhas que representam os coeficientes de variao para as duas primeiras coletas (A e B), tm um valor mximo registrado sobre o mesmo cido [( 18:1 n 9)(nmero 7)], isso significa que ocorreram diferenas elevadas nos percentuais individuais desse cido para o perodo em que a estabilidade da temperatura era maior. Para os cidos 6 (18:0) e 8 (18:1 n 7), as mesmas linhas esto assumindo valores relativamente mais baixos, indicando que as variaes individuais desses cidos no foram significativas em relao variao do seu ismero de nmero 7 (18:1 n 9). Outras variaes no so to perceptveis como essa ultima, elas ocorrem em escala menor, portanto, foi necessrio o emprego de outro grfico de colunas para visualizar as diferenas nas variaes individuais dos mexilhes submetidos ao estudo desse trabalho.

72

25
valores de C.V

20 15 10 5 0 11 steres dos cidos 13 1 3 5 7 9

coleta 1 coleta 2 coleta 3 coleta 4

Figura 20. Grfico de colunas para os valores dos coeficientes de variao dos cidos em cada coleta. No grfico representado na Figura 20 fica mais fcil perceber as variaes individuais entre as duas primeiras e as duas ultimas coletas. Para 61,5 % dos cidos, os coeficientes de variao das duas ultimas coletas so maiores que os das primeiras. Entre eles esto os dois mega 3 de maior abundancia no leo dos mexilhes (EPA e DHA). O perodo em que essa variao ocorreu foi nos bimestres de menor temperatura, e percebe-se que a variao atinge mais o EPA do que o DHA desse perodo. A interpretao dos grficos demonstra que pode haver uma mudana no perfil de alguns cidos, principalmente saturados e polinsaturados de acordo com perodos de instabilidade e estabilidade de temperatura, porem as relaes com os fatores ambientais e metablicos so difceis de comparar em pesquisas com amostras em habitats sem controle de todos os fatores envolvidos.

73 5. CONCLUSO Em termos gerais, o mtodo para determinao dos cidos graxos por cromatografia gasosa eficiente, principalmente para resultados quantitativos. No entanto, para garantir a caracterizao essencial o uso do espectrmetro de massas e dos padres dos cidos de interesse, pois diminui as chances de identificao duvidosa de compostos e ismeros. O clculo do fator de resposta tambm deve ser empregado, principalmente quando se quer determinar o percentual dos cidos polinsaturados, em os valores desse fator so mais significantes para se obter a quantidade real dos mesmos. Estatisticamente no foi possvel obter respostas significativas para as pequenas variaes dos cidos graxos presentes no leo extrado dos mexilhes. No entanto, a interpretao dos percentuais utilizando grficos, relacionados com as temperaturas dos perodos de coleta, demonstraram que algumas variaes de percentuais podem ocorrer nos meses em que as mdias de temperatura variam mais, indicando uma possvel mudana na incorporao ou produo dos cidos. Claramente se percebe que a quantidade de mega-3 no leo dos mexilhes bastante significativa se comparada com outras fontes como peixes e crustceos, suas amplitudes tambm informam que as variaes sutis nas quantidades tornam o perfil bastante estvel. Para fins nutricionais, eles podem ser utilizados com seguridade para comparaes com outros perfis, de gorduras animal e vegetal. Ainda no se tem informaes sobre o uso do leo de mexilho perna perna para fins comerciais ou medicinais, embora o teor de polinsaturados seja relativamente alto, assim como o de alguns cidos saturados tambm necessrios para dietas que contenham polinsaturados.

74 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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ANEXOS

86 Anexo I- Frmulas

Teste F

SA: desvio padro de valores para uma amostra A SB: desvio padro de valores para uma amostra B

Teste t-student para comparao entre mdias

x: mdia de n valores para uma amostra n: nmero de amostras Sp: desvio padro agregado S: desvio padro

87 Anexo II. Mapas

Figura 1. Mapa indicando o estado e a Ilha de Santa Catarina (ampliao) Fonte: Google Earth, obtida em 05/02/2007

Figura 2. Mapa ampliado da regio de Sambaqui. Fonte: Google Earth, obtida em 05/02/2007

88 Anexo III. Local de coleta e espinheis

Figura 3. Foto do local de coleta: Sambaqui (Florianpolis-SC), em destaque os flutuadores dos espinheis (circulado).

Figura 4. Representao dos espinheis de corda com os mexilhes cultivados no Sambaqui

89 Anexo IV. Estrutura dos steres de cidos graxos

ster do cido olico mega 7

ster do cido olico mega 9

ster do cido Linolnico (mega 3)

ster do cido cis-5,8,11,14,17Eicosapentaenico (EPA)

ster do cido cis-4,7,10,13,16,19Docosahexaenico (DHA)

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