artigo tcnico

Incidncia de microrganismos em salas limpas

Catherine Simes de Abreu* Terezinha de Jesus Andreoli Pinto** Dbora Cristina de Oliveira***
1. Introduo
A preo cu pa o em se man ter nveis mni mos de con ta mi na o ambien tal, con for me Whyte e cola bo ra do res8, envol ve de for ma mais inten sa os paren te rais de gran de volu me, nos quais no se admi te o empre go de sis te mas con ser van tes. Embora nos paren te rais de peque no volu me estes sis te mas sejam empre ga dos, sua con cen tra o deve ser mni ma no sen ti do de redu zir efei tos txi cos, mas ain da efi caz em im pe dir a pro li fe ra o micro bia na. A efi c cia est por sua vez rela cio na da a carac te rs ti cas da cepa micro bia na, o que deno ta a impor tn cia do conhe ci men to quan ti ta ti vo e qua li ta ti vo do bio bur den (car ga micro bia na) ambien tal. Delineou-se por tan to este tra ba lho, cujo obje ti vo con sis tiu em iden ti fi car as cepas encon tra das em salas lim pas, pro ce der a um estu do de fre qn cia das mes mas, assim como in ter pre tar sua pre sen a no con tex to da con di o expe ri men tal. Quanto meto do lo gia ado ta da, em ter mos gerais, no pri mei ro momen to (Qualificao 1) tra ba lhou-se segun do o Federal Standard 209E 2, Nota, em fase at rest. No segun do momen to (Qualificao 2) seguiu-se a reco men da o do Institute of Environmental Sciences and Technology Contamination Control Division, nas seguin tes situa es: Sala lim pa as built, sala lim pa at rest e sala lim pa em ope ra o ou dyna mic. Na fase as built, o pro gra ma de moni to ra men to ambien tal ini ciou-se com ati vi da des de lim pe za pr via, a fim de remo ver a sujei ra mais pesa da, uti li zan do deter gen tes e aces s rios apro pria dos. Na fase at rest, o pro gra ma de moni to ra men to ambien tal envol veu um maior nme ro de ati vi da des, entre as quais a Qualificao da rea. Tal qua li fi ca o con sis tiu na gera o de pro vas docu men tais de que o sis te ma de ar con di cio na do tra ba lha de manei ra con sis ten te, em con jun to com os pro ce di men tos de lim pe za, assep sia, ves ti men ta, entre outros, para asse gu rar um ambien te apro pria do para a fabri ca o de pro du tos est reis. A Qualificao da rea envol veu a deter mi na o de uma matriz de amos tra gem ( grid) seguin do-se nor mas inter na cio nais, par ti cu lar men te o Federal Standard 209E (Airborne Particulate Cleanliness Classes in Cleanrooms and Clean Zones)2 e IEST (Institute of Environmental Sciences and Technology)4. A deter mi na o foi fei ta levan do-se em con ta a rea da super f cie de cada sala ou regio a ser estu da da, assim como sua clas si fi ca o te ri ca em ter mos de con cen tra o de par t cu las. A rea da super f cie de cada sala foi divi di da de manei ra ima gi n ria em qua dra dos de tama nhos iguais (tabela II), o que cor res pon de ao grid. A amos tra gem foi geral men te rea li za da no cen tro de cada qua dra do, no en tan to ocor re ram casos em que algum fator limi tan te ou algu ma razo tc ni cocien ti fi ca deter mi nou que a amos tra gem fos se des lo ca da para um dos can tos do qua dra do ima gi n rio. Desta manei ra foi pos s vel cole tar uma amos tra de cada qua dra do, a fim de se ter uma idia do nme ro de par t cu las vi veis (micror ga nis mos), clas si fi can do-a. O meio de cul tu ra uti li za do nes te tra ba lho foi o Agar Casena Soja (Difco) acres ci do de 0,1% de Lecitina de Soja e 0,7% de Tween 80 para a ina ti va o de pos s veis res duos de

2. Material e mtodo
O mate rial de estu do no pre sen te tra ba lho con sis tiu-se de par t cu las vi veis detec ta das em ambien tes e super f cies duran te Programa de Monitoramento Ambiental, e foi ini cia do ime dia ta men te aps ter sido fina li za do o aca ba men to de eta pas de edi fi ca o des ti na da a pro du o de medi ca men tos cefa los po r ni cos est reis. * *Catherine Simes de Abreu Eli Lilly do Brasil abreu_catherine_simes@lilly.com ** Terezinha de Jesus Andreoli Pinto Prof. Titular do Departamento de Farmcia Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP - tjapinto@usp.br *** Dbora Cristina de Oliveira Mestre e Doutoranda em Frmaco e Medicamentos Departamento de Farmcia Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP - olidec@usp.br Correspondncia: Departamento de Farmcia FCF USP Av. Prof Lineu Prestes, 580 Butant 05508-900 So Paulo SP

sani ti zan tes, e 10 ml de Penicilinase por litro de meio pre pa ra do para a ina ti va o de pos s veis res duos de anti bi ti cos cefa los po r ni cos. O meio foi pre pa ra do de acor do com as ins tru es do fabri can te. Foram pesa dos 40 g do p, 1 g de leci ti na de soja e 7 g de Tween 80 num balo de fun do cha to com capa ci da de de 2 litros. Todos os ingre dien tes (exce to a Penicilinase) foram solu bi li za dos em 1 litro de gua quen te ( WFI Water for Injection) e fer vi dos at a com ple ta dis so lu o. Em segui da, os bales pre pa ra dos foram colo ca dos em auto cla ve pre via men te vali da da para este ri li za o. O ciclo de auto cla va o con sis tiu de trs fases: pr aque ci men to, tem po neces s rio para a cma ra toda atin gir 121C; Exposio ou Esterilizao, trin ta minu tos a 121C e 15 libras de pres so; e res fria men to, tem po para que da de pres so e dimi nui o da tem pe ra tu ra. As amos tra gens de par t cu las vi veis foram deter mi na das tan to em amos tra gens de ar como de super f cies repre sen ta ti vas de equi pa men tos e piso. Para as amos tra gens de ar foi uti li za do amos tra dor de im pac to mode lo SAS Super 90 PBI. Este equi pa men to pro mo ve suc o de dis tin tos volu mes de ar, ten do sido esco lhi dos os volu mes de 1000 litros de ar para amos tra gens nas posi es den tro dos flu xos lami na res ( rea A)5 e 500 litros de ar pa ra amos tra gens nas posi es res tan tes ( reas B, C e D)5. A ope ra o con sis tiu em inser o de pla cas Rodac indi vi dual men te no equi pa men to e pos te rior suc o de dis tin tos volu mes de ar de acor do com a clas si fi ca o das reas lim pas con ten do os pon tos (o ar suc cio na do impac ta na super f cie des ta pla ca con ten do meio de cul tu ra gar Casena Soja). Em se gui da, as pla cas Rodac foram reti ra das e incu ba das, se guin do-se con ta gem das col nias ( UFC). Esta ope ra o foi rea li za da pa ra ca da pon to de amos tra gem na fase em ope ra o ou dyna mic. A amos tra gem de par t cu las vi veis de super f cies foi rea li za da empre gan do pla cas de con ta to (Rodac) con ten do meio de cul tu ra, para o con ta to com a super f cie a ser amos tra da, por um pero do de tem po de apro xi ma da men te 5 segun dos sob leve pres so. Aps o pero do de incu ba o pro ce deu-se a con ta gem das col nias ( UFC). A iden ti fi ca o dos micror ga nis mos obti dos na amos tra gem de con ta mi nan tes de ar e de super f cies foi efe tua da empre gan do equi pa men to BioMeriux Vitek, que con sis te em um sis te ma auto ma ti za do empre ga do na iden ti fi ca o de bac t rias e fun gos. As uni da des de lei tu ra so conhe ci das como car tes, cujas res pos tas bio qu mi cas per mi ti ro lei tu ras espe c fi cas em varia es colo ri m tri cas e de tur bi dez. - car tes Vitek : GNI - iden ti fi ca o de Gram nega ti vos GPI iden ti fi ca o de Gram posi ti vos YBC iden ti fi ca o de leve du ras Empregou-se ain da, na iden ti fi ca o dos microrganismos con ta mi nan tes, con tro les posi ti vos que con sis ti ram de cepas de bac t rias e fun gos, com ATCC (American Type Culture Collection) conhe ci do para refe rn cia.

3. Resultados e discusso
A con ta mi na o micro bia na que venha poten cial men te a ocor rer num pro ces so assp ti co con ven cio nal fun o de mui tas vari veis envol vi das no pro ces so de enva se do pro du to: pla ne ja men to da rea de enchi men to, velo ci da de do ar, pro ce di men to de sani ti za o, nme ro de par t cu las no vi veis e vi veis, este ri li za o do equi pa men to, este ri li za o do pro du to, tama nho de aber tu ra do fras co para acon di cio na men to, tem po que o fras co per ma ne ce expos to ao ambien te, trei na men to do pes soal em tc ni cas assp ti cas 1,6. Entre as poten ciais fon tes de con ta mi na o, sele cio nou-se aque las decor ren tes do ambien te pro du ti vo. Assim, pro ce deu-se a obten o de dados de par t cu las vi veis pro ve nien tes do ar (ambien te) e super f cies (Rodac), sem pre bus can do res pei tar o melhor pos s vel as loca li za es geo gr fi cas. Os fato res de varia o con si de ra dos no estu do foram: Classe: locais com dis tin tas exi gn cias de qua li da de ambien tal, con for me cri t rios do Federal Standard 209E2, IEST4 e o United States Departament of Health and Human Sevices5. A clas si fi ca o rea li za da em fun o do nme ro vi veis no ar e Rodac . Cada clas se foi repre sen ta da por dis tin tas salas e cada sala por dis tin tos pon tos de cole ta. Momento: antes e aps sani ti za o Movimento no labo ra t rio: din mi co e em repou so.

artigo tcnico

Datas: foram rea li za das cole tas em diver sas datas Os resul ta dos obti dos nes te tra ba lho cor res pon dem aos momen tos da qua li fi ca o e cer ti fi ca o das salas lim pas, e tam bm pos te rior moni to ra men to de roti na. Embora o tra ba lho tenha con tem pla do qua tro momen tos, sen do res pec ti va men te Qualificao 1, Rotina 1, Quali fica o 2 e Rotina 2, em decor rn cia da ausn cia de dados de par t cu las vi veis e de pou cos dados de par t cu las no vi veis no momen to deno mi na do Qualificao 1, a an li se esta ts ti ca no abran geu os resul ta dos gera dos nes te momen to. A ava lia o esta ts ti ca dos resul ta dos foi efe tua da, para a ra cio na li za o do tra ba lho, em seg men tos dis tin tos, sen do que o pri mei ro con sis tiu em ava liar os resul ta dos pro ve nien tes do momen to Rotina 1; a seguir, pro ce deu-se a ava lia o dos resul ta dos gera dos no momen to Qualificao 2, ento a ava lia o dos resul ta dos pro ve nien tes do momen to Rotina 2 e, por fim um estu do dos microrganismos pre sen tes por clas se de sala lim pa. Os resul ta dos de con ta mi na o obti dos aps sani ti za o devem ser ana li sa dos ten do em men te tan to o efei to dos sa ni ti zan tes empre ga dos (per xi do de hidro g nio 4%, lcool iso pro p li co 70% e LPH-SE 0,4% (solu o de ci dos fen li cos), assim como a pos si bi li da de de cepas resis ten tes aos mes mos 3. Tendo em vis ta a impor tn cia do conhe ci men to qua li ta ti vo do Bioburden ambien tal e pro je es rela ti vas a con ser van tes empre ga dos na for mu la o far ma ceu ti ca8, impor tan te salien tar que no pre sen te tra ba lho foram detec ta dos con ta mi nan tes do gne ro Staphylococcus e Pseudomonas, embo ra o lti mo no se loca li ze entre os que foram iso la dos com maior fre qn cia. Ao se ava liar as bac t rias obti das nas amos tra gens efe tua das no pre sen te tra ba lho, deve-se con si de rar que 49 (11,8%) foram bac t rias Gram nega ti vas, geral men te todas sus cep t veis desi dra ta o7. As deter mi na es das tabelas I e II foram rea li za das em 103 pon tos clas se B, 7 pon tos clas se C e 103 pon tos clas se D. As por cen ta gens da tabela I foram cal cu la das em fun o do total de pon tos em que foi obser va do algum micror ga nis mo, enquan to que as por cen ta gens da tabela II foram cal cu la das em fun o do total de pon tos ins pe cio na dos para cada clas se. As por cen ta gens das tabelas I e II foram repre sen ta das nas figuras 1 e 2. Os micror ga nis mos mais comuns foram: Bacillus sp, Staphylococcus sp, Corynebacterium sp e Staphylococcus hae moly ti cus. No total estes qua tro micror ga nis mos esti ve ram pre sen tes em apro xi ma da men te 80% das deter mi na es. Pela tabela II e figura 2 obser va-se que todos os mi cror ga nis mos encon tram-se apro xi ma da men te na mes ma pro por o em todas as clas ses (B, C e D). impor tan te res sal

ar t que um con sis ten te pro gra ma de con tro le ambien tal ( reas e pes soal), alia do a robus to pro gra ma de sani ti za o das reas atuam dire ta men te na migra o de micror ga nis
TABELA I Microrganismos presentes nos pontos estudados por tipo e ordem de importncia

Tipo Bacilo G+ Staphylococcus sp Coco G+ Corynebacterium sp Bacilo G+ Staphylococcus hae moly ti cus Coco G+ Staphylococcus xylo sus Coco G+ Alcaligenes xilo so xi dans Bacilo G- Flavobacterium sp Bacilo G- Flavobacterium bre ve Bacilo G- Enterococcus cas se li fla vus Coco G+ Pseudomonas stut ze ri Bacilo G- Pseudomonas sp Bacilo G- Staphylococcus auri cu la ris Coco G+ Micrococcus luteus Coco G+ Staphylococcus epi der mi dis Coco G+ Comamonas aci do vo rans Bacilo G- Staphylococcus coh ni Coco G+ Stenotrophomonas mal to phi lia 1 0.24% Total

Microrganismo Bacillus sp

n % 119 28.67% 93 22.41% 70 16.87% 46 11.08% 15 3.61% 14 3.37% 11 2.65% 9 2.17% 7 1.69% 6 1.45% 5 1.20% 5 1.20% 4 0.96% 4 0.96% 3 0.72% 3 0.72% Bacilo G- 415 100%

TABELA II Microrganismos presentes nos pontos estudados por classe e por ordem de importncia

Microrganismo Bacillus sp

B 60% Staphylococcus sp 35% Corynebacterium sp 31% Staphylococcus hae moly ti cus 21% Staphylococcus xylo sus 4% Alcaligenes xilo so xi dans 1% Flavobacterium sp 8% Flavobacterium bre ve 5% Enterococcus cas se li fla vus 1% Pseudomonas stut ze ri 1% Staphylococcus auri cu la ris 1% Pseudomonas sp 4% Staphylococcus epi der mi dis 4% Micrococcus luteus 0% Staphylococcus coh ni 0% Comamonas aci do vo rans 0% Stenotrophomonas mal to phi lia 1%

C 43% 43% 71% 29% 0% 0% 0% 0% 0% 14% 0% 0% 0% 14% 0% 14% 0%

D 52% 52% 32% 21% 11% 13% 3% 4% 6% 4% 4% 1% 0% 3% 3% 2% 0%

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mos de reas adja cen tes e de supor te para reas cr ti cas de enva se assp ti co.

4. Concluso
1 Em rela o a iden ti fi ca o micro bia na, os micror ganismos mais fre quen tes foram Bacillus sp, Staphylococcus sp e Corynebacterium sp (tabela I). 2Observou-se cons tn cia na pre va ln cia de cepas micro bia nas iden ti fi ca das nas dife ren tes clas ses de ambien tes B, C e D (tabela II, figura 2).

5. Referncias Bibliogrficas
1. ASEP TIC pro ces sing and ter mi nal ste ri li za tion. J. Parenter. Sci. Technol., Philadelphia, v.45, n.6, p.254-258, 1991. 2. INS TI TU TE of Environmental Sciences. Federal stan dard 209 E: air bor ne par ti cu la te clean li ness in clean rooms and clean zones, Mount Prospect: IES, 1992. 48p. 3. FRIE BEN, W.R. Control of the asep tic pro ces sing envi ron ment. Am. J. Hosp. Pharm., Washington, v.40, p.1928-1935, 1983. 4. INS TI TU TE of Environmental Sciences and Technology, IEST- RPCC-0062: tes ting clean rooms, Mount Prospect: IES, 1992. 35p. 5. UNI TED STA TES Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research. Guideline on Sterile Drug Products Produced by Asseptic Processing: Topic 3: Environmental Monitoring. IN: _____. Guidance for Industry. Rocksville: the United Pharmacopeial Convention, p. 535-599, 2002. ( PDA/ USP Joint Conference on Sterile Products Manufacturing, May 2002). 6. UNI TED STA TES PHAR MA CO PEIA. 25ed. Rockville; United States Pharmacopeial Convention, 2002. <1116>. 7. WHYTE, W., NIVEN, L. Airborne bac te ria sam pling: the effect of dehy dra tion and sam pling time. J. Parenter. Sci. Technol., Philadelphia, v.40, n.5, p.182-187, 1986. 8. WHYTE, W., NIVEN, L., BELL, N.D. Microbial growth in small volu me phar ma ceu ti cals. J. Parenter. Sci. Technol., Philadelphia, v.43, n.5, p.208-212, 1989. Nota: Os dados expe ri men tais aqui apre sen ta dos foram cole ta dos no 1 semes tre de 2001, estan do por tan to em con for mi da de com o pero do em vigor da nor ma US Federal Standard 209E , a qual foi can ce la da em novem bro de 2001, sen do subs ti tu da pelas nor mas da ISO ( ISO 14644 Part 1 e Part 2) vide publi ca o da revis ta da SBCC ( nov/ dez 2001).

FIGURA 1 Freqncia dos microrganismos encontrados nas amostragens coletadas.

FIGURA 2 Frequncia dos microrganismos encontrados distribudos nas classes B, C e D.

AGRA DE CI MEN TOS : Eli Lilly do Brasil LTDA

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