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LISTA DE FIGURAS

F 1 - Etapa de um processo genrico de purificao de biomolculas........................................3 F 2 Mercado mundial de membranas: e oluo das endas de membrana e m!dulos" por tipo de processo...........................................................................................................................# F 3 $i%metro de poros de membranas de MF" &F" 'F e ()..................................................* F # Filtro rotati o a +cuo........................................................................................................, F - Filtrao con encional .dead and filtration/ e a filtrao em flu0o cru1ado ou filtrao tangencial (cross flow filtration/................................................................................................., F * $ois tipos b+sicos de centr2fugas: centr2fuga de discos .a/ e centr2fuga tubular .b/.........3 F , - 4epresentao es5uem+tica dos diferentes tipos de cromatografia..................................16

SUMRIO

1 )'74($&89(.....................................................................................................................3 2 $E:E';(';)ME'7(.......................................................................................................# 2.1 <):7=4)>( $( 7EM?..................................................................................................# 2.2 4E;):9( @)@A)(B4CF)>?.........................................................................................2.2.1 :ED?4?89( D(4 MEM@4?'?:........................................................................2.2.2 >A?4)F)>?89(......................................................................................................* 2.2.3 4(MD)ME'7( >EA&A?4.....................................................................................3 2.2.# D&4)F)>?89( $E @?)E? 4E:(A&89(...........................................................F 2.2.- D&4)F)>?89( $E ?A7? 4E:(A&89(............................................................16 2.2.* 74?7?ME'7(: F)'?):......................................................................................11 2.3 >(MDE7G'>)?: $( E'BE'<E)4( @)(H&IM)>(...............................................12 3 >('>A&:9(.......................................................................................................................12 # 4EFE4G'>)?:.....................................................................................................................1#

1 INTRODUO

Drocessos biotecnol!gicos so reali1ados em etapas. $e modo amplo podemos citar os processos de preparao do in!culo com o meio de cultura" a biorreao e em seguida a recuperao e purificao dos produtos obtidos .downstream/. Esta Jltima etapa comple0a 5uando no processo est+ sendo utili1ado clulas microbianas ou clulas animais" de ido as ariadas caracter2sticas dos meios e das biomolculas de interesse" se tornando to ou mais desafiante 5ue o estudo e o desen ol imento da etapa de culti o" pois no K+ processos de purificao de aplicao geral. ? recuperao e purificao dos bioprodutos podem cKegar a representar 36L do alor agregado ao produto final e so reali1adas atra s de di ersas tcnicas de operaMes unit+rias" mas a reali1ao de cada etapa no compreende necessariamente na aplicao de uma Jnica operao unit+ria. Ela reali1ada fracionando-se o produto da reao" baseando-se nas propriedades f2sico-5u2micas do produto al o" subproduto e impure1as. ? etapa de downstream pode ser di idida em 5uatros etapas principais: clarificao" purificao de bai0a resoluo" purificao de alta resoluo e tratamentos finais. Dara produtos intracelulares necess+rio efetuar a etapa de rompimento celular em seguida da clarificao. ? Figura 1 apresenta um flu0ograma de um processo genrico de purificao de biomolculas.

Figura 1 - Etapa de um processo genrico de purificao de biomolculas.

2 DESENVOLVIMENTO 2.1 HISTRICO DO TEMA

?s indJstrias 5u2mica e bio5u2mica so" fundamentalmente" indJstrias de transformao. Dara se cKegar aos produtos finais" com as especificaMes deseNadas" necess+rio separar" concentrar e purificar as espcies presentes nas diferentes correntes resultantes dessas transformaMes. Este" sem dJ ida" tem sido um dos maiores desafios da indJstria" desde seus prim!rdios. ? partir do final da dcada de 1F*6" alm de processos cl+ssicos de separao" como destilao" filtrao" absoro" troca-iOnica" centrifugao" e0trao por sol ente" cristali1ao e outros" surgiu uma no a classe de processos 5ue usa membranas como barreira seleti a. Esse tipo de processo re5uer pouca energia" no outra a ra1o pela 5ual o desen ol imento desses processos coincide com a crise energtica da dcada de 1F,6" atribu2do ao ele ado preo do petr!leo na poca. $o final da dcada de 1F*6" 5uando Aoeb P :ouriraNan demonstraram" pela primeira e1" a iabilidade econOmica de processos como a dessalini1ao de +guas por osmose in ersa" at os dias de KoNe o mercado de separao por membranas passou de &:Q 2 milKMesRano para cerca de &:Q #"# bilKMes em 2666" com e0pectati a de crescimento de 3 a 16L ao ano. ? Kemodi+lise o grande respons+ el pela dimenso desse mercado" a di+lise representa 5uase metade do mercado de membranas. 'a Figura 2 obser a-se como encontra a-se o mercado mundial de membranas para diferentes fins no ano de 2666.

Fonte: :tratKmann" <. .AIChE Journal" maio de 2666/. Figura 2 Mercado mundial de membranas: e oluo das endas de membrana e m!dulos" por tipo de processo.

( processo da cromatografia atribu2do a um bot%nico russo em sua e0periSncia na separao de e0tratos de folKas. ?pesar deste estudo e de outros anteriores" 5ue tambm poderiam ser considerados precursores do uso dessa tcnica" a cromatografia foi praticamente ignorada at a dcada de 36" 5uando foi redescoberta" e impulsionando seu aperfeioamento at o ele ado grau de purificao obtido atualmente com essa operao. ( primeiro processo de liofili1ao foi reali1ado em 1F11" com o 2rus da rai a. :eu uso em escala industrial foi a partir da :egunda Buerra Mundial de ido a demanda de plasma sanguineo e processamento de raMes militares" mas o maior in estimento foi durante o programa ?pollo da 'asa" cuNa tecnologia desen ol ida gerou o 5ue KoNe se denomina alimentos de con eniSncia. <oNe em dia " rotineiramente" liofili1ada uma grande ariedade de substancias" como: antibi!ticos" anticoagulantes" bactrias" 2rus" en1imas" KormOnios e fraMes do sangue.

2.2 REVISO BIBLIOGRFICA

? re iso bibliogr+fica est+ di idida em itens 5ue podem indi idualmente ou de forma combinada descre er processos utili1ados para recuperao e purificao de bioprodutos.

2.2.1 SEPARAO POR MEMBRANAS

?lgumas operaMes unit+rias 5ue podem ser utili1adas so reali1adas atra s do processo de separao por membranas. &ma membrana pode ser definida como uma barreira 5ue separa duas fases e restringe" total ou parcialmente" o transporte de uma ou de +rias espcies 5u2micas presentes nas fases. Esta Jtil na separao de produtos em concentraMes muito bai0as e na obteno de uma melKor eficiSncia dos processos bio5u2micos. ? grande antagem dessa no a concepo 5ue a reao e a separao ocorrem simultaneamente e" se poss2 el" em um mesmo e5uipamento. ?lm disso" as clulas e biocatalisadores podem ser mantidos no sistema. &m e0emplo seria o processo com membrana cKamado per aporao" usado na produo de um bioproduto ol+til como no etanol ou aromas" em 5ue esses dois inibem a ati idade celular. ? remoo cont2nua destes apresenta a antagem adicional de manter suas concentraMes em n2 eis mais bai0os" aumentando a eficiSncia do processo. ( tamanKo do poro define" em princ2pio" a capacidade seleti a da membrana.Figura 3/

Figura 3 $i%metro de poros de membranas de MF" &F" 'F e ().

2.2.2 CLARIFICAO

? primeira etapa a clarificao" onde ocorre a separao das clulas e seus fragmentos do meio de culti o. ( meio resultante" isento de clulas" denominado clarificado ou filtrado. Essa operao assim denominada pois a remoo dos s!lidos suspensos " constitu2dos sobretudo por clulas 2ntegras e seus fragmentos" resulta na reduo da turbide1 do meio.?lgumas operaMes unit+rias de clarificao so: filtrao con encional" filtrao tangencial e centrifugao. ? filtrao con encional aplica-se T clarificao de grandes olumes de suspensMes dilu2das de clulas" da ordem de milKares de litros" produtos e0tracelulares e situaMes nas 5uais a assepsia no necess+ria. 7em como princ2pio o tamanKo das part2culas. ( processo de filtrao descrito pela lei de $arcU" a 5ual relaciona a elocidade do l25uido 5ue permeia o meio filtrante com a diferena de presso resultante do referido flu0o. ( e5uipamento com mais fre5VSncia na clarificao de grandes olumes de suspensMes microbianas o filtro rotati o a +cuo" demonstrada na Figura #.

Figura # Filtro rotati o a +cuo.

? filtrao tangencial um processo utili1ando membranas. $iferentemente da filtrao con encional onde a soluo ou suspenso pressionada contra membrana" na tangencial ela escoa em paralelo T superf2cie da membrana" mantendo assim um flu0o constante de filtrao. )sso de ido a polari1ao da concentrao" acumulo de soluto na membrana semi-permea el" estar minimi1ada nesse tipo de filtrao. ? Figura - apresenta uma comparao e representao dos dois tipos de filtrao citados.

Figura - Filtrao con encional .dead and filtration/ e a filtrao em flu0o cru1ado ou filtrao tangencial (cross flow filtration/. ? centrifugao compreende a acelerao da sedimentao de clulas em suspenso em um meio l25uido. ? induo da agregao das clulas microbianas com base nas caracter2sticas iOnicas da superf2cie aumenta a dimenso e a densidade dos s!lidos suspensos" o 5ue resulta maior elocidade de centrifugao. E0istem dois modelos b+sicos de centrifugas" a centrifuga de discos .Figura *a/ e a tubular .Figura *b/.

Figura * $ois tipos b+sicos de centr2fugas: centr2fuga de discos .a/ e centr2fuga tubular .b/.

2.2.3 ROMPIMENTO CELULAR

( rompimento celular ocorre ap!s a etapa de separao e la agem .clarificao/ da clulas obtidas ao final do culti o. (s critrios utili1ados para a seleo da tcnica de rompimento celular de em considerar alguns fatores" como: tamanKo da clula" toler%ncia a tensMes de cisalKamento" necessidade de controle de temperatura" tempo de operao" rendimento do processo " gasto de energia" custo e capital de in estimento. 4eali1ando esse processo" K+ a liberao da molcula al o de dentro da clula" mas tambm a liberao de di ersas outras molculas. >omo conse5uSncia" ocorre aumento da iscosidade do meio como resultado da liberao de nucleot2dios e a molcula-al o liberada com todas as outras molculas intracelulares" o 5ue amplia a di ersidade de contaminantes. <+ 5uatro classes de di iso nesse processo" eles so: mec%nicos" no-mec%nicos" 5u2micos e en1im+ticos. ( rompimento mec%nico pode ser feito atra s de: Komogeni1ador de alta presso" 5ue utili1ando alta presso fora o impacto das clulasW moinKo de bolas" 5ue atra s de uma rotao Nunto com esferas de idro causa o cisalKamento das clulasW e ultra-som" 5ue atra s do uso de ondas sonoras causa ibraMes no l25uido" gerando bolKas pe5uenas 5ue entrarem em colapso geram cKo5ues no meio e conse5uentemente rompimento celular. ( rompimento no-mec%nico isa o no rompimento completo da membrana celular" criando uma membrana semi-permea el" assim impede a contaminao do meio com inJmeras molculas intracelulares 5ue no so a molcula-al o. ?lguns tipos so: cKo5ue osm!tico" utili1ando soluo de sacarose e resfriamentoW congelamentoRdescongelamento" 5ue pode causar total rompimento ou lesionar a membranaW e term!lise" 5ue utili1ando o a5uecimento se torna um processo simples e mais ade5uado T larga escala.

( rompimento 5u2mico utili1a: adio de +lcalisW adio de detergentesW adio de sol entes. Dodendo tambm utili1ar a adio de en1imas" capa1es de Kidrolisar paredes celulares" processo i+ el para clulas sens2 eis T temperatura" T tenso de cisalKamento ou pressMes.

2.2.4 PURIFICAO DE BAIXA RESOLUO

? etapa de purificao de bai0a resoluo eRou concentrao compreendem a separao da molcula-al o de outras 5ue possuam caracter2sticas f2sico-5u2micas significati amente distintas. ?lgumas operaMes unit+rias dessa etapa so: precipitao" ultrafiltrao e e0trao em sistemas de duas fases l25uidas. ? precipitao uma das operaMes mais adotadas" tanto em escala de laborat!rio 5uanto industrial" para a purificao de prote2nas de origem microbiana" animal ou egetal. Esse processo promo e a reduo do olume inicial da soluo aumentando a concentrao das molculas-al o" por isso i+ el antes de uma purificao de alta resoluo. Dodendo ser reali1ada com adio de sol ente org%nico na soluo. ? ultrafiltrao um processo de separao por membranas 5ue consiste no transporte de soluMes atra s de membranas com poros de di%metros de 1 a -66 nm utili1ando como fora motri1 a diferena de presso. X utili1ada para concentrar molculas como prote2nas e polissacar2deos. $e ido a no uniformidade da distribuio do tamanKo dos poros na membrana o torna um processo de bai0a resoluo. ? e0trao l25uido-l25uido em sistemas de duas fases a5uosas" sendo uma delas um sol ente" utili1ada na purificao de antibi!ticos" +cidos org%nicos e de prote2nas. ? separao entre a molcula a ser purificada e os contaminantes decorre das diferentes solubilidades apresentadas por esses solutos" em cada uma das fases a5uosas. ? repetida aplicao da e0trao por esse processo um recurso igoroso na purificao de prote2nas. ? aplicao em larga escala obtida mantendo-se a composio e as proporMes dos olumes das fases em relao T escala de laborat!rio. :o di ersas as antagens apresentadas por esse tipo de processo: possibilidade de operao continua em larga escala T temperatura ambienteW manuteno das prote2nas utili1ando pol2meros ou saisW possibilidade de eliminao de algumas etapas do processo de purificao para molculas intracelulares.

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2.2.5 PURIFICAO DE ALTA RESOLUO

? etapa de purificao de alta resoluo consiste na separao das subst%ncias com caracter2sticas f2sico-5u2micas semelKantes. ? operao reali1ada nessa etapa a cromatografia. ? cromatografia tem como base diferentes migraMes dos compostos de uma mistura" isso ocorre de ido a diferentes interaMes entre duas fases imisc2 eis" a fase m! el e a estacion+ria. ? grande ariedade de combinaMes entre fases m! eis e estacion+rias a torna uma tcnica e0tremamente ers+til e de grande aplicao. ? eficiSncia da purificao nesta etapa pode ser a aliada de acordo com o grau de separao das molculas" o 5ual denominado resoluo cromatogr+fica. Essa operao pode ser di idida por di ersos modos de classificao" alguns deles so: pela forma f2sica do sistema cromatogr+fico.Figura ,/" pela fase m! el empregada" pela fase estacion+ria utili1ada e pelo modo de separao" 5ue consiste nos mtodos de adsoro" partio" troca iOnica" e0cluso ou misturas desses mecanismos.

Figura , - 4epresentao es5uem+tica dos diferentes tipos de cromatografia. ( termo cromatografia em de um estudo feito por um russo o 5ual essa tcnica atribu2da. 'esse estudo" foi adicionado ter de petr!leo" considerado a fase m! el" em uma coluna de idro preencKida com carbonato de c+lcio" considerado a fase estacion+ria" le ando T separao dos componentes em fai0as coloridas. Este pro a elmente o moti o pelo 5ual a tcnica conKecida como cromatografia .chrom Y cor e graphie Y escrita/" podendo le ar T errOnea idia de 5ue o processo seNa dependente da cor. Dara os processos de purificao dado Snfase na cromatografia l25uida e gasosa. (s processos industrialmente comuns de cromatografia so: por e0cluso molecular" baseia-se na separao de molculas em funo da massa molar eRou do olume efeti o em soluoW por adsoro de diferentes molculas sobre a matri1W dessoro seleti a" separando as molculas a

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partir de suas caracter2sticas" por mtodos de troca-iOnica" interao Kidrof!bica" afinidade e imunoafinidade.

2.2. TRATAMENTOS FINAIS

(s tratamentos finais dependem do seu fim para comerciali1ao" ou seNa" se deseNado um alto grau de pure1a sero empregados condicionamentos finais ao produto. 'o caso de produtos farmacSuticos essa etapa necess+ria pois esses de em estar puros" secos" cristalinos ou amorfos. Dor tanto" de em ser submetidos a alguns tratamentos finais como a cristali1ao ou a liofili1ao. ? liofili1ao um mtodo de secagem e0tremamente Jtil para a conser ao de materiais biol!gicos" microrganismos e medicamentos. Esse o melKor mtodo para obteno de produtos desidratados de alta 5ualidade e importante no caso de materiais em 5ue se pretenda e itar a perda de substancias ol+teis" ati idade biol!gica ou outra ati idade" pois modificaMes f2sico-5u2micas so inibidas. Ela isa a remoo do sol ente" a partir do ida de processo de congelamento e em seguida sublimao. Drodutos com esse condicionamento possuem boa estabilidade durante o arma1enamento resultando longo tempo de prateleira. ? cristali1ao uma operao de separao onde" partindo de uma mistura KomogSnea super saturada se obtm cristais de um dos componentes da mistura com 166L de pure1a" mas dependendo das condiMes operat!rias podem-se erificar impure1as de grande afinidade com o soluto. 'esse processo criam-se condiMes termodin%micas 5ue le am as molculas a apro0imarem-se e a agruparem-se em estruturas altamente organi1adas" os cristais" sendo assim necess+rio conKecimento das relaMes de e5uil2brio entre fases .l25uidoRs!lido/. Essa tcnica comum na purificao de prote2nas" particularmente as en1imas" e de grande import%ncia" pois permite a estocagem est+ el de bioprodutos" a partir da imobili1ao das molculas. ?p!s a cristali1ao" o produto pode ser recuperado por filtrao ou centrifugao seguido de secagem.

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2.3 COMPETENCIAS DO ENGENHEIRO BIO!UIMICO

( EngenKeiro @io5u2mico respons+ el pela an+lise do processo biotecnol!gico a ser reali1ado" desen ol endo assim um plano de operaMes a serem reali1adas isando T melKor relao custo-benef2cio" ou seNa" com um menor alor agregado" utili1ando menos etapas no processo" e com maior pure1a do produto final. 4espons+ el pela reali1ao e controle de todas as etapas do processo" no apenas da etapa de purificao" tambm fica a cargo desse profissional o poss2 el aperfeioamento das tcnicas aplicadas e transposio do processo de uma escala de laborat!rio para uma escala industrial. Dor e0emplo" a ampliao de escala cromatogr+fica de e manter os mesmos graus de pure1a" rendimento" ati idade biol!gica e produti idade da escala inicialmente estudada.

3 CONCLUSO

Dodemos obser ar 5ue os mtodos utili1ados nos diferentes processos dependem do n2 el deseNado de grau de pure1a do produto" sendo assim" produtos para fins terapSuticos so" ob iamente" os 5ue re5uerem maior n2 el de pure1a e" portanto" a comple0idade do processo de purificao ele ada. ?tra s de an+lises em cada etapa do processo de purificao se determina a porcentagem de recuperao" o grau de purificao da molcula al o e caracter2sticas do produto e das principais impure1as. Essas informaMes sero utili1adas para determinar as pr!0imas operaMes unit+rias a serem reali1adas. $eterminando-se a capacidade biol!gica da molcula considerada" e associada aos porcentagem recuperada. 7endo em ista 5ue a cada operao unit+ria o rendimento final do produto ser+ menor" sendo assim" K+ a iabilidade em se desen ol er processos 5ue utili1em um nJmero menor de etapas. Dor e0emplo" se a cada operao unit+ria o rendimento em produto for de F6L" a aplicao de no e operaMes le ar+ a um rendimento final de cerca de apenas #6L. ?lgumas soluMes so conKecidas para se poder redu1ir o nJmero de etapas do processo. >ombinando finalidades diferentes em uma Jnica etapa de operao" por e0emplo" clarificando" concentrando e pr-purificando simultaneamente pela e0trao em sistemas de duas fases a5uosas. ? aplicao das etapas cromatogr+ficas em ordem otimi1ada tambm olumes en ol idos" permite-se determinar a

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contribui para a reduo de etapas e perdas no processo. ModificaMes genticas no desen ol imento do microorganismo com o obNeti o de aumentar a resoluo na purificao" integrando totalmente as etapas de desen ol imento do processo. 'os processos cromatogr+ficos seria ideal alcanar a purificao em uma Jnica etapa" e itando perdas do produto" mas a aplicao de mais de uma etapa de cromatografia pode ser necess+ria e eficiente" pois ir+ ocorrer a separao por espec2ficas propriedades das molculas eliminando di ersas impure1as por mtodos distintos. Em resumo" pode-se di1er 5ue o sucesso tcnico e econOmico do processo est+ relacionado T seleo ade5uada das tcnicas e da ordem de aplicao das mesmas. ?s seguintes regras gerais podem ser consideradas para a abordagem inicial do problema: escolKa de processos de purificao baseados nas diferenas apresentadas em uma dada propriedade f2sico-5u2mica das molculas .produto e impure1as/W remoo das impure1as presentes em maior concentrao nas etapas iniciais do processoW aplicao de tcnicas de alta resoluo em relao ao tipo de produto" nas etapas finais do processo.

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4 REFER"NCIAS

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