02/09/2013

Fundamentos de Espectrometria de Massas

Tcnicas Hifenadas GC/MS
Jose L. Paz J. jlpazj@iqm.unicamp.br

Cromatografia a gs acoplada espectrometria de massas (GC/EM)

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Introduo
Quais so as aplicaes tpicas para GC/MS? Quais so os principais componentes de um GC/MS? Quais so os tipos de analisadores de massas usados em GC/MS? Como o espectro de massas de um composto definido e como o espectro de massas pode auxiliar na identificao de um composto? Que tipos de software so usados para GC / MS?

Introduo
O primeiro acoplamento foi implementada na dcada de 1950 (by Roland Gohlke and McLafferty) Considerado como a combinao perfeita em testes de identificao final para muitas aplicaes diferentesaplicaes, p. ex., forenses. Usado para identificar positivamente e quantificar uma substncia especfica em uma amostra, com base na informao, cientificamente comprovado de seu espectro de massa. Novas tecnologias geram equipamentos cada vez mais robustos e com mais ferramentas para aquisio e tratamento de dados.

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Introduo
GC/MS um sistema hifenado que combina a a fora de separao do GC com a capacidade de identificao e quantificao do MS.
Cromatografia gasosa (GC) Tcnica analtica muito poderosa para a separao eficiente e anlise de amostras complexas produzindo, e Espectrometria de Massas (MS) Usada para identificar e quantificar compostos em numerosos e variados segmentos industriais.

Introduo

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Introduo
Resposta do Sinal

Sensibilidade Faixa Dinamica Linearidade

Velocidade da Separao Capacidade de Pico

Espectro de Massas (MS)

Preciso de Massa Poder de Resoluo Velocidade de Aquisio

Introduo
Especialmente eficiente para a identificao e quantificao de misturas complexas de compostos orgnicos volteis e semi-volteis. Exemplos de aplicao incluem:
Deteco de pesticidas em alimentos, ar, gua e anlise do solo, Controle de dopagem em competies de atletismo, e Anlise dos insumos qumicos usados na produo de produtos farmacuticos e medicamentos.

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Instrumentao GC/MS
Componentes e operao

Componentes do sistema
CL CE Seringa Bomba APCI APPI ESI DESI DART MALDI FAB B LIT Tof Orbitrap FT ICR Eletromultiplicadora MCP

Presso atmosfrica

Sistema de insero

Fonte de ons

Analisador de ons

Detector

Sistema de dados

Vcuo

Vcuo 10-5 10-8 torr

Insero direta CG

EI CI

Q IT (3D)

Fotomultiplicadora Eletromultiplicadora

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Configuraes de equipamentos

Alguns GC/MS comerciais

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Processo GC/MS
a b c b c a

Instrumentao GC
Componentes e operao

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GC Componentes
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Gs de arraste (Reservatrio). Regulador de presso. Reguladores de vazo. Injetor (flash vaporization). Forno. Coluna cromatogrfica. Detector Amplificador de sinal. 8. Registro de sinal converso analgico digital (dados).

Fig 3. Componentes do cromatografo

GC Gs de arraste
A fase mvel um gs inerte, no reage e no interage com os componentes da amostra nem com a fase estacionria, atua apenas como transportador atravs da coluna (gs de arraste). Gs de arraste de alta pureza 99,9995 (grau analtico 5.0) e deve ser compatvel com o detector empregado.
Hlio MS, TCD. Argnio ECD. Hidrognio FID, TCD. Oxignio ou ar sinttico - FID. Nitrognio FID, ECD.

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GC Filtro de gases
Para eliminar impurezas que possam contaminar a amostra ou gerar rudo no sinal Impurezas freqentes;
Umidade Nitrognio Oxignio Argnio Dixido de carbono Hidrocarbonetos

Fig 4. Montagem de filtros de gases

GC Presso e Vazo
Controladores de presso
Presso na porta de injeo para manter as vazes constantes, e reprodutveis.

Controladores de vazo.
Vazo na coluna (mL min -1). Diviso de amostra (mL min -1) Purga de septo (mL min -1) Vazo no detector (mL min -1)

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GC Injetores
Portas de injeo de amostra com controle preciso de temperatura Podem ser do tipo
Split/Splitless Empacotada Cold On column PTV

Temperatura deve ser ajustada de 30 a 50oC acima do ponto de ebulio do componente menos voltil.

GC Tipo de injetores

Fig 5. Tipos de injetores comuns em cromatografos

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GC Caractersticas da amostra
Aplica-se para a separao e anlise de misturas cujos constituintes tenham pontos de ebulio < 300oC A amostra e/ou seus componentes devem ser volteis e termicamente estveis!!! Alternativa, promover sua volatilidade atravs de reaes qumicas - derivatizao

GC Caractersticas da amostra
Volatilidade dos componentes ou a presso de vapor da amostra analisada depende de:
Massa molecular dos analitos. Natureza qumica dos analitos (grupos funcionais).
Foras de disperso de London. Interaes dipolo-dipolo. Interaes ponte de hidrognio.

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GC Forno
Uma das componente crticas do GC, deve ter uma dinmica de aquecimento/esfriamento rpida. O forno pode ser operado durante a separao de duas maneiras :
Temperatura constante mtodo isotrmico Temperatura variada linearmente mtodo de temperatura programada.

GC Principio bsico
pigmentos separados

Fig 2. Processo de eluio atravs de um sistema cromatogrfico

Separao de misturas por interao diferencial dos seus componentes entre uma fase estacionria (slido ou lquido ) e uma fase mvel (gs).

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GC Separao x temperatura

Fig 6. Cromatograma da separao de uma mistura de hidrocarbonetos (C6 C21) a temperatura constante

GC Separao x temperatura

Fig 7. Cromatograma da separao de uma mistura de hidrocarbonetos (C6 C21) com temperatura programada.

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GC Colunas
Colunas empacotadas.
Recheados com a fase estacionria, Dimetro () de 3 a 6 mm Comprimento (L) de 0,5 m a 5 m Aplicaes na separao de gases, solvente e misturas pouco complexas Recobertas com a fase estacionria. Dimetro () de 0,1 a 0,5 mm Comprimento (L) de 5 m a 100 m Alta resoluo e muito eficiente na separao de misturas complexas.

Colunas capilares

GC Colunas
Existem colunas capilares com uma variedade de fases estacionrias, Slida ou lquida? As fases estacionrias devem ter as seguintes caractersticas;
Caractersticas semelhantes a dos compostos a serem separados Inerte em relao amostra Baixssima volatilidade Estabilidade trmica Baixa viscosidade

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GC Colunas
As fases estacionrias so diferenciadas pela sua polaridade
No-polares; Polmeros a base de alquilsiloxanos
Mecanismo de separao presso de vapor.

Polaridade intermediaria Fortemente Polar: Polmeros a base de etileno glicol

Mecanismo de separao Alem da presso de vapor dos compostos atuam tambm interaes do tipo ligao de hidrognio, dipolo-dipolo

Quirais; Polmeros de ciclodextrina, entre outras

GC Fases comuns

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GC Colunas x Seleo
Em geral, a seleo da coluna depende da compatibilidade da polaridade entre a fase estacionria e os analitos alvos constituintes da amostra Analitos polares requerem fases estacionrias polares e vice-versa Quando se tem uma mistura de analitos no-polares e polares, como escolher uma uma coluna boa. A coluna de uso geral, ou de partida, a coluna de fase quimicamente ligada (5% dimetil 95% difenil polisiloxano

GC Interface
O desafio na interface de um MS com um GC a manuteno da presso de vcuo necessria no MS, introduzindo um fluxo de gs do cromatgrafo. Historicamente, as interfaces de GC / MS eram dispositivos de restrio ou reduo do fluxo de gs para dentro do MS.

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GC Interface
No entanto, para fluxos baixos de gs, 1 mL / min, tpicos de GC capilar possvel a conexo direta com o MS. Estas interfaces so construdas a partir de materiais inertes e so aquecidos uniformemente a fim de evitar zonas trmicas de esfriamento que inibem o fluxo de compostos de muito baixa presso de vapor para a fonte de ionizao.

Instrumentao MS
Componentes e operao

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Fonte de ons
A fonte de ons ou cmera de ionizao onde ocorre a formao de ons em fase gasosa, a partir de amostras slidas, lquidas ou gasosas, dependendo da forma de insero de amostra. A ionizao pode gerar ons positivos e/ou negativos, sendo os ons positivos predominantes. Os mtodos clssicos de ionizao, quando a insero de amostra por CG ou sonda de insero direta, so a ionizao por eltrons (EI) e a ionizao qumica (CI)

Fonte de ons
As formas principais de ionizao so:
Ejeo ou captura de eltrons comum na fonte de ons EI e CI.

Protonao ou desprotonao comum nas fontes de ons ESI, APCI, APPI e Maldi

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EM Ionizao EI
Ionizao por eltrons (EI) 10-5 mbar
Ocorre em 10-16 s Energia do feixe de eltrons 70 eV Ionizao forte das molculas Fragmentao intensa fornecendo infomaes estruturais

EM Ionizao EI
Os espectros de massas so reprodutveis em equipamentos similares Existem uma variedades de bibliotecas de espectros de massas; Wiley, Nist, entre outras

Fig 12. Numero de ons formados em funo da energia dos eltrons

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EM Ionizao CI
Ionizao qumica (CI) 10-3 mbar
Mtodo de ionizao indireta e branda Transferncia de um prton do gs reagente molcula - on molecular protonado [M-H]+ Fragmentao leve ou quase ausente, ideal para obter o on molecular

EM Mtodos de ionizao

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EM Comparao entre EI e CI
a)

b)

Fig 13. a) Fragmentao intensa no EM modo EI b) Fragmentao leve no EM modo CI

Instrumentao - Analisadores
Componentes e operao

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Analisadores de Massas
O analisador de massas separa ons de acordo com sua relao massa/carga (m/z) Os analisadores de massa mais comuns:
Setor Magntico (B) Combinaes de Setor Eltrico e Magntico Quadrupolo (Q) Iontrap (3D) Tempo de Vo (TOF) FT-ICR

Analisador B

Setor Magntico

ms_sectorfield.exe

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Analisador Q

Quadrupolo

Analisador Ion trap (3D)

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Analisador Tof (L)

Tempo de Vo Linear

Analisador Tof (V)

Tempo de Vo Angular

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Instrumentao Detectores
Detectores

Detectores
O detector tem a funo de capturar e amplificar o sinal da corrente de ons que so ejetados do analisador e transferir o sinal para o sistema de processamento de dados Os trs principais tipos de detectores so
Fotomultiplicador Multiplicador de eltrons MCP (micro-channel plate)

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Detectores
O detector depende do tipo de analisador;
Fotomultiplicador e multiplicador de eltrons so utilizados com analisadores quadrupolo, setor magntico e ion trap. Apresentam larga faixa dinmica (105 a 108) MCP utilizado com analisadores tempo de vo, apresentam respostas extremamente rpidas com alta sensibilidade

Fotomultiplicador
Dinodo de converso de alta voltagem - converte ons positivos ou negativos em eltrons, que so em seguida convertidos em ftons O fotomultiplicador selado em um envelope de vidro, e assim protegido de contaminaes, o que faz que seu tempo de vida seja mais longo Tempo estimado de vida de 10 anos, sem manuteno

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Multiplicador de eltrons
Dinodo de converso que utilizado para converter ons positivos ou negativos em eltrons. Potencias mais altos nos dinodos de converso so utilizados para acelerar ons de massa altas e assim melhorar a sensibilidade

MCP - TOF
O MCP um multiplicador de eltrons muito rpido Um nico on pode gerar 107 eltrons sendo produzidos em um perodo de 4-5 ns

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EM - Princpios bsicos
100 218 100 202 41 50 67 55 79 95 121 107 0 30 30 40 50 60 70 80 90 (ma inlib ) Pyrene, hexa d ec a hyd ro135 148 161 199 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 0 39 50 62 67 74 60 70 80 30 40 50 (ma inlib ) Pyrene 189 88 90 100 101 110 110 122 120 134 130 140 150 150 161 160 174 170 180 187 190 200 210 175 50

A espectrometria de massas estuda sistemas pela formao de ons em fase gasosa, com ou sem fragmentao, e que so caracterizados por suas relaes massa/carga (m/z) e suas abundancias relativas (Definio IUPAC)

EM Caractersticas
Sensibilidade medida da relao sinal rudo para um padro especifico Exatido e preciso na medida de massas B e Tof Resoluo unitria no caso de Q e IT Faixa dinmica 105 Linearidade curva de calibrao R2>0,99 Reprodutibilidade aps muitas injees (<5%)

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Resoluo Q e IT

Fig. 11. Resoluo de analisadores tipo Q e IT

Espectrometria de Massas
Calibrao

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EM Calibrao
O espectrmetro de massas precisa ser calibrado com o padro PFTBA (m/z 30 m/z 600);
Todas vez que desligado, seja por manuteno ou queda de energia Diariamente quando em rotina de quantificao Semanalmente quando em anlises qualitativos
m/e 69 F3C CF2 F2C CF2 N F2C CF2 F2C CF3 F2C CF3 CF2 CF2 m/e 502 m/e 219

C12F27N 671.09
Fig. 14. Fragmentos do Perfluortributilamina (PFTBA); ons monitorados m/z 69, 219 e 502 daltons

Espectrometria de Massas
Sistema de aquisio de dados

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Aquisio de dados
O espectrmetro de massas geralmente utilizado de dois modos;
Varredura completa (Full Scan). Monitoramento seletivo de ons ( SIM).

Dependendo da configurao do equipamento

faixa de massas (max.; 650, 700, 1000 daltons) velocidade de varredura (scan s -1) baixa ou alta resoluo (mais comuns Q e IT-3D, unitria).

Aquisio no modo full scan/SIM em equipamentos mais robustos e modernos

Modo Full Scan

Aquisio de dados em uma faixa de m/z prdefinida no mtodo de anlise, isto depende de:
A massa molecular dos analitos alvo do estudo, p. ex.; 35 a 500 daltons

Espectros de massas reprodutveis

Padro de fragmentao caracterstico informao estrutural Identificao de compostos desconhecidos, quando comparados com biblioteca de EM de referncia Minimiza falsos positivos

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Modo Full Scan

Ferramentas de software permitem a obteno de
Cromatogramas de ons reconstrudos (RIC) pela extrao de algum ons caracterstico do analito (Simulao do experimento SIM) Verificao de co-eluies (pureza do pico)

Anlises quantitativas
A sensibilidade do equipamento diminui a medida que a faixa de m/z for mais extensa. Aquisio de dados mais lenta, assim temos menos pontos para picos cromatogrficos

Full scan (m/z 50 350)

scan 4.7

scan 7.9

scan 10.6

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Extrao de ons RIC

Processamento de dados: Extrao do ons de m/z 78 a partir do de dados full scan

Aquisio full scan

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Espectro de Massas
Abundancia de ons (%)
100 Cl 112

50

77 114

51 0 25 32 38 43 50 53 56 60 64 60 70 75 80 84 87 90 97 100 108 110 120 130

20 30 40 (ma inlib ) Benzene, c hloro-

Relao massa/carga (m/z)

Figura 15. Espectro de massas Grfico (m/z) x Abundancia de ons (%) Unidades: Daltons (Da) = unidade de massa atmica Thomson (Th) = m/z Th = Da/z = m/z

Informaes do EM
Pico base on mais intenso (100%) Pico do on molecular (Precursor)
100 77

Br

Padro de fragmentao (ons fragmento )

50 51

156

Istopos
38 44 50 60 60 70 80 90 74 104 111 118 100 110 120 128 130 143 140 150 160 170

12

27

10 20 30 40 (ma inlib ) Benzene, b romo-

Figura 16. Componentes e informaes fornecidas pelo espectro de massas

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Istopos
100
35Cl

112

M 34,96885 (100%) 37Cl 36,96590 (31,96%)

Cl

50 114

M+2
113 0 99 105 107 108 109 110 111 109 111 113 99 101 103 (ma inlib ) Benzene, c hloro100
79Br 81Br

115 116 115 117 119 121 123

78,91833 (100%) 80,91628 (97,27%)

Br 156 158

50

M+2

141

143 148 150 152

155 154

157

159 160 162 164 166 168 170

140 142 144 146 (ma inlib ) Benzene, b romo-

156

158

Figura 16. Distribuio isotpica de halognios

Modo Full Scan

As informaes obtidas no modo de anlise full scan permitem desenvolver o experimento SIM, em geral, aplicado para quantificao.

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Modo SIM
Aquisio de dados de grupos de ons especficos caractersticos das molculas estudadas, entre elas;
on molecular (M+), on pico base, e Outros on intensos que refletem o padro de fragmentao da molcula.

A intensidade relativa destes ons deve manter o padro observado no modo de varredura completa. Monitorando-se poucos ons se ganha sensibilidade, isto , mais pontos para o pico cromatogrfico.

Aquisio SIM

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Modo SIM
Limites de deteco menores so obtidos , torna-se um mtodo de anlise quantitativo vivel a nveis de trao. Neste tipo de anlise observa-se pouca ou nenhuma interferncia da matriz, ou seja, aumento de seletividade. Quando maior sensibilidade requerida parte-se para experimentos EM/EM

SIM (m/z 145, 147, 173, 175 e 255)

Fig. 17. Cromatograma TIC X Cromatograma SIM do pesticida propizamida

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Espectrometria de Massas
Bibliotecas

Bibliotecas EM
Busca automtica em bibliotecas de espectros, baseada na comparao estatstica ( Probability Based Matching )
Espectros de analitos desconhecidos

PBM

Possveis candidatos (Confiabilidade %)

Biblioteca de espectros

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Biblioteca EM obtido
Espectros de analitos desconhecidos

Biblioteca Resultado do PBM

Biblioteca de espectros

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Biblioteca - Cuidados
Limitaes
Identificao pouco confivel de espectros muito simples, p. ex. faixa de massa selecionada Diferenas entre espectros gerados por diversos analisadores de massas (Q x IT-3D) Tamanho da base de dados

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