Cincia Tc. Vitiv. 17 (1), 15-26.

2002

DETERMINAO DO ZINCO EM VINHOS POR ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORO ATMICA COM CHAMA. VALIDAO DO MTODO DE ANLISE

DETERMINATION OF ZINC IN WINE BY FLAME ATOMIC ABSORPTION SPECTROMETRY (FAAS). VALIDATION OF THE ANALYTICAL METHOD

Sofia Catarino1,2, A.S. Curvelo-Garcia1, R. Bruno de Sousa2

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INIA. Estao Vitivincola Nacional. 2565-191 Dois Portos. Portugal. E-mail: inia.evn@oninet.pt Instituto Superior de Agronomia Departamento de Qumica Agrcola e Ambiental. Tapada da Ajuda. 1349-017 Lisboa. Portugal. E-mail: brunosousa@isa.utl.pt

(Manuscrito recebido em 27.02.02. Aceite para publicao em 21.05.02.)

RESUMO O doseamento do zinco (Zn) em vinhos justifica-se pelo seu potencial efeito txico sob o organismo humano e ainda por se encontrar na origem de acidentes de estabilidade fisicoqumica. No presente artigo, apresentada a descrio e caracterizao intralaboratorial do mtodo de determinao analtica do teor total de Zn em vinhos por espectrofotometria de absoro atmica com chama. A praticabilidade, especificidade, modelo matemtico da curva de calibrao, limites analticos, taxas de recuperao e aplicabilidade, repetibilidade e reprodutibilidade intralaboratorial, so algumas das caractersticas avaliadas, tendo sido utilizados vinhos brancos, tintos e licorosos para o seu estudo. O mtodo analtico, de elevada especificidade, permite quantificar teores superiores a 0,1 mg/L, com elevada preciso (CVr < 3,0%; CVR < 8,5%). A curva de calibrao que descreve a gama de trabalho (0 a 2 mg/L) apresenta desvio linearidade, sendo representada por um polinmio de 3 grau (y = a + bx + cx2 + dx3). As taxas de recuperao determinadas nos diversos vinhos variam entre 83,09% e 101,06%. Palavras chave: vinho, zinco, espectrofotometria de absoro atmica com chama, validao do mtodo Key words: wine, zinc, flame atomic absorption spectrometry, validation of the method

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INTRODUO O zinco, constituinte natural das uvas como resultado da sua assimilao pela videira, desempenha um papel fisiolgico no seu desenvolvimento, encontrandose na planta sob forma ligada. Para alm desta sua natureza endgena, tambm de referir, como significativa, a derivada de um enriquecimento pelo contacto com materiais base de ligas contendo Zn ou ainda a resultante de determinados tratamentos anticriptogmicos das vinhas (fungicidas de sntese contendo sais de Zn) e da utilizao de certos produtos enolgicos (Stella, 1974; Curvelo-Garcia, 1988, Fournier et al., 1998). Por um processo idntico ao que se passa com o cobre (reduzida solubilidade do sulfureto respectivo), por outro lado conhecida a eliminao natural de uma parte significativa deste metal, durante a fermentao alcolica (Iglesias e Mario, 1977, citado por Curvelo-Garcia, 1988). semelhana de outros metais, o teor total de Zn nos vinhos depende da intensidade dos fenmenos de macerao, extraco e solubilizao ocorridos durante a fermentao, j que se localiza preferencialmente nas pelculas e granhas da uva. Fermentaes decorridas a temperaturas mais elevadas, em igualdade das restantes condies, originam vinhos com maior teor de Zn (Fournier et al., 1998). No obstante os teores normalmente encontrados no vinho serem demasiado reduzidos para provocar intoxicaes, agudas ou crnicas, este metal pesado reconhecido pela sua aco txica sobre o organismo humano (Fournier et al., 1998). O estudo dos metais pesados com implicaes toxicolgicas implica a avaliao da sua biodisponibilidade, sendo importante distinguir entre as formas qumicas assimilveis pelo organismo, susceptveis de serem acumuladas, e as formas qumicas no assimilveis, sendo por isso rejeitadas. A aplicao de tcnicas electroqumicas permite determinar a concentrao das formas lbeis, que se dissociam em soluo, por oposio s concentraes totais medidas por tcnicas espectromtricas. Fournier et al. (1998) observaram que a distribuio do Zn, sob a forma orgnica e mineral, influenciada pela temperatura de fermentao; em vinhos obtidos a partir de fermentaes decorridas a temperatura mais baixa (25C), grande parte do Zn encontravase sob a forma inica. Temperaturas de fermentao mais elevadas (30C) favorecem a solubilizao de complexos organometlicos que retm uma parte do Zn (II) contido no vinho. A presena simultnea de formas orgnicas e minerais de Zn nos vinhos reflecte as duas fontes de contaminao anteriormente descritas: parte das formas minerais pode provir de uma contaminao por contacto com materiais, enquanto que os tratamentos com fungicidas so apontados como responsveis por contaminaes sob a forma orgnica (Fournier et al., 1998). 16

O OIV (1990) indica 5 mg/dm3 (teor total), como limite mximo, o que se julga um valor relativamente elevado face s actuais possibilidades tecnolgicas, tanto mais que elevados teores de Zn podero ser sede de acidentes de estabilidade fisico-qumica, e de poder afectar as caractersticas spidas dos vinhos (foi relatada a existncia de relao entre a sensao de adstringncia e a concentrao de Zn) (Fournier et al., 1998). Alis, a generalidade dos valores encontrados na bibliografia so efectivamente bastante inferiores aquele limite. Martin de la Hinojosa et al. (1994) analisaram 84 amostras de vinho, originrios de 22 regies espanholas diferentes, encontrando teores entre 0,17 e 4,14 mg/dm3. Pouco tempo depois, Sudraud et al. (1995) divulgavam os resultados de um estudo envolvendo 70 vinhos brancos e tintos de vrias regies vitivincolas francesas: foram observados teores entre 0,15 e 9,40 mg/dm3, sendo que 5 vinhos apresentavam teor superior a 5 mg/dm3. As concentraes mais elevadas foram ento atribudas a provveis contaminaes com materiais de bronze ou lato. Em vinhos portugueses, Curvelo-Garcia e Ghira (1981) quantificaram valores sensivelmente mais baixos (de 0,16 a 1,96 mg/dm3). Um estudo posterior, em que foi avaliado o teor de Zn em solos de duas vinhas portuguesas, no demonstrou a acumulao significativa deste elemento, ao contrrio do que se verificou para o cobre (Magalhes et al., 1985). De acordo com os autores, os diferentes resultados podem ser explicados pela mais recente incorporao do Zn nos fungicidas, pelo que se justificaria reavaliar a situao. Actualmente, a determinao analtica do Zn em mostos e vinhos mais generalizada certamente a que recorre a AAS (espectrofotometria de absoro atmica) com chama. Embora o Zn possa ser determinado por AAS com forno de grafite, os teores em que surge so suficientemente elevados para a determinao por atomizao por chama (Soares et al., 1995). mtodo oficial na Unio Europeia (CEE, 1990) e no mbito do OIV (1990); a determinao realizada directamente sobre a amostra desalcoolizada, a 213,9 nm, com chama de ar-acetileno. O mtodo que nos propomos estudar e validar justamente o mtodo oficial da Unio Europeia (CEE, 1990). MATERIAL E MTODOS De acordo com o Mtodo Oficial Europeu (Regulamento CEE n 2676/90 de 17 de Setembro), o zinco doseado directamente no vinho desalcoolizado, 17

por espectrofotometria de absoro atmica com chama, com leitura a 213,9 nm. Calibrao Preparao de solues padro correspondentes a 0 (branco de calibrao); 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg/dm3 (a partir de soluo padro de zinco a 1,0000 g/dm3, obtida por dissoluo de 4,3975 g de sulfato de zinco (ZnSO4..7H2O) em gua desionizada - condutividade < 0,1 Scm-1). Realizaram-se quatro curvas de calibrao (1, 2, 3 e 4), em sesses de trabalho distintas, a partir de solues padro preparadas no prprio dia, com excepo da curva 4, realizada a partir das mesmas solues que a curva 2. A realizao de mais do que uma curva de calibrao teve por objectivo confirmar o modelo matemtico. Preparao de amostras Eliminao do etanol por concentrao a de 100 cm3 de vinho, em evaporador rotativo com bomba de vcuo (temperatura: 30 a 40 C). Reposio ao volume inicial de 100 cm3 com gua desionizada. Condies operatrias

= 213,9 nm; largura da fenda do monocromador = 0,7 nm; fluxo do ar = 12

dm3/min; fluxo do acetileno = 1,7 dm3/min; fluxo de aspirao = 2,5 cm3/min. Doseamento Leitura das solues de calibrao e amostras, em triplicado. Clculo e apresentao dos resultados Clculo automtico da concentrao do elemento na soluo de leitura, por interpolao inversa da curva de calibrao. Os resultados so expressos em mg/dm3 de vinho, com 1 decimal. Equipamento utilizado Espectrofotmetro de absoro atmica Varian SpectrAA-10, equipado com queimador de ar-acetileno e lmpada de ctodo oco de zinco. Evaporador rotativo com banho de gua com termostato e bomba de vcuo (Buchi B169). Protocolo de validao Validao por caracterizao intralaboratorial (avaliao indirecta) com base na metodologia indicada por Bouvier (1994). Conhecida a sequncia de procedimentos do mtodo e respectivos pontos crticos, entendeu-se avaliar a sua especificidade, modelo matemtico da curva de calibrao, limites analticos, taxas de recuperao e aplicabilidade, repetibilidade e reprodutibilidade intralaboratorial. 18

Modelo matemtico da curva de calibrao O desconhecimento do algoritmo de converso automtica dos valores de absorvncia para valores de concentrao implicou a realizao de pesquisa sobre o mesmo. O primeiro passo consistiu na observao de uma curva de calibrao, no intervalo de 0 a 2 mg/dm3, construda a partir de 20 pontos de calibrao. As concentraes calculadas automaticamente, a partir da leitura de diferentes amostras de vinho, foram comparadas com as estimativas das concentraes correspondentes aos sinais instrumentais, atravs do ajustamento de diferentes modelos: linear (y = a + bx), quadrtico (y = a + bx + cx2), cbico (y = a + bx + cx2 + dx3), potncia (y = axb), exponencial ( y = aebx) e logartmico (y = a ln(x) + b). Seleccionado o modelo, e aps o clculo do coeficiente de determinao (r2), coeficientes de regresso e respectivos intervalos de confiana, testou-se a significncia da estimativa da ordenada na origem por meio de um teste t de Student. A homogeneidade das varincias, hiptese de verificao obrigatria para a validade da regresso, foi avaliada atravs do teste de Cochran. De modo complementar, procedeu-se anlise dos resduos de regresso das diferentes curvas. A anlise de varincia, para verificao da existncia de uma regresso significativa (comparao das variaes devidas regresso e ao erro residual) e ajustamento do modelo (comparao entre erro de ajustamento e erro puro), foi realizada atravs do teste F de Fisher. Limites analticos Anlise em triplicado de 20 preparaes de branco, em 3 sesses de trabalho, calculando-se a mdia dos valores obtidos e o respectivo desvio padro. O limite de deteco igual leitura do branco, x0, adicionada 3 vezes do desvio padro em torno desse valor s0 (LD = x0 + 3s0). O limite de quantificao igual leitura do branco, x0, adicionada 10 vezes do desvio padro em torno desse valor s0 (LD = x0 + 10s0), a 95% de probabilidade. Taxas de recuperao e aplicabilidade (exactido) Adio de zinco em 4 nveis diferentes (de 0,3 a 1,6 mg/dm3), a 2 vinhos brancos, 2 vinhos tintos e 1 vinho licoroso, cobrindo a gama de concentraes abrangidas pelo mtodo. Clculo das taxas de recuperao e estudo do ajustamento do modelo linear curva de resposta, atravs da anlise de varincia (teste F de Fisher). Comparao dos declives das curvas de resposta dos diferentes vinhos atravs do teste t de Student. 19

Fidelidade (preciso) A fidelidade foi estudada em 4 vinhos brancos, 4 vinhos tintos e 3 vinhos licorosos, seleccionados de forma a representar o intervalo de concentraes abrangidas pelo mtodo. Para cada srie de 10 repeties, foi aplicado o teste de Grubbs para pesquisa e correco de valores aberrantes, seguindo-se o clculo da mdia dos valores obtidos e respectivo desvio padro. Para a avaliao da reprodutibilidade intralaboratorial foram realizadas 3 determinaes, em dias diferentes.

RESULTADOS E DISCUSSO Especificidade A capacidade do mtodo distinguir o zinco de outros elementos, sendo funo do princpio em que se baseia, elevada. A utilizao de uma lmpada de emisso especfica para o zinco permite eliminar interferncias espectrais. No se conhecem interferncias qumicas (especficas) por reaco com os constituintes da chama de ar-acetileno. Como o mtodo da absoro atmica relativo, as determinaes quantitativas s se podem fazer por comparao com padres, pelo que qualquer comportamento da amostra que seja diferente das solues de referncia pode conduzir a uma interferncia. Assim, a eliminao do etanol das amostras e posterior diluio, tem por objectivo minimizar as interferncias fsicas da matriz (no especficas). As interferncias de fundo raramente ocorrem quando a concentrao salina inferior a 5%, teor superior ao apresentado pelos vinhos. Modelo matemtico das curvas de calibrao A tcnica de absoro atmica fornece medida de unidade ptica (unidades de absorvncia), posteriormente convertida em unidades de concentrao, de forma a obter-se um resultado analtico. Idealmente, e de acordo com a lei de BeerLambert, existe uma relao linear entre a absorvncia e a concentrao. Na prtica, mesmo num intervalo pequeno de concentraes, verifica-se a existncia de condies de inaplicabilidade da Lei de Beer-Lambert, pelo que a curvatura na calibrao a regra e no a excepo (Limbek e Rowe, 1986). De acordo com os mesmos autores, a maior ou menor severidade da curvatura depende do elemento em anlise. No caso do elemento em questo, o zinco, a curvatura suave (Varian, 1979), tal como se pode observar na Fig. 1. Segundo Limbek e Rowe (1986), o modelo polinomial de 3 grau (cbico) constitui uma aproximao excelente para curvas suaves. 20

Fig. 1

Dados de calibrao para ajustamento de curva de regresso Calibration data for curve fitting trialses

Os coeficientes de determinao (r2) dos modelos linear, quadrtico, cbico, potncia, exponencial e logartmico, so, respectivamente, iguais a 0,9974; 0,9995; 0,9996; 0,9978; 0,9441 e 0,9772. Embora, os modelos quadrtico e cbico apresentem valores muito aproximados, apenas o ltimo permitiu estimar concentraes iguais s obtidas (Catarino e Curvelo-Garcia, 2002). Modelo polinomial de 3 grau No Quadro I, apresentam-se os valores dos coeficientes das curvas de calibrao, parmetros e testes estatsticos realizados. QUADRO I
Estudo estatstico das curvas de calibrao (y = a + bx + cx2 + dx3) Calibration curves statistical treatment (y = a + bx + cx2 + dx3)

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Os valores observados das ordenadas na origem no diferem significativamente de zero, pelo que se conclui que as curvas passam pela origem. As curvas de calibrao verificam homogeneidade de varincias a 99,5% de probabilidade. A anlise dos resduos de regresso no evidencia nenhuma tendncia clara que sugira a violao das hipteses do modelo ou um ajustamento insatisfatrio (Catarino e Curvelo-Garcia, 2002). Os resultados da anlise de varincia das diferentes curvas de calibrao demonstram que uma elevada percentagem da variao total explicada pelo modelo polinomial. Contudo, o modelo poderia ter sido ajustado s aos erros, pelo que a decomposio da variao em torno do modelo em erro puro e erro do ajustamento, mostra-nos se h necessidade de procurar outro modelo. O teste F de Fisher permite concluir que a variao devida a este erro no significativa, traduzindo um bom ajustamento do modelo. Limites analticos O limite de deteco e limite de quantificao calculados so iguais a 0,033 0,005 mg/dm3 e 0,077 0,017 mg/dm3, respectivamente. Admitindo-se o valor de 0,1 mg/dm3 como limite de quantificao do mtodo, em rigor, a metodologia utilizada no seu clculo implica a sua actualizao sempre que se construa nova curva de calibrao. Taxas de recuperao e aplicabilidade (exactido) As taxas de recuperao encontradas no vinho licoroso so inferiores s dos restantes vinhos, provavelmente devido maior complexidade da matriz, com efeitos ao nvel da viscosidade e consequentemente da aspirao e nebulizao da amostra (Quadro II). A incorporao de sacarose nas solues padro, de QUADRO II
Taxas de recuperao Recovery estimates

forma a simular o contedo em acares dos vinhos licorosos, poder minimizar os efeitos de matriz neste tipo de amostras. De um modo geral, observa-se uma diminuio da taxa de recuperao com o aumento da quantidade de zinco adicionado (Catarino e Curvelo-Garcia, 2002). As taxas de recuperao so satisfatrias, denotando razovel aplicabilidade do mtodo. 22

Aplicabilidade O estudo do ajustamento do modelo linear s curvas de resposta dos vinhos, bem como os respectivos coeficientes de regresso, so apresentados no Quadro III. QUADRO III
Estudo estatstico das curvas de resposta (y = a + bx) Calibration curves statistical treatment (y = a + bx)

Verifica-se ajustamento do modelo linear em todas as curvas de resposta, com excepo do vinho VB2, concluindo-se pela aplicabilidade do mtodo s restantes matrizes em estudo. Os resultados do teste de comparao dos declives, permitem afirmar que os declives das curvas dos vinhos brancos so significativamente diferentes dos declives da curva do vinho licoroso, o que confirma a existncia de efeito de matriz. Observa-se ainda que o declive da curva do vinho VB2 significativamente diferente de todos os restantes, provavelmente devido a um efeito de matriz. Fidelidade (preciso) Os valores de repetibilidade e reprodutibilidade intralaboratorial determinados nos diferentes vinhos, a 97,5% de probabilidade, podem ser observados no Quadro IV. Nos vinhos tintos, os coeficientes de variao mais elevados surgem QUADRO IV
Repetibilidade (r) e reprodutibilidade intralaboratorial (R) Repeatability (r, within-run precision) and reproducibility (R, between-run precision)

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associados aos extremos da gama de trabalho, enquanto que nos vinhos brancos no se verifica nenhuma tendncia (Catarino e Curvelo-Garcia, 2002). Verificase ainda que o mtodo apresenta maior preciso para os vinhos brancos do que para os vinhos tintos.

CONCLUSES
O mtodo descrito e caracterizado, pela sua praticabilidade e capacidade de fornecer resultados analticos com a preciso e exactido necessrias, apropriado para o controlo de rotina do teor total de zinco em vinhos. O limite de quantificao suficientemente reduzido para o trabalho de rotina, podendo em alternativa, recorrerse tcnica de espectrofotometria de absoro atmica com atomizao electrotrmica para estudos que exijam limites analticos inferiores.

SUMMARY Determination of zinc in wine by flame atomic absorption spectrometry (FAAS). Validation of the analytical method The determination of zinc in wine is important because this metal is toxic and may involve haze formation during wine storage. This paper describes the determination of total contents of zinc in wine by flame atomic absorption spectrometry. The method was validated and its analytical characteristics were checked (praticability, specificity, algorithm calibration curve, analytical limits, acurracy and precision: repeatability and reproducibility). White, red and fortified wines were used. Within a limited concentration range (0 to 2 mg/dm3), there is some deviation to linearity and a cubic polynomial is a better fit (y = a + bx + cx2 + dx3). The quantification limit for zinc was 0,1 mg/dm3. Spiking wine samples with aqueous zinc gave recoveries between 83,09% and 101,06%. Replicate of 11 wine samples, at several concentration levels, gave relative standard deviations better than 3,0% (n = 10), indicating that the analytical method is of high precision.

RESUME Determination du zinc dans les vins par spectrometrie dabsorption atomique de flamme. Validation de la mthode danalyse Limportance du dosage du zinc (Zn) dans les vins est li sa toxicit pour lhomme et encore aux problmes de stabilit physico-chimique qu il pourra tre sige. Dans cet article, on prsente la description et la caractrisation intralaboratoire de la mthode de dtermination analytique du teneur total de Zn des vins par spctrophotomtrie d absorption atomique avec flamme. La practicabilit, la spcificit, le modle mathmatique de la courbe de calibration, les limites analytiques, les taux de rcupration et aplicabilit (exactitude), la rptabilit et la rprodutibilit intralaboratoire (fidlit) sont quelques-unes des caractristiques values. Cet tude a t appliqu des vins blancs, rouges et de licqueur. La mthode analytique, de trs grande spcificit, permet quantifier des teneurs suprieurs 0,1 mg/dm3, avec une grande prcision (CV<3,0 % pour la rptabilit; CV<8,5 % pour la rprodutibilit intralaboratoire). La courbe de calibration pour la gamme de travail (0 2 mg/dm3) est carte de la linarit; elle est bien dcrite par un polynme

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du trosime degr (y = a + bx + cx2 + dx3). Les taux de rcupration dtermins varient entre 83,09 % et 101,06 %.

AGRADECIMENTOS Ao Eng Tcnico Pedro Barros pelo apoio na componente instrumental. Ao Doutor Sun Baoshan pela ajuda na traduo do resumo para a lngua inglesa.
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