Cogumelo shiitake (Lentinula edodes) reduz o crescimento de fitopatgenos e a severidade de manchas foliares em sorgo

Everaldo Piccinin1, Robson Marcelo Di Piero2 & Srgio Florentino Pascholati1

(1)

Universidade de So Paulo, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrcola, CEP 13418-900 Piracicaba, SP. (2)Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Cincias Agrrias, Departamento de Fitotecnia, CEP 88040-900 Florianpolis, SC. Autor para correspondncia: Srgio Florentino Pascholati - (sfpascho@esalq.usp.br) Data de chegada: 14/01/2008. Aceito para publicao em: 27/07/2009. 1559

RESUMO
Piccinin, E.; Di Piero, R.M.; Pascholati, S.F. Cogumelo shiitake (Lentinula edodes) reduz o crescimento de fitopatgenos e a severidade de manchas foliares em sorgo. Summa Phytopathologica, v.36, n.1, p.68-72, 2010.
Lentinula edodes (cogumelo shiitake) um fungo basidiomiceto qu e apresenta propriedades nu tricionais, medicina is e antibitica s. Compostos de interesse pa ra o homem tm sid o i so l a d o s d o b a si d i o ca r p o e d o s fi l t ra d o s d e c u lt u r a o b t i do s a pa r t i r d o c re sc im en to m ic el ia l. O p re se nt e t ra ba lh o te ve c om o ob je ti vo s a va l i a r o e fei t o d e d i fe r e nt e s p r ep a r a es d e L . e d o d e s sob r e p a t g e n os d a c u l t u ra d o so r g o, E x se r o h il u m tu r c i c u m e Co lletotrich um su blin eo lu m , bem como a proteo das pla ntas de sor go c on tr a est es p a t g en os. E m te st es c om p l a c a s d e Pe tr i e l min a s de vid ro pa ra microscop ia , extra tos a qu o sos obtid os do basidiocarpo inteiro e de suas partes individualizadas, pleo e estipe, redu ziram a ta xa de crescimento micelial e inibira m a germinao de esporos dos fungos, enquanto a atividade antifngica do filtrado de crescime nto micelia l foi men os pronu ncia da . Em m esoctilos de sorgo, a s diferentes prepa raes do shiit ake no provocaram o a c mu lo de fitoa lexinas. O extra to a qu oso do ba sidioca rpo e o composto lentinana reduziram parcialmente a severidade das doenas provocadas por E. turcicum na cv. Brandes e por C . sublineolum na cv. Tx-398-B, quando pulverizados 48 horas antes da inoculao das pla nta s, sob condies de ca sa de vegeta o. Porta nto, L . e d od e s apresenta potencial como agente de controle biolgico ou como um modelo para a sntese de substncias fungicidas.

Palavras-chave adicionais: Lentinula edodes, antibiose, Exserohilum turcicum, Colletotrichum sublineolum, Sorghum bicolor.

ABSTRACT
Piccinin, E.; Di Piero, R.M.; Pascholati, S.F. shiitake (Lentinula edodes) mushroom reduces growth of plant pathogens and leaf spot severity in sorghum. Summa Phytopathologica, v.36, n.1, p.68-72, 2010.
Lentinula edodes (shiitake mushroom) is a fungus that presents nutritional, medicinal and antibiotic properties. Valuable compounds have been isolated from the fruiting bodies and from mycelium growth filtra tes. The present work ha d as objectives the evalua tion of the effect of L. e d o d e s prepa ra tions on two sorghu m pa thogens, Exserohilum tu rcicu m and Co lleto trich um sublin eolum, as well as the protection of sorghum plants against those fungi. When in v itro studies were carried ou t, aqueous extracts from the whole fruiting bodies and also from fruiting body parts, cap and stem, reduced the mycelium growth and the spore germination of the plant pa thogens, while the antifungal activity of L. edodess mycelium growth filtrate wa s less pronou nced. T he shiita k e prepa ra tions did not indu ce phytoalexin accumulation in sorghum mesocotyls. Aqueous extra cts from fruiting bodies and lentinan partially redu ced disease severity caused by E. turcicum in the cv. Brandes and by C. sublineolum in the cv. T x-3 9 8 -B, when a pplied 4 8 hou rs before pla nt inocu la tion. Therefore, L. edodes exhibits potential as a biological control agent or as a model for the synthesis of fungicidal compounds.

Keywords: Lentinula edodes, antibiosis, Exserohilum turcicum, Colletotrichum sublineolum, Sorghum bicolor.

Lentinula edodes (Berk.) Pegler, conhecido como cogumelo shiitake, a segunda mais importante espcie de cogumelo comestvel cultivada no mundo, ficando atrs apenas do champignon de Paris (Agaricus bisporus). A produo mundial crescente, sendo a China o principal pas produtor (1). No Brasil, a produo de shiitake est se expandindo, principalmente nas regies sul e sudeste, dadas as condies climticas favorveis (9). O shiitake pode ser cultivado em troncos de rvores como o eucalipto, carvalho, mangueira e abacateiro, ou em substratos preparados pelo homem, sob condies controladas, e tem atrado a ateno de pesquisadores por apresentar qualidades nutricionais, medicinais e teraputicas comprovadas cientificamente (4).

A atividade antibitica de L . ed od es foi demonstrada em experimentos envolvendo fungos, vrus e bactrias, a partir de compostos produzidos durante o crescimento micelial em laboratrio (6, 7, 9, 15), assim como a partir de substncias encontradas no basidiocarpo (5, 8, 12). Na rea mdica, resultados positivos foram verificados com a utilizao de L. edodes no combate a patgenos humanos, e tambm na ativao do sistema imunolgico e na melhora de problemas de sade como o colesterol, a asma e a lcera. Entre as substncias caracterizadas, destaca-se a lentinana, uma -glucana isolada do basidiocarpo por extrao aquosa. A lentinana possui a capacidade de recuperar ou aumentar a resposta das clulas hospedeiras a substncias

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biologicamente ativas, por estimular a maturao, diferenciao ou proliferao de clulas envolvidas nos mecanismos de defesa, aumentando a resistncia do hospedeiro contra vrios tipos de cncer e doenas infecciosas (2). Alm da ativao do sistema imune em animais, L. edodes pode ativar mecanismos de defesa em vegetais. Em plantas de pepino, extratos aquosos do basidiocarpo provocaram um aumento foliar na atividade de enzimas relacionadas defesa, o que pode ter contribudo para a proteo parcial observada em tais plantas contra Colletotrichum lagenarium (3). Atualmente, uma das principais preocupaes do homem est relacionada preservao dos recursos naturais, bem como qualidade dos alimentos consumidos. Na agricultura, o uso de produtos fitossanitrios menos txicos e com baixo impacto ambiental tem sido uma das exigncias do mercado consumidor e dos agricultores. Nesse sentido, esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito antibitico de vrias preparaes obtidas a partir do cogumelo L . edodes sobre dois fungos fitopatognicos, Exserohilum turcicum (Pass.) e Colletotrichum sublineolum Ces (Wils), causadores de doenas foliares em plantas de sorgo (Sorghum bicolor Moench). Alm disso, as preparaes do cogumelo foram aplicadas em duas cultivares de sorgo para se avaliar o efeito protetor contra os fitopatgenos, buscando medidas alternativas aos fungicidas convencionais para o controle de doenas em plantas.

induzir a esporulao, C. sublineolum foi cultivado em meio de aveia, a 21 + 2 oC, sob luz negra ( = 320 nm) durante 20 dias, enquanto E. turcicum foi mantido em BDA, a 26 + 2 oC, no escuro, por 30 dias. Testes in vitro Para testar o efeito de L. edodes sobre o crescimento micelial dos patgenos, cada uma das preparaes do cogumelo (extrato aquoso de basidiocarpo, EAB; extrato aquoso do pleo, EAP; extrato aquoso da estipe, EAE; e o filtrado do crescimento micelial, FCM) foi incorporada separadamente em 150 mL de BDA a 45 oC, nas propores de 0; 0,01; 0,1; 1 e 2% (v/v) e vertida em placas de Petri. Trs dias depois, cada placa recebeu um disco de 0,5 cm de dimetro contendo miclio de um dos patgenos, na parte central. Foram realizadas seis repeties para cada concentrao testada, em delineamento inteiramente casualizado. As placas onde se repicou C. sublineolum foram mantidas a 22 + 1 oC, sob luz fluorescente, enquanto as placas contendo E . turcicum foram mantidas a 27 + 2 oC, sob condies de escuro. O crescimento diametral das colnias fngicas foi avaliado quando o miclio presente em um dos tratamentos alcanou o dimetro mximo da placa de Petri (9 cm). A influncia das preparaes de L. edodes sobre a germinao dos condios dos patgenos foi determinada atravs do uso de lminas de vidro para microscopia recobertas com uma camada de poliestireno (10). A unidade experimental foi representada por uma lmina contendo duas gotas, sendo cada gota composta por 40 L de suspenso de esporos do patgeno + 40 L de uma preparao do cogumelo, de tal forma que a concentrao final dos patgenos na gota fosse 104 esporos mL-1 e a concentrao final das preparaes do cogumelo fosse 2 ou 5% (v/v). Neste ensaio, foram testadas as preparaes EAB, EAP, EAE, FCM e lentinana. O controle geral consistiu de gua destilada, enquanto o meio lquido batata-dextrose (BD) foi utilizado como um segundo controle, especfico para o FCM. Foram realizadas trs repeties para cada tratamento, em um delineamento inteiramente casualizado. As lminas contendo C. sublineolum foram incubadas a 21 + 2 oC e sob luz negra, enquanto as contendo E. turcicum foram mantidas a 27 + 2 oC , no escuro, realizando-se cmara mida para todas as lminas. A porcentagem de germinao de condios foi determinada 24 h aps o incio dos experimentos, atravs do emprego de azul de algodo com lactofenol e observao em microscpio tico. Foram avaliados 100 esporos em cada gota.

MATERIAL E MTODOS Lentinula edodes e fitopatgenos Em todos os testes, utilizou-se o isolado de L. edodes (shiitake) denominado Piracicaba, o qual se encontra depositado na micoteca do Instituto de Botnica, em So Paulo, com o nmero de registro CCB 654. O crescimento micelial de L. edodes foi realizado em condies de laboratrio, cultivando-se o fungo em BDA, no escuro, a 22 + 2 oC. Os basidiocarpos foram obtidos aps o cultivo do fungo em toras de Eucalyptus grandis, em local sombreado. O isolamento de L. edodes, o preparo de inculo, a inoculao das toras e a colheita dos basidiocarpos foram conduzidos seguindo-se a metodologia de Pascholati et al. (16). Para a obteno dos extratos aquosos (EA), os basidiocarpos ou suas partes constituintes individualizadas (pleo e estipe), desidratados em p, foram misturados com gua destilada (14 mL para cada grama), e aps 4 h de incubao a 4 oC, a suspenso foi filtrada em filtro comum (8 g cm -2) e centrifugada a 20.000 g 20 min -1, sendo o sobrenadante filtrado em membrana tipo Millipore (dimetro do poro = 0,2 m), sob condies asspticas. Os extratos aquosos brutos foram armazenados em geladeira a 4 oC e utilizados, aps diluies, nos testes in vitro e in vivo (18). Outro tipo de preparao utilizada foi o filtrado de crescimento micelial (FCM). Para tal, 12 discos (0,5 cm de dimetro) retirados de BDA contendo crescimento vegetativo de L. edodes foram repicados para seis erlenmeyers contendo 300 mL de meio lquido BD (batatadextrose) cada um. Aps 160 dias de cultivo, a 25 + 2 oC, sob agitao, o contedo dos erlenmeyers foi filtrado e armazenado de forma semelhante ao descrito anteriormente. A lentinana, uma -glucana presente na parede celular do cogumelo, foi cedida pela Ajinomoto Indstria e Comrcio Ltda. Colletotrichum sublineolum e Exserohilum turcicum foram isolados a partir de folhas de sorgo das cultivares Tx-398-B e Brandes, respectivamente. Culturas puras dos patgenos foram mantidas em BDA, a 26 + 2 oC, visando estimular o crescimento micelial. Para

Bioensaio com mesoctilos de sorgo e testes de proteo de plantas em casa de vegetao Para analisar o efeito das preparaes de L. edodes no acmulo de fitoalexinas em mesoctilos de sorgo, sementes de sorgo da cultivar Brandes foram embebidas em gua por 4 h, sob aerao e a temperatura ambiente, e dispostas entre camadas de papel de filtro umedecidas, no escuro a 28 oC. Aps 5 dias, as plntulas foram expostas a duas horas de luz para a paralisao da elongao dos mesoctilos. Estes foram coletados e colocados no interior de tubos de ensaio contendo 3 mL das diferentes preparaes de L. edodes (EAB, EAP, EAE, FCM e lentinana). O controle geral consistiu de gua destilada e o meio lquido BD foi utilizado como um segundo controle, especfico para o FCM. Foram feitas cinco repeties por tratamento, onde cada unidade experimental foi representada por um tubo de ensaio contendo cinco mesoctilos. Os tubos de ensaio foram vedados com plstico Magipack e incubados sob luz fluorescente constante, a 25 + 2 oC, durante 60 h. Aps esse perodo, eliminou-se 0,5 cm da base dos mesoctilos, e os 2,0 cm acima foram pesados e colocados em 1,4 mL

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de metanol 80% acidificado com 0,1% (v/v) HCl, a 4 oC durante 96 h. Posteriormente, as fraes metanlicas das amostras foram separadas dos tecidos e a absorbncia determinada em espectrofotmetro a 480 nm (13). A atividade elicitora dos preparados foi calculada em termos de Absorbncia a 480 nm g-1 tecido fresco. Plantas de sorgo foram cultivadas em vasos de alumnio de 2 L preenchidos com terra e esterco curtido, na proporo de 3:1, mantidos em casa de vegetao. Para verificar a proteo de sorgo contra C . sublineolum, plantas da cultivar Tx398-B, apresentando quatro folhas expandidas, foram aspergidas separadamente com preparaes de L . edodes (EAB a 2% v/v e lentinana a 2% m/v) ou com gua destilada, utilizando-se um volume mdio de 5,5 mL por planta. Os tratamentos foram efetuados em todas as folhas das plantas. Quarenta e oito horas aps os tratamentos, as plantas foram inoculadas com C. sublineolum (5 x 104 condios mL-1) em todas as folhas, permanecendo sob condies de cmara mida e luz constante durante 24 h. Aps este perodo, as plantas retornaram para a casa de vegetao. Foram feitas cinco repeties por tratamento e cada repetio consistiu de um vaso contendo trs plantas. O delineamento foi inteiramente casualizado. A avaliao foi realizada estimando-se a severidade da doena na 5a folha, aos 30 dias aps a inoculao, com base em escala diagramtica (17). Na verificao do efeito protetor de L. edodes contra E. turcicum, o procedimento geral foi o mesmo descrito no pargrafo anterior. No entanto, utilizou-se a cultivar de sorgo Brandes, e as plantas foram inoculadas com uma suspenso de 5 x 105 esporos mL-1 de E. turcicum. As 24 h de cmara mida foram realizadas sob condies de escuro, e posteriormente, as plantas foram mantidas em ambiente controlado (25 + 2 oC e fotoperodo de 16 h) at o final do experimento. A avaliao foi efetuada 45 dias aps a inoculao, estimando-se a severidade da doena na 5a folha de cada planta.

RESULTADOS E DISCUSSO Os extratos aquosos obtidos do basidiocarpo de L. edodes como um todo (EAB) ou de suas partes constituintes, pleo e estipe, (EAP e EAE) reduziram o crescimento micelial de E . turcicum e de C . sublineolum , a partir da concentrao de 1% (v/v) (Figura 1). semelhana do observado por Takazawa et al. (20), o efeito do cogumelo foi apenas fungisttico, j que houve desenvolvimento dos fitopatgenos quando os discos contendo miclio dos mesmos foram

retirados dos tratamentos e colocados em BDA onde no haviam sido incorporadas as preparaes do cogumelo. O filtrado de crescimento micelial (FCM) do cogumelo inibiu o crescimento de E . turcicum em intensidade semelhante das preparaes de basidiocarpo (Figura 1A). No entanto, no teve efeito sobre C . sublineolum (Figura 1B), revelando que os patgenos estudados apresentam sensibilidade diferencial com relao a compostos presentes no FCM. Na mesma linha de pesquisa, Maki (11) e Sasaki et al. (19) demonstraram a produo de antibiticos antifngicos por parte de L. edodes. Extratos obtidos a partir do crescimento micelial de L. edodes inibiram o desenvolvimento in vitro dos fungos filamentosos Helminthosporium sp., Fusarium solani e Phomopsis sojae, agentes causais da helmintosporiose do trigo, da sndrome da morte sbita em soja, e da seca das hastes e das vagens em soja, respectivamente (19). Por sua vez, Maki (11) reportou a liberao de substncias inibitrias a Candida albicans para o substrato de crescimento de L. edodes. A atividade antibitica do cogumelo desidratado e transformado em p sobre a levedura C. albicans no foi reduzida comparado ao cogumelo fresco (14). Alm de inibir o desenvolvimento micelial, as preparaes obtidas a partir do basidiocarpo (EAB, EAP e EAE) reduziram significativamente a germinao de esporos de E . turcicum e de C . sublineolum (Figura 2), quando utilizadas a 2% (v/v). A lentinana tambm apresentou efeito inibitrio sobre a germinao de esporos dos patgenos (Figura 2). No caso do FCM, o efeito inibidor foi menos pronunciado e s ocorreu no teste envolvendo E . turcicum e, ainda assim, quando se utilizou a concentrao mais elevada, 5% v/v (Figura 2A), enquanto que no teste com C . sublineolum , o FCM no diferiu estatisticamente do seu controle, o meio lquido BD (Figura 2B). De maneira geral, a autoclavagem dos extratos a 121 oC / 20 min pouco alterou o desempenho das preparaes nos testes in vitro (dados no mostrados), revelando que as substncias antifngicas produzidas por L . edodes apresentam natureza termo-resistente. J o extrato aquoso de basidiocarpo autoclavado (EABA), obtido a partir da autoclavagem do basidiocarpo antes da realizao da extrao aquosa, inibiu o crescimento micelial dos patgenos em maior intensidade que o EAB (dados no mostrados), mas por outro lado, estimulou a germinao de esporos de C. sublineolum (Figura 2B). provvel que a autoclavagem do basidiocarpo tenha aumentado a solubilidade em

Figura 1. Efeito de preparaes de Lentinula edodes sobre o crescimento micelial de Exserohilum turcicum (A) e de Colletotrichum sublineolum (B). EAB = extrato aquoso do basidiocarpo; EAP = extrato aquoso do pleo; EAE = extrato aquoso da estipe; FCM = filtrado do crescimento micelial.

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Figura 2. Efeito de preparaes de Lentinula edodes sobre a germinao de esporos de Exserohilum turcicum (A) e de Colletotrichum sublineolum (B). AD = gua destilada; EAB = extrato aquoso do basidiocarpo; EABA = EAB autoclavado; EAP = extrato aquoso do pleo; EAE = extrato aquoso da estipe; BD = batata-dextrose (meio de cultura lquido); FCM = filtrado do crescimento micelial; LEN = lentinana. As barras representam a mdias. Mdias seguidas por letras iguais no diferem significativamente a 1% pelo teste de Tukey.

gua de compostos atuando sobre o miclio de E. turcicum e de C . sublineolum, e tambm de nutrientes que devem ser os responsveis pelo estmulo germinao de esporos. As diferentes preparaes do cogumelo shiitake no desencadearam um acmulo significativo de fitoalexinas nos mesoctilos de sorgo, um dos importantes mecanismos de defesa vegetal nessa espcie (Tabela 1). O maior efeito foi o do meio lquido BD, meio utilizado como um dos controles para o FCM. Com relao proteo de sorgo, tanto o extrato aquoso do basidiocarpo a 2% (v/v) como a lentinana (2g 100 mL-1) reduziram significativamente as doenas causadas por E. turcicum na cv. Brandes e por C. sublineolum na cv. Tx 398-B, quando aplicados 48 h antes da inoculao (Tabela 2). Esse o primeiro relato da proteo de duas cultivares de sorgo contra patgenos pela aplicao foliar de metablitos produzidos por um cogumelo. A inibio no crescimento micelial e na germinao de esporos dos patgenos testados, bem como a baixa capacidade de elicitar o acmulo de fitoalexinas, apontam a antibiose como um dos mecanismos de ao envolvidos no controle das doenas em plantas de sorgo pelas preparaes de L. edodes.
Tabela 1. Atividade elicitora do acmulo de fitoalexinas em mesoctilos de sorgo por preparaes de Lentinula edodes , utilizadas a 2% (v/v). Tratamento gua destilada Extrato aquoso do basidiocarpo (EAB) EAB autoclavado Extrato aquoso do pleo Extrato aquoso da estipe Batata-dextrose Filtrado do crescimento micelial Lentinana
2 3

Tabela 2. Efeito de preparaes de Lentinula edodes sobre a severidade de doenas foliares causadas por Exserohilum turcicum e Colletotrichum sublineolum em plantas de sorgo das cultivares Brandes e Tx 398-B, respectivamente. Tratamentos realizados 48 h antes das inoculaes. Severidade (%) Tratamentos gua Extrato aquoso basidiocarpo Lentinana
(1)

cv. Brandes x E. turcicum

cv. Tx 398-B x C. sublineolum

27,8 a(1)
(2)

25,4 a 7,0 b 10,6 b

18,2 b 20,8 b

(3)

Mdias seguidas por letras iguais, na coluna, no diferem significativamente a 1% pelo teste de Tukey. (2)Utilizado na proporo de 2% (v/v). (3)Utilizada na proporo de 2g para 100mL de gua destilada.

Acmulo de fitoalexinas -1 (Abs 480 nm g tecido fresco) 0,7 b 0,5

1

1,1 ab b 1,4 ab 1,0 ab 2,7 a 1,4 ab 0,6 b 35,6

Substncias antibiticas produzidas por microrganismos so utilizadas para o desenvolvimento de fungicidas de alta eficincia e de amplo espectro de atuao. O caso de maior sucesso na agricultura ocorreu com a descoberta das estrobilurinas produzidas pelo cogumelo Strobilurus tenacellus, as quais originaram, aps algumas modificaes visando melhorar a estabilidade das molculas, os fungicidas azoxystrobin e cresoxim-metil, empregados atualmente na agricultura mundial (21). Por sua vez, L. edodes produz substncias que reduzem o desenvolvimento de E. turcium e de C. sublineolum, assim como a severidade de manchas foliares em sorgo provocadas por esses patgenos. Os resultados do presente trabalho evidenciaram o potencial do cogumelo shiitake para o controle de fitopatgenos e encorajam a realizao de novas pesquisas buscando compostos de baixo impacto ambiental que possam ser empregados no manejo integrado de doenas de plantas.

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Colletotrichum sublineolum
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Mdias seguidas por letras iguais no diferem significativamente a 1% pelo teste de Tukey. (2) Lentinana foi utilizada na proporo de 2g para 100mL de gua destilada. (3) 5 Uma suspenso de esporos de Colletotrichum sublineolum (10 esporos/mL) foi utilizada como controle positivo.

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