07/04/2013

Microbiologia Aula 5

Princpios de Gentica Microbiana

Prof. Dr. Agenor Messias Silvestre Jr
agenor@uninove.br

Recombinao gentica

Transformao / Conjugao /Transduo

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Recombinao gentica

Griffith: 1928 (evento marcante na biologia pois forneceu as primeiras evidncias de que o DNA
era o material gentico)

DEFINIO
grego genno; fazer nascer) a cincia da hereditariedade e da variabilidade dos organismos.
GENTICA (do

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Estrutura do DNA
Dupla fita em forma de hlice Cadeia de nucleotdios

Watson e Crick

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Variabilidade em microrganismos
Gentipo: potencial total herdado

O gentipo a composio gentica do

indivduo. Representa todos os potenciais, mas no a propriedades em si; Fentipo: poro expressa do gentipo referente s propriedades reais, expressas realmente. O FENTIPO E A EXPRESSO DO GENTIPO!!!

Estrutura do DNA
Cada nucleotdeo contm os seguintes elementos:

1 Base orgnica nitrogenada (Por que contm nitrognio na sua formao) 1 Acar chamado DESOXIRRIBOSE (Possui 5 Carbonos na sua molcula)

1 grupo fosfato (PO4-)

As duas fitas so ati-paralelas

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Estrutura do DNA

5 to 3 (fitas so antiparalelas)

O pareamento das bases so complementares

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ESTRUTURA DO DNA
1) Estrutura primria

5 to 3 (fitas so antiparalelas)

O pareamento das bases so complementares

A=T CG

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PAREAMENTO DAS BASES NITROGENADAS

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Diferenas entre DNA e RNA

20 aminocidos

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1 aminocido formado por 3 bases nitrognadas

Como existem 4 bases (A, C, T e G), existem 4x4x4=64 diferentes combinaes de 3 bases formando cdon. No entanto, o nmero de aminocidos codificados apenas 20

AUG tambm sinal de iniciao

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O cdigo "degenerado": trs aminocidos, Arg, Leu, Ser, tem seis cdons; outros tem 3 ou 4 cdons; apenas Met tem um nico cdon Aparentemente, o cdigo evoluiu para minimizar o efeito deletrio de mutaes

EXERCCIO: Escreva a fita de DNA complementar e do RNA.

TAC CGC ATA CGA TAC CTC ACC GCT GAA CCA AAA CGG

(DNA- me) (DNA-comp.) (RNA)

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DNA girase

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Replicao do dna

Replicao do DNA
Na replicao o DNA (fita dupla) convertido em duas molculas filhas idnticas

Quando se inicia a duplicao o superenovelamento dos cromossomos relaxado pela enzima TOPOISOMERASE.
Em seguida as duas fitas do DNA so desenrolados por uma enzima: HELICASE. A helicase ou DNA helicase uma enzima que promove a abertura da hlice de DNA, separando-o em duas fitas simples para que possa sofrer replicao. A helicase quebra as LIGAES DE HIDROGNIO entre as bases nitrogenadas.

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Forquilha de replicao do DNA

A helicase ou DNA helicase uma enzima que promove a abertura da hlice de DNA, separando-o em duas fitas simples para que possa sofrer replicao. A helicase quebra as ligaes de hidrognios entre as bases nitrogenadas.

replicao

Forquilha de replicao do DNA

A topoisomerase uma enzima que desempenha importante papel nos processo de replicao e empacotamento de DNA. Ela catalisa uma quebra nas molculas de DNA, mas usa ligaes covalentes para segurar as molculas de DNA que foram quebradas.

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Forquilha de replicao
Em geral em procariotos ocorre uma replicao bidirecional duas forquilhas de replicao ocorrem ao mesmo tempo.

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Transcrio (DNA
Uma fita do DNA serve de molde Tem Uracil (U) no lugar de Timina (T) RNA fita simples Trs tipos de RNA com diferentes funes:

RNA)

mRNA (RNA mensageiro): especifica a sequncia de aa tRNA (RNA de transferncia): usa a informao contida no mRNA e traduz essa informao em uma sequncia de aa rRNA (RNA ribossmico): forma os ribossomos responsveis pela traduo do RNA em protenas

Traduo (RNA

protenas)

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Vrios ribossomos podem traduzir simultaneamente uma molcula de mRNA

Os ribossomos movem-se ao longo de um mRNA na direo 5'3'

O conjunto conhecido como polissomo ou polirribossomo Cada ribossomo funciona independentemente dos demais

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Variaes genotpicas
Ocorre graas a dois mecanismos:
Mutaes

Recombinao gentica

Variaes no genoma microbiano

Mutaes
Alteraes (hereditrias) na sequncia de nucleotdeos de um gene. - Geralmente resultam em pequenas alteraes genticas

Recombinao gentica
Elementos genticos contidos em dois genomas diferentes so reunidos numa unidade. - Provoca alteraes mais significativas.

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Variaes genotpicas
MUTAES
Mudanas hereditrias nucleotdeos de um gene Diferentes tipos
Substituio de bases (troca de bases) Mutaes de remoo (remoo de bases) Adio ou perda de bases (protenas no funcionais) Mutaes sem sentido (trmino da cadeia de aa) Mutaes silenciosas (no acarreta efeito no fentipo) Mutaes de supresso (corrigem mutaes)

na

seqncia

de

Mutao por Substituio de bases

MUTAO SILENCIOSA : Substituio de uma base do DNA por outra (no 3 nucletido de cada codo), mas que resulta num codo que codifica o mesmo aminocido, devido redundncia do cdigo gentico (DEGENERADO). So muito comuns e responsveis pela diversidade gentica que no expressa fenotipicamente.

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Mutao por Substituio de bases

Mutao com perda de sentido: Substituio de uma base do DNA por outra, que tem como consequncia a substituio de um aminocido por outro na protena codificada. A conformao da protena pode ser alterada. (ex: anemia falciforme)

Mutao por Substituio de bases

Mutao sem sentido (nonsense):
Substituio de uma base do DNA de tal modo que, no RNAm, um cdon que especifica um aminocido alterado para um cdon de parada (STOP CDON), ou o contrrio. Origina uma protena mais curta ou mais longa do que a protena normal.

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Deleco
(remoo de uma ou mais bases do DNA)
Pode ser removida uma nica base do DNA ou milhares delas. A remoo de um nmero de bases que no seja mltiplo de trs altera completamente a mensagem do gene.

MUTAO POR INSERO

(Insero de uma ou mais bases do DNA)
Pode ser inserida uma nica base do DNA ou vrias delas. A remoo de um nmero de bases que no seja mltiplo de trs altera completamente a mensagem do gene.

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Como detectar mutaes

Serratia marcescens: vermelho normal, cinza mutantes

Plaqueamento de rplicas
(replica plating)
Uma tcnica conhecida como plaqueamento de rplicas (replica plating),, permite a rpida identificao de clones mutantes . Nesta tcnica, as bactrias so plaqueadas em meio completo, no-seletivo, de forma a se obter colnias isoladas, as quais ocupam posies definidas no meio semi-slido. Esta placa pressionada sobre um pedao de veludo esterilizado ao qual ficaro aderidas as clulas bacterianas de cada posio. Em seguida o veludo pressionado sobre um meio seletivo, por exemplo, um meio seletivo contendo todos os requerimentos nutricionais exceto arginina. Aps um dia de incubao compara-se o posicionamento das colnias nas duas placas. Se uma colnia cresceu na placa de meio completo e no cresceu na placa de meio seletivo, podemos inferir que a colnia que ocupava aquela posio, na placa original, era um mutante biossinttico de arginina e ser identificado como Arg -.

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Plaqueamento de rplicas
(replica plating)
Esta placa pressionada sobre um pedao de veludo esterilizado ao qual ficaro aderidas as clulas bacterianas de cada posio. Em seguida o veludo pressionado sobre um meio seletivo, por exemplo, um meio seletivo contendo um antibitico. Aps um dia de incubao compara-se o posicionamento das colnias nas duas placas.

Plaqueamento de rplicas (replica plating)

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Plaqueamento de rplicas
(replica plating)
Uma tcnica conhecida como plaqueamento de rplicas (replica plating),, permite a rpida identificao de clones mutantes . Nesta tcnica, as bactrias so plaqueadas em meio completo, no-seletivo, de forma a se obter colnias isoladas, as quais ocupam posies definidas no meio semi-slido. Esta placa pressionada sobre um pedao de veludo esterilizado ao qual ficaro aderidas as clulas bacterianas de cada posio. Em seguida o veludo pressionado sobre um meio seletivo, por exemplo, um meio seletivo contendo antibitico. Aps um dia de incubao compara-se o posicionamento das colnias nas duas placas. Se uma colnia cresceu na placa de meio completo e no cresceu na placa de meio seletivo, podemos inferir que a colnia que ocupava aquela posio, na placa original, era um mutante resistente ao antibitico presente no meio de cultura.

Agentes mutagnicos
Agentes qumicos: anlogos de base
Radiaes: raios-X, luz ultra-violeta Transposons So sequncias de DNA capazes de se movimentar de uma regio para outra num genoma.

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Agentes qumicos: anlogos de base

EX. Brometo de etdio O brometo de etdio um agente intercalante usado frequentemente como marcador de cidos nucleicos em laboratrios de biologia molecular para processos como a electroforese em gel de agarose.

Agentes mutagnicos e seu modo de ao

Agente
Anlogos de base 5-bromouracil 2-aminopurina Qumicos que reagem com o DNA cido nitroso (HNO2) Hidroxilamina (NH2OH) Agentes alquilantes Monofuncional (ex. sulfonato de etil metano) Bifuncionais (ex. gs mostarda, nitrosoguanidina) Corantes intercaladores Acridinas, brometo de etdio

Ao
Substitui T, mas pareia com G Substitui A, mas pareia com C Desamina A e C Reage com C Metilao de G, que passa a parear com T Ligao cruzada das fitas de DNA, a regio cortada deleo pela DNA polimerase Inserem-se entre nucleotdeos Formao de dmeros de pirimidina Formao de radicais livres que quebram o DNA

Resultado
Troca de AT por GC Troca de AT por GC

Troca de AT por GC Troca de GC por AT Troca de GC por AT Troca de GC por AT Mutao pontual e

Radiao Ultravioleta
Radiao ionizante (ex. raios X)

Microinseres e microdelees Reparos podem levar erros ou delees

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Radiaes: raios-X, luz ultra-violeta

RADIAO ULTRA-VIOLETA
1. A exposio luz ultravioleta leva as timinas adjacentes(vizinhas) a fazerem ligaes

cruzadas, formando um dmero de timina e interrompendo o pareamento normal de bases.

2. Uma endonuclease corta o DNA e depois uma

exonuclease remove o DNA danificado

3. A

DNA-polimerase

preenche

lacuna

sintetizando o DNA novo, utilizando a fita intacta como molde.

4. A DNA-Ligase sela a lacuna restante, unindo o DNA velho e o DNA- novo.

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ESTUDO DIRIGIDO: GENTICA BACTERIANA 1. Definir os termos: GENTICA, GENE, ALELO, CDIGO GENTICO, GENTIPO, FENTIPO. 2. Descreva o processo de replicao do DNA. Qual o papel das principais enzimas envolvidas nesse processo? 3. Por que as fitas de DNA so anti-paralelas explique. 4. Qual processo denominado semi-conservativo. Explique. 5. O que uma forquilha de replicao. Quando ela se forma. 6. Compare as molculas de DNA e RNA. Quais as diferens e semelhanas entre elas? 7. Explique a frase: O sentido da vida do 5 para o 3 8. Descreva o processo de transcrio e sntese protica. 9. Porqu o cdigo gentico e chamado de degenerado? 10. Descreva a tcnica de plaqueamento de rplicas. Qual a funo desse mtodo? 11. Escreva a molcula de DNA e RNA da seguinte protena: METIONINA- LEUCINA - ALANINA - SERINA - -CISTENA - ARGININA

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