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FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA UNIVERSIDADE DE SO PAULO

NATALIA CAVALCA CARDOSO

Estudo Comparativo da Extrao de DNA em Diferentes Fontes de Material Biolgico para a Realizao da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) no Diagnstico da Doena Renal Policstica em Felinos da Raa Persa

Projeto de Iniciao Cientfica

Orientador Prof. Dr. Bruno Cogliati Laboratrio de Patologia Morfolgica e Molecular Departamento de Patologia FMVZ/USP

Colaboradores Mestranda Juliana Mariotti Guerra Laboratrio de Patologia Morfolgica e Molecular Departamento de Patologia FMVZ USP Prof. Dr. Luiz Fernando Onuchic Laboratrio de Nefrologia Celular, Gentica e Molecular Departamento de Clnica Mdica FMUSP Prof. Msc. Alexandre Gonalves Teixeira Daniel Departamento de Clnica Mdica Universidade Metodista de So Paulo

So Paulo 2013
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INTRODUO A doena renal policstica (DRP) felina uma enfermidade de cunho hereditrio autossmico

dominante, caracterizada pela presena de cistos localizados no crtex renal e, ocasionalmente, no fgado e pncreas (Cooper & Piveral, 2000). Esta enfermidade causada por mutaes em um de dois genes, PKD1 (polycystic kidney disease 1) ou PKD2, sendo que aproximadamente 85% dos casos devem-se a mutaes em PKD1. A DRPAD felina consiste na molstia hereditria mais prevalente em gatos domsticos, estando presente em 35 a 60% dos gatos da raa Persa. Entretanto, estudos realizados no Brasil indicam que os gatos sem raa definida (SRD) e de pelo curto tambm podem ser afetados pela doena (Ferrante, 2004). Como h similaridades morfolgicas e patogenticas dessa enfermidade com a doena renal policstica autossmica dominante em humanos, os felinos domsticos considerados um excelente modelo de desenvolvimento espontneo dessa doena (Biller et al., 1990). A DRP cursa clinicamente com o crescimento progressivo de cistos no parnquima renal, levando sua compresso e comprometimento da funo renal, culminando em um quadro de insuficincia renal crnica (Simec et al., 2000). O diagnstico em gatos realizado associando-se sinais clnicos, anlises bioqumicas, exames de imagem obtidos, principalmente, atravs de ultrassonografia e testes genticos (Scherding, 1994). Lyons et al. (2004) identificaram uma transverso de C para A no xon 29 do gene PKD1 felino, levando a um cdon de parada prematura no RNAm em animais que apresentavam alteraes ultrassonogrficas compatveis com a doena policstica renal autossmica dominante (DRPAD) dos felinos. Recentemente, testes moleculares para deteco da mutao relacionada DRPAD, empregando as tcnicas de PCR/RFLP (Reao em Cadeia da Polimerase/ Polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos por corte da fita dupla de DNA) ou de PCR em tempo real foram relatados. Eles podem ser usados para genotipar filhotes recm-nascidos e discriminar aqueles animais que apresentem a mutao C>A no xon 29 do gene PKD1 felino (Bonazzi et al., 2009). Dentre os tecidos usados para a extrao do DNA com alta qualidade tem-se, principalmente, o sanguneo, a mucosa epitelial bucal e o folculo piloso, sendo cada um deles associados a diferentes tipos de coleta. O mtodo de extrao por coluna membrana de slica gel foi o que demonstrou quantidades similares de DNA genmico extrado, tanto de sangue coagulado quanto com anticoagulante EDTA, alm de melhor preservao das amostras, considerado o mtodo padro ouro. (Clements et al., 2008). Em animais domsticos, a escolha da amostra biolgica deve levar em conta requisitos como facilidade de obteno pelo proprietrio, de armazenamento e envio ao laboratrio de anlises
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clnicas, assim como de processamento da mesma. Muitas vezes, a coleta de sangue em felinos domsticos pode ser trabalhosa devido a dificuldades de conteno do animal, principalmente em animais jovens, levando ao estresse excessivo. Em relao ao pelo, sabe-se que h grande variao da quantidade de DNA extrado da raiz ou pores mais distais de pelos arrancados ou cados (Andresson et al., 2006). No que diz respeito coleta de clulas bucais atravs ao swab oral, h concordncia menor para sequenciamento completo do genoma quando comparado ao sangue (Short et al., 2005). Assim, outras fontes de material biolgico para testes moleculares devem ser estudados e validados na clnica de felinos.

OBJETIVOS Avaliar diferentes fontes de materiais biolgicos de felinos da raa Persa para padronizar e

comparar a extrao de DNA genmico provenientes de amostras de sangue com EDTA, swab de clulas bucais e de folculos pilosos para a realizao do teste molecular de PCR/RFLP para identificao da mutao C>A do xon 29 do gene PKD1 e diagnstico da DRPAD felina.

MATERIAIS E MTODOS

3.1 Grupos Experimentais: sero avaliadas amostras biolgicas coletadas de 50 felinos da raa Persa, oriundas de criadores registrados na regio metropolitana de So Paulo. Os animais do grupo experimental sero os mesmos utilizados no projeto de mestrado realizado pela M.V. Juliana Mariotti Guerra e orientado pelo Prof. Bruno Cogliati. O projeto foi aprovado pela Comisso de Biotica e Comisso de tica Hospitalar da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo (protocolo 2496/2011).

3.2 Coleta de Material Biolgico: amostras de sangue colhidos da veia jugular sero armazenadas em tubo contendo EDTA e tubo seco. Amostras de clulas epiteliais bucais sero recolhidas atravs de escova citolgica estril em cavidade oral. Os bulbos pilosos sero coletados por avulso dos pelos. Todos os materiais biolgicos so acondicionados a 4C at sua chegada ao laboratrio. Posteriormente, as amostras sero armazenadas em freezer -80 C.

3.3 Extrao do material gentico: amostras de DNA genmico sero obtidas a partir de sangue coletado com EDTA, de swabs da cavidade oral ou de folculos pilosos, atravs de kits comerciais com colunas de slica (GE Healthcare, EUA) ou com resinas inicas (Biorad, EUA), segundo orientaes do fabricante.
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3.4 Avaliao quantitativa e qualitativa do material extrado: a avaliao da qualidade e quantidade do DNA extrado ser realizada atravs da anlise da integridade e pureza das amostras pelo aparelho NanoDrop (NanoDrop Technologies, EUA) e em corrida em gel de agarose 1,5% em tampo de corrida TAE 1X. A colorao do gel ser realizada com SYBR Safe DNA Gel Stain (Life Technologies, EUA) e a revelao por cmera fotogrfica em cmara escura sob luz ultravioleta.

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Avaliao da amplificao do material gentico: a eficcia de amplificao do material

gentico obtido ser testada peloo processo de genotipagem, o qual ser conduzido em duas etapas. A primeira compreender a amplificao de um amplicon contendo o xon 29 do gene PKD1, enquanto a segunda consistir na anlise por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) visando identificao potencial da mutao C>A na posio 138 do xon 29. O produto de amplificao do xon 29 constar de 559 pares de base (pb). A reao de digesto, por sua vez, baseia-se na informao de que a variante com a substituio C>A promove a criao de um stio de restrio para a enzima Mly1 (New England Biolabs, Beverly, EUA), levando a digesto com tal enzima a produzir dois fragmentos de 316 e 243 pb em substituio ao fragmento selvagem correspondente a 559 pb. O produto da reao de digesto enzimtica, por sua vez, ser analisado em gel de agarose a 2% e fotografado para documentao usando o sistema Image Master VDS (Pharmacia Biotech, Sucia).

3.6 Anlise Estatstica dos resultados: os dados contnuos sero inicialmente comparados com a curva de Gauss atravs do teste de distncia K-S. Quando paramtricos, sero representados atravs da mdia e desvio padro. Estes dados sero analisados pelo teste t de Student no pareado. Aceitaremos neste estudo risco alfa menor ou igual a 5%.

REFERNCIAS
ANDRESSON et al. Forensic Science International 164, p. 5664, 2006. BILLER et al. Journal of the American Veterinary Medical Association. v. 196, n. 8, p. 1288-90, 1990. BONAZZI et al. Journal of feline medicine and surgery. 11 (6), p. 430-434, 2009. CLEMENTS et al. Research in Veterinary Science 85, p. 7479, 2008. COOPER e PIVERAL. Feline practice. Texas, v. 28, n. 2, p. 20-1, 2000. FERRANTE, T. Nosso Clnico. So Paulo: Trofu, ano 7, n. 42, p. 6-10, 2004. LYONS et al. Journal of the American Society of Nephrology. v. 15, n. 10, p. 2548-55, 2004. SCHERDING, R. G. The cats: diseases and clinical management. In: SHERDING, R. G. W. B.Saunders. 2. ed. Philadelphia. 1994. p. 1719-21. SHORT et al. Journal of Heredity 96, p. 829-835, 2005. SIMEC et al. Veterinarski arhiv. suppl. 70, p. 159-63, 2000.