Novos e velhos marcadores bioqumicos da funo renal: uma abordagem prtica

Caio M. M. de Cordova, PhD, TEAC-SBAC

Universidade de Blumenau, SC

Fisiologia Renal
1. Formao da urina 2. Regulao do equilbrio hidroeletroltico 3. Regulao do equilbrio cido-base 4. Excreo de dejetos do metabolismo proteico 5. Funo hormonal
1. Calcitriol 2. Renina 3. Eritropoetina

6. Conservao de protenas
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Anatomia Renal

cortex

medula

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Fisiologia Renal
4. Excreo do catabolismo proteico
Mais de 15 compostos nitrogenados no-proteicos
Uria: Aminocidos: cido rico: Creatinina: Creatina: Amnia: 45% 20% 20% 5% 1-2% 0,2%

Alterao dos nveis sanguneos:

perda de 50% da funo renal

Uria:
NH2

O C NH2

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Fisiologia Renal
Uria
De-aminao dos Aas: amnia Fgado: amnia uria (menos txica) Interferentes:
Dieta proteica, metabolismo hidratao do paciente, sangramento gastrintestinal

uria:
catabolismo dos AAs (dieta rica em protenas, dano tecidual,
febre, terapia com corticosterides ou tetraciclina, absoro de sangramento intestinal, hormnios tiroideanos, sntese proteica),

desidratao

uria:
da nutrio proteica, doena heptica severa, uso de andrognios e hormnios do crescimento, gravidez

Ainda serve como medida grosseira da funo renal

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Aplicao Clnica
Uria
Causas Pr-renais:
Problemas circulatrios renais: Insuficincia cardaca congestiva, choque, hemorragia, desidratao, hipovolemia

Causas Ps-renais:
Obstruo Clculos renais, tumores na bexiga ou na prstata, infeces severas

Relao uria:creatinina
20: 1 30: 1 Doena renal intrnseca com balano nitrogenado estvel >40:1 causa pr-renal (remoo da uria reduz-se mais do que da creatinina) <20: 1 Insuf. Renal Aguda (uria difunde-se mais facilmente no gromrulo)
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Fisiologia Renal
4. Excreo do catabolismo proteico
Creatinina
Derivado da creatina:
Sintetizada no fgado e pncreas a partir de arginina, glicina e metionina Fosforilda no tecido muscular: reservatrio de alta energia Convertida rapidamente em ATP Creatina: 400 mg/100 g de msculo Converso espontnea: creatinina (2% ao dia)

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Aplicao Clnica
Creatinina
Proporcional massa muscular Lixo do metabolismo muscular Filtrada livremente no gromrulo, secretada muito pouco nos tbulos, no reabsorvida Variabilidade biolgica: <10% Aumento nos nvei sricos:
Perda de 50% da funo renal

Pouco sensvel para alterao leves e moderadas da taxa de filtrao gromerular (0,6 1,2 mg/dL)
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Fisiologia Renal
4. Compostos nitrogenados no proteicos
cido rico derivado da oxidao das purinas no fgado Reabsorvido (90%) no tbulo proximal e secretado no tbulo distal Insuficincia renal crnica avanada:
cido rico srico

Diurticos tiazdicos, probenicida salicilatos em altas doses e fenilbutazona:

excreo de cido rico

Eclmpsia ! Gota:
Hiperuricemia, deposio tecidual de uratos insolveis, ataques recorrentes de artrite, nefropatia e nefrolitase Primria (erro inato do metabolismo) ou Secundria ( da TFG e da secreo tubular, da destruio celular em leucemias, quimioterapia
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Mtodos
Dosagem do cido rico
Enzimtico (uricase) Oxidao do cido rico em alantona, H2O2, CO2

Absoro diferencial: c. rico absorve em 290 nm, alantona no Colorimtrico: Deteco do H2O2 com o-dianisidina, 3-metil-2-benzotiazolinona, N,N-dimetilalinina U.V. Oxidao do etanol em acetaldedo pelo H2O2, oxidao do acetaldedo e NADH em acetato e NAD+ pela aldedo desidrogenase homens 3,6 7,7 mg/dL (214 458 mol/L)

V.R.: soro
mulheres 2,5 6,8 mg/dL (149 405 mol/L)

Urina (colher com 20 mL de NaOH 10%) 250 750 mg (1,49 4,46 mmol) / 24 hs.
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Mtodos
Dosagem da Uria
Nitrognio ureico X uria
60 daltons (total): 28 daltons (N na uria) multiplicar NU por 2,146

Mtodo enzimtico U.V. (urease/glutamato desidrogenase):

Uria + H2O urease > (NH4)2CO3 NH4+ + c. -ceto-glutrico + NADH GLDH > ADP + H+ + NAD+

Reao cintica:
NH4+ endgeno () consumido rapidamente

V.R.: 10 36 mg/dL (1,8 6,1 mmol/L)

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Mtodos
Dosagem da Uria
Interferentes
Amnia (NH3)
Insuficincia heptica Contaminao bacteriana Detergentes comuns Lavao da vidraria

Vit. C
Reduz o H2O2
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Dosagem da creatinina
Reao de Jaff (1886)
Creatinina + picrato OH- > complexo de Janovski (vermelho - a laranjado)
Vit. C, piruvato, acetona, c. acetoactico, levulose, glicose, aminohipurato, c. rico, protenas, antibiticos bilirrubina e hemoglobina

Desproteinizao Adsoro com slica (Terra de Fuller, reagente de Lloyd) Cintico automatizado
lipemia, bilirrubina e hemoglobina

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Dosagem da creatinina
Reao de Jaff (1886)
Cuidados:
Estabilidade do picrato alcalino Oxidao Temperatura Bi-reagente? Linearidade

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Dosagem da creatinina
Dosagem da creatinina urinria
Reao de Jaff

Cintico automatizado
Alta variabilidade em relao ao contedo proteico Observar a curva de reao !

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Dosagem da creatinina
Reao de Jaff

absorbncia

tempo
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Rastreabilidade do Calibrador da Creatinina

Creatinina: Creatinina
calibrador rastrevel GC-ID/MS (IFCC) No altera interferncias por (Jaff):
Drogas Substncias endgenas
Glicose Ceotcidos Bilirrubina Hemoglobina Protenas
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Mtodos
Dosagem da creatinina
Mtodo Enzimtico:
creatinina amidohidrolase (creatinase ou creatinina hidrolase); creatinina deaminase (creatinina iminohidrolase) oxidao do NADH

V.R.: <12 anos

homens mulheres

0,25 0,85 mg/dL 0,60 1,20 mg/dL 0,40 1,00 mg/dL

Pouco sensvel em alteraes leves da funo renal

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Filtrao gromerular
Testes de Clearance
Volume de plasma do qual uma substncia pode ser completamente eliminada na urina numa unidade de tempo Mede a filtrao gromerular ou a secreo tubular O melhor teste para avaliar dano gromerular difuso leve moderado Ideal para medir a TFG: susbtncia filtrada livremente mas no secretada, reabsorvida, degradada ou sintetizada pelos tbulos
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Mtodos
Clearance de Inulina
Uma polifrutose que tem as carratersticas ideais para medir a TFG Deve ser introduzida por infuso venosa Raramente utilizada Gold standard para valores de referncia Semelhante: iotalamato
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Mtodos
Clearance de Creatinina
Endgena, filtrada livremente, variabilidade biolgica pequena, secretada pelos tbulos
Superestima a TFG em 15% em indivduos normais Situaes de proteinria intensa: secreo de creatinina, pode superestimar a TGF em 100% !

Cuidados:
coletar a urina de 24 hs. corretamente No esquecer do sangue ! Corrigir o resultado com a superfcie do indivduo (nomogramas ou Frmula de DuBois):

Superfcie = Peso (kg) 0,425 x Altura0,725 x 0,007184 Clearance corrigido: C (mL/min./1,73 m2)= C ur x V (mL) x 1 x 1,73 C soro t(min.) S Caio Cordova - cmcordova@furb.br

V.R.
Clearance de Creatinina
Idade
2-30 dias: 1-6 meses: 7-12 meses: 1-3 anos: 4-12 anos: 40-58 mL/min./1,73 m2 57-97 mL/min./1,73 m2 81-125 mL/min./1,73 m2 96-138 mL/min./1,73 m2 122-154 mL/min./1,73 m2

Mulher > 12 anos: 70-130 mL/min./1,73 m2 Homem > 12 anos: 75-130 mL/min./1,73 m2
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Estimativa da TFG
Creatinina isolada*
Cockcroft-Gault
Depurao de creatinina = [(140 - idade) x peso]/creatinina srica x 72 (x 0,85 para mulheres)

MDRD (frmula completa)

TFG = 170 x creatinina srica-0,999 x idade-0,176 x BUN-0,170 x albumina srica0,318 x 0,762 (se mulher) x 1,18 (se afro-americano)

MDRD (frmula simplificada)

TFG = 186 x creatinina srica-1,154 x idade-0,203 x 0,742 (se mulher) x 1,212 (se afroamericano) * No so aplicveis a pacientes que se encontrem em situao de instabilidade da funo renal, ou IR aguda
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J Bras Nefrol, Vol XXVI - n 3 - Supl. 1 - 2004

Calibrador rastrevel (IDMS) e eTFG

Calibrador IDMS fornece resultados de creatinina 1010-20% menores Algumas Frmulas corrigidas (IDMS(IDMS-rastreveis) rastreveis) esto disponveis: disponveis:
MDRD 44-parametros (adultos) adultos) CKDCKD-EPI (adultos) adultos) Interim Schwartz (crianas ) (crianas) Equaes corrigidas para mtodos enzimticos No h verso corrigida para MDRD 66-parametros, parametros, CockcroftCockcroftGault, Gault, Schwartz original ou outras equaes Superestimam a TFG
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Qual equao usar para adultos?

MDRD (1999, 2006 para calibrao com IDMS)
Subestima a TFG nos estgio iniciais (1 e 2) No confivel para eTFG >60 mL/min/1.73m2

CKD-EPI (2009)
Mais exata que a TFG medida Comprovada por 26 estudos, com subgrupos (idade, sexo, etnia, diabetes, transplante)

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MDRD: eTFG = 186*(0,742 se mulher)*(1,212 se negro)*creatinina-1,153*idade-0.203 CKD-EPI: eTFG = 141 x min(Creat/k, 1) a x max(Creat/k, 1)-1.209 x 0.993 idade x 1,018 [se
mulher] x 1,159 [se negro]
k= 0,7 p/ mulher e 0,9 p/homens; a = -0,329 p/ mulher e -0,411 p/ homens;

http://www.nephromatic.com/egfr.php

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O NKDEP recomenda relatar a eTFG com a creatinina

100 Percent of laboratories reporting eGFR 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2003 2005 2007 2008 2009 2010
College of American Pathologists Survey C-B 2010
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3 20 50 70

CAP Chemistry Survey Participants

77 80

Efeitos de relatar a eTFG

Estudo em Alberta, Canada (n = 1,1 M) Aumento de 68% de busca ao nefrologista 62% tinham eTFG <30 mL/min/1.73m mL/min/1.73m2 Dentre estes (eTFG <30 mL/min/1.73m mL/min/1.73m2) Aumentou a procura de mulheres No houve mudanas para homens Maior procura com 4646-65 e 86 anos A maioria com hipertenso, hipertenso, diabetes, e outras cocomorbidades
Hemmelgarn et al. JAMA 2010;303:1151-8.
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Proteinria

Proteinria
Preferencialmente de 24 hs

Relao Protena/Creatinina
Ref.: < 200 mg/g

Qual mtodo usar ?

cido sulfosaliclico 3%
Mais sensvel para albumina (4x mais) Albumina ~ globulinas Albumina ~ globulinas
J Bras Patol Med Lab 41(2): 99-103, 2005.

cido tricloroactico 20% Vermelho de Pirogalol

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FIltrao gromerular
Ultrafiltrado: 10 mg/L de albumina 140 L/dia = 1,4 L/dia

Sangue: 45.000 mg/L de albumina

Slide cortesia de Glen Hortin Caio Cordova - cmcordova@furb.br

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Processos tubulares
Reabsoro de 99% da Albumina

Albumina
10 mg/L em 140 L

TammHorsfall Enzimas Proteases Peptdeos Exosomos

10 mg/L em 1.4 L Reabsoro de 99% da gua e outras subst. Concentrao dos dejetos na urina
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Slide cortesia de Glen Hortin

Microalbuminria

Microalbuminria
Albuminria entre 30 e 300 mg/24 hs
Ou relao albumina/creatinina (RAC)
30-300 mg/g Creatinina
(segunda urina da manh)

Falso (+) de 11 a 32%

Nefropatia diabtica Aterosclerose

Imunoturbidimetria ou nefelometria ? Sensibilidade x pr-zona !

J Bras Patol Med Lab 41(2): 99-103, 2005.

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Microalbuminria
Microalbuminria

mg/L mg/dl

mg/L

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Microalbuminria

Microalbuminria
Dificuldades
Coleta da urina de 24 hs Valor de corte nico emprico (30 mg/g)
Variaes em rel. a sexo, idade, etnia, exerccio

Amostra isolada qual usar?

Primeiro jato, amostra aleatria

RAC varia menos com primeira urina da manh.

Nephrol Dial Transplant (2009) 24: 717718

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Qual amostra de urina usar ?

CVs intraintra-individuais
100 P = < 0.01 P = < 0.01

CV intra-individual (%)

80 P = 0.58 60

N=250 Hipertenso estvel

40

20

0 24-hs 1 (manh) Outras (manh)

Albumina/creatinina
Witte, Gansevoort et al, JASN 2009;20:436-43 Caio Cordova - cmcordova@furb.br Slide cortesia de Greg Miller

Microalbuminria

Microalbuminria
Dificuldades Estabilidade
Albuminia adsorve superfcies plsticas ! Impacto ? Proteases na amostra Estvel 7 dias a 4C a -20C no h certeza
Nephrol Dial Transplant (2009) 24: 717718

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Microalbuminria
Falta de calibradores rastreveis para urina
Todos calibram com Albumina srica (CRM 470, Institute for Reference Materials and Measurements, Belgium) diluda (em que?)

Qual albumina dosar?

Ligada acidos graxos, bilirrubina, hormnios, ons, drogas Forma dmeros consigo mesma e conjuga com outras molculas (grupos tiol) glicada em vrios graus Fragmentos truncados identificados no plasma e na urina A filtrao gromerular depende do tamanho e da carga da molcula

Qual eptopo o seu imunoensaio detecta?

Ao menos 5 stios antignicos Formas no imunognicas de albumina presente
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Microalbuminria
Sugestes:
Mudar o termo para: Albumina urinria
Macroalbuminria: forma grande? Microalbuminria: forma pequena de albumina?
Termo deriva da sensibilidade das tiras de urina Acarretou no V.R. arbitrrio No necessariamente reflete a condio clnica

Padronizar o laudo (ao menos por regies)

mg/g ?
Nephrol Dial Transplant (2009) 24: 717718

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Cenceito da Doena Renal

Hipertenso Anemia Malnutrio Desordem sseas Complica es Complica Complicaes

DCV

Estgio: TFG:
Normal Normal

1 90
Risco Risco aumentado aumentado

2 60-89
Dano Dano

3 4 5 30-59 15-29 <15 mL/min/1.73m2

TFG TFG Falncia Falncia Renal Renal Morte Morte

Hipertenso Diabetes DCV Evoluo prevenvel

Urina Alb:Creat >30 mg/g

eTFG <60 mL/min/1.73m2

>3 meses

Complicaes e progresso prevenveis

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National Kidney Foundation. K/DOQI Clinical Practice Guidelines for Chronic Kidney Disease: Evaluation, Classification and Stratification. Am J Kid Dis 2002;39 (suppl 1): S1-S266. (Slide cortesia de Greg Miller)

Mortalidade x eTFG ou albuminuria

Todas as causas: eTFG
21 cohorts Gen population N = 1.2 M

All-cause mortality: ACR

Cardiovascular: eTFG

Cardiovascular mortality: ACR

15

30

45 60 75 90 105 120 2.5 5 eTFG (mL/min/1.73m2)

10

30 ACR (mg/g)

300

1000

www.thelancet.com online 18/05/2010 DOI:10.1016/S0140-6736(10)60674-5

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Mortalidade x eTFG ou albuminuria

Todas as causas : eTFG
21 cohorts Gen population N = 1.2 M

Todas as causas : RAC

Cardiovascular: eTFG

Cardiovascular: RAC

15

30

45 60 75 90 105 120 2.5 5 eTFG (mL/min/1.73m2)

10

30 RAC (mg/g)

300

1000

www.thelancet.com online 18/05/2010 DOI:10.1016/S0140-6736(10)60674-5

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Preciso dos Imunoensaios

CAP Survey, dentre laboratrios, por mtodo
30 Among laboratory CV, % 25 20 15 10 5 0 0 20 40 60 80 100 Peer group mean, mg/L
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Inst. 1 (N=11) Inst. 2 (N=79) Inst. 3 (N=69) Inst. 4 (N=194) Inst. 5 (N=59) Inst. 6 (N=59) Inst. 7 (N=44) Inst. 8 (N=39) Inst. 9 (N=207) Inst. 10 (N=112) Inst. 11 (N=86) Inst. 12 (N=123) Inst. 13 (N=82) Inst. 14 (N=18) Inst. 15 (N=66)

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Albumina urinria trabalho em andamento

Variabilidade intra-individual, requisitos para coleta de amostra, requisitos de desempenho das metodologias Harmonizao dos Imunoensaios comerciais, influncia das formas de albumina e da matriz da urina VR e limites de deciso clnica em relao : idade, sexo, etnia, co-morbidades Desenvolvimento de um sistema de referncia JCTLM
(Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine )

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Novos marcadores
BetaBeta-2-microglobulina
Br Med J (Clin Res Ed). 1981; 282(6258): 9598

CistatinaCistatina-C
Inibidor de protease no glicosilada de baixo peso molecular (13KDa) Menos interferentes que creatinina
massa muscular, sexo, certos antibiticos, bilirrubinas, cetonas

Monitoramento de transplantes
Braslia Med 2009;46(1):46-53

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eTFG com Cistatina C

Produzida constantemente por todas as clulas nucleadas Filtrada livremente pelo gromrulo Completamente reabsorvida e catabolizada pelos tbulos proximais (quando funcionalmente intactos) intactos) No secretada pelos tbulos proximais Influncia mnima de massa muscular e dieta Independente de idade >1 ano Excelente marcador para TFG
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Marcadores renais em crianas (n=258)

CistatinaCistatina-C Creatinina

Bokenkamp et al. Pediatr Nephrol 1998;12:125-9

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Limitaes da Cistatina C
Influenciada por disfuno na tiride e com glicocorticides (e possivelmente em outras condies) condies) Influncia por sexo ou etnia no muito certa No um analito dosado frequentemente

Os resultados discordam com mtodos diferentes

Equaes para eTRG foram sugeridas mas: mas: Est limitada ao mtodo usado para desenvolver a equao No validado em grande escala
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Padronizao da Cistatina C
Grupo de trabalho IFCC (chair: A. Grubb) Material de referncia ERMERM-DA 471/IFCC (IRMM)
Cistatina C humana recombinante em pool de soro humano estabilizado e delipidado Concentrao: Concentrao: 5,48 0,15 mg/L Avaliao em processo Equao para eTFG em processo

EsperaEspera-se que os fabricantes estabeleam a rastreabilidade com este novo MR

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Performance analtica de 4 ensaios automatizados para a dosagem da Cistatina C

CV (%) medido/relatado (bula):
5,0 / 2,4 ; 6,6 / 2,83 ; 8,9 / 2,3 ; 5,6 / 3,7

Clin Chem 56(8): 1336-9, 2010 Caio Cordova - cmcordova@furb.br

eTFG em crianas
Mais afetada pelo resultado mais baixo de Creatinina IDMSIDMS-rastrevel A combinao da calibrao com IDMS e a no correo do baixo teor proteico (Jaff) Jaff) pode resultar em eTFG at 40% mais alta em crianas Superestima a funo renal das crianas

A equao original de Schwartz, ou outras frmulas peditricas no podem ser usadas com calibrao IDMSIDMS-rastrevel. rastrevel.
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Nova equao peditrica

Em desenvolvimento pelo projeto Chronic Kidney Disease in Children (CKiD) CKiD) (PI - G. Schwartz) TFG 1010-90 mL/min/1.73m2 medida com iohexol (contraste Omnipaque Omnipaque ) Dosagem da creatinina por mtodo enzimtico com calibrador rastrevel por IDMS Poder usar creatinina e cistatina C A padronizao das dosagens da Cistatina C dever acontecer antes da aplicao da nova equao. equao.
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Interim Schwartz
eTFG = 0,41 * (altura (altura / creatinina)
Altura em cm. Creatinina em mg/dL com mtodo enzimtico (sem influncia do efeito das protenas sricas) sricas) com calibrador IDMSIDMS-rastrevel Pode ser usada com qualquer mtodo IDMSIDMS-rastrevel Aplicvel de 15 a 80 mL/min/1,73m2 Calculador disponvel no site do NKDEP Pacientes com IR moderada
Schwartz, et al. J Am Soc Nephrol 2009;20:629-637. Caio Cordova - cmcordova@furb.br

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Obrigado pela ateno !

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Declarao de conflitos de interesse

Empregador ou Chefia:
Nada a declarar

Consultoria:
Laboratrio de Anal. Clin. Sta. Isabel, Blumenau, SC

Propriedade de aes de empresas:

Nada a declarar

Honorrios recebidos:
Nada a declarar

Financiamento:
Nada a declarar

Perito legal:
Nada a declarar
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Caio M. M. de Cordova
Universidade de BlumenauBlumenau- FURB
Departamento de Cincias Farmacuticas

Tel.: (47) 3321-7318 cmcordova@furb.br

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