Relatrio Bioqumica

DOSEAMENTO DE PROTENAS POR ESPECTROFOTOMETRIA MOLECULAR

N.. 3190 Srgio Mendes
N.. 3194 Joo Mota
N.. 3210 Ricardo Rei
N.. 3249 Eugnio Guedes

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Resumo
Este trabalho tem como objectivo a determinao da
quantidade de protena numa amostra por espectrofotometria
molecular. Para tal foi utilizado um dos vrios mtodos
colorimtricos, o mtodo do Biureto, obtendo-se amostras de
azul prpura. Como a reaco do Biureto s ocorre na presena
de compostos com duas ligaes peptdicas, quanto menor for a
diluio maior ser a intensidade do azul.

Objectivo
O objectivo deste trabalho a determinao de protena
numa amostra, utilizando-se o mtodo do Biureto.


Reagentes:
Soluo padro de albumina de soro de bovino (BSA) 2 mg/ml
Soluo de protena de concentrao desconhecida
Solues de protena da clara do ovo e de soja
Reagente do Biureto

Material e equipamento:
Espectrofotmetro marca Hitachi 2001
Tubos de ensaio
Pipetas graduadas de 1 cm
3
/ 2 cm
3
Pipetador
Clulas de espectrofotmetro

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Introduo
O objectivo do nosso trabalho foi determinar a quantidade
de protena numa amostra atravs de um mtodo colorimtrico
para o doseamento de protenas em soluo. Neste caso o mtodo
que utilizamos na aula foi o mtodo do biureto. Este mtodo
reage com todos os conjuntos que contm duas ou mais ligaes
peptdicas formando uma cor azul prpura. A soluo proteica
tratada com ies Cu (II) num meio moderadamente alcalino. A
intensidade da cor produzida proporcional ao nmero de
ligaes peptdicas e, assim, ao nmero de molculas
peptdicas presentes na soluo.
Para calcular-mos a concentrao de protena numa amostra
utilizamos uma curva de calibrao que normalmente feita
utilizando uma soluo proteica padro de soluo aquosa de
albumina de soro bovino.
A espectrofotometria o mtodo de anlises ptico mais
usado nas investigaes biolgicas e fsico-qumicas. O
espectrofotmetro um instrumento que permite comparar a
radiao absorvida ou transmitida por uma soluo que contm
uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade
conhecida da mesma substncia. Neste trabalho utilizamos um
espectrofotmetro de marca Hitachi-2001 de feixe duplo. O seu
funcionamento veio simplificar muito a utilizao desta
tcnica analtica. Neste tipo de aparelhos uma radiao
monocromtica emerge da fonte e atravessa um sistema ptico
que designado por beam splitter que divide essa radiao em
duas de intensidade exactamente igual. Se o contedo de ambas
as clulas for igual, a intensidade do raio final ser nula.
Se uma das clulas contiver tudo menos o solvente que o
branco e a outra contiver o solvente e a substncia a dosear,
o resultado do raio vai estar apenas relacionado com a
substncia a dosear. Se tivermos um comprimento de onda
pertencente gama do visvel, a substncia a dosear tem que
ser corada. Na zona do visvel as clulas podem ser de vidro
ou de plstico. No caso de a gama de trabalho ser no
ultravioleta, teremos de utilizar clulas de quartzo, uma vez
que ocorre interferncia entre a radiao UV e o vidro, no
ocorrendo com o quartzo.
O tipo de molculas biolgicas em estudo foram as
protenas que so polipptidos de alto peso molecular ligados
entre si por ligaes peptdicas. As protenas so as
macromolculas mais abundantes e variadas nos seres vivos e
neles desempenham funes de extrema importncia. Estas
dividem-se em dois grandes grupos: albumina e globulinas quer
na forma livre ou actuando como protenas transportadoras.
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Procedimento experimental
A nossa aula prtica foi iniciada com uma breve
introduo, feita pela professora, a
indicar quais os procedimentos que
deveramos ter em relao
experincia que iramos realizar,
foram distribudas aleatoriamente
pelos grupos a elaborao dos tubos
de calibrao, ficando o nosso grupo
com a elaborao dos tubos 7 e 9,
estes contendo respectivamente 1,0
ml de BSA (soluo padro de
albumina de soro de bovino 2 mg/ml)
e 0,5 ml de gua e o outro 1,5 ml de
BSA este sem levar gua. Tivemos
tambm de preparar um tubo com a
amostra de protena, tendo este 1,0
ml de protena mais 0,5 ml de gua.
Para a elaborao dos tubos comeou-
se por recolher todo o material que
necessitvamos para a elaborao da nossa experincia (vide
fig. 1) identificando os tubos com os nmeros identificativos
dos tubos de calibrao que nos foram indicados e
identificando as pipetas
com o respectivo
reagente que foi
utilizado em cada uma
delas. Com a ajuda de
uma pipeta de 1 cm
3
e um
pipetador retirou-se 1,0
ml de BSA para o tubo 7,
depois com outra pipeta
de 1 cm
3
pipetou-se 0,5
ml de gua destilada
(vide fig.2) para o
mesmo tubo 7, agitou-se
o preparado e ps-se a
repousar no suporte para
tubos de ensaio. Para a
preparao do tubo 9
usou-se uma pipeta de 2 cm
3
e um pipetador e pipetou-se 1,5 ml
de BSA (vide fig.3) este tubo no levou gua, pousando-o de
seguida no suporte de tubos.
Fig.1: Material utilizado para a
preparao das amostras.
Pipetador, pipetas e tubos de
ensaio e seu respectivo suporte.
Fig.2 e 3: Pipetao de gua destilada seguida de
pipetao da soluo de BSA
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Posto isto preparou-se o tubo 10 (com a amostra de
protena) este contendo 1,0 ml de
protena que foi pipetada com uma nova
pipeta de 1 cm
3
e juntou-se neste tubo
0,5 ml de gua com uma nova pipeta de 1
cm
3
, homogeneizou-se e pousou-se no
suporte para tubos de ensaio. Depois
desta fase tivemos de aguardar enquanto
os nossos colegas acabavam de fazer a
preparao dos seus tubos para a curva
de calibrao, devido necessidade que
existe em se adicionar o biureto aos
tubos de ensaio com as preparaes a
todos ao mesmo tempo. Depois da adio
do biureto aos tubos de ensaio, que foi
pipetado com um pipetador electrnico
ajustado para pipetar 1,5 ml deste
reagente (vide fig. 4), agitou-se para
homogeneizar a preparao e deixou-se
em repouso cerca de 20 minutos.
Depois de todo este procedimento
a professora juntou-nos volta do
espectrofotmetro para nos dar uma
breve explicao de como funcionar
com este. Em seguida cada grupo
escolheu um comprimento de onda com o
qual iria trabalhar para medir os
pontos de calibrao em Abs. Ento
comeou-se por passar todas as
preparaes para clulas do
espectrofotmetro, tubo 1 para a
clula 1, tubo 2 para a clula 2,
assim consequentemente at ao
ltimo tubo, em seguida
passou-se para a determinao
do branco experimental, para
isto, e depois do
espectrofotmetro estar
ligado, escolheu-se a opo
PHOTOMETRY do menu inicial
(vide fig.6) e carregou-se
Enter e em seguida apareceu-
nos outro menu no qual na
primeira opo que era DATA
MODE (vide fig.7) foi
escolhida e aps a verificao
do tipo de leitura que
queramos fazer, mudou-se para
absorvncia devido a estar
Fig.4: Adio do reagente biureto s
amostras previamente preparadas.
Fig.6: Imagem do monitor do espectrofotometro,
imagem retirada de Santana, M.A., (2003), Como
operar com o espectrofotmetro HITACHI U-2001
, Santarm.
Fig.5: Clulas. Imagem retirada de
Santana, M.A.; Pinto, M.P.,
(2008), Doseamento de protenas
por espectrofotometria molecular,
Santarm.

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configurado para transmitncia e
carregou-se enter e seleccionou-
se a opo que nos permitia fazer
uma leitura em absorvncia (ABS),
em seguida voltamos para o menu
principal e entrou-se em
PHOTOMETRY e seleccionou-se a
opo 2 TEST SETUP para se
definir o comprimento de onda que
se pretende trabalhar, inseriu-se
550 nm porque dentro do espectro
com o qual se queria trabalhar
foi o que nos pareceu mais
correcto, mais uma vez voltou-se
ao menu principal e escolheu-se
desta vez a opo 8 INST SETUP
para se defenir as variveis do
aparelho, escolhendo aqui a opo USER esta em que o
utilizador que define todas as variveis do aparelho,
definindo tambm o On na opo de TEXT PRINT para que
sejam impressos os valores medida que vo sendo lidos pelo
aparelho. Depois de termos estas opes todas definidas
carregou-se no boto Forward para passar ao menu de leitura.
Depois do espectrofotmetro estar
configurado para a preparao procedeu-
se ento aferio do zero para nos dar
apenas a indicao da nossa soluo,
ento ps-se uma clula com a soluo
branco na cmara da parte de trs e
outra clula tambm com a soluo branco
na clula da parte da frente e procedeu-
se obteno do zero carregando na
tecla Auto-zero. Depois de aferirmos o
zero do espectrofotmetro comeou-se a
fazer as leituras de absorvncia de
todos os tubos que foram preparados
anteriormente (vide fig.8), tendo o
cuidado de limpar com um pouco de papel
as clulas antes de as colocar na cmara
do espectrofotmetro agarrando pela zona
estriada. Depois de termos todos os
valores impressos foi s fazer uma
tabela no Excel com os valores dos mg de BSA utilizados em
cada amostra e com os valores da absorvncia que nos deu para
550 nm e fazer uma regresso para nos dar um grfico de onde
pudssemos aferir se tudo foi realizado conforme o protocolo e
se os valores obtidos foram os esperados.
Fig.7: Imagem do monitor do espectrofotometro,
imagem retirada de Santana, M.A., (2003), Como
operar com o espectrofotmetro HITACHI U-2001
, Santarm.
Fig.8: Colocao das clulas no
espectrofotmetro.
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Varivel X 1 Desenho de linha ajustada
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 1 2 3 4
X 1 - mg de protena
Y

-

A
b
s
o
r
v

n
c
i
a

e
m

n
m
Y
Y previsto
Apresentao e tratamento de resultados

Curva de calibrao

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mg protena -- 0,2 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2.4 3,0
Abs (550nm) -- 0,020 0,042 0,081 0,118 0,162 0,181 0,231 0,275

Soluo de protena de concentrao desconhecida

Tubo 10
ml de soluo 1,0
Abs (550 nm) 0,229

Curva padro das absorvncias em funo de mg de protena





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Sumrio dos resultados


Estatstica de regresso
R mltiplo 0,997862507
Quadrado de R 0,995729584
Quadrado de R ajustado 0,995017847
Erro-padro 0,00634853
Observaes 8



gl SQ MQ F F de significncia
Regresso 1 0,056385677 0,056386 1399,015 2,43757E-08
Residual 6 0,000241823 4,03E-05
Total 7 0,0566275



RESULTADO RESIDUAL

Observao Y previsto Residuais
1 0,024756637 -0,004756637
2 0,042995575 -0,000995575
3 0,079473451 0,001526549
4 0,115951327 0,002048673
5 0,152429204 0,009570796
6 0,18890708 -0,00790708
7 0,225384956 0,005615044
8 0,28010177 -0,00510177
9 0,249750286 -0,020750286



Clculo da concentrao de protena da soluo desconhecida




y = mx + b
y = 0.091x + 0,007
y = 0,091X0,229 + 0,007
y = 0,028 mg/ml

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Discusso e concluso

Depois de todos os procedimentos e clculos efectuados e a
regresso linear tambm efectuada podemos afirmar que o mtodo
utilizado um mtodo muito sensvel devido facilidade com
que pudemos alterar um dos factores, por exemplo o tempo de
espera depois da colocao do biureto ou a colocao do
biureto nos tubos de ensaio com as preparaes em tempos
diferentes, ou no caso de factores qumicos que podem ser
responsveis pela alterao dos valores como por exemplo a
presena de impurezas no mesmo comprimento de onda que a
amostra e concentraes elevadas que tendem a deslocar o
equilbrio para valores negativos ou positivos provocando
assim a curvatura da recta que est patente no grfico, sendo
esta uma das restries da equao de Beer-Lambert. Como no
caso da nossa experincia essas variaes no foram muito
evidentes, como se pode observar com os resultados obtidos na
regresso que fizemos com os valores de absorvncia a 550 nm e
com os valores dos mg de protenas utilizadas em cada tubo de
ensaio, o que tambm faz com que os desvios lei de Beer-
Lambert sejam muito reduzidos, em que nos dado o valor
residual que da ordem dos 10
-3
em relao ao valor esperado o
que muito bom para um mtodo to sensvel como o com o
espectrofotmetro, tal como o pequeno valor da ordenada na
origem na recta, um bom indicador do sucesso da experincia.
Pode-se concluir assim que a experincia efectuada teve
resultados prximos do excelente, devido aos diminutos erros e
desvios, o que da tambm advm a qualidade, o cuidado e o
rigor dos operadores no cumprimento de todos os passos do
procedimento protocolar.

Bibliografia
Santana, M.A., (2003), Como operar com o espectrofotmetro
HITACHI U-2001 , Santarm;
Santana, M.A.; Pinto, M.P., (2008), Doseamento de protenas
por espectrofotometria molecular, Santarm;
Santana, M.A.; Pinto, M.P., (2007) Noes De
Espectrofotometria, Santarm.