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c
i
a
(
5
4
6
n
m
)
Figura 1 Comportamento cintico do reagente de Lactato aps adio de amostra biolgica (Reao de Ponto Final)
O reagente apresentou ponto final da reao em trs minutos e permaneceu estvel at sete
minutos com absorvncia de aproximadamente 0,500A. preconizado que a reao atinja ponto final
no mximo em cinco minutos, sendo assim, o reagente em desenvolvimento atendeu a especificao.
Teste de repetibilidade onde forma obtidos os seguintes resultados: Mdia de 46,2 mg/dL,
Desvio Padro de 2,14 mg/dL e Coeficiente de Variao de 4,64%. Os resultados podem ser
visualizados na Figura 2:
39,74
41,88
44,02
46,16
48,3
50,44
52,58
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Anlises
V
a
l
o
r
e
s
Figura 2 Teste de preciso mostrando a distribuio das vinte dosagens de uma amostra em torno da mdia no eixo Y e
com escalas de trs desvios padres abaixo e acima da mdia
No teste de preciso foi obtido coeficiente de variao de 4,64% atendendo ao determinado
pelo setor de Pesquisa e Desenvolvimento da BioTcnica e pelo Manual do Controle de Qualidade
BIOTCNICA (2008), que de no mximo 5% e a disperso das determinaes em torno da mdia
no mostram tendncias de elevao ou diminuio em determinaes em seqncia. Alm disto,
nenhuma delas ultrapassa os limites de trs desvios padres conforme especificaes internas da
BioTcnica e Regras de WESTGARD (1981). A obteno de baixo coeficiente de variao indica
baixo erro aleatrio.
Os resultados obtidos no teste de linearidade esto demonstrados no Grfico 3:
R
2
= 0,9994
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 25 50 75 100 125
Concentr ao (mg/dL)
A
b
s
o
r
v
n
c
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a
(
5
4
6
n
m
)
Figura 3 Linearidade: correlao entre as absorvncias obtidas e as concentraes de Lactato (Coeficiente de correlao
r = 0,9997)
No teste de linearidade os resultados obtidos mostram leituras de absorvncias lineares no
intervalo de concentrao de zero a 120 mg/dL e r= 0,9997 demonstrando comportamento linear neste
intervalo. Para este mtodo o coeficiente de variao r foi maior que 0,99 conforme determinado no
Manual de Validao do setor de Pesquisa e Desenvolvimento da BioTcnica.
Os resultados obtidos no teste de exatido encontram-se na Tabela 2.
Tabela 2 - Exatido: determinao da concentrao de Lactato em relao aos soros controles e seus respectivos desvios em
relao ao valor esperado (Recuperao)
Amostra Valor obtido Valor esperado Desvio Recuperao
Soro Controle um 11,8 mg/dL 11,4 mg/dL 3,50% 103,5%
Soro Controle dois 38,2 mg/dL 37,9 mg/dL 0,79% 99,21%
Soro Controle trs 13,8 mg/dL 13,7 mg/dL 0,73% 99,27%
O teste apresentou desvios de 3,5%, 0,79% e 0,73% para os soros controles um, dois e trs
respectivamente, demonstrando baixo erro sistemtico em relao ao valor esperado e de acordo com o
preconizado no Manual de Validao de produtos da BioTcnica que de 10% para este analito.
Os resultados obtidos no Teste de Estabilidade do Calibrador de Lactato esto demonstrados
na Figura 4:
Estabilidade CALIBRADOR - Lactato
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
50,00
55,00
60,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Tempo ( dias)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o
(
m
g
/
d
L
)
2 a 8 oC Plstico
37oC Plstico
37oC Vidro
Figura 4 Teste de Estabilidade de Calibrador de Lactato em condies de estresse
(Absorvncia em funo do Tempo em dias)
No teste de Estabilidade do Calibrador de Lactato a concentrao inicial foi de 38,0 mg/dL.
Aps sete dias, as amostras de Calibrador que foram colocadas em estufa a 37C obtiveram queda na
concentrao para 37,1 mg/dL (em frasco de plstico) e para 37,4 mg/dL (em frasco de vidro) no
sendo esta queda significativa devido s variaes intra-ensaio, que so da ordem de aproximadamente
3% (~1,11 mg/dL) e variaes de calibrao do equipamento da ordem de 5% (~1,85%). Na amostra
refrigerada a concentrao obtida aps sete dias foi de 41,8 mg/dL. Aps 20 dias as amostras
obtiveram mesma concentrao. Aps 27, 34 e 41 dias a amostra de Calibrador de Lactato em
condio de estresse e em frasco de vidro obteve uma queda significativa na concentrao. Portanto o
Calibrador de Lactato tem maior estabilidade quando envasado em frasco plstico, mesmo em
condies de estresse.
Os resultados obtidos no Teste de Sensibilidade Metodolgica do Reagente de Lactato esto
demonstrados na Tabela 3 e na Figura 5:
Tabela 3 - Dados referentes Figura 5: Teste de Sensibilidade Metodolgica do Reagente de Lactato
Mdia de cinco replicatas(mg/dL) CV (%)
1,66 3,30
3,4 0
6,46 1,38
12,7 0,56
24,82 1,96
Figura 5 Anlise Estatstica do Teste de Sensibilidade Metodolgica do Reagente de Lactato. Grfico da mdia das
dosagens de amostras de baixa concentrao de Lactato em funo do Coeficiente de Variao (CV) de tais amostras
Os resultados obtidos no Teste de Sensibilidade (ou limite de deteco) Metodolgica do
Reagente de Lactato, de acordo com a Tabela 3 e a Figura 5, mostram uma replicata de maior
Coeficiente de Variao foi a mdia de 1,66 mg/dL, sendo este valor aproximado a sensibilidade o
Reagente de Lactato, j que a sensibilidade se refere a variao da resposta de um mtodo de medio
que possvel se medir.
Os resultados obtidos no Teste de Correlao do Reagente de Lactato BioTcnica
(Metodologia Trinder) em relao a um reagente de Lactato (Metodologia LDH UV Lactato
Desidrogenase Ultra violeta), esto demonstrados na Figura 6:
Teste de Correlao - Lactato
Y = 0,945X + 2,1316
R
2
= 0,9946
R = 0,9973
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
Biotcnica LOD POD (mg/dL)
L
D
H
U
V
(
m
g
/
d
L
)
Figura 6 - Teste de Correlao do Reagente de Lactato Trinder BioTcnica e Reagente de Lactato LDH UV (Lactato
Desidrogenase Ultra violeta)
No Teste de Correlao do Reagente de Lactato Trinder BioTcnica que apresenta como
princpio do mtodo a reao do Lactato com a Lactato oxidase e a Peroxidase e leitura em
espectrofotmetro em 546 nm com um reagente de Lactato que tem como princpio do mtodo a
oxidao do Lactato pela Lactato Desidrogenase e leitura em 340 nm, o r obtido foi de 0,9973
demonstrando comportamento linear e atendendo aos requisitos do Manual de Validao de Reagente
da BioTcnica que de r no mnimo de 0,99. O reagente Lactato BioTcnica apresentou valores
correspondentes aos obtidos pelo reagente de Lactato LDH UV.
Os resultados obtidos no Teste de Reprodutibilidade encontram-se na Tabela 3:
Tabela 4 - Teste de Reprodutibilidade do Reagente de Lactato BioTcnica
Teste de Reprodutibilidade
Tempo (dias) Resultados (mg/dL)
Um 27,35
Dois 29,20
Trs 30,26
Quatro 28,60
Cinco 29,41
Mdia (mg/dL) 28,96
Desvio Padro (mg/dL) 1,08
Coeficiente de Variao (%) 3,73
No Teste de Reprodutibilidade um dos parmetros modificado para avaliar o comportamento
analtico do reagente. No caso dos resultados apresentados na Tabela 4 o teste foi realizado usando um
mesmo sistema analtico (Equipamento, operador, calibrador, etc) variando-se somente o dia. Foi
obtido coeficiente de variao de 3,73% atendendo as especificaes do Manual de validao do setor
de Pesquisa e Desenvolvimento da BioTcnica que de no mximo 5%. Este resultado demonstra que
o sistema analtico, que inclui o reagente em anlise estvel mesmo aps um determinado intervalo
de tempo.
5. Consideraes Finais
Neste trabalho foram revisadas as caractersticas gerais das enzimas e exploradas as suas
diversas aplicaes na cincia e na indstria. Ateno especial foi dada aplicao destas em
diagnstico molecular conforme explicaes mais detalhadas que seguem.
Aps a pesquisa e o desenvolvimento de metodologia Trinder para a dosagem do Lactato (um
analito plasmtico encontrado em diversas patologias ou situaes de estresse fsico), a formulao
proposta para o produto apresentou desempenho adequado, demonstrado nos testes de: exatido,
sensibilidade, especificidade, estabilidade, linearidade, reprodutibilidade, etc.
O desenvolvimento do reagente para dosagem de Lactato foi possvel devido alta
especificidade enzimtica que utiliza enzimas como a Peroxidase e a Lactato oxidase, demonstrando a
importante aplicao das enzimas no Diagnstico Molecular dentre as diversas reas. A otimizao e
estabilizao das enzimas em meio lquido foi possvel atravs da formulao desenvolvida na
BioTcnica de acesso restrito. Verificou-se que a metodologia enzimtica-colorimtrica para dosagem
de lactato atendeu de modo satisfatrio a determinao para o Diagnstico Clnico, o que possibilitou
sua utilizao na rotina laboratorial. Os procedimentos de validao, Controle de Qualidade e controle
estatstico foram perfeitamente aplicveis a essa metodologia e forneceram dados que garantem a
qualidade do processo analtico. Os laboratrios puderam, ento, adquirir reagentes confiveis para a
determinao de lactato dos seus pacientes.
A preveno de erros no desenvolvimento do reagente enzimtico implica na criao de
Processos Analticos capazes de atingir os requisitos da qualidade para a Produo de reagentes e
consequentemente resultados de utilidade mdica. uma atitude que determina a qualidade inerente
dos processos de medidas.
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