CRISTIANE DOS SANTOS GIUBERTI

ESTUDO DA ESTABILIDADE E PRODUO

PILOTO DE LIPOSSOMAS pH-SENSVEIS
FURTIVOS DE CISPLATINA





















Belo Horizonte
Faculdade de Farmcia da UFMG
2007


CRISTIANE DOS SANTOS GIUBERTI










ESTUDO DA ESTABILIDADE E PRODUO
PILOTO DE LIPOSSOMAS pH-SENSVEIS
FURTIVOS DE CISPLATINA



























Belo Horizonte
Faculdade de Farmcia da UFMG
2007
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-
Graduao em Cincias Farmacuticas da
Faculdade de Farmcia da Universidade
Federal de Minas Gerais, como requisito
parcial obteno do grau de Mestre em
Cincias Farmacuticas.

Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Mnica Cristina de
Oliveira
Co-orientador: Prof. Dr. Gilson Andrade
Ramaldes











































Dedico este trabalho a minha famlia,
as pessoas mais importantes da minha vida:

Aos meus pais, Jonas e Janir
s minhas irms, Mrcia e Patrcia
Aos meus irmos, Jonas e Jardel
Ao meu cunhado Lucas (in memorian)
E s minhas sobrinhas Letcia e Luiza.





AGRADECIMENTOS


A Deus, agradeo pela minha vida e pela realizao deste trabalho.

minha famlia, por me apoiar, me aconselhar, me valorizar e por entender minha ausncia.

s minhas amigas de repblica Danielle, Denise, Paola, Janana Lbe, Janana Scaramussa e
Grazielle, pela acolhida, enorme amizade e pela convivncia.

Aos amigos da Faculdade de Farmcia da UFMG, especialmente queles do Laboratrio de
Qumica Farmacutica, do Laboratrio de Controle de Qualidade e do Laboratrio de
Radioistopos.

Rute, Maria Anglica, Danielle e Paola por me ajudarem no estudo para a seleo do
mestrado.

Aos meus amigos do laboratrio lvaro, Elaine, Las, Talita, Svia, Berta, Guilherme Diniz,
Soninha, Jos Geraldo, Guilherme Carneiro, Erly, Vanessa, Cristiane Moraes, Dlia, Gisele,
Martinha, Isabel, Andra, Daniel, Juliana, Ricardo, Viviane, Laurinha, Diego, Samuel, rica e
Helena, por tudo o que vivenciamos juntos.

Ao Eduardo, tcnico responsvel do LTF e Elaine, grande amiga, por toda a colaborao,
principalmente pela cumplicidade e pelas horas dispensadas produo piloto.

Ao Gilson, meu co-orientador, pelo carinho e disponibilidade em sanar minhas dvidas.

Aos professores, Vildete e Lucas, agradeo por toda contribuio cientfica.

minha orientadora, Mnica, por eu ter encontrado nela uma profissional em quem me
espelhar, por todo o carinho, acolhida e fora doada para a realizao e continuao deste
trabalho.

Ao Prof. Marcelo Santoro, pela gentileza de disponibilizar os equipamentos do Laboratrio
de Enzimologia e Fsico-qumica de Protenas (ICB/UFMG) e ao Jamil, pela presteza e
disposio em me auxiliar na utilizao da ultracentrfuga.

CAPES, pelo financiamento da minha bolsa de estudos.

FAPEMIG, FINEP e ao CNPQ, pelo apoio financeiro.












RESUMO

Cisplatina (CDDP) um frmaco antineoplsico utilizado no tratamento de cncer de ovrio,
testculo, cabea, pescoo e pulmo. A encapsulao da CDDP em lipossomas uma
alternativa para burlar os efeitos colaterais graves e o desenvolvimento de resistncia ao
frmaco, que limitam a sua utilizao. Contudo, a instabilidade fsica (agregao/fuso) e
qumica (hidrlise/peroxidao) limitam o uso destes sistemas carreadores como produtos
farmacuticos. O preparo de formas farmacuticas liofilizadas uma estratgia empregada
para aumentar a estabilidade destas formulaes. Alm disso, faz-se necessrio o
desenvolvimento de um processo de produo de lipossomas que seja economicamente vivel
e reprodutvel em larga escala. Portanto, o objetivo deste trabalho foi o estudo de diferentes
parmetros relacionados estabilidade qumica e fsico-qumica de uma formulao de
lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina (SpHL-CDDP) assim como estabelecer um
processo eficiente para a sua produo em escala piloto. SpHL-CDDP foram produzidos em
escala piloto com o emprego de trs etapas, a saber: evaporao em fase reversa,
homogeneizao sob alta presso e ultrafiltrao (REV/HAP/UF). A otimizao de
parmetros relacionados a homogeneizao sob alta presso (presso aplicada e nmero de
ciclos) e ultrafiltrao (nmero de ciclos) foram avaliados nesse processo de produo piloto.
A presso de 500 Bar e nmero de ciclos igual a 9 foram adotados para a produo de SpHL-
CDDP, que apresentaram dimetro igual a 99,0 3,9 nm e teor de encapsulao de 12,9
2,30 %. Duas substncias crioprotetoras, sacarose e trealose, foram avaliadas quanto a
eficcia sobre o controle do dimetro das vesculas e reteno do material encapsulado, aps o
processo de liofilizao/rehidratao, sendo a trealose mais eficiente do que a sacarose,
mostrando menor aumento do dimetro das vesculas. A estabilidade de armazenamento de
SpHL-CDDP foi avaliada mediante o acompanhamento da variao do dimetro, potencial
zeta e teor de encapsulao. Aps 135 dias de armazenamento, os SpHL-CDDP liofilizados e
sob a forma lquida no mostraram alterao do dimetro e potencial zeta das vesculas.
Entretanto, os SpHL-CDDP na forma liofilizada mostraram-se mais eficientes quanto a
reteno da CDDP encapsulada do que a disperso lipossomal.

Palavras-chave: Cisplatina, Sistema de liberao de frmacos, Lipossomas, Crioprotetores,
Escalonamento, Estabilidade





ABSTRACT

Cisplatin (CDDP) is an antineoplasic drug used for the treatment of ovary, testicle, head, neck
and lung carcinoma. The CDDP entrapment into liposomes is an alternative to circumvent
severe side effects and the appearance of drug resistance which limit its use. However, the
physical (aggregation/fusion) and chemical (hydrolysis/peroxidation) instabilities limit the use
of these drug carriers as pharmaceutical products. The preparation of freeze-dried
pharmaceuticals is a strategy used to improve the stability of these formulations. Moreover,
the development of an economically feasible and reproducible process of liposome production
on a large scale becomes necessary. Therefore, the aim of this work was the study of different
factors related to the chemical and physico-chemical stability of stealth pH-sensitive liposome
containing CDDP (SpHL-CDDP) as well as the establishment of an efficient process for its
production in a pilot scale. SpHL-CDDP were produced in a pilot scale using three stages,
namely: reverse phase evaporation, homogenization under high pressure and ultrafiltration
(REV/HAP/UF). The optimization of factors related to the homonogenization under high
pressure (pressure and number of cycles) and ultrafiltration (number of cycles) was evaluated
in this process of pilot production. The pressure of 500 Bar and number of cycles equal to 9
were adopted for the production of SpHL-CDDP which presented a mean diameter of 99.0
3.9 nm and encapsulation percentage of 12.9 2.30. Two cryoprotectants, sucrose and
trehalose, were investigated about their effectiveness to control the vesicles diameter and
retention of encapsulated CDDP after the freeze-drying/rehydration step. The trehalose
showed a higher ability to the formation of smaller vesicles than the sucrose. The long-term
storage of SpHL-CDDP was evaluated by the alterations of the diameter, zeta potential and
encapsulation of CDDP. After 135 days of storage, freeze-dried or diluted SpHL-CDDP did
not show any alteration of the vesicle diameter and zeta potential. However, the freeze-dried
SpHL-CDDP were superior on the CDDP retention than the liposomal dispersion.

Key words: Cisplatin, Drug delivery systems, Liposome, Cryoprotectants, Scale up, Stability









LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Estrutura qumica dos complexos de platina........................................................... 21
Figura 2 Caractersticas estruturais dos lipossomas .............................................................. 24
Figura 3 Classificao de lipossomas quanto ao dimetro e nmero de bicamadas ............. 25
Figura 4 Estruturas qumicas de CHEMS, DOPE e DSPE-PEG 2000.................................. 27
Figura 5 Fases de agregao dos lpides em meio aquoso. ................................................... 28
Figura 6 Comportamento de fases das membranas lipdicas................................................. 29
Figura 7 Equao de Henry utilizada no clculo do potencial zeta das partculas................ 31
Figura 8 Estrutura qumica do lisofosfolpide da DOPE ...................................................... 33
Figura 9 CDDP e seus produtos de hidrlise......................................................................... 34
Figura 10 Representao esquemtica da interao fosfolpide-acar ................................ 36
Figura 11 Organograma da produo de lipossomas pH-sensveis furtivos ......................... 46
Figura 12 Homogeneizador de alta presso de estgio nico................................................ 49
Figura 13 Dispositivo de ultrafiltrao Millipore Pellicon XL

acoplado a bomba
peristltica................................................................................................................................. 49
Figura 14 Curva de calibrao para o doseamento da CDDP obtida pelo mtodo de CLAE
................................................................................................................................................. .55
Figura 15 Variao do dimetro das vesculas e do ndice de polidisperso de SpHL-CDDP
durante um perodo de 60 dias de armazenamento. ................................................................. 70

Figura 16 Variao do potencial zeta de SpHL-CDDP durante um peroodo de 60 dias de
armazenamento.........................................................................................................................71








LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Valores das reas dos picos atribudos CDDP obtidos pelo emprego de CLAE.. 56
Tabela 2 - Teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 1a.......... 58
Tabela 3 - Teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 1b ......... 59
Tabela 4 - Influncia da presena de crioprotetores sobre o dimetro das vesculas dos SpHL-
CDDP obtidos segundo mtodo 1a aps o processo de liofilizao ....................................... 60
Tabela 5 - Influncia da presena de crioprotetores, presentes na fase interna e externa, sobre
o dimetro das vesculas dos SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1a aps o processo de
liofilizao ................................................................................................................................ 60
Tabela 6 - Influncia do nmero de ciclos empregados no processo de homogeneizao sob
presso a 500 bar sobre o dimetro das vesculas dos SpHL................................................... 61
Tabela 7 - Influncia do nmero de ciclos empregados no processo de homogeneizao sob
presso a 1000 bar sobre o dimetro das vesculas dos SpHL................................................. 62
Tabela 8 - Influncia do nmero de ciclos empregados no processo de homogeneizao sob
presso a 500 bar sobre o dimetro das vesculas dos SpHL-CDDP ....................................... 63
Tabela 9 - Influncia do nmero de ciclos de ultrafiltrao sobre a purificao dos SpHL-
CDDP ....................................................................................................................................... 63
Tabela 10 - Caracterizao fsico-qumica dos SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 2 ............. 64
Tabela 11 - Influncia da presena de crioprotetores sobre o dimetro das vesculas dos
SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 2........................................................................................ 65
Tabela 12 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP
liofilizados na ausncia de crioprotetores................................................................................. 67
Tabela 13 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP
liofilizados na presena de sacarose ......................................................................................... 68
Tabela 14 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP
liofilizados na presena de trealose .......................................................................................... 69
Tabela 15 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP
armazenados na forma lquida.................................................................................................. 70


Tabela 16 - Avaliao do teor de liberao de CDDP a partir de SpHL-CDDP aps 135 dias
de armazenamento.................................................................................................................... 72











































LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

AL antes da liofilizao
A/O gua em leo
CDDP cisplatina
CHEMS hemisuccinato de colesterila
CHOL colesterol
CLAE cromatografia lquida de alta eficincia
dp desvio padro
DAD detector de arranjo de diodos
DL depois da liofilizao
DOPE dioleilfosfatidiletanolamina
DPPC dipalmitoilfosfatidilcolina
DSPE-PEG
2000
diestearoilfosfatildiletanolamina-polietilenoglicol
2000

EDTA cido etilenodiaminotetraactico
fc fator de correo
HEPES N-[2-hidroxietil] piperazina N-[2-cido etanosulfnico]
i.p. ndice de polidisperso
INCA Instituto Nacional do Cncer
IV intravenoso
kDa quilodltons
L.D. limite de deteco
Lip-Disperso lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina sob a forma lquida
Lip-S/ Criop lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina sem crioprotetores
Lip-Sacarose lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina com sacarose
Lip-Trealose lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina com trealose
LUV lipossomas unilamelares grandes
MLV lipossomas multilamelares
N.D. no determinado
p/p relao peso por peso
p/v relao peso por volume
PC fosfatidilcolina
PCS espectroscopia de correlao de ftons
PEG polietilenoglicol
REV evaporao em fase reversa
SFM sistema fagocitrio mononuclear
SpHL lipossomas pH-sensveis furtivos brancos (sem cisplatina)
SpHL-CDDP lipossomas pH-sensveis furtivos de cisplatina
SUV lipossomas unilamelares pequenos
Tg Temperatura de transio vtrea
Tm Temperatura de transio de fase
USP Farmacopia Americana


SUMRIO

RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

INTRODUO.....................................................................................................................

15

REVISO DA LITERATURA.............................................................................................

16
1 Cncer................................................................................................................................. 16
2 Tratamento do cncer......................................................................................................... 17
2.1 Cisplatina......................................................................................................................... 17
2.1.1 Vias de administrao da cisplatina......................................................................... 18
2.1.1.1 Administrao intravenosa................................................................................... 18
2.1.1.2 Administrao intraperitoneal.............................................................................. 18
2.1.2 Inconvenientes da utilizao da cisplatina............................................................... 19
2.2 Novas propostas para a quimioterapia dos compostos de platina................................... 20
3 Sistemas nanoestruturados para vetorizao de frmacos.................................................. 21
4 Cisplatina em sistemas nanoestruturados........................................................................... 22
5 Lipossomas......................................................................................................................... 24
5.1 Definio......................................................................................................................... 24
5.2 Classificao.................................................................................................................... 25
5.2.1 Lipossomas unilamelares e multilamelares............................................................. 25
5.2.2 Lipossomas convencionais e furtivos...................................................................... 25
5.2.3 Lipossomas pH-sensveis........................................................................................ 26
6 Propriedades fsicas e fsico-qumicas dos lipossomas...................................................... 28
6.1 Transio de fase dos lpides........................................................................................... 28
6.2 Dimetro das vesculas.................................................................................................... 29
6.3 Potencial zeta................................................................................................................... 30
6.4 Teor e eficincia de encapsulao................................................................................... 31
7 Estabilidade qumica e fsico-qumica dos lipossomas e do frmaco encapsulado........... 32
7.1 Estabilidade fsica............................................................................................................ 32
7.2 Estabilidade qumica....................................................................................................... 33


7.3 Hidrlise da cisplatina..................................................................................................... 33
8 Liofilizao......................................................................................................................... 34
9 Crioproteo....................................................................................................................... 35
10 Produo em escala piloto................................................................................................ 38
11 Proposta de estudo da estabilidade e produo em escala piloto de SpHL-CDDP sob a
forma liofilizada....................................................................................................................

41

OBJETIVOS..........................................................................................................................

43

MATERIAL E MTODOS..................................................................................................

44
1 Material.............................................................................................................................. 44
2 Mtodos gerais................................................................................................................... 44
3 Obteno da curva de calibrao para doseamento da CDDP........................................... 45
3.1 Linearidade...................................................................................................................... 45
4 Preparao dos lipossomas pH-sensveis furtivos de CDDP............................................. 46
4.1 Mtodo 1 Preparao de SpHL-CDDP em pequena escala pelo mtodo REV............ 46
4.1.1 Obteno de uma emulso A/O............................................................................... 46
4.1.2 Obteno de SpHL-CDDP....................................................................................... 47
4.1.3 Purificao dos SpHL-CDDP por ultracentrifugao............................................. 47
4.1.4 Avaliao da influncia do uso de crioprotetores no processo de liofilizao de
SpHL-CDDP.....................................................................................................................

47
5 Mtodo 2 Preparao de SpHL-CDDP em escala piloto pelo mtodo REV................... 48
5.1 Avaliao da influncia do nmero de ciclos de homogeneizao e da presso sobre o
dimetro das vesculas dos SpHL........................................................................

48
5.2 Avaliao do nmero de ciclos de ultrafiltrao necessrios para a separao da
CDDP no encapsulada.........................................................................................................

49
5.3 Preparao de SpHL-CDDP pelo mtodo de evaporao em fase reversa..................... 50
5.3.1 Obteno de uma emulso A/O............................................................................... 50
5.3.2 Obteno de SpHL-CDDP....................................................................................... 51
5.3.3 Purificao dos SpHL-CDDP por ultrafiltrao...................................................... 51
6 Preparao das solues de crioprotetores......................................................................... 51
7 Determinao do teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP................................. 53
8 Determinao do dimetro e do potencial zeta dos SpHL e SpHL-CDDP........................ 54
9 Liofilizao dos SpHL-CDDP............................................................................................ 54
10 Ressuspenso dos SpHL-CDDP....................................................................................... 54


11 Estudo da estabilidade de armazenamento dos SpHL-CDDP.......................................... 55
12 Anlise estatstica............................................................................................................. 55

RESULTADOS E DISCUSSO..........................................................................................

56
1 Obteno da curva de calibrao para doseamento da CDDP........................................... 56
1.1 Linearidade...................................................................................................................... 56
2 Caracterizao fsico-qumica de SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1...................... 57
2.1 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta.............................................. 57
2.1.1 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta dos SpHL-CDDP
obtidos segundo mtodo 1a..............................................................................................

57
2.1.2 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta dos SpHL-CDDP
obtidos segundo mtodo 1b..............................................................................................

57
2.2 Determinao do teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP obtidos segundo
mtodo 1................................................................................................................................

57
2.2.1 Determinao do teor de encapsulao em SpHL-CDDP obtidos segundo
mtodo 1a........................................................................................................................

57
2.2.2 Determinao do teor de encapsulao e dimetro em SpHL-CDDP obtidos
segundo mtodo 1b...........................................................................................................

58
3 Influncia da presena de crioprotetores sobre as caractersticas fsico-qumicas dos
SpHL-CDDP liofilizados obtidos pelo mtodo 1..................................................................

59
3.1 Influncia dos crioprotetores, presentes somente na fase externa, sobre o dimetro e
potencial zeta das vesculas aps a reconstituio do p dos SpHL-CDDP obtidos
segundo mtodo 1a................................................................................................................

59
3.2 Influncia dos crioprotetores sobre o dimetro e potencial zeta das vesculas aps a
reconstituio do p dos SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1a, utilizando
crioprotetores na fase interna e externa dos lipossomas........................................................

61
4 Avaliao dos parmetros de produo dos SpHL segundo mtodo 2 (escala piloto)....... 61
4.1 Influncia do nmero de ciclos de homogeneizao e da presso sobre o dimetro das
vesculas de SpHL.................................................................................................................

61
4.2 Avaliao do nmero de ciclos de ultrafiltrao necessrios para a separao da
CDDP no encapsulada.........................................................................................................

64
5 Caracterizao fsico-qumica de SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 2...................... 65
6 Influncia da presena de crioprotetores sobre as caractersticas fsico-qumicas dos
SpHL-CDDP liofilizados obtidos pelo mtodo 2..................................................................

65
7 Estudo da estabilidade de armazenamento dos SpHL-CDDP............................................ 66
7.1 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta de SpHL-CDDP durante o



armazenamento...................................................................................................................... 66
8 Por que a trealose mais eficiente do que a sacarose no controle do dimetro dos
SpHL-CDDP? .......................................................................................................................

73

9 CONCLUSO E PERSPECTIVAS..................................................................................

76

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..................................................................................

77










































15
INTRODUO

A CDDP um dos frmacos mais efetivos e potentes da terapia antitumoral. Essa
utilizada frequentemente como tratamento de primeira escolha contra vrios tipos de tumores
slidos (KONDAGUNTA et al., 2005), porm apresenta alguns inconvenientes, tais como: os
efeitos adversos graves, o desenvolvimento de resistncia ao frmaco, a rpida inativao,
alm de incompatibilidades farmacotcnicas durante sua administrao (MONTI et al., 2005).
O desenvolvimento de frmacos anlogos e de novas formulaes so estratgias atualmente
utilizadas para aumentar a eficcia e segurana de utilizao da CDDP. Uma forma de reduzir
os efeitos colaterais e txicos, assim como aumentar o ndice teraputico da CDDP, a sua
encapsulao em lipossomas (VELINOVA et al., 2004).
Lipossomas so sistemas lipdicos dispersos constitudos freqentemente por
fosfolpides, os quais em meio aquoso se organizam espontaneamente em bicamadas
formando vesculas esfricas (LASIC, 1998). O extenso interesse no uso de lipossomas como
carreadores de frmacos exige procedimentos que atendam aos padres farmacuticos quanto
preparao e caracterizao das vesculas. Procedimentos tecnolgicos aceitveis devem ser
reprodutveis em larga escala e economicamente viveis (VEMURI;RHODES, 1995). Alm
disso, para serem empregados como carreadores de frmacos, tambm importante que os
lipossomas mantenham-se suficientemente estveis por um perodo de tempo razovel. Esses
podem sofrer mudanas tanto fsicas quanto qumicas durante a estocagem. A estabilidade dos
lipossomas sob a forma lquida reduzida devido aos fenmenos de agregao e/ou fuso e
devido ao fato dos fosfolpides, constituintes das vesculas, sofrerem hidrlise e oxidao em
meio aquoso. Esses fenmenos de instabilidade das vesculas podem ocasionar a perda do
material encapsulado. A liofilizao na presena de agentes crioprotetores uma alternativa
obteno de um sistema de liberao de frmacos mais estvel (CHOW et al., 1995;
VEMURI et al., 1995; MOHAMMED et al., 2006).
Assim, nesta dissertao de mestrado, foi realizado o estudo de preparo de SpHL-
CDDP sob a forma liofilizada, seguido de avaliao de um processo para a sua produo em
escala piloto e do estudo de sua estabilidade qumica e fsico-qumica .








16
REVISO DA LITERATURA

1 Cncer

O cncer uma doena que pode acometer diversos rgos e tecidos de diferentes
origens histolgicas. Pode se manifestar com diferentes comportamentos biolgicos que tm
em comum o crescimento desordenado das clulas do organismo. As caractersticas que
diferenciam os diversos tipos de cncer entre si variam de acordo com o tipo de clula
acometida, sua velocidade de multiplicao e a capacidade de invadir tecido e rgos
distantes, originando as metstases. O surgimento do cncer ocorre atravs da transformao
de uma clula normal em clula cancerosa devido a alterao do seu DNA. As causas do
cncer so variadas e esto associadas participao de vrus, ao de substncias qumicas
do meio ambiente ou da alimentao, ou ainda influncia de agentes fsicos, tal como a
radiao. A clula cancerosa prolifera-se desordenadamente, perde a capacidade de aderncia,
invade os tecidos vizinhos, penetra nos vasos sangneos e linfticos e espalha-se pelo
organismo, estabelecendo-se em locais distantes de sua origem, onde produz os tumores
secundrios (JUNQUEIRA;CARNEIRO, 2000).
O cncer a segunda maior causa de morte nos pases industrializados depois das
doenas cardiovasculares, onde uma em cada quatro pessoas adquire a doena e uma em cada
cinco morre (FONTES et al., 2005). objeto de estudo de vrios centros de pesquisa em todo
o mundo, sendo o responsvel por 12% das mortes, cerca de seis milhes de pessoas a cada
ano. Tambm no Brasil, as neoplasias constituem a segunda maior causa de morte. Alm
disso, cerca de 500.000 novos casos de cncer so diagnosticados por ano (INCA, 2006).
Os genes que participam na formao de tumores so principalmente os que, nas
clulas normais, esto envolvidos com o controle do ciclo celular, o reparo do DNA
danificado ou a apoptose. O ciclo celular o processo bsico de gnese de novas clulas e
compreende os fenmenos que ocorrem desde a formao de uma clula at sua prpria
diviso em duas clulas-filhas. A intrfase representa o perodo compreendido entre duas
divises e ocorre em trs fases consecutivas denominadas G1, S e G2: (i) em G1 as clulas
apresentam intensa atividade de sntese de RNA e de protenas, com marcante aumento do
citoplasma; (ii) no perodo S a clula duplica o seu contedo de DNA e (iii) em G2 ocorre
discreta sntese de RNA e de protenas que so essenciais para mitose. Tendo passado pelas
fases da intrfase, o ncleo entra em processo de diviso ou mitose. O perodo onde no
ocorre a proliferao das clulas denominado G0. No se conhece o mecanismo de ao de


17
todos os genes supressores de tumores, porm alguns codificam protenas que mantm as
clulas em G0, portanto fora do ciclo mittico. Um gene supressor muito estudado o p53, e
aproximadamente 50% de todos os tumores malignos humanos apresentam mutao ou
deleo deste gene. O gene p53 normal suprime a formao do cncer atravs de diversos
mecanismos, impedindo que as clulas com DNA danificado entrem na fase S do ciclo
mittico, at que o DNA seja reparado, ou desencadeado o mecanismo de apoptose da clula
danificada (JUNQUEIRA;CARNEIRO, 2000).
Uma caracterstica marcante dos tecidos tumorais o fato do pH extracelular (pH
e
) ser
mais cido que o pH dos tecidos normais. O pH intracelular (pH
i
) de ambos os tecidos
relativamente similar devido necessidade de se manter um ambiente favorvel para as vrias
atividades citoplasmticas. Portanto, o pH
e
substancialmente reduzido no tumor quando
comparado com o tecido normal, promove um gradiente de pH celular diferente nestes dois
tecidos. Uma das hipteses mais aceitas para explicar o baixo pH
e
nos tecidos tumorais o
clearance ineficiente dos metablitos cidos produzidos durante a gliclise aerbica intensa
da clula cancerosa (STUBBS et al., 1999).

2 Tratamento do cncer

Existem trs principais tipos de tratamento para o cncer: cirurgia, radioterapia e
quimioterapia. A tcnica cirrgica pode levar remoo de tumores com eficcia, nos casos
em que no apresentam metstase. A radioterapia (geralmente raios gama, radioistopos como
cobalto-60, raios X e at prtons e msons pi negativos) usada comumente em conjunto com
a cirurgia, com incremento da eficcia do tratamento. Entretanto, na ocorrncia de metstase,
faz-se necessria uma abordagem sistmica, que pode ser efetuada, em cerca de 60-70 % dos
casos, com a quimioterapia (ALMEIDA et al., 2005).

2.1 Cisplatina

A cis-diaminodicloroplatina (II) (CDDP) um complexo inorgnico divalente
hidrossolvel que contm platina. CDDP e outros frmacos relacionados, como a
carboplatina, formam fortes intermedirios eletroflicos que atuam via substituio
nucleoflica na formao de ligaes cruzadas no DNA (BOULIKAS;VOUGIOUKA, 2003).
O mecanismo de ao da CDDP envolve a entrada na clula, onde o on cloreto se dissocia e


18
gera um complexo que reage com a gua. A substituio do cloreto por gua fornece uma
molcula carregada positivamente, a espcie ativada da droga, a qual, a seguir, reage com
cidos nucleicos, formando ligaes cruzadas intrafilamentares, provavelmente entre N7 e O6
das molculas de guaninas adjacentes, o que resulta em uma desnaturao local da cadeia do
DNA (BOULIKAS;VOUGIOUKA, 2003).
Considerado um dos frmacos mais efetivos e potentes na terapia antitumoral, a
CDDP freqentemente utilizada como tratamento de primeira escolha contra vrios tipos de
tumores slidos, incluindo cncer testicular, carcinoma de ovrio, cncer de cabea e pescoo
e cncer de pulmo (KONDAGUNTA et al., 2005; MUGGIA;FOJO, 2004; SHIRAZI et al.,
1996; LE CHEVALIER et al., 1994; GUILLOT et al., 1992).

2.1.1 Vias de administrao da CDDP

2.1.1.1 Administrao intravenosa

A CDDP geralmente administrada por via intravenosa (IV) e disponibilizada
comercialmente como soluo injetvel na concentrao de 1 mg/mL. Os esquemas tpicos de
administrao intravenosa de CDDP, como agente nico a adultos ou crianas, so: 50-100
mg/m
2
como infuso IV a cada 3 ou 4 semanas; ou infuso IV de 15-20 mg/m
2
por dia
durante 5 dias consecutivos, a ser repetido a cada 3 ou 4 semanas (MARTINDALE, 2005).

2.1.1.2 Administrao intraperitoneal

A CDDP tambm tem sido administrada por via intraperitoneal com a finalidade de se
atingir nveis tumoricidas do frmaco localmente, ao mesmo tempo em que os efeitos
colaterais sistmicos so minimizados (TAMURA et al., 2002). Grande parte dos estudos da
eficcia da administrao intraperitoneal tm administrado agentes quimioterpicos para o
tratamento da carcinomatose peritoneal e do cncer ovariano. Como 50 % dos pacientes com
doenas malignas gastrointestinais e ginecolgicas, apresentam carcinomatose peritoneal logo
aps cirurgia local, h um grande interesse em utilizar essa nova via de administrao
(PHILLIPS et al., 2002). A razo para a terapia intraperitoneal em cncer ovariano porque o
peritnio recebe exposio sustentada a altas concentraes dos agentes antitumorais
enquanto tecidos sadios, como a medula ssea, so relativamente poupados (ARMSTRONG


19
et al., 2006).
Hrinbaschek e colaboradores (2001) relataram que a administrao intraperitoneal de
CDDP e mitomicina evitou a carcinomatose peritoneal em modelo animal (ratos). Armstrong
e colaboradores (2006) conduziram um estudo no qual foi realizada a administrao loco-
regional de CDDP na cavidade abdominal de pacientes com carcinoma ovariano estgio III ou
carcinomatose peritoneal primria, que levou a uma reduo de 25% de mortalidade se
comparada administrao intravenosa. Embora grande parte dos frmacos administrados por
essa via sejam rapidamente depurados do fluido peritoneal, essa forma de administrao pode
atingir picos de concentraes mais elevadas nesse fluido quando comparadas com o mesmo
frmaco administrado por via intravenosa (PHILLIPS et al., 2002). Goel e colaboradores
(1989) demonstraram que a administrao de CDDP por via intraperitoneal resultou em uma
concentrao de 12 a 15 vezes maior na cavidade peritoneal que a concentrao plasmtica.
A maioria dos frmacos antitumorais so molculas hidrossolveis pequenas, como a
CDDP, que so absorvidas rapidamente atravs dos capilares e atingem a circulao
sangunea. Isto dificulta a manuteno de uma concentrao adequada do frmaco na
cavidade intraperitoneal por longos perodos. Como as partculas corpusculares so
absorvidas lentamente pelo sistema linftico sem serem absorvidas pelos capilares, ficando
retidas na cavidade peritoneal, a profilaxia da carcinomatose peritoneal uma aplicao
potencial dos lipossomas contendo agentes antitumorais (KUMAGAI et al., 1996).

2.1.2 Inconvenientes da utilizao da CDDP

A CDDP apresenta como inconvenientes da sua utilizao: os efeitos adversos graves,
o desenvolvimento de resistncia ao frmaco e sua rpida inativao devido a complexao
com o plasma e protenas teciduais, alm de incompatibilidades farmacotcnicas durante sua
administrao. Os efeitos txicos deste frmaco, em animais e humanos, incluem
nefrotoxicidade, ototoxicidade, neurotoxicidade e mielosupresso. Contudo seu principal
efeito adverso dose-limitante a nefrotoxicidade (BOULIKAS;VOUGIOUKA, 2003). Os
efeitos nefrotxicos da CDDP so cumulativos e aumentam com a dose e durao do
tratamento (MARTINDALE, 2005).
A resistncia CDDP parece envolver uma combinao de mecanismos incluindo
diminuio do transporte do frmaco, aumento da detoxificao celular devido a glutationa e
metalotionenas, e aumento na capacidade de reparo celular, bem como alteraes nas vias de


20
apoptose celular (MONTI et al., 2005). Como exemplos de incompatibilidades da CDDP com
outros frmacos ou constituintes da formulao podemos citar: (i) sua precipitao em
presena de etoposdeo dissolvido em soluo de cloreto de sdio 0,9 %; (ii) precipitao em
presena de tiotepa dissolvida em soluo de glicose a 5 % e (iii) degradao da CDDP
decorrente de sua interao com trometamol, um excipiente utilizado na formulao de 5-
Fluouracila (TRISSEL et al., 1996; FOURNIER et al,1992).
Existem duas estratgias para aumentar a segurana da utilizao deste frmaco: 1) o
desenvolvimento de frmacos anlogos, como a carboplatina e a oxaliplatina e 2) o
desenvolvimento de formulaes alvo-especficas.

2.2 Novas propostas para a quimioterapia dos compostos de platina

Aps a introduo da CDDP e demonstrao de sua importncia no tratamento de
cncer ovariano e testicular, houve a necessidade do desenvolvimento de anlogos menos
txicos. CDDP se tornou o prottipo de uma classe de agentes antineoplsicos, muitos dos
quais foram abandonados em estudos pr-clnicos ou em estgios clnicos de
desenvolvimento, enquanto poucos foram inseridos na rotina clnica (JAKUPEC et al., 2003).
Estudos anteriores levaram ao desenvolvimentos dos anlogos, carboplatina, oxaliplatina e
satraplatina, o primeiro complexo de coordenao da platina administrado por via oral,
representados na Figura 1. Nos estudos mais recentes, o principal foco o desenvolvimento
de complexos que superem os principais mecanismos de resistncia do tumor CDDP,
denominados cis-aminodicloro(2-metilpiridina)platina(II) (ZD0473) e trans-
amino(diclorociclohexilamina)dihidroxiplatina (IV) (JM335).
A carboplatina [cis-diamino(1,1-ciclobutanodicarboxilato)platina II] menos txica
aos rins e sistema nervoso, e causa menos nusea e mese do que a CDDP. Entretanto, efeitos
adversos hematolgicos so mais frequentes com a utilizao da carboplatina
(BOULIKAS;VOUGIOUKA, 2003). Outro frmaco de segunda gerao, a nedaplatina (cis-
diaminoglicolatoplatina II), desenvolvida e utilizada no Japo, apresenta propriedades
toxicolgicas melhores que a CDDP. A mielosupresso dose-limitante e toxicidades no-
hematolgicas so geralmente leves (JAKUPEC et al., 2003).



21
Oxaliplatina
NH
2
Pt
NH
2
O
O
O
O
Pt
NH
3
Cl
NH
3
Cl
Cisplatina
O
Pt
O
O
O
NH
3
NH
3
Carboplatina
N
Pt
H
3
N
CH
3
Cl
Cl
ZDM0473
Pt
N
H
2
Cl
Cl H
3
N
O
O
CH
3
O
O
CH
3
Satraplatina
O
Pt
O
NH
2
NH
2
O
Nedaplatina
Pt
N
H
2
Cl
NH
3
OH
OH
Cl
JM335

Figura 1 Estrutura qumica dos complexos de platina.

A ocorrncia de resistncia cruzada entre a CDDP, carboplatina e nedaplatina torna os
dois ltimos frmacos inefetivos no tratamento de pacientes que no responderam ao
tratamento prvio com CDDP.
Oxaliplatina apresenta como efeitos colaterais a neurotoxicidade, toxicidade
hematolgica e gastrointestinal. Possui vasto efeito antitumoricida, tanto in vitro quanto in
vivo, melhor perfil de segurana que a CDDP e ausncia de resistncia cruzada CDDP e
carboplatina. Sua ao antineoplsica otimizada quando administrada em combinao com
outros agentes como o 5-fluorouracil e gencitabina (BOULIKAS;VOUGIOUKA, 2003).

3 Sistemas nanoestruturados para vetorizao de frmacos

A associao de frmacos j em uso a um sistema transportador, visando direcionar o
frmaco para a clula alvo e evitar os locais indesejveis onde o frmaco exerce toxicidade,
oferece um ganho de tempo na fase de desenvolvimento de um produto porque usa um
frmaco j caracterizado do ponto de vista farmacolgico (FRZARD et al., 2005). O
direcionamento de frmacos por meio de sistemas carreadores tem sido amplamente estudado.
A nanotecnologia, uma rea do conhecimento cientfico de carter multidisciplinar, que
envolve a criao e utilizao de materiais, instrumentos e sistemas em uma escala


22
nanomtrica, est associada tecnologia farmacutica no desenvolvimento de sistemas
transportadores de frmacos.

4 CDDP em sistemas nanoestruturados

Inmeras pesquisas cientficas tm utilizado nanossistemas para a veiculao da
CDDP, entre as quais so destacadas as nanopartculas (XU et al., 2006); microesferas
(KUMAGAI et al., 1996), nanocpsulas (VELINOVA et al., 2004, BURGER et al., 2002),
micelas polimricas (NISHIYAMA et al., 2003) e lipossomas (STATHOPOULOS et al.,
2006; RAMACHANDRAN, 2006; JNIOR et al., 2007a,b).
Microesferas constitudas de copolmeros de cido ltico-cido gliclico foram
desenvolvidas para a encapsulao de CDDP (CDDP-PLGA), apresentando dimetro de
aproximadamente 100 m e teor de encapsulao de 5 % (KUMAGAI et al., 1996). CDDP-
PLGA foram administradas por via intraperitoneal em ratas com carcinomatose peritoneal e
monstraram ser mais efetivas quanto a sobrevida dos animais do que a soluo de CDDP.
Alm disso, a preparao liberou o frmaco lentamente por um longo perodo na cavidade
peritoneal.
Xu e colaboradores (2006) desenvolveram nanopartculas de CDDP constitudas de
caprolactona/polietilenoglicol ou caprolactona/polimetacrilato, com eficincia de
encapsulao de aproximadamente 90 %. Estas nanopartculas foram testadas em clulas de
adenocarcinoma de ovrio SKOV-3, as quais so clulas resistentes CDDP, dentre outros
frmacos. As nanopartculas de CDDP foram capazes de ser internalizadas pelas clulas e
mostraram uma elevada eficcia antitumoral.
Burger e colaboradores (2002) desenvolveram um sistema lipossomal de CDDP,
constitudo por razes equimolares de dioleilfosfatidilserina e dioleilfosfatidilcolina, e
produzido por hidratao do filme lipdico seguida de congelamento-descongelamento. A
citotoxicidade dos lipossomas de CDDP foi aproximadamente 1000 vezes maior do que a
CDDP livre e nesta formulao, o frmaco apresenta-se sob a forma de agregados.
Micelas polimricas constitudas por polietilenoglicol-cido poliglutmico e CDDP
foram investigadas quanto a capacidade de constiturem um sistema de liberao de frmacos
tumor-especfico. A concentrao de CDDP nas micelas foi de 39 %. As micelas contendo
CDDP apresentaram elevada estabilidade em gua, mesmo em solues muito diludas.
Entretanto, em solues ricas em ons cloreto, estas se dissociam acompanhadas de liberao
da CDDP (NISHIYAMA et al., 2003).


23
Uma formulao de lipossomas de CDDP, Lipoplatin, foi desenvolvida com a
finalidade de reduzir a toxicidade sistmica da CDDP e direcion-la aos stios tumorais. Essa
formulao constituda por dipalmitoilfosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, colesterol e
diestearoilfosfatidiletanolamina acoplada ao polietilenoglicol 2000, com dimetro vesicular
mdio de 110 nm. Lipoplatin menos txica que a CDDP livre em ratos. Lipoplatin 3
mg/mL (concentrao referente CDDP) deve ser armazenada ao abrigo da luz, devido a
fotossensibilidade (BOULIKAS, 2004). Estudos clnicos de fase I-II, associaram gencitabina
com CDDP lipossomal, para avaliao de eficcia e toxicidade, em pacientes refratrios a
tratamentos anteriores utilizando somente gencitabina. O avano detectado foi a menor
toxicidade observada, atribuda ao uso de Lipoplatin (STATHOPOULOS et al., 2006).
Outra formulao de CDDP lipossomal, denominada SPI-077, foi delineada a fim
direcionar a CDDP s clulas tumorais atravs do retardo da excreo renal e aumento do
tempo de circulao, para reduzir a toxicidade ocasionada pela CDDP na sua forma livre
(no-encapsulada) e evitar os procedimentos profilticos como hidratao e utilizao de anti-
emticos. Entretanto, reaes graves de hipersensibilidade aos componentes da formulao
fizeram necessria a profilaxia com corticosterides e anti-histamnicos. (JAKUPEC et al.,
2003). Resultados dos estudos pr-clnicos so conflitantes j que enquanto um estudo indica
que SPI-077 exibiu atividade superior CDDP livre em modelos tumorais de camundongos
(NEWMAN et al., 1999), outro sugere que a CDDP no liberada a partir dos lipossomas de
maneira suficiente (ZAMBONI et al., 2000 apud JAKUPEC et al., 2003).
Estudos realizados por Jnior e colaboradores (2007a) demonstraram que os SpHL-
CDDP apresentam uma maior atividade citotxica sobre a linhagem celular A549 (clulas
cancerosas de pulmo humano) do que a CDDP livre. Alm disso, essa formulao exibiu a
mesma eficincia em clulas sensveis e em clulas resistentes CDDP, o que sugere que essa
pode burlar os mecanismos de resistncia oferecidos pelas clulas penetrao do frmaco.
Estudos de difrao de raios-X foram efetuados em amostras de lipossomas de CDDP
estericamente estabilizados SPI-077 sob as formas lquida, congelada e liofilizada. As
molculas de CDDP encapsuladas mantiveram-se quimicamente estveis e no sofreram
hidrlise. Os dados obtidos mostraram ainda que a CDDP formou uma soluo supersaturada.
As amostras congeladas e/ou liofilizadas foram similares s amostras no estado lquido,
demonstrando que nem o congelamento nem a liofilizao induzem cristalizao do frmaco
(ARCON et al., 2004).




24
5 Lipossomas

5.1 Definio

Lipossomas so sistemas lipdicos dispersos constitudos freqentemente por
fosfolpides, os quais em meio aquoso se organizam espontaneamente em bicamadas
formando vesculas esfricas. Essas bicamadas circundam uma cavidade aquosa interna e se
encontram envolvidas por um meio aquoso (Figura 2). Considerando que os lipossomas so
constitudos por molculas anfiflicas, os mesmos so capazes de encapsular substncias
hidroflicas, lipoflicas e anfiflicas. Molculas hidroflicas so encapsuladas na sua cavidade
interna, onde esto presentes os grupos polares dos fosfolpides. As substncias lipoflicas so
acomodadas na regio apolar da bicamada e as anfiflicas ao longo de toda sua extenso,
interagindo com a regio apolar e polar. Esses sistemas lipdicos foram descritos, na dcada
de 60, por Bangham e colaboradores (1965) como modelos de membranas biolgicas. A
utilizao dos lipossomas como sistemas de liberao de frmacos foi proposta na dcada de
70. Entretanto, as primeiras formulaes de lipossomas estudadas no produziram os
resultados esperados, devido instabilidade das vesculas, baixa taxa de encapsulao dos
frmacos e escolha inadequada da via de administrao (LASIC, 1998).











Figura 2 Caractersticas estruturais dos lipossomas (Adaptado de FRZARD et al,
2005).


25
5.2 Classificao

As propriedades qumicas e fsico-qumicas dos lipossomas variam de acordo com sua
composio lipdica, dimetro vesicular, lamelaridade, carga superficial e mtodo de
preparao.

5.2.1 Lipossomas unilamelares e multilamelares

Os lipossomas so classificados de acordo com o dimetro e nmero de bicamadas em
(i) vesculas unilamelares pequenas (SUV), (ii) vesculas unilamelares grandes (LUV) e (iii)
vesculas multilamelares (MLV). As vesculas unilamelares, formadas por uma bicamada
nica, so denominadas SUV quando possuem dimetro compreendido entre 25-50 nm e em
LUV, quando so maiores que 100 nm (Figura 3). Os lipossomas multilamelares so
formados por bicamadas sucessivas, separadas por compartimentos aquosos, com dimetro
compreendido entre 100-1000 nm (NEW, 1990; SAHOO, 2003).


Figura 3 Classificao de lipossomas quanto ao dimetro e nmero de bicamadas
(Adaptado de LASIC, 1998).

5.2.2 Lipossomas convencionais e furtivos



26
Os lipossomas convencionais, quando administrados por via endovenosa, sofrem
adsoro de protenas sricas (opsoninas), ocasionando sua captura pelas clulas do sistema
fagocitrio mononuclear (SFM), sobretudo no fgado, bao e medula ssea. Foi observado
que a incorporao, na membrana dos lipossomas, de lipdeos acoplados a polmeros de
etilenoglicol (PEGs), altera sua interao com o ambiente, sendo o efeito mais importante o
impedimento da captura pelos macrfagos e a prolongao de sua presena na corrente
sangunea. Esses lipossomas, denominados lipossomas furtivos, permitem uma distribuio
do frmaco para outros rgos alm daquele do SFM (FONTES et al., 2005). Concentraes
de 5-10 % de fosfatidiletanolamina acoplado a PEG (PE-PEG) de massa molecular 1000-2000
Da conferem excelente estabilidade s formulaes (ULRICH, 2002).
Antes do advento das formulaes com polmeros hidroflicos acoplados aos
fosfolpides, foram utilizados lipossomas pequenos, com membrana rgida e neutros, como
tentativas de reduo da ao do SFM sobre os lipossomas. Entretanto, esse tipo de lipossoma
tm srias desvantagens como sistema de liberao de frmacos, que incluem: pequeno
volume interno de encapsulao, aumento do dimetro das vesculas durante armazenamento,
poucas substncias disponveis para esse tipo de formulao e perfil farmacocintico dose-
dependente (PAPAHADJOPOULOS;GABIZON, 1995).

5.2.3 Lipossomas pH-sensveis

O uso de lipossomas pH-sensveis como sistemas de liberao de frmacos foi
sugerido a partir da observao de que tecidos enfermos (tumores, metstases, inflamaes e
infeces) apresentam um pH menor do que os tecidos normais (GULINO et al., 1967), alm
do fato de que alguns tipos de vrus desenvolveram estratgias para aproveitar-se da
acidificao do meio do lmen endossomal para infectar clulas (SIMES et al., 2004). Esses
lipossomas exibem transies de fases, caractersticas dos seus constituintes fosfolipdicos,
que so responsveis pela desestabilizao das vesculas em meio cido e so estveis em pH
fisiolgico (pH 7,4).



27

P
O
O O
-
O
NH
3
+
O
O
O H
O
CH
3
CH
3
H
3
C
CH
3
CH
3
O
O
O
HO
P
O
O O
-
O
H
N
O
O
O H
O
O
OCH
3
O
( )
45
A
B
C

Figura 4 Estruturas qumicas de CHEMS (A), DOPE (B) e DSPE-PEG
2000
(C).


Os lipossomas pH-sensveis so constitudos por fosfolpides derivados da
fosfatidiletanolamina (PE), como por exemplo, a dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE). Estes
derivados organizam-se em meio aquoso, a temperatura ambiente, sob a forma hexagonal, no
sendo capazes de se apresentar na forma de vesculas (SIEGEL, 1986). A formao de
lipossomas com estes fosfolpides requer a adio de agentes estabilizantes, normalmente
lpides carboxilados, como o hemisuccinato de colesterila (CHEMS), que em pH fisiolgico
se encontram sob a forma ionizada (Figura 4). Esses estabilizantes so capazes de se inserirem
entre as molculas de fosfolpides, e o aparecimento de repulses eletrostticas entre os
grupamentos carboxila, presentes no estabilizante, e os grupos fosfato dos fosfolpides
favorecem a organizao lamelar (Figura 5), possibilitando a formao dos lipossomas. A
exposio dos lipossomas pH-sensveis a um meio cido resulta na protonao dos agentes
estabilizantes, com conseqente desestabilizao das vesculas e a liberao do material
encapsulado (OLIVEIRA et al., 2000).






28











Figura 5 Fases de agregao dos lpides em meio aquoso (Adaptado de LASIC, 1998).


6 Propriedades fsicas e fsico-qumicas dos lipossomas

As propriedades e aplicaes dos lipossomas dependem das caractersticas fsicas e
fsico-qumicas de suas membranas.

6.1 Transio de fase dos lipdes

A fluidez da bicamada, quando constituda de um nico tipo de lpide, depende da
temperatura de transio de fase do estado gel (slido) para o estado lquido-cristalino (fluido)
(Tm) (Figura 6). Quando a temperatura do meio igual a Tm, as cadeias carbnicas dos
lipdes passam do estado ordenado (slido) para o estado fluido no qual as cadeias carbnicas
encontram-se desordenadas e tm grande liberdade de movimento. Portanto, de acordo com a
Tm, as membranas lipossomais de diferentes composies podem exibir diferentes nveis de
fluidez sob as mesmas condies de temperatura. A permeabilidade da bicamada depende da
fluidez da membrana e da natureza do soluto encapsulado. A taxa de permeabilidade mais
elevada ocorre na Tm e menor no estado gel em comparao com o estado fluido
(FRZARD et al., 1999).



29






Figura 6 - Comportamento de fases das membranas lipdicas (Adaptado de FRZARD
et al., 2005).

Um componente lipdico importante, muito utilizado na composio dos lipossomas,
o colesterol. Este aumenta a rigidez das membranas no estado cristal-lquido e reduz a
rigidez e os defeitos estruturais das membranas no estado gel.

6.2 Dimetro das vesculas

A obteno de lipossomas com dimetro reduzido e distribuio homognea das
vesculas um importante fator para garantia da estabilidade dessa forma farmacutica.
Muitos estudos utilizam lipossomas unilamelares homogneos com dimetro compreendido
entre 50 e 150 nm. Essa faixa um meio termo entre a eficincia de encapsulao (aumenta
de acordo com o aumento do dimetro), a estabilidade do lipossoma (diminui com o aumento
do dimetro acima da faixa tima de 80-200 nm) e capacidade de extravasamento (diminui
com o aumento do dimetro) (LASIC, 1998).
No presente trabalho, foi estudada uma formulao farmacutica destinada
administrao parenteral. A Farmacopia americana 29 edio (USP 29), classifica as
emulses injetveis lipdicas de acordo com o dimetro mdio vesicular (DMV) e inclui os
lipossomas na classe das microemulses, isto , formulaes lipdicas cujo DMV seja menor
que 0,1 m. Os limites farmacopicos para a garantia da estabilidade de armazenamento
destas formulaes preconizam que estas apresentem pH entre 6-9, DMV menor ou igual a
500 nm, concentrao de cidos graxos livres menor que 0,07 mEq/g e que a concentrao
percentual peso/volume de glbulos maiores que 5 m seja menor que 0,05 % do total da
fase dispersa (DRISCOLL, 2006). Como os capilares sanguneos possuem dimetro interno


30
entre 4 e 9 m, o limite de 5 m apresenta relevncia fisiolgica, por ser um preventivo da
ocluso da microvasculatura.
So utilizadas diferentes tcnicas para anlise do dimetro e distribuio dos
lipossomas. Dentre estas esto compreendidas tcnicas de espalhamento da luz (BERGER, N.
et al., 2001; CASALS et al., 2003; YANG et al., 2006) e microscopia, como microscopia de
criofratura (BERGER et al., 2001) e microscopia de fora atmica (RUOZI et al., 2005;
RAMACHANDRAN et al., 2006). Neste trabalho foi empregada a tcnica denominada
espectroscopia de correlao de ftons (PCS) ou espalhamento dinmico da luz (Quasielastic
Light Scattering) na anlise do dimetro das vesculas lipossomais.
A tcnica de PCS consiste em atravessar determinada amostra com um feixe de laser,
de modo que as partculas presentes espalhem a luz. O espalhamento da luz est relacionado
ao movimento browniano das partculas de modo que a intensidade da luz espalhada por estas
forme um padro de movimento. Por meio da disperso da luz, torna-se possvel determinar o
dimetro mdio das partculas. Partculas menores so capazes de movimentarem mais
rapidamente e causam rpidas modificaes no espalhamento da luz. Por outro lado,
partculas de maior dimetro, as quais possuem menores coeficientes de difuso, resultam em
menores flutuaes na intensidade do espalhamento da luz (HASKELL et al., 1998). Esta
tcnica permite a medida de partculas cujos dimetros estejam compreendidos na faixa de 1 a
5000 nm (MALVERN INSTRUMENTS, 1996a).

6.3 Potencial zeta

A medida do potencial zeta uma ferramenta muito til na deteco da magnitude de
interaes repulsivas entre as partculas coloidais e comumente utilizada para avaliar a
estabilidade dos colides (CASALS et al., 2003).
O potencial zeta pode ser definido como a carga existente na fronteira entre a
superfcie de uma partcula individual e seus ons associados, no plano de cisalhamento. A
carga no pode ser medida diretamente, mas pode-se determinar a grandeza da carga eltrica
pelas medidas da mobilidade eletrofortica das partculas submetidas aplicao de um
determinado campo eltrico (FLORENCE;ATTWOOD, 2003).
Para a determinao do potencial zeta dos lipossomas foi utilizado um mtodo que
consiste na incidncia de um feixe de luz e aplicao de um campo eltrico de fora


31
conhecida atravs da amostra. Neste mtodo, as partculas carregadas se deslocam com
velocidades distintas induzindo deslocamentos da frequncia do feixe de luz incidente,
gerando um espectro de frequncias. As frequncias so ento utilizadas para os clculos das
velocidades, as quais so convertidas para valores de mobilidades eletroforticas. Atravs da
aplicao da equao de Henry (Figura 7) pode-se ento determinar o potencial zeta das
partculas. Nesta equao, a funo de Henry, f(Ka), pode ser representada pela aproximao
de Huckel, igual a 1, quando o dimetro da partcula muito menor que a espessura da dupla
camada de cargas ao redor da partcula. Utiliza-se a aproximao de Smoluchowsky, igual a
1,5, quando o dimetro da partcula maior que a espessura da dupla camada de cargas
(MALVERN INSTRUMENTS, 1996b).

( )
3
Ka 2
Ue
f
=

na qual, Ue a mobilidade eletrofortica, a constante dieltrica da amostra, o
potencial zeta, f(Ka) a funo de Henry e a viscosidade do solvente.

Figura 7 Equao de Henry utilizada no clculo do potencial zeta das partculas.


6.4 Teor e eficincia de encapsulao

O teor e a eficincia de encapsulao de uma substncia em lipossomas so dois
parmetros importantes que devem ser considerados na escolha do mtodo de preparao,
sobretudo quando se procura desenvolver uma composio farmacutica. Esses parmetros
podem ser otimizados atravs da escolha do mtodo de encapsulao e da manipulao da
composio lipdica da membrana. importante a obteno de altas taxas de encapsulao,
particularmente quando o frmaco possui doses elevadas ou quando no possvel o
reaproveitamento do frmaco no-encapsulado. A relao frmaco/lipde tambm dever ser
maximizada, visto que determina a quantidade de lipde a ser administrada ao paciente.
Assim, quanto menor for a quantidade de lipde veiculada, menores sero os riscos de efeitos
colaterais associados aos mesmos (FRZARD et al., 2005; SWARBRICK;BOYLAN, 1994).




32
7 Estabilidade qumica e fsico-qumica dos lipossomas e do frmaco encapsulado

Para funcionar efetivamente como um vetor de frmacos, importante que os
lipossomas mantenham-se suficientemente estveis por um perodo de tempo razovel. Esses
podem sofrer mudanas tanto fsicas quanto qumicas durante a estocagem. As mudanas
fsicas podem ocorrer nas vesculas fosfolipdicas, incluindo agregao e fuso. J as
mudanas qumicas incluem hidrlise das ligaes ster dos fosfolpides em disperses
aquosas de lipossomas e oxidao dos fosfolpides que contm cidos graxos insaturados,
bem como a oxidao do colesterol. Todas essas transformaes podem causar a perda do
material encapsulado (CHOW et al., 1995). As instabilidades fsicas tambm podem ser
provocadas durante as transies de fase dos lpides; entretanto, a incluso de colesterol ou
derivados nas bicamadas podem reduzir ou erradicar esses fenmenos de transio
(McMULLEN et al., 1993).

7.1 Estabilidade fsica

A estabilidade fsica de lipossomas pode ser entendida como um tipo de estabilidade
coloidal. Um dos aspectos mais importantes dessa estabilidade a mudana do tamanho das
partculas e de sua distribuio. As mudanas no sistema coloidal podem ocorrer
principalmente por dois mecanismos: (i) a nvel molecular, pela troca molecular assimtrica
(conhecido como maturao de Ostwald), (ii) a nvel de partculas ocorre na maioria das vezes
agregao, fuso, coacervao ou flutuao/precipitao. No caso de lipossomas, agregao e
fuso so as principais fontes de instabilidade. Agregao de lipossomas neutros causada
por interaes de Van der Waals, e tende a ser mais pronunciada em vesculas grandes.
Embora fatores como resduos de solventes e traos de elementos possam potencializar esse
processo, a formao de agregados de lipossomas um fenmeno natural e inevitvel para
membranas sem carga. A maneira mais simples de contornar essa situao utilizar lpides
carregados na formulao (NEW, 1990). Casals e colaboradores (2003) afirmam que a
presena de 25 % de lpides carregados confere uma suficiente estabilidade eletrosttica que
evita a agregao e fuso de vesculas por um perodo de 3 meses, a 4 C. Outra forma de
aumentar a estabilidade dos lipossomas revesti-los com polmeros hidroflicos no-inicos,
como PEG, o que leva ao aparecimento da repulso de hidratao caracterizada pela presena
de uma barreira estrica que impede a aproximao das vesculas (ULRICH, 2002).


33
7.2 Estabilidade qumica

Muitas disperses de fosfolpides contm lpides insaturados (cadeias acila) como
parte de sua cadeia molecular. Os lpides insaturados sofrem degradao oxidativa ou
peroxidao lipdica. Essas reaes podem ocorrer durante a preparao, o armazenamento ou
no momento do uso. A peroxidao um processo complexo envolvendo reaes radicalares
que resultam na formao de perxidos cclicos e hidroperxidos. Essa degradao oxidativa
acontece rapidamente se os lpides insaturados no forem protegidos durante a preparao e o
armazenamento. Devem ser protegidos pela manuteno em atmosfera de gs inerte, como
nitrognio ou argnio; pela remoo de metais pesados (adio de EDTA) ou pela adio de
antioxidantes, como alfa-tocoferol ou butilhidroxitolueno.
A hidrlise dos lpides leva a formao de lisofosfolpides (Figura 8) e cidos graxos
livres. Os lisofosfolpides podem ser posteriormente hidrolisados em glicerofosfocompostos e
cidos graxos. Esses produtos de reao podem alterar a rigidez da bicamada lipossomal, a
reteno do material encapsulado e o dimetro das vesculas e, portanto, devem ser mantidos
em nveis mnimos (VEMURI et al., 1995).


Figura 8 Estrutura qumica do lisofosfolpide da DOPE (1-oleil 2-hidroxi glicero-3-
fosfoetanolamina).


7.3 Hidrlise da CDDP

Em soluo aquosa, os tomos de cloro da CDDP so facilmente substitudos por
ligantes aquo (Figura 9), originando espcies mais reativas. Parte destes ligantes podem ser
desprotonados a hidroxo ligantes, que ocasiona uma diminuio da reatividade do
complexo (JAKUPEC et al., 2003). Visando a manuteno da integridade da molcula do
frmaco, a soluo de CDDP deve conter, no mnimo, cloreto de sdio 0,2 % p/v
(THOMPSON, 1998).


34

- -- - Cl
-
, +H
2
O - -- - Cl
-
, +H
2
O
Pt
H
3
N
OH
2
H
3
N
OH
+
Pt
H
3
N
OH
2
H
3
N
OH
2
+2
Pt
H
3
N
Cl H
3
N
OH
2
+
Pt
H
3
N
Cl H
3
N
OH
Pt
H
3
N
OH H
3
N
OH
Pt
H
3
N
Cl H
3
N
Cl
- H
+
- H
+
- H
+

Figura 9 CDDP e seus produtos de hidrlise.

8 Liofilizao

Com o objetivo de aumentar a estabilidade fsica e qumica dos lipossomas, o processo
de liofilizao tm sido utilizado, aumentando dessa forma a vida de prateleira das
formulaes lipossomais (YANG et al., 2006). Em relao estabilidade desta forma
farmacutica, a utilizao de uma suspenso aquosa como um produto comercial
questionvel. Em contraste, uma preparao seca para ser hidratada imediatamente antes da
sua utilizao pode evitar muitos problemas associados com as disperses aquosas de
lipossomas. O processo pode ser aplicado sobre os lpides ou sobre os lipossomas
propriamente ditos (PAYNE et al., 1986). Tem sido relatado que lipossomas contendo
molculas encapsuladas podem ser liofilizados e reconstitudos com significante reteno da
taxa de encapsulao e sem alteraes significativas no tamanho das vesculas (VEMURI et
al., 1995).


35
Liofilizao o processo empregado na desidratao de substncias extremamente
sensveis ao calor. Nesse processo, a soluo ou suspenso lquida inicialmente congelada;
em seguida, a presso sobre a matria congelada reduzida e, por fim, a gua removida por
sublimao (AULTON, 2005). O processo de liofilizao envolve 3 estgios: (i)
congelamento da suspenso lipossomal; (ii) secagem primria (perda de gua por sublimao
at 0,5 %) e (iii) secagem secundria (remoo da gua residual e obteno de p seco
poroso) (MOHAMMED et al., 2006; AULTON, 2005).
O programa de liofilizao empregado influencia as caractersticas do produto.
Lipossomas de fosfatidilcolina e colesterol (PC:CHOL, razo molar 4:1, respectivamente)
foram submetidos diferentes ciclos de liofilizao. Seguindo as etapas de liofilizao,
constitudas do congelamento, secagem primria e secundria sob temperaturas de - 70 C,
- 50 C e - 30 C, respectivamente (programa 1); - 50 C, - 40 C e - 25 C (programa 2) e - 30
C, - 20 C e - 10 C (programa 3), as formulaes do programa 1 e 2 mantiveram-se com
dimetro vesicular mdio menores que 200 nm quando acrescidos de crioprotetores; enquanto
que a formulao submetida ao programa 3 sofreu significativa agregao e fuso das
vesculas (MOHAMMED et al., 2007).

9 Crioproteo

Como dito anteriormene, a liofilizao bastante utilizado para prolongar a vida de
prateleira dos lipossomas. Entretanto, tanto o congelamento quanto a secagem podem induzir
a danos, resultando no aparecimento de fenmenos relacionados agregao e/ou fuso das
vesculas. Os lipossomas podem ter seu dimetro alterado durante a liofilizao e/ou durante
a subseqente rehidratao se estabilizantes apropriados no forem empregados
(MOHAMMED et al., 2006). Assim sendo, para promover estabilidade fsica durante o
processo de liofilizao, agentes crioprotetores como acares (por exemplo: sacarose,
trealose e lactose) e seus derivados so utilizados. Aminocidos tambm tm sido estudados
quanto a sua capacidade crioprotetora (MOHAMMED et al., 2007).
A partir da observao da capacidade de muitos organismos sobreviverem completa
desidratao, em estado de anidrobiose, os pesquisadores chegaram descoberta de que essa
sobrevivncia possibilitada pela presena de grande quantidade de dissacardeos
(particularmente sacarose e trealose) sintetizados durante o processo de perda de gua. Os
acares inserem-se entre as pores polares do fosfolpide no estado seco, levando


36
formao de ligaes de hidrognio. Essas interaes entre os acares e os fosfolpides
permitem a manuteno do estado fsico das membranas no estado seco de forma similar
existente no estado hidratado. Tem sido proposto que essas interaes acares/fosfolpides
resultam na diminuio da temperatura de transio gel/lquido-cristalino do fosfolpide (Tm)
no seu estado desidratado. Dessa forma, essa transio de fase no ocorre durante o processo
de desidratao/rehidratao, evitando a perda do material encapsulado (van WINDEN et al.,
1997).









Figura 10 Representao esquemtica da interao fosfolpide-acar.

Anlises de espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e de
calorimetria exploratria diferencial (DSC) demonstraram que a reduo da temperatura da
transio de fase gel/lquido-cristalino depende da razo de massa de acar:lpide. Alm
disso, a manuteno da integridade da membrana lipdica na presena de acares est
associada com a formao de uma matriz vtrea dos acares temperatura ambiente. Esta
amorfa, termodinamicamente instvel e caracterizada por alta viscosidade e baixa mobilidade
molecular. A formao dessa matriz vtrea evita a fuso da membrana lipdica, sendo isto
importante para a manuteno do dimetro das vesculas e a reteno do contedo
encapsulado (CACELA;HINCHA, 2006; van WINDEN et al., 1997; RICKER et al., 2003).
Em misturas de trealose e lpides no estado seco, duas populaes distintas de acar esto
presentes: uma interage diretamente com pores polares do fosfolpide (ocupando o lugar da
gua) e a outra populao forma a matriz vtrea (CROWE et al., 1987).
A crioproteo oferecida pelos solutos influenciada pela temperatura de transio
dos lpides e pela temperatura de transio vtrea (Tg) dos carboidratos. A utilizao de
O
O
O
R'
O
R' O
P
O
O
O
-
R
O
O
OH
HO
HO
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
O
O
R'
O
R' O
P
O
O
O
-
R


37
crioprotetores durante a liofilizao deve observar a Tg do soluto empregado como tal, a fim
de preservar a natureza porosa do liofilizado. A secagem primria deve ser feita a
aproximadamente 4 C abaixo da Tg dos carboidratos. Em uma mistura de lipossomas de
PC:CHOL e trealose, este acar apresentou Tg de - 30 C e quando a temperatura da
secagem primria foi mantida abaixo desta, produtos estveis foram obtidos nos programas de
liofilizao 1 e 2, citados no item 9. Entretanto, sob temperatura em torno da Tg (programa 3)
ocorreu fuso da vescula, possivelmente devido falta de formao da matriz vtrea
(MOHAMMED et al., 2006).
De acordo com mtodos calorimtricos e de difrao de raio-X, cerca de 18-24
molculas de gua, dependendo se os lpides esto estabilizados em vesculas grandes ou
pequenas, contribuem para a espessura da bicamada e, portanto, para a barreira de
permeabilidade. Luzardo e colaboradores (2000) descreveram a estrutura de hidratao da
interface da bicamada lipdica, como sendo composta por 3 ou 4 molculas de gua, que so
deslocadas por sacarose ou trealose de forma coligativa (isto , por efeito osmtico); 7
molculas de gua fortemente ligadas s carbonilas que so deslocadas apenas por trealose; 7
molculas de gua muito fortemente ligadas aos fosfatos que podem ser substitudos por
sacarose ou trealose se a desidratao for extremamente drstica, como no caso da
liofilizao. Os mecanismos de ao da sacarose e da trealose so diferentes, provavelmente
devido estereoqumica do grupos hidroxila nas posies equatorial e axial. Entretanto, sob
condies drsticas, nas quais a gua completamente removida, os dois acares atuam de
maneira semelhante.
Zadi e Gregoriadis (2000) utilizaram a sacarose como agente crioprotetor em razes de
massa lpide:acar variando de 1:1 at 1:15, na produo de lipossomas pelo mtodo de
congelamento/descongelamento, seguido de liofilizao. O emprego de relao
sacarose:lpide igual a 1:1 resultou em aumento considervel do teor de encapsulao de
diferentes solutos, porm com a formao de vesculas maiores (213-687 nm). Para razo
sacarose:lpide igual a 5:1 foi observada reduo do dimetro das vesculas lipossomais (93-
116 nm), sem apresentar variao significativa sobre o teor de frmaco encapsulado.
Entretanto, em razes sacarose:lpide muito maiores (10:1 a 15:1), o teor de frmaco
encapsulado diminuiu e o dimetro das vesculas permaneceu inalterado, em virtude da
proteo efetiva proporcionada pela sacarose contra a desestabilizao das estruturas
lipossomais. Portanto, a escolha da razo crioprotetor:lpide ideal para a encapsulao de
substncias e manuteno do dimetro das partculas depende do balano dessas avaliaes.


38
Hincha e Hagemann (2004) investigaram a habilidade da sacarose, trealose, 2-O-(-D-
glicopiranosil)glicerol (GG), derivados do aminocido betana (glicinobetana e
glutamatobetana) e sorbitol em estabilizar lipossomas durante a desidratao e a rehidratao.
Na ausncia de qualquer soluto protetor, os lipossomas perdem completamente seu material
encapsulado e sofrem o fenmeno de fuso. Sacarose e trealose foram aproximadamente
iguais quanto capacidade de estabilizar lipossomas, sorbitol foi superior aos ltimos,
enquanto GG mostrou-se menos eficaz e os derivados da betana no apresentaram nenhuma
proteo. Estudos feitos por Glavas-Dodov e colaboradores (2005) demonstraram que o
processo de congelamento/descongelamento no alterou o tamanho das partculas de
lipossomas rehidratados contendo sacarose como crioprotetor e, apenas uma pequena
diminuio na taxa de encapsulao foi observada, com taxas superiores a 76 %.

10 Produo em escala piloto

O escalonamento de lipossomas depende dos seguintes fatores crticos: o
desenvolvimento de um processo eficiente e adequado para a produo de lipossomas estreis
e livres de pirognios em escala industrial; altos e reprodutveis nveis de encapsulao do
frmaco, com uma quantidade mnima de frmaco livre (no-encapsulado) presente no
produto final; e ainda, que a formulao do lipossoma seja estvel durante o armazenamento
(AMSELEM et al., 1990). O extenso interesse no uso de lipossomas como carreadores de
frmacos exige procedimentos que atendam aos padres farmacuticos quanto preparao e
caracterizao das vesculas. Procedimentos tecnolgicos aceitveis devem ser reprodutveis
em larga escala e economicamente viveis. VEMURI e RHODES (1995) tambm consideram
que para a produo em larga escala de lipossomas, deve-se garantir a remoo de todo o
solvente orgnico, a proteo dos fosfolpides contra a oxidao, a remoo das endotoxinas,
a remoo da droga livre (no-encapsulada), o controle do tamanho das vesculas e a
esterilizao dos lipossomas.
Quando um sistema solvente for selecionado para um dado procedimento devem-se
levar em considerao os limites de segurana, solubilidade e pureza do mesmo. Os resduos
de solventes na preparao acabada podem causar danos sade do paciente. Solventes como
etanol e hidrocarbonetos podem levar desestabilizao dos lipossomas por interferirem nas
interaes cooperativas hidrofbicas entre os grupos metileno dos fosfolpides que mantm a
estrutura unida. Estudos de VEMURI e RHODES (1995) demonstraram que quanto menor o


39
lote e maior a temperatura do banho, menor ser a quantidade de resduo de clorofrmio no
filme fosfolipdico. Estes estudos ainda sugerem que o tamanho do lote influencia mais na
quantidade de resduo de clorofrmio do que a temperatura do banho.
A melhor maneira de controlar os nveis de endotoxinas das preparaes de
lipossomas a utilizao de matria-prima de alta qualidade com baixos nveis de
endotoxinas e a conduo do processo em condies asspticas com utenslios
despirogenizados. Para a utilizao dos lipossomas como um sistema controlador da liberao
de drogas, necessria a completa remoo da droga livre. Para isso so utilizadas vrias
tcnicas como cromatografia de troca inica (AMSELEM et al., 1990), ultrafiltrao e
cromatografia por excluso de tamanho (VEMURI;RHODES, 1994).
Lipossomas no podem ser esterilizados pela exposio a altas temperaturas, e
tambm so sensveis aos vrios tipos de irradiao, bem como esterilizao por agentes
qumicos. Logo, o nico mtodo disponvel para a esterilizao a filtrao em membranas
de 0,22 m, para lipossomas pequenos. Para lipossomas maiores, o processo deve ser
conduzido em condies asspticas (NEW, 1990).
Mtodos comumente utilizados para a preparao de lipossomas que podem ser
utilizados no escalonamento incluem hidratao do filme lipdico, homogeneizao sob alta
presso, injeo de solvente orgnico e uso de gradiente de pH. Amselem e colaboradores
(1990) compararam cinco mtodos de preparao de lipossomas por hidratao do filme
lipdico. Para o escalonamento de lipossomas de doxorrubicina, um frmaco lipoflico, foi
escolhido o processo chamado hidratao lenta do filme lipdico delgado, constitudo de
fosfatidilcolina:fosfatidilglicerol:colesterol (concentrao lipdica 35 mM, razo molar 7:3:4).
Aps a hidratao do filme, foi realizada a extruso em membranas de policarbonato de 0,4 e
0,2 m. Lipossomas oligolamelares foram obtidos, de dimetro compreendido entre 300-500
nm, com taxa de encapsulao de 97 % .O dimetro dos lipossomas no sofreu alterao por
um perodo de 5 meses, a 4 C. Este mtodo mostrou-se o mais eficiente em termos de
encapsulao do frmaco.
Um outro mtodo utilizado para o escalonamento de lipossomas foi a homogeneizao
sob alta presso. Mesoporfirina de estanho, um inibidor competitivo da hemeoxigenase, foi
dissolvido em metanol. A esta soluo foi adicionada fosfatidilcolina de ovo previamente
dissolvida em uma mistura metanol:clorofrmio (9:1). O solvente foi evaporado em rotavapor
sob presso reduzida. Ao filme lipdico formado foi adicionada uma soluo de lactose 0,05
M/tampo fosfato 0,004 M. Essa mistura foi ento homogeneizada por 2 horas e aps esse


40
perodo, submetida microfluidizao, a 60-80 psi. As vesculas obtidas apresentaram
dimetros menores de 200 nm e taxa de encapsulao acima de 90 %. Os lipossomas de
mesoporfirina de estanho foram esterilizados por filtrao e liofilizados em um ciclo de um
dia, com reteno do dimetro das vesculas e manuteno da taxa de encapsulao. A lactose
foi utilizada por suas propriedades crioprotetoras e por sua aceitabilidade em formulaes
para uso parenteral (CANNON et al., 1993).
Jeffs e colaboradores (2005) utilizaram o mtodo da injeo de solvente seguida de
ultrafiltrao da preparao de lipossomas constitudos de colesterol:
diestearoilfosfatidilcolina:dioleiloxidimetimetilaminopropano:diestearoilglicerometoxipolietil
enoglicol 2000 (concentrao lipdica 20 mM, razo molar 55:20:15:10, respectivamente)
para a encapsulao de plasmdeo de DNA em larga escala. Com esse mtodo foram obtidas
vesculas de dimetro inferior a 200 nm e taxa de encapsulao acima de 80 %.
VEMURI e RHODES (1994) sugeriram a utilizao do mtodo de encapsulao por
gradiente de pH seguido de diafiltrao para o escalonamento de lipossomas constitudos por
fosfatidilcolina de ovo:fosfatidilglicerol de ovo:colesterol contendo sulfato de orciprenalina
(100 mg/mL). O filme lipdico foi hidratado com tampo fosfato contendo 5 % lactose, pH
4,5, e o frmaco foi dissolvido em tampo fosfato contendo 5 % de lactose, pH 9,5. Por esse
mtodo, foram obtidos lipossomas unilamelares e oligolamelares, de dimetro inferior a 200
nm e com taxa de encapsulao de 80-85 %. O processo de liofilizao no alterou o dimetro
das vesculas, porm reduziu a porcentagem de encapsulao em 15 %. O extravasamento do
frmaco foi associado ao aumento do tamanho das vesculas, durante o armazenamento.
Para a produo em larga escala de lipossomas unilamelares grandes (LUV) pode-se
utilizar o mtodo da microfluidizao, no qual a suspenso lipdica forada repetidamente
sob alta presso atravs de um pequeno orifcio para colidir contra uma parede ou um fluido
que venha em sua direo contrria. As desvantagens so a relativa alta polidispersibilidade
da disperso lipossomal, dificuldades em refinar o dimetro das vesculas e algum risco de
degradao da amostra (ULRICH, 2002).
BARNADAS-RODRGUEZ e SABS (2001) estudaram uma variedade de fatores a
fim de avaliar as caractersticas de lipossomas obtidos em um microfluidizador. Fatores tais
como a presso, tempo que as amostras so processadas (ciclos), a fora inica, a
concentrao de fosfolpide e a quantidade de solvente orgnico (etanol) foram relacionados
com o dimetro mdio dos lipossomas e sua heterogeneidade. Para minimizar o nmero de
experimentos foi aplicado o design fatorial, como estratgia estatstica de otimizao. Como


41
as caractersticas das suspenses lipossomais determinam sua eficincia de encapsulao e
aplicao, um conhecimento detalhado do processo de homogeneizao pode facilitar a
escolha das condies de trabalho para a obteno de um tipo de lipossoma pr-determinado.
Atravs da variao do nmero de ciclos (0-9) e da presso empregada (1273-5092 Bar), os
resultados mostram que o dimetro sempre diminui com o aumento do nmero de ciclos e
com o aumento da presso. Entretanto, h um limite no nmero de ciclos empregado para um
valor de presso constante, a partir do qual, no ocorre mais a diminuio do dimetro. Esse
valor constante foi atingido em todos os valores de presso em aproximadamente sete ciclos.
Em amostras homogeneizadas a aproximadamente 3000 Bar, por 9 ciclos, foram obtidos
lipossomas de dimetro igual a 134 nm.

11 Proposta de estudo da estabilidade e produo em escala piloto de SpHL-CDDP sob
a forma liofilizada

Uma formulao de SpHL-CDDP foi desenvolvida em escala laboratorial, pelo nosso
grupo de pesquisa, mediante o emprego do mtodo de evaporao em fase reversa (REV)
seguida de extruso e ultracentrifugao. Estudos de biodistribuio mostraram que aps a
administrao de SpHL-CDDP, por via endovenosa, a CDDP atingiu uma concentrao
aproximadamente 2 vezes maior em tumores slidos de camundongos do que aps a
administrao de CDDP livre (JUNIOR et al., 2007a,b). Diante desses resultados, teve incio
a pesquisa da viabilidade da transposio de escala e da produo desta formulao sob as
formas lquida e liofilizada para futura avaliao em testes clnicos. O processo deve ser
reprodutvel e levar produo de lipossomas estreis e livres de pirognios (WAGNER et
al., 2002). Outro fator a ser considerado a estabilidade do produto, que no caso dos
lipossomas pode ser limitada pelo extravasamento do frmaco a partir das vesculas,
mudanas no tamanho das partculas durante a estocagem e pela estabilidade qumica do
frmaco e dos componentes lipdicos (CANNON et al., 1993). A liofilizao na presena de
dissacardeos, como sacarose e trealose, permite a manuteno da estabilidade de uma
formulao, impedindo o extravasamento do material encapsulado e a alterao do dimetro
vesicular (CROWE et al., 1998). Desse modo, nessa dissertao de mestrado foram avaliados
o uso de crioprotetores na preparao de SpHL-CDDP na forma liofilizada, um mtodo de
preparo dessa formulao em escala piloto e a estabilidade de armazenamento da mesma.




42
OBJETIVOS

Objetivo geral

O presente trabalho de dissertao de mestrado teve como objetivos estudar diferentes
parmetros relacionados estabilidade qumica e fsico-qumica de uma formulao de SpHL-
CDDP, assim como estabelecer um processo eficiente para a sua produo em escala piloto.

Objetivos especficos

Desenvolver uma formulao farmacutica de SpHL-CDDP sob a forma liofilizada e
avaliar o teor de encapsulao, dimetro e potencial zeta das partculas;
Avaliar a estabilidade fsico-qumica da formulao de SpHL-CDDP lquida e
liofilizada ao longo do tempo de armazenamento;
Avaliar a eficincia de um processo de preparo de uma formulao de SpHL-CDDP
em escala piloto constitudo pelas etapas de evaporao sob vcuo/homogeneizao
sob alta presso/ultrafiltrao.
























43
MATERIAL E MTODOS

1 Material

Dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) e diestearilfosfatidiletanolamina-polietilenoglicol
2000 (DSPE-PEG
2000
) foram adquiridos da Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Alemanha).
Hemisuccinato de colesterila (CHEMS) foi fornecido pela Sigma-Aldrich (Steinheim,
Alemanha). A CDDP foi adquirida da Quiral Qumica do Brasil S/A (Juiz de Fora, Minas
Gerais, Brasil). A sacarose e a trealose dihidratada, N-[2-hidroxietil] piperazina N-[2-cido
etanosulfnico] (HEPES) e hidrxido de sdio foram adquiridos da Vetec Qumica Fina Ltda.
(Rio de Janeiro, Brasil).
O metanol, acetato de etila e a N, N- dimetilformamida (DMF), todos solventes grau
HPLC, foram adquiridos da Tedia (Fairfield, Ohio, Estados Unidos). Os solventes
clorofrmio P.A. e ter etlico P.A. foram adquiridos da Synth (So Paulo, Brasil). O cloreto
de sdio P.A. e o isopropanol foram provenientes da Merck (Darmstadt, Alemanha). A gua
utilizada em todos os experimentos foi deionizada e destilada.

2 Mtodos gerais

Os lipossomas foram preparados utilizando um rotavapor Buchi Labortechnik AG CH-
9233, modelo R-210, acoplado a uma bomba de vcuo de mesma marca, modelo V-700
(Flawil, Sua). A calibrao dos lipossomas produzidos em pequena escala foi feita atravs
de um extrusor Lipex Biomembranes, modelo T 001 (Vancouver, Canad). Para a calibrao
dos lipossomas produzidos em larga escala foi utilizado um homogeneizador de alta presso
de estgio nico, modelo APV 2000 (Albertslund, Dinamarca). A purificao dos lipossomas
foi realizada por ultracentrifugao, utilizando uma ultracentrfuga Sorvall Ultra 80
(Albertville, Estados Unidos) ou por ultrafiltrao em um dispositivo Millipore Pellicon XL
com membrana de politersulfona Biomax

de 300 kDa (Massachusetts, Estados Unidos)

acoplada a uma bomba peristltica Watson-Marlow 313S (Inglaterra). Os lipossomas obtidos
foram caracterizados quanto ao dimetro das partculas e potencial zeta utilizando o Zetasizer
Malvern Instruments, modelo 3000 HSA (Malvern, Inglaterra). A liofilizao foi realizada em
liofilizador E-C Modulyo, acoplado a uma bomba Edwards, modelo E2M18FF (Inglaterra). O
teor de encapsulao foi determinado em cromatgrafo lquido de alta eficincia Waters
Instruments, composto por uma bomba modelo 515, um auto-injetor modelo 717 Plus e um


44
detector DAD modelo 2996 (Milford, Estados Unidos), conectado a um computador
apresentando o software Empower, verso 2.0. As amostras foram vortexadas em Mini-shaker
Ika, modelo MS1 (Wilmington, Estados Unidos).

3 Obteno da curva de calibrao para doseamento da CDDP

A cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) foi utilizada como mtodo de
doseamento da CDDP, segundo mtodo analtico descrito na Farmacopia Americana 24
edio (USP 24), com modificaes no eluente empregado. O eluente descrito na USP 24
constitudo por acetato de etila, metanol, dimetilformamida e gua, na proporo de
25:16:5:5, respectivamente; enquanto o eluente utilizado neste trabalho constitudo por
acetato de etila, metanol, dimetilformamida e gua, na proporo 4:4:1:1, respectivamente. A
cisplatina foi separada utilizando como fase estacionria a coluna Lichrosper

100 NH
2
, 25
cm x 4 mm, 10 m (Darmstadt, Alemanha). O volume de injeo foi de 20 L, em fluxo igual
a 1,0 mL.min
-1
e o material eludo foi detectado em comprimento de onda igual a 310 nm.

3.1 Linearidade

Para a determinao da linearidade do mtodo de CLAE empregado no doseamento da
CDDP foi construda uma curva de calibrao apresentando 6 pontos relativos a diferentes
concentraes de soluo padro de CDDP, preparadas em triplicatas. Inicialmente, uma
soluo concentrada de CDDP 2 mg/mL foi preparada pela solubilizao de 50 mg de CDDP
em 20 mL de soluo de cloreto de sdio 0,9 g% (p/v), sob aquecimento em temperatura
inferior a 45 C, seguida de agitao em vrtex. A soluo de CDDP obtida foi transferida
quantitativamente para um balo volumtrico de 25 mL, completando-se o volume com
soluo de NaCl 0,9 g% (p/v). A partir desta soluo, foram transferidas alquotas de 0,25;
0,50; 1,00; 2,00; 4,00 e 8,00 mL para bales volumtricos de 10 mL. O volume de cada balo
foi completado com fase mvel para a obteno das respectivas concentraes de 0,05; 0,10;
0,20; 0,40; 0,80 e 1,60 mg/mL de CDDP. As solues foram mantidas a temperatura ambiente
e protegidas da luz, seguido de sua injeo no cromatgrafo lquido utilizando as condies
cromatogrficas descritas acima. A partir das reas dos picos obtidos, a curva de calibrao
foi construda e a linearidade do mtodo foi avaliada mediante o clculo de regresso linear
pelo mtodo dos mnimos quadrados.


45
4 Preparao de lipossomas pH-sensveis furtivos de CDDP (SpHL-CDDP)

A preparao de SpHL-CDDP foi realizada mediante o emprego do mtodo de
evaporao em fase reversa (REV). Aps a obteno das vesculas lpidicas, a produo foi
efetuada por dois mtodos distintos, que foram denominados como Mtodo 1, a produo de
liposssomas em pequena escala; e Mtodo 2, a produo em escala piloto (Figura 11).

Figura 11 Organograma da produo de lipossomas pH-sensveis furtivos.

4.1 Mtodo 1 Preparao de SpHL-CDDP em pequena escala pelo mtodo REV

4.1.1 Obteno de uma emulso gua em leo (A/O)

Alquotas clorofrmicas de DOPE, CHEMS e DSPE-PEG
2000
(concentrao lipdica
total igual a 40 mM; razo molar igual a 5,7:3,8:0,5; respectivamente) foram transferidas para
um balo de fundo redondo, sendo o solvente, em seguida, evaporado sob vcuo. O filme
lipdico obtido foi dissolvido em 3,0 mL de ter etlico, previamente tratado com soluo de
tampo HEPES 10mM para eliminao de perxidos e em uma quantidade de soluo de
hidrxido de sdio necessria para ionizar completamente o CHEMS. Posteriormente, para a
obteno de lipossomas de CDDP, foi adicionado 1,0 mL de uma soluo de NaCl 0,9 g%
Preparao de lipossomas
pH-sensveis furtivos por
REV
PEQUENA ESCALA
MTODO 1
ESCALA PILOTO
MTODO 2
Extruso em membranas
de policarbonato
Homogeneizao sob alta
presso

Ultracentrifugao

Ultrafiltrao


46
(p/v) contendo CDDP 2,0 mg/mL, soluo lipdica. A mistura obtida foi, ento, submetida
ao vrtex durante 5 minutos, produzindo uma emulso do tipo A/O.

4.1.2 Obteno de SpHL-CDDP

Posteriormente, a emulso A/O foi submetida evaporao sob vcuo a fim de se
eliminar o solvente orgnico, permitindo a formao das vesculas lipdicas. Em seguida, os
lipossomas foram submetidos calibrao mediante sua passagem atravs de membranas de
policarbonato da marca Millipore (Bedford, Estados Unidos). Pelo mtodo 1a, os lipossomas
foram calibrados pela passagem por membranas de 0,4 m, 0,2 m e 0,1 m (5 vezes cada
ciclo), respectivamente, para a obteno de lipossomas com dimetro das vesculas em torno
de 100 nm, visando uma administrao intravenosa. Pelo mtodo 1b, os lipossomas foram
calibrados em membranas de policarbonato de 0,4 m, 0,2 m, 0,1 m e 0,05 m (por 5
vezes), respectivamente, objetivando tambm a administrao intravenosa.

4.1.3 Purificao dos SpHL-CDDP por ultracentrifugao

O material no encapsulado nos SpHL-CDDP obtidos em pequena escala foi separado
dos lipossomas mediante ultracentrifugao, a 150000 x g, a 4 C, durante 90 minutos. Aps a
ultracentrifugao, o pellet foi reconstitudo adicionando-se uma das seguintes solues: a)
soluo isotnica de sacarose (relao p/p de crioprotetor:fosfolpide igual a 1:1, 2:1 ou 3:1),
b) soluo isotnica de trealose (relao p/p de crioprotetor:fosfolpide igual a 1:1, 2:1 ou 3:1)
e c) soluo de cloreto de sdio 0,9 g% (p/v). Os SpHL-CDDP foram caracterizados quanto
ao teor de encapsulao, dimetro e potencial zeta das vesculas.

4.1.4 Avaliao da influncia do uso de crioprotetores no processo de liofilizao de
SpHL-CDDP

Os SpHL-CDDP descritos acima, preparados na ausncia e presena dos
crioprotetores foram submetidos ao processo de liofilizao durante 24 horas. Em seguida, os
SpHL-CDDP liofilizados foram reconstitudos em gua destilada e foram submetidos
ultracentrifugao (150000 x g, 4 C, 90 minutos) para separao de CDDP liberada no


47
processo de liofilizao. Os SpHL-CDDP ressuspensos foram tambm caracterizados quanto
ao dimetro e potencial zeta das vesculas.
Com o intuito de se avaliar tambm a ao dos crioprotetores sobre a estabilidade da
formulao liofilizada, lipossomas contendo crioprotetores tanto na fase interna quanto na
fase externa das vesculas lipossomais foram produzidos. Nesse caso, a adio dos
crioprotetores sacarose e trealose na razo crioprotetor/fosfolpide p/p igual a 1:1 e 2:1,
respectivamente, na cavidade interna dos SpHL-CDDP foi executada pela sua encapsulao
juntamente com a CDDP, utilizando o mtodo 1a.

5 Mtodo 2 Preparao de SpHL-CDDP em escala piloto pelo mtodo REV

Para a produo de SpHL-CDDP em escala piloto, o mtodo utilizado diferenciou-se
da produo em pequena escala quanto ao volume do lote e aos mtodos de calibrao das
vesculas e de purificao dos lipossomas. A preparao de lipossomas pH-sensveis furtivos
brancos (sem CDDP, SpHL) e de SpHL-CDDP foi realizada mediante o emprego do mtodo
REV. Foram preparados lotes de 50 mL, sob presso e rotao controladas. Os lipossomas
foram submetidos calibrao mediante sua passagem atravs de um homogeneizador de alta
presso de estgio nico (HAP) e a separao do material no encapsulado foi realizada por
ultrafiltrao.

5.1 Avaliao da influncia do nmero de ciclos de homogeneizao e da presso sobre o
dimetro das vesculas dos SpHL

A fim de se definir as condies para a produo dos SpHL em escala piloto, foram
analisadas 2 variveis no processo de homogeneizao da amostra: a presso aplicada no HAP
e o nmero de ciclos empregados. Os valores de presso testados foram 500 e 1000 Bar, e a
passagem atravs do HAP (Figura 12) foi realizada por at 12 ciclos. SpHL foram
acrescentados ao recipiente alimentador do HAP e a homogeneizao foi realizada sob fluxo
contnuo. Ao atingir a presso desejada, iniciou-se a cronometragem de cada ciclo. Cada ciclo
representa o tempo necessrio para que toda a amostra seja homogeneizada, sob presso
constante. O dimetro das vesculas foi analisado por espectroscopia de correlao de ftons,
conforme descrito no item 8, em alquotas retiradas antes do processo de homogeneizao (0
ciclo) e nos tempos correspondentes a 3, 6, 9 e 12 ciclos.


48

Figura 12 - Homogeneizador de alta presso de estgio nico.


5.2 Avaliao do nmero de ciclos de ultrafiltrao necessrios para a separao da
CDDP no encapsulada

Aps a passagem da amostra pelo homogeneizador de alta presso, os SpHL-CDDP
foram ultrafiltrados em um dispositivo Pellicon XL com membrana de polietersulfona
Biomax

de 300 kDa (50 cm

2
) acoplada a uma bomba peristltica, sob fluxo de 40 mL/min
(Figura 13). Os lipossomas foram permeados durante 1 a 6 ciclos, sendo que cada ciclo
corresponde reduo do volume da amostra at o volume mnimo necessrio recirculao
pelo dispositivo de ultrafiltrao.
Inicialmente, um volume de 100 mL da disperso lipossomal foi acondicionada em
um recipiente alimentador, no qual era mantida sob agitao constante. Sua passagem foi
impulsionada pela bomba peristltica at a membrana, a qual separava a amostra em duas
fases, sendo elas: 1) o permeado, composto principalmente por soluo de CDDP e cloreto
de sdio e 2) o retido, composto pelos SpHL-CDDP. A amostra retida retornava ao
recipiente alimentador e recirculava at sua concentrao a um volume de aproximadamente
20 mL. Ao atingir esse volume, cessava-se o bombeamento e a amostra era diluda com
soluo de NaCl 0,9 g% (p/v) em quantidade suficiente para 100 mL. Este procedimento foi


49
repetido por at 6 ciclos. Ao final de 6 ciclos, a amostra retida foi reservada. Um volume de 5
mL de soluo de NaCl 0,9 g% (p/v) foi injetado na membrana para recuperar o volume
morto de SpHL-CDDP restante no dispositivo de ultrafiltrao e adicionado amostra
retida, totalizando assim 25 mL de lipossomas purificados. Aps cada ciclo, a soluo
permeada foi reservada, para subsequente anlise da concentrao de CDDP por CLAE. Os
permeados obtidos aps o quarto, quinto e sexto ciclo de permeao foram liofilizados, a fim
de concentrar as amostras para se atingir um nvel de CDDP detectvel.



Figura 13 - Dispositivo de ultrafiltrao Millipore Pellicon XL

acoplado a bomba
peristltica.

5.3 Preparao de SpHL-CDDP pelo mtodo de evaporao em fase reversa

5.3.1 Obteno de uma emulso A/O

Alquotas clorofrmicas de DOPE, CHEMS e DSPE-PEG
2000
(concentrao lipdica
total igual a 40 mM; razo molar igual a 5,7:3,8:0,5; respectivamente) foram transferidas para
um balo de fundo redondo, sendo o solvente, em seguida, evaporado sob presso reduzida e
rotao de 100 rpm. O filme lipdico obtido foi dissolvido em 150 mL de ter etlico,
previamente tratado com soluo tampo de HEPES 10 mM, para eliminao de perxidos e
contendo quantidade de NaOH necessria para ionizar completamente o CHEMS.
Posteriormente, foram adicionados 50 mL de soluo de NaCl 0,9 g% (p/v), contendo CDDP
2,0 mg/mL, soluo lipdica. Em seguida, a mistura obtida foi submetida ao vrtex durante
5 minutos, produzindo uma emulso do tipo A/O.



50
5.3.2 Obteno de SpHL-CDDP

Posteriormente, a emulso foi submetida evaporao do solvente orgnico sob
presso reduzida, levando formao de vesculas lipdicas. A rotao foi mantida em 100
rpm. Em seguida, a disperso de lipossomas foi diluda para um volume final igual a 110 mL
com uma soluo de NaCl 0,9% (p/v), a fim de se obter o volume mnimo necessrio para a
calibrao do dimetro dos lipossomas em um homogeneizador de alta presso. A calibrao
foi realizada mediante a passagem da disperso de SpHL-CDDP no HAP, sob presso de 500
Bar, por 9 ciclos. O dimetro das vesculas foi analisado por espectroscopia de correlao de
ftons, conforme descrito no item 8.

5.3.3 Purificao dos SpHL-CDDP por ultrafiltrao

O material no encapsulado foi separado dos lipossomas produzidos pelo mtodo 2
mediante a ultrafiltrao em um dispositivo Pellicon XL com membrana de polietersulfona
Biomax de 300 kDa (Millipore) acoplada a uma bomba peristltica Watson-Marlow 313S,
sob fluxo de 40 mL/min. Os lipossomas foram permeados por 6 ciclos. Aps cada ciclo, a
soluo permeada foi reservada para posterior anlise por CLAE. A suspenso retida pela
membrana (SpHL-CDDP concentrado) foi reconstituda adicionando-se uma das seguintes
solues: 1) soluo isotnica de sacarose (relao p/p de crioprotetor:fosfolpide igual a 1:1);
2) soluo isotnica de trealose (relao p/p de crioprotetor:fosfolpide igual a 2:1) ou 3)
soluo de cloreto de sdio 0,9 g% (p/v).

6 Preparao das solues de crioprotetores

Foram testadas solues crioprotetoras de sacarose e trealose para a avaliao da sua
influncia sobre o teor de encapsulao, o dimetro e o potencial zeta das vesculas, antes e
aps a liofilizao dos SpHL-CDDP. As concentraes escolhidas para os testes basearam-se
na relao p/p entre os fosfolpides e crioprotetores presentes na formulao, variando desde
uma relao 1:1 at 1:3, conforme trabalho executado por Zadi e Gregoriadis (2000). As
solues de crioprotetores eram isotnicas em relao soluo encapsulada. Foram
preparadas e acrescentadas formulao no momento da reconstituio do pellet, obtido aps
ultracentrifugao (mtodo 1), ou para a reconstituio dos lipossomas concentrados por
ultrafiltrao (mtodo 2). As quantidades necessrias de sacarose, trealose e cloreto de sdio


51
para cada formulao foram pesadas em balana analtica (Sartorius BP221S, Alemanha),
dissolvidas em quantidade suficiente de gua destilada e transferidas quantitativamente para
bales volumtricos de 100 mL, completando-se o volume com gua destilada. As solues g
e h, contendo CDDP, foram aquecidas em temperatura inferior a 45 C a fim de promover a
solubilizao desse frmaco.


a) Soluo isotnica de sacarose (relao p/p crioprotetor:fosfolpide 1:1)
Sacarose.............................................................................................................. 2,25 %
Cloreto de sdio................... .............................................................................. 0,69 %
gua destilada qsp................ ............................................................................. 100 mL

b) Soluo isotnica de sacarose (relao p/p crioprotetor:fosfolpide 2:1)
Sacarose.............................................................................................................. 4,50 %
Cloreto de sdio.................... ............................................................................. 0,48 %
gua destilada qsp................ ............................................................................. 100 mL

c) Soluo isotnica de sacarose (relao p/p crioprotetor:fosfolpide 3:1)
Sacarose................................. ............................................................................. 6,75 %
Cloreto de sdio.................... .............................................................................. 0,30 %
gua destilada qsp............................................................................................... 100 mL

d) Soluo isotnica de trealose (relao p/p crioprotetor:fosfolpide 1:1)
Trealose dihidratada (fc: 1,1052)*...................................................................... 2,25 %
Cloreto de sdio................................................................................................... 0,69 %
gua destilada qsp............................................................................................... 100 mL
*fc significa fator de correo relativo ao peso da trealose hidratada sobre sua forma anidra


e) Soluo isotnica de trealose (relao p/p crioprotetor:fosfolpide 2:1)
Trealose dihidratada (fc: 1,1052)........................................................................ 4,50 %
Cloreto de sdio................................................................................................... 0,48 %
gua destilada qsp............................................................................................... 100 mL



52
f) Soluo isotnica de trealose (relao p/p crioprotetor:fosfolpide 3:1)
Trealose dihidratada (fc: 1,1052)........................................................................ 6,75 %
Cloreto de sdio................................................................................................... 0,30 %
gua destilada qsp................................................................ .............................. 100 mL

g) Soluo isotnica de CDDP e sacarose (relao p/p crioprotetor:fosfolpide 1:1)
CDDP................................................................................................................. 0,20 %
Sacarose............................................................................................................... 2,25 %
Cloreto de sdio.................................................................................................. 0,69 %
gua destilada qsp.............................................................................................. 100 mL

h) Soluo isotnica de CDDP e trealose (relao p/p crioprotetor:fosfolpide 2:1)
CDDP................................................................................................................. 0,20 %
Trealose dihidratada (fc: 1,1052)....................................................................... 4,50 %
Cloreto de sdio................................................................................................... 0,48 %
gua destilada qsp.............................................................................................. 100 mL


7 Determinao do teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP

A determinao da porcentagem de CDDP encapsulada foi realizada por CLAE, como
descrito no item 3. Os SpHL-CDDP foram previamente abertos com o emprego de lcool
isoproplico na proporo 1:2, seguida de diluio em fase mvel (1,5 vezes) para injeo no
cromatgrafo. O teor de encapsulao (TE) da CDDP em SpHL-CDDP foi calculado
mediante a determinao da porcentagem da concentrao de CDDP presente nos lipossomas
purificados (Lip Purificado) e a concentrao de CDDP presente nos lipossomas antes da
purificao (Lip Total), como indicado na equao discriminada abaixo:







Total Lip
[CDDP]
100 x
Purificado Lip
[CDDP]
TE =


53
8 Determinao do dimetro e do potencial zeta dos SpHL e SpHL-CDDP

A anlise do dimetro das partculas foi efetuada por meio de espectroscopia de
correlao de ftons utilizando-se o equipamento Zetasizer 3000 HSA (Malvern, Inglaterra).
Para a realizao das medidas foram utilizados aproximadamente 30 L de lipossomas
diludos em 3 mL de soluo de cloreto de sdio 0,9 g% (p/v), at que se obtivesse a
contagem adequada de partculas. As medidas foram efetuadas a temperatura de 25C e a um
ngulo de 90. Os resultados so apresentados como a mdia de dez medidas.
O potencial zeta foi determinado por espalhamento dinmico da luz e anlise da
mobilidade eletrofortica das vesculas. As medidas foram feitas em triplicata em alquotas
diludas 250 vezes, empregando-se o equipamento Zetasizer 3000 HSA (Malvern, Inglaterra),
a temperatura de 25C e a um ngulo de 90.

9 Liofilizao dos SpHL-CDDP

Amostras de aproximadamente 1,5 mL de SpHL-CDDP foram pesadas em frascos de
vidro mbar, congeladas em nitrognio lquido e colocadas na cmara do liofilizador. Os
lipossomas foram submetidos liofilizao durante 24 horas. Aps este perodo, os frascos
foram vedados e os SpHL-CDDP liofilizados foram armazenados sob proteo da luz, em
atmosfera de nitrognio, a 4 C.

10 Ressuspenso dos SpHL-CDDP

Os lipossomas pH-sensveis furtivos liofilizados foram reconstitudos com quantidade
suficiente de gua destilada para a recuperao do volume inicial de lipossomas, em
temperatura ambiente. Em seguida, a disperso lipossomal foi submetida agitao, com
auxlio do vrtex, por 3 minutos. O dimetro e o potencial zeta destas amostras foram
determinados conforme descrito no item 8, a fim de se avaliar o efeito crioprotetor da
sacarose e da trealose. Imediatamente aps a ressuspenso, estes lipossomas foram novamente
submetidos ultracentrifugao visando avaliar o efeito da liofilizao/reconstituio sobre a
reteno da cisplatina encapsulada nos lipossomas pH-sensveis furtivos. Aps a
ultracentrifugao, a quantidade de cisplatina presente no sobrenadante foi analisada por
CLAE. O pellet foi reconstitudo com soluo de NaCl 0,9 g% (p/v) e os lipossomas foram
armazenados sob atmosfera de nitrognio, a 4 C, protegidos da luz.


54
11 Estudo da estabilidade de armazenamento dos SpHL-CDDP

Foi realizado um estudo comparativo da estabilidade de armazenamento dos SpHL-
CDDP, obtidos pelo mtodo 2, sob a forma lquida e liofilizada quanto ao dimetro das
vesculas, potencial zeta e teor de encapsulao. Foram preparados 7 lotes de SpHL-CDDP,
sendo que 3 lotes foram armazenados sob a forma lquida, isto , como disperses
lipossomais, a 4 C, protegidos da luz e sob atmosfera de nitrognio. Cada um dos 4 lotes
restantes foi dividido em 3 sublotes, aos quais foram adicionadas soluo isotnica de
sacarose (relao p/p crioprotetor:fosfolpide 1:1), soluo isotnica de trealose (relao p/p
crioprotetor:fosfolpide 2:1) ou soluo de cloreto de sdio 0,9 g% (p/v). Os sublotes foram
divididos em frascos de vidro mbar, liofilizados (conforme descrito no item 9) e
armazenados sob atmosfera de nitrognio, a 4C, protegidos da luz. As disperses lipossomais
e os lipossomas liofilizados foram caracterizados nos perodos de tempo iguais a 0, 7, 15, 30,
60 e 135 dias. Em cada um dos tempos pr-determinados, as amostras liofilizadas foram
ressuspensas, como descrito no item 10, e caracterizadas quanto ao dimetro das vesculas e
potencial zeta. O teor de encapsulao de CDDP em SpHL-CDDP preparados com trealose
(relao p/p crioprotetor:fosfolpide 2:1) foi determinado, conforme item 7, aps 135 dias de
armazenamento.

12 Anlise estatstica

Os valores mdios os desvios padro (dp) foram calculados para todos os
experimentos descritos acima. A anlise estatstica foi feita atravs da anlise de varincia de
uma via (ANOVA). Um nvel de p < 0,05 foi aceito como estatisticamente significativo.





55
RESULTADOS E DISCUSSO

1 Obteno da curva de calibrao para doseamento da CDDP

1.1 Linearidade

Na tabela 1 so apresentados os valores das reas dos picos das diferentes
concentraes da soluo de CDDP empregadas para a construo da curva de calibrao. A
curva de calibrao (Figura 14) apresentou um coeficiente de correlao igual a 0,9982,
indicando adequada linearidade para a faixa de concentrao utilizada (0,05 a 1,6 mg de
CDDP/mL).

Tabela 1 - Valores das reas dos picos atribudos CDDP obtidos pelo emprego de
CLAE
Concentrao da soluo padro de CDDP (mg/mL)
0,05 0,10 0,20 0,40 0,80 1,60
rea 1 22666 43500 94886 197462 378854 1042353
rea 2 22956 46234 80659 173879 377042 960837
rea 3 21392 43621 93070 218429 459945 938130


Figura 14 Curva de calibrao para o doseamento da CDDP obtida pelo mtodo de
CLAE


y = 608639x - 30592
r
= 0,9982
0
500000
1000000
1500000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
Concentrao (mg/mL)
rea dos picos


56
2 Caracterizao fsico-qumica de SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1

2.1 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta

2.1.1 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta dos SpHL-CDDP obtidos
segundo mtodo 1a

A produo de lipossomas pelo mtodo REV leva preferencialmente obteno de
lipossomas unilamelares grandes (LUV). As vesculas obtidas apresentaram um dimetro
mdio igual a 131,0 19,4 nm e um ndice de polidisperso de 0,15. As vesculas de SpHL-
CDDP mostraram valores de potencial zeta prximos a neutralidade (1,9 1,2 mV).

2.1.2 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta dos SpHL-CDDP obtidos
segundo mtodo 1b

Com a finalidade de obteno de vesculas com dimetro mdio abaixo de 100 nm, foi
realizada a calibrao dos lipossomas pela passagem atravs de membranas de 50 nm,
segundo mtodo 1b. Contudo com a utilizao dessas membranas, obteve-se vesculas de
dimetro mdio igual a 109,0 3,3 nm. O objetivo de uma maior reduo do dimetro no foi
atingido. O valor do potencial zeta das vesculas foi de 1,7 0,28 mV.

2.2 Determinao do teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP obtidos segundo
mtodo 1

2.2.1 Determinao do teor de encapsulao dos SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo
1a

A encapsulao da CDDP em lipossomas pH-sensveis furtivos, mediante o emprego
do mtodo REV, resultou em um teor de encapsulao que variou de 17 a 23 % (0,28 a 0,40
mg de CDDP/mL) na ausncia ou presena de trealose e sacarose, empregados como
crioprotetores, antes do processo de liofilizao dos SpHL-CDDP (Tabela 2). Convm
ressaltar, que aps o processo de liofilizao/reconstituio, na presena ou ausncia dos


57
diferentes crioprotetores, no foi observado nenhum pico no cromatograma do sobrenadante
obtido aps a centrifugao das diferentes amostras. Isto indica que a CDDP se manteve
encapsulada durante as etapas de liofilizao/reconstituio, mostrando a estabilidade do
sistema frente s condies de preparo de sua forma liofilizada.

Tabela 2 - Teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 1a
Amostra*


Razo Crioprotetor:
Fosfolpide
(p/p)
Teor de encapsulao
(%)
[CDDP]
(mg/mL)
Lip-S/ Criop - 19,6 3,0 0,32 0,04
Lip-Sacarose 1:1 16,7 0,30
2:1 18,2 1,9 0,28 0,04
3:1 22,7 4,4 0,27 0,01
Lip-Trealose 1:1 19,0 0,34
2:1 20,7 1,6 0,40 0,04
3:1 N.D. N.D.
*As denominaes Lip-S/ Criop, Lip-Sacarose, Lip-Trealose referem-se aos SpHL-CDDP
preparados na ausncia de crioprotetor, na presena de sacarose e de trealose,
respectivamente. N.D. significa valores no determinados. Os valores so expressos como
mdia dp (n = 3, para as amostras Lip-Sacarose e Lip-Trealose 2:1; n = 2, para a amostra
Lip-Sacarose 3:1 e n = 1 para as amostras Lip-Sacarose 1:1, Lip-Trealose 1:1 e 3:1).


2.2.2 Determinao do teor de encapsulao e dimetro dos SpHL-CDDP obtidos
segundo mtodo 1b

Na tabela 3, esto apresentados os valores de teor de encapsulao da CDDP nos
SpHL-CDDP produzidos segundo mtodo 1b. Os SpHL-CDDP preparados tanto com
sacarose ou trealose apresentaram teor de encapsulao em torno de 10 % (0,2 mg de
CDDP/mL), com a adio de mais uma etapa de extruso (membrana de 0,05 m). Isto
revela perda do material encapsulado em relao ao processo de extruso empregado no
mtodo 1a.
Como observado no mtodo 1a, aps o processo de liofilizao/reconstituio desses
lipossomas no ocorreu liberao da CDDP encapsulada e o dimetro mdio das vesculas foi
igual a 232 e 347 nm para as preparaes Lip-Sacarose 3:1 e Lip-Trealose 2:1,


58
respectivamente. Ambas formulaes mostraram-se heterogneas com valores de i.p. iguais a
0,401 e 0,550, respectivamente.

Tabela 3 - Teor de encapsulao da CDDP em SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 1b
Amostra
Razo Crioprotetor:
Fosfolpide
(p/p)
Teor de
encapsulao
(%)
[CDDP]
(mg/mL)
Lip-Sacarose 3:1 10,2 0,19
Lip-Trealose 2:1 10,9 0,20


3 Influncia da presena de crioprotetores sobre as caractersticas fsico-qumicas dos
SpHL-CDDP liofilizados obtidos pelo mtodo 1

3.1 Influncia dos crioprotetores, presentes somente na fase externa, sobre o dimetro e
potencial zeta das vesculas aps a reconstituio do p dos SpHL-CDDP obtidos
segundo mtodo 1a

A fim de se obter uma preparao de SpHL-CDDP na forma liofilizada foi avaliada a
influncia da presena de crioprotetores sobre o dimetro das vesculas, aps a reconstituio
do p, para administrao intravenosa (Tabela 4).
Na ausncia de crioprotetor, os SpHL-CDDP apresentaram um dimetro mdio igual a
391 nm aps reconstituio, com uma distribuio de tamanho heterognea (i.p. = 0,682).
Considerando, que se tem por objetivo o preparo de SpHL-CDDP para administrao
intravenosa, sabido que quanto menor o dimetro das vesculas, maior o seu raio de
curvatura, e consequentemente, menor a opsonizao. Tm sido demonstrado que
lipossomas podem atingir diferentes tumores devido a sua propriedade de circulao por um
tempo prolongado e devido ao tamanho reduzido ( 500 nm) que permite o extravasamento
em tecidos com permeabilidade vascular aumentada, condio frequentemente presente no
caso de tumores (LASIC, 1998; YUAN et al., 1995).
Avaliando-se a populao de vesculas de dimetro inferior a 200 nm, pode-se
observar que a mesma, na ausncia de crioprotetor, representa somente 28%. Com o uso dos
crioprotetores sacarose e trealose, nas razes crioprotetor:fosfolpide iguais a 1:1 e 2:1 (p/p),
respectivamente, o dimetro mdio das vesculas no aumentou de maneira to acentuada,
estando compreendido entre 213 e 257 nm. No entanto, as formulaes so ainda


59
heterogneas com ndice de polidisperso superior a 0,2. Em relao distribuio percentual
do dimetro mdio, foi observada uma maior quantidade de vesculas de dimetro mdio
inferior a 200 nm (40 a 50 %). O aumento na razo de crioprotetor:fosfolpide para 3:1 da
trealose resultou em um aumento do dimetro das vesculas (372 nm) e uma menor
quantidade de partculas inferiores a 200 nm (16%). O aumento da razo
crioprotetor:fosfolpide para a sacarose no levou a melhora significativa no controle do
dimetro das vesculas aps liofilizao. Ambas as formulaes apresentaram-se heterogneas
com valores de i.p. superiores a 0,2. A partir dos resultados obtidos, optou-se pelo
prosseguimento do trabalho utilizando sacarose na razo crioprotetor:fosfolpide igual a 1:1
(p/p), e de trealose, na razo crioprotetor:fosfolpide igual a 2:1 (p/p).

Tabela 4 - Influncia da presena de crioprotetores sobre o dimetro das vesculas dos
SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1a aps o processo de liofilizao
Amostra*
Razo
Crioprotetor:
Fosfolpide
(p/p)
Dimetro
Mdio (nm)
ndice de
Polidisperso
(i.p.)
Distribuio
de vesculas
de dimetro
200 nm
(%)
Potencial
zeta (mV)
Lip-S/Crio-AL - 131,1 19,4 0,150 80,4 13,3 1,9 1,2
Lip-S/Crio-PL - 390,7 139, 5 0,682 28,2 12,2 0,5 0,5
Lip-Sacarose-AL 1:1 128,8 0,165 89,1 2,5
2:1 154,0 14,1 0,254 73,0 6,7 -2,3 3,5
3:1 111,8 16,6 0,080 96,0 6,2 - 1,3 1,0
Lip-Sacarose-PL 1:1 251,6 0,396 40,7 1,0
2:1 256,7 13,6 0,479 40,9 0,1 0,6 3,4
3:1 263,3 50,0 0,569 36,4 7,7 1,6 2,9
Lip-Trealose-AL 1:1 126,9 0,193 80,6 -
2:1 153,4 18,69 0,231 75,8 11,2 -1,5 1,8
3:1 129,9 0,148 89,0 5,3
Lip-Trealose-PL 1:1 242,5 0,601 40,9 -
2:1 213,4 37,4 0,386 50,5 8,3 -2,8 2,8
3:1 372,1 0,446 16,3 2,7
*As abreviaturas AL e PL significam antes e aps a liofilizao, respectivamente.

Os valores
so expressos como mdia dp (n = 3), exceto para as amostras Lip-Sacarose e Lip-Trealose
1:1 assim como Lip-Trealose 3:1 (n = 1).


60
Em relao medida de potencial zeta, as vesculas de SpHL-CDDP apresentaram
valores prximos neutralidade na ausncia e presena dos crioprotetores (Tabela 4).

3.2 Influncia dos crioprotetores sobre o dimetro e potencial zeta das vesculas aps a
reconstituio do p dos SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1a, utilizando
crioprotetores na fase interna e externa dos lipossomas

A adio de crioprotetores, na fase interna e externa das vesculas lipossomais, no
levou melhora da eficincia de manuteno do tamanho, resultando em valores de dimetro
mdio superiores ao mtodo 1a, no qual os crioprotetores foram adicionados somente fase
externa da formulao. Em relao a distribuio percentual de vesculas menores que 200 nm
houve diminuio para valores abaixo de 18% (Tabela 5).

Tabela 5 - Influncia da presena de crioprotetores, presentes na fase interna e externa,
sobre o dimetro das vesculas dos SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 1a aps o
processo de liofilizao
Amostra*
Razo
Crioprotetor:
Fosfolpide
(p/p)
Dimetro
Mdio (nm)
ndice de
Polidisperso
(i.p.)
Distribuio
de vesculas
de dimetro
200 nm
(%)
Potencial
zeta (mV)
Lip-Sacarose-AL 1:1 108,6 5,9 0,04 0,02 99,7 0,1 - 4,45 0,8
Lip-Sacarose-PL 1:1 423,1 8,6 0,65 0,24 16,5 0,3 1,60 3,7
Lip-Trealose-AL 2:1 104,85 8,4 0,05 0,01 99,7 0,5 - 2,50 1,6
Lip-Trealose-PL 2:1 384,7 123,7 0,42 0,02 18,0 13,1 0,10 1,8
* Os valores so expressos como mdia dp (n = 2).



4 Avaliao dos parmetros de produo dos SpHL segundo mtodo 2 (escala piloto)


4.1 Influncia do nmero de ciclos de homogeneizao e da presso sobre o dimetro das
vesculas dos SpHL




61
Os SpHL produzidos pelo mtodo 2 apresentaram um dimetro mdio de
aproximadamente 380 nm (i.p. = 0,66) logo aps a hidratao do filme lipdico. A diluio da
disperso de SpHL no levou alterao do dimetro e distribuio da populao das
vesculas (Tabela 6). Quando submetidos homogeneizao sob presso igual a 500 Bar aps
3 ciclos, observou-se uma reduo significativa no dimetro das vesculas (115 nm) e a
obteno de uma disperso lipossomal de maior homogeneidade (i.p. = 0,24). A distribuio
do dimetro das vesculas mostra que a totalidade da amostra possui tamanho inferior a 500
nm, sendo que 40 % possui dimetro inferior a 100 nm. Com o acrscimo do nmero de
ciclos para 9, observa-se um dimetro mdio igual a 94,5 nm, um ganho na homogeneidade
da disperso de lipossomas (i.p. = 0,19) e no valor absoluto da porcentagem da populao de
vesculas de dimetro inferior a 100 nm (54,3 %). No entanto, no existe diferena
estatisticamente significativa entre a distribuio de vesculas de dimetro 100 nm com o
emprego de 3, 6 e 9 ciclos (p > 0,05). Ao se aumentar o nmero de ciclos para 12, no foram
observadas alteraes nestes resultados, sugerindo que foi alcanado o limite de reduo do
dimetro das vesculas nas condies de presso empregadas.


Tabela 6 - Influncia do nmero de ciclos empregados no processo de homogeneizao
sob presso a 500 Bar sobre o dimetro das vesculas dos SpHL
Distribuio do dimetro das vesculas (%) Nmero
de
ciclos*
Dimetro
mdio (nm)
ndice de
poli-
disperso
(i.p.)
100 nm 200 nm 200-500 500 nm
0 381,8 37,8 0,66 0,01 4,10 0,0 21,8 7,8 41,2 2,2 37,1 9,9
3 115,0 5,5 0,24 0,05 40,2 0,4 89,4 0,2 10,4 0,3 0,2 0,1
6 104,3 6,4 0,23 0,01 47,4 10,4 92,0 3,8 7,9 3,8 0,1 0,1
9 94,5 15,8 0,19 0,00 54,3 20,5 96,1 2,1 3,8 2,1 0,0 0,0
12 81,3 0,2 68,7 98,5 2,3 0,0
*Os valores de 0 a 9 ciclos correspondem a mdia dp (n = 2), enquanto que o 12 ciclo
apresenta valores de n = 1.


Ao serem homogeneizados sob presso igual a 1000 Bar (Tabela 7), aps 3 ciclos,
observou-se uma reduo significativa no dimetro das vesculas (87 nm) e a obteno de
uma disperso lipossomal de maior homogeneidade (i.p. 0,2). A distribuio do dimetro das
vesculas mostra que a totalidade da amostra possui tamanho inferior a 500 nm, sendo que 55


62
% possui dimetro inferior a 100 nm. Com o acrscimo do nmero de ciclos para 6, observa-
se um dimetro mdio igual a 80,3 nm, uma disperso lipossomal homognea (i.p. = 0,2) e
uma porcentagem de populao de vesculas de dimetro inferior a 100 nm igual a 69%,
sendo estatisticamente diferente daquela obtida com o emprego de 3 ciclos (p < 0,001). Ao se
aumentar o nmero de ciclos para 12, no foram observadas alteraes nestes resultados,
sugerindo que foi alcanado o limite de reduo do dimetro das vesculas nas condies de
presso empregada. Entretanto, a utilizao desta presso levou a um aquecimento da
amostra, atingindo a temperatura de 55 C. Portanto, optou-se em empregar a
homogeneizao sob presso a 500 Bar, por 9 ciclos, no preparo de SpHL-CDDP. Alm
disso, foi adicionado essa formulao um agente antioxidante, o butilhidroxitolueno (BHT),
em concentrao igual a 0,01 % (p/p).

Tabela 7 - Influncia do nmero de ciclos empregados no processo de homogeneizao
sob presso a 1000 Bar sobre o dimetro das vesculas dos SpHL
Distribuio do dimetro das vesculas (%) Nmero
de
ciclos*
Dimetro
mdio (nm)
ndice de
poli-
disperso
(i.p.)
100 nm 200 nm 200-500 500 nm
0 280,1 7,1 0,4 0,05 5,6 2,7 27,0 0,17 54,2 0,06 18,8 0,17
3 86,9 1,3 0,2 0,03 54,8 0,2 95,7 1,67 4,2 1,67 0,0 0,00
6 80,3 1,1 0,2 0,01 69,0 0,1 97,5 0,1 2,3 0,00 0,0 0,00
9 79,7 0,2 69,0 97,6 2,3 0,0
12 79,0 0,2 69,0 97,5 2,3 0,0
* Os valores de 0 a 6 ciclos correspondem a mdia dp (n = 3), enquanto que os ciclos 9 e
12 apresentam valores de n = 1.



SpHL-CDDP foram submetidos a 9 ciclos de homogeneizao sob presso de 500 Bar,
sendo obtidos lipossomas com dimetro vesicular mdio de 99 nm, monodispersos, com 52,6
% das vesculas menores que 100 nm e 100 % compreendidas abaixo de 500 nm, dimetro
limitante administrao parenteral (Tabela 8). A porcentagem de vesculas de dimetro
100 nm foi significativamente maior com o emprego de 9 ciclos ao invs de 3 ciclos
(p < 0,01). Diante desses resultados, utilizou-se a presso de 500 Bar e 9 ciclos para a
produo de SpHL-CDDP, segundo o mtodo 2, para proceder o teste de estabilidade.


63
Tabela 8 - Influncia do nmero de ciclos empregados no processo de homogeneizao
sob presso a 500 Bar sobre o dimetro das vesculas dos SpHL-CDDP
*Os valores de 0 a 9 ciclos correspondem a mdia dp (n = 7).


4.2 Avaliao do nmero de ciclos de ultrafiltrao necessrios para a separao da
CDDP no encapsulada

A avaliao do nmero de ciclos necessrios para a eliminao da CDDP no
encapsulada com o uso da ultrafiltrao est demonstrada na Tabela 9. Aps 5 ciclos de
ultrafiltrao, a cisplatina no encapsulada, contida no permeado, no foi mais detectada. O
processo de ultrafiltrao foi eficiente na separao do material encapsulado do no
encapsulado e foi utilizado na produo piloto para a purificao dos SpHL-CDDP obtidos
segundo mtodo 2.

Tabela 9 - Influncia do nmero de ciclos de ultrafiltrao sobre a purificao dos
SpHL-CDDP
Nmero de ciclos Concentrao de CDDP no permeado (mg/mL)
*

1 0,70 0,10
2 0,30 0,04
3 0,17 0,03
4 0,08 0,01
5 < L.D.
**

6 < L.D.
*
Os valores de 1 a 6 ciclos correspondem a mdia dp (n = 7).
**
A concentrao de CDDP foi menor que o limite de deteco (L.D.).



Distribuio do dimetro das vesculas (%) Nmero
de
ciclos*
Dimetro
mdio (nm)
ndice de
poli-
disperso
(i.p.)
100 nm 200 nm 200-500 500 nm
0 364,7 51,0 0,7 0,18 6,2 2,5 22,7 5,9 45,3 5,7 31,9 5,2
3 112,7 4,1 0,2 0,01 40,1 0,1 89,3 0,1 10,4 0,0 0,1 0,1
6 104,2 2,9 0,2 0,02 46,3 7,9 90,0 2,0 9,7 2,0 0,1 0,1
9 98,8 3,6 0,2 0,01 52,6 5,6 93,8 2,0 6,0 2,0 0,0 0,0


64
5 Caracterizao fsico-qumica de SpHL-CDDP obtidos segundo mtodo 2

Para que os lipossomas sejam utilizados como carreadores de frmacos, estes devem
apresentar dimetro de vescula definido e distribuio homognea, pois esses parmetros
influenciam no seu comportamento biolgico e na sua estabilidade. Os SpHL-CDDP, obtidos
pelo mtodo 2, foram monodispersos, com dimetro mdio vesicular menor que 100 nm e
potencial zeta prximo a neutralidade. O teor de encapsulao ficou em torno de 13 %
(Tabela 10). Esse teor de encapsulao foi menor do que aquele observado para os SpHL-
CDDP calibrados por uso do mtodo de extruso (mtodo 1). Considerando que a distribuo
percentual de vesculas de dimetro 200 nm igual com o emprego de 3 e 6 ciclos
(p > 0,05) (Tabela 8), seria interessante avaliar num estudo futuro, a possibilidade de se obter
um aumento do teor de encapsulao de CDDP em SpHL-CDDP mediante a reduo do
nmero de ciclos de homogeneizao a 500 Bar (3 ciclos).

Tabela 10 - Caracterizao fsico-qumica dos SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 2*
Teor de
encapsulao (%)
Dimetro das
vesculas (nm)
ndice de
polidisperso (i.p.)
Potencial Zeta(mV)
12,9 2,30 99,0 3,9 0,20 0,01 2,1 2,9
*Os valores apresentados correspondem a mdia dp (n = 7).


6 Influncia da presena de crioprotetores sobre as caractersticas fsico-qumicas dos
SpHL-CDDP liofilizados obtidos pelo mtodo 2

Para a avaliao da influncia dos crioprotetores nos SpHL-CDDP, preparados em
escala piloto, foram utilizadas a relao crioprotetor:fosfolpide de 1:1 (p/p) para a sacarose e
de 2:1 (p/p), para a trealose. Na ausncia de uma substncia crioprotetora, o dimetro mdio
das vesculas aps a ressuspenso do p foi de aproximadamente 470 nm, com ndice de
polidisperso de 0,50 (Tabela 11). Na presena dos crioprotetores, o aumento do tamanho das
vesculas aps a reconstituio do liofilizado foi significativamente menor com o uso da
trealose, nos quais o dimetro mdio das vesculas sofreu um menor aumento, dobrando o valor
do dimetro mdio em relao as amostras antes da liofilizao.
Para as amostras liofilizadas na ausncia de crioprotetores ou utilizando sacarose (razo
crioprotetor:fosfolpide 1:1 p/p), ocorreu aumento do dimetro das vesculas na ordem de 5


65
vezes. A distribuio percentual de vesculas abaixo de 200 nm foi de 12-14 % e menores de
500 nm variou de 37 a 44 %.

Tabela 11 - Influncia da presena de crioprotetores sobre o dimetro das vesculas dos
SpHL-CDDP obtidos pelo mtodo 2
Distribuio percentual do
dimetro das vesculas
Amostra*
Razo
Crioprotetor:
Fosfolpide
(p/p)
Dimetro
mdio
(nm)
ndice de
polidisperso
(i.p.)
200 200-500 500
Lip-S/Crio-AL - 99 4 0,20 0,01 94 2 6 2 0 0
Lip-S/Crio-PL - 470 15 0,50 0,18 12 5 43 4 44 0
Lip-Sacarose-PL 1:1 410 39 0,43 0,08 14 4 49 7 37 8
Lip-Trealose-PL 2:1 192 10 0,46 0,06 56 0 37 3 7 3
*Os valores indicados representam a mdia dp (n = 4), exceto para Lip-S/Crio cujo n = 7.


Os resultados obtidos indicam que SpHL-CDDP para fins de administrao intravenosa,
em maior volume, podem ser preparados empregando-se as etapas de evaporao sob presso
reduzida da emulso O/A, seguida de homogeneizao sob alta presso e ultrafiltrao nas
condies avaliadas. A homogeneizao sob alta presso e a extruso foram as duas tcnicas
utilizadas neste trabalho para a calibrao e reduo do dimetro das vesculas dos lipossomas.
Em comparao com a extruso, a homogeneizao sob alta presso mais promissora para a
produo em larga escala em funo da facilidade de manuseio e rapidez do processo.

7 Estudo da estabilidade de armazenamento dos SpHL-CDDP

A estabilidade de armazenamento dos SpHL-CDDP, sob as formas lquida (disperso
lipossomal) e liofilizada, obtidos pelo mtodo 2, foi avaliada quanto ao dimetro das vesculas,
potencial zeta e teor de encapsulao.

7.1 Determinao do dimetro das vesculas e potencial zeta de SpHL-CDDP durante o
armazenamento

De acordo com os resultados apresentados na tabela 12, observou-se que aps o
processo de liofilizao/rehidratao, ocorreu aumento significativo, da ordem de 5 vezes, do


66
dimetro mdio das vesculas liofilizadas na ausncia de crioprotetores (p < 0,001) em relao
disperso lipossomal. A disperso lipossomal, cuja distribuio de dimetro era homognea
antes de ser submetida liofilizao (i.p. = 0,2), apresentou-se heterognea aps a rehidratao
(i.p. = 0,5). Pode-se verificar que no existe diferena significativa (p > 0,05) entre os
dimetros mdios e potencial zeta dos SpHL-CDDP, aps o processo de
liofilizao/rehidratao, das vesculas ressuspensas, ao longo de 60 dias de armazenamento.
Na ausncia de crioprotetores, os lipossomas sofreram agregao e/ou fuso das vesculas,
resultando no aumento do dimetro mdio aps a rehidratao do material liofilizado. Em
relao aos valores de potencial zeta, no foram observadas alteraes ao longo do tempo de
armazenamento.

Tabela 12 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP
liofilizados na ausncia de crioprotetores
Distribuio percentual do
dimetro das vesculas
Amostra*
Dimetro
mdio
(nm)
ndice de
Polidisperso
(i.p.) 200 200-500 500
Potencial
zeta
(mV)
Lip-S/Crio-AL 99 3,6 0,2 0,0 94 2,0 6 2,0 0 0,0 2,8 3,5
Lip-S/Crio-PL d 0 470 14,5 0,5 0,2 12 4,5 43 4,2 44 0,4 1,5 2,0
Lip-S/Crio-PL d 7 501 29,0 0,4 0,1 8 2,3 44 8,3 48 7,2 1,4 1,5
Lip-S/Crio-PL d 15 473 27,5 0,5 0,1 11 3,9 45 3,7 44 0,4 3,0 1,8
Lip-S/Crio-PL d 30 457 48,2 0,5 0,1 13 4,4 39 0,0 44 0,1 1,5 2,4
Lip-S/Crio-PL d 60 490 10,2 0,4 0,1 7 2,3 48 2,2 45 0,2 2,2 1,6
*As denominaes d0, d7, d15, d30 e d60 referem-se aos dias 0, 7, 15, 30 e 60 aps o preparo
dos SpHL-CDDP liofilizados.

Os valores indicados representam a mdia dp (n = 3).


Na tabela 13 esto apresentados os resultados relativos ao estudo de variao do
dimetro dos SpHL-CDDP ao longo do tempo de armazenamento em que foi utilizada a
sacarose, na razo crioprotetor:fosfolpide 1:1. A sacarose no exerceu a ao crioprotetora
desejada, visto que o dimetro das vesculas aumentou significativamente (p < 0,001) aps
rehidratao do p liofilizado, comportando-se de maneira semelhante aos SpHL-CDDP
produzidos na ausncia de crioprotetores. A distribuio percentual das vesculas de SpHL-
CDDP menores que 200 nm, tanto em SpHL-CDDP preparados sem ou com sacarose menor
que 14 %. A concentrao de sacarose utilizada no foi efetiva para a crioproteo almejada.
Como observado anteriormente na ausncia de crioprotetor, o potencial zeta dos SpHL-CDDP


67
preparados na presena de sacarose tambm no mostrou alterao ao longo do tempo de
armazenamento.


Tabela 13 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP
liofilizados na presena de sacarose
Distribuio percentual do
dimetro das vesculas
Amostra*
Dimetro
mdio
(nm)
ndice de
polidisperso
(i.p.) 200 200-500 500
Potencial
zeta (mV)
Lip-Sac-AL 99 3,6 0,2 0,0 94 2,0 6 2,0 0 0,0 3,2 4,7
Lip-Sac-PL d 0 410 38,7 0,4 0,1 14 3,8 48 6,7 37 8,2 0,5 4,5
Lip-Sac-PL d 7 454 45,7 0,3 0,1 8 6,5 52 3,6 41 7,3 1,5 2,4
Lip-Sac-PL d 15 510 53,8 0,5 0,2 9 5,1 39 6,3 52 8,8 0,7 6,4
Lip-Sac-PL d 30 414 16,9 0,5 0,1 14 3,8 43 7,0 41 6,8 0,6 1,2
Lip-Sac-PL d 60 409 24,1 0,4 0,1 14 3,8 48 6,7 37 7,9 2,4 1,2
*Os valores indicados representam a mdia dp (n = 4).


Entretanto, o uso da trealose como crioprotetor permitiu um maior controle do dimetro
das vesculas de SpHL-CDDP aps a liofilizao/rehidratao como indicado na Tabela 14.
Apesar do aumento significativo, da ordem de 2 vezes, do dimetro mdio das vesculas em
relao disperso lipossomal (p < 0,001), o mesmo menor do que o observado na presena
de sacarose (quatro vezes maior). A disperso lipossomal de SpHL-CDDP apresentou-se
heterognea (i.p. = 0,5), no entanto a maioria das vesculas apresentaram dimetro igual ou
inferior a 500 nm (93%), o que importante para a garantia de segurana de uma administrao
endovenosa e para a eficcia antitumoral. Com o uso da sacarose como crioprotetor, foi
observado um percentual elevado de vesculas com dimetro superior a 500 nm (37 %). Ao
longo do tempo de armazenamento, pode-se verificar que no houve diferena significativa (p
> 0,05) entre os dimetros mdios e potencial zeta dos SpHL-CDDP preparados na presena de
trealose, aps o processo de liofilizao/rehidratao.






68
Tabela 14 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP
liofilizados na presena de trealose
Distribuio percentual do
dimetro das vesculas
Amostra*
Dimetro
mdio
(nm)
ndice de
polidisperso
(i.p.)
200 200-500 500
Potencial
zeta (mV)
Lip-Tre-AL 99 3,6 0,2 0,0 94 2,0 6 2,0 0 0,0 2,4 3,8
Lip-Tre-PL d 0 192 10,3 0,5 0,1 56 0,1 37 3,0 7 2,9 3,1 1,9
Lip-Tre-PL d 7 199 17,6 0,5 0,0 52 7,5 39 7,0 8 2,3 2,4 2,3
Lip-Tre-PL d 15 210 32,0 0,5 0,1 45 7,4 42 4,6 10 6,3 2,1 2,4
Lip-Tre-PL d 30 192 10,2 0,5 0,1 56 0,2 33 5,9 8 3,0 2,4 1,3
Lip-Tre-PL d 60 191 11,9 0,4 0,1 56 0,2 38 2,6 6 2,5 3,3 1,6
Lip-Tre-PL d 135 181 9,3 0,5 0,1 56 0,0 37 3,1 8 3,0 N.D.
*A denominao d135 refere-se ao 135 dia aps o preparo dos SpHL-CDDP liofilizados.
N.D. significa valores no determinados.

Os valores indicados representam a mdia dp (n =
4).


A variao do dimetro e potencial zeta da preparao lquida de SpHL-CDDP foi
tambm acompanhada ao longo do tempo para fins de comparao com sua forma liofilizada.
Conforme descrito na Tabela 15, pode-se observar que a disperso lquida de SpHL-CDDP no
sofreu alterao do dimetro das vesculas durante o perodo de armazenamento de 135 dias. O
dimetro mdio manteve-se em torno de 110 nm. A distribuio percentual de vesculas
menores de 500 nm foi igual a 100 %. O potencial zeta da preparao lquida de SpHL-CDDP
tambm se manteve constante ao longo do tempo de armazenamento. Possivelmente isso se
deve presena de DSPE-PEG
2000
na formulao de SpHL-CDDP contribuindo para a
estabilizao das vesculas. A mobilidade eletrofortica de SpHL-CDDP muito baixa (< 0,5
ms
-1
/Vcm
-1
), apesar da presena de CHEMS que confere uma carga negativa superfcie dos
lipossomas. Os valores da mobilidade eletrofortica so coerentes com os valores descritos na
literatura quando da utilizao de DSPE-PEG
2000
na concentrao de 5 % (WOODLE et al.,
92). Alm disso, convm ressaltar que a inalterao desses dados demonstram que as cadeias
de polietilenoglicol no foram afetadas pelo processo de liofilizao/rehidratao e no
armazenamento de SpHL-CDDP.


69

Tabela 15 - Avaliao da estabilidade do dimetro e potencial zeta de SpHL-CDDP
armazenados na forma lquida
Distribuio percentual do
dimetro das vesculas
Amostra
Dimetro
mdio
(nm)
ndice de
polidisperso
(i.p.)
200 200-500 500
Potencial
zeta (mV)
Lip-Disperso d 0 110 3,9 0,2 0,0 89 0,1 11 0,1 0,1 0,1 1,7 1,9
Lip-Disperso d 7 113 4,5 0,2 0,0 89 0,1 11 0,1 0,1 0,1 0,2 2,7
Lip-Disperso d 15 116 3,9 0,2 0,0 89 0,1 11 0,1 0,1 0,1 0,5 0,9
Lip-Disperso d 30 110 2,0 0,2 0,0 89 0,1 11 0,1 0,0 0,1 1,5 2,9
Lip-Disperso d 60 117 7,8 0,3 0,1 87 4,8 13 4,3 0,4 0,5 2,2 1,2
Lip-Disperso d 135 118 4,8 0,3 0,1 84 4,7 16 4,7 0,4 0,5 N.D.
*Os valores indicados representam a mdia dp (n = 3).



Portanto, em todas as formulaes de SpHL-CDDP avaliadas (liofilizada e lquida) no
foram observadas modificaes do dimetro, ndice de polidisperso e potencial zeta durante o
seu armazenamento por at 60 ou 135 dias. As figuras 15 e 16 mostram o sumrio desse
conjunto de dados.





70



0 1 7 15 30 60
0
100
200
300
400
500
600
Tempo (dias)
T
a
m
a
n
h
o

(
n
m
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
P
I
C
A
0
100
200
300
400
500
600
T
a
m
a
n
h
o

(
n
m
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
P
I
0 1 7 15 30 60
0
100
200
300
400
500
600
T
a
m
a
n
h
o

(
n
m
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
P
I
0 1 7 15 30 60
0
100
200
300
400
500
600
T
a
m
a
n
h
o

(
n
m
)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
P
I
B
D


Figura 15 Variao do dimetro das vesculas e do ndice de polidisperso de SpHL-
CDDP durante um perodo de at 60 dias de armazenamento. (A) SpHL-CDDP
liofilizados e rehidratados na ausncia de crioprotetor; (B) SpHL-CDDP liofilizados e
rehidratados na presena de sacarose (relao sacarose:fosfolpide 1:1 p/p) (C) SpHL-
CDDP liofilizados e rehidratados na presena de trealose (relao trealose:fosfolpide
2:1 p/p) e (D) SpHL-CDDP na forma lquida. O tempo 0 representa as amostras antes da
liofilizao (exceto para D) e o tempo 1 representa o dia em que as amostras foram
ressuspensas.



71


0 1 7 15 30 60
0
2
4
6
8
10
A
P
o
t
e
n
c
i
a
l

z
e
t
a

(
m
V
)
0 1 7 15 30 60
0
2
4
6
8
10
B
P
o
t
e
n
c
i
a
l

z
e
t
a

(
m
V
)
0 1 7 15 30 60
0
2
4
6
8
10
C
P
o
t
e
n
c
i
a
l

z
e
t
a

(
m
V
)
0 1 7 15 30 60
0
2
4
6
8
10
D
Tempo (dias)
P
o
t
e
n
c
i
a
l

z
e
t
a

(
m
V
)

Figura 16 Variao do potencial zeta de SpHL-CDDP durante um perodo de at 60
dias de armazenamento. (A) SpHL-CDDP liofilizados e rehidratados na ausncia de
crioprotetor; (B) SpHL-CDDP liofilizados e rehidratados na presena de sacarose
(relao sacarose:fosfolpide 1:1 p/p) (C) SpHL-CDDP liofilizados e rehidratados na
presena de trealose (relao trealose:fosfolpide 2:1 p/p) e (D) SpHL-CDDP na forma
lquida. O tempo 0 representa as amostras antes da liofilizao (exceto para D) e o
tempo 1 representa o dia em que as amostras foram ressuspensas.





72
A partir da observao do melhor efeito crioprotetor, conseguido com o emprego de
trealose, foi investigada tambm a estabilidade relativa reteno de CDDP encapsulada em
SpHL-CDDP aps 135 dias de armazenamento. Os SpHL-CDDP liofilizados na presena de
trealose conseguiram manter o frmaco encapsulado de forma mais eficiente do que a
formulao lquida (p < 0,05) (Tabela 16). Portanto, a preveno da agregao e/ou fuso das
vesculas observada nos estudos de estabilidade do dimetro das vesculas parece no impedir o
extravasamento da CDDP encapsulada nos SpHL-CDDP. No entanto, o processo de preparo de
SpHL-CDDP sob a forma liofilizada contribuiu com a otimizao desse parmetro de
estabilidade da preparao lipossomal.

Tabela 16 - Avaliao do teor de liberao de CDDP a partir de SpHL-CDDP aps 135
dias de armazenamento

Amostra* Teor de liberao (%)
Lip-Trealose 4,0 1,0
Lip-Disperso 14,3 3,5
*
Os valores indicados representam a mdia dp de dois (Lip-Disperso) ou trs
experimentos (Lip-Trealose).


8 Por que a trealose mais eficiente do que a sacarose no controle do dimetro dos
SpHL-CDDP?

A crioproteo oferecida pelos solutos influenciada pela temperatura de transio de
fase dos lpides (Tm) e pela temperatura de transio vtrea dos crioprotetores (Tg) (CROWE et
al., 1994). A utilizao de crioprotetores durante a liofilizao deve observar a Tg do soluto
empregado como tal, a fim de preservar a natureza porosa do liofilizado.
A secagem primria do processo de liofilizao deve ser feita a aproximadamente 4 C
abaixo da Tg dos crioprotetores (MOHAMMED et al., 2006). Estudos de Roos e colaboradores
(1997) demonstraram que em solues aquosas crioconcentradas, a sacarose (concentrao
mxima de soluto igual a 81,7 % p/p) apresentou uma Tg igual - 46 C, enquanto que a
trealose (concentrao mxima de soluto igual a 81,6 % p/p) apresentou Tg igual a - 40 C. Em
virtude da maior habilidade da trealose em controlar o dimetro das vesculas de SpHL-CDDP,
pode-se sugerir que a trealose apresentava Tg acima da temperatura empregada na liofilizao,
mantendo-se como uma matriz vtrea. Por sua vez, a sacarose presente nos SpHL-CDDP deve


73
apresentar Tg abaixo ou igual a temperatura empregada na secagem primria, j que apresentou
propriedades semelhantes s amostras liofilizadas na ausncia de uma substncia crioprotetora.
Crowe e colaboradores (1996) observaram que amostras de lipossomas constitudos por
fosfatidilcolina de ovo na presena de sacarose como crioprotetor (razo lpide:acar 1:1 p/p)
atingiram menor temperatura de transio vtrea e de uma maneira mais rpida durante a
hidratao do que com o emprego de trealose (razo lpide:acar 1:1 p/p). Portanto a sacarose
apresentou menor capacidade de manuteno da matriz vtrea, a qual importante para o
controle do dimetro das vesculas. Os valores de Tg so inversamente proporcionais ao teor de
umidade da amostra, ou seja, a medida que a amostra hidratada, os valores da temperatura de
transio vtrea diminuem (CROWE et al., 1998). Durante o processo de rehidratao do
liofilizado, o menor aumento do dimetro em Lip-trealose (o dimetro dos lipossomas com
trealose aumentou 2 vezes em relao aos SpHL-CDDP antes da liofilizao) do que em Lip-
sacarose (o dimetro dos lipossomas com sacarose aumentou 4 vezes em relao aos SpHL-
CDDP antes da liofilizao) pode ser devido ao fato de que a medida que a trealose
hidratada, grande parte da gua absorvida leva formao da trealose dihidratada, que
responsvel pela maior temperatura de transio vtrea deste dissacardeo. Em oposio, a
absoro da gua pela sacarose resulta em um decrscimo da Tg, de modo que essa temperatura
pode ser mais facilmente atingida durante o processo, desestabilizando a matriz vtrea de
sacarose (CROWE et al., 1996).
Deste modo, alm da maior Tg apresentada pela trealose, podem ser ressaltadas outras
vantagens que so importantes para sua eficcia crioprotetora, como sua baixa
higroscopicidade, a ausncia de ligaes de hidrognio internas que permite maior flexibilidade
para a formao de ligaes de hidrognio durante a liofilizao e reatividade qumica muito
baixa (ABDELWAHED, 2006).
Embora a manuteno da matriz vtrea seja necessria para a estabilizao dos
lipossomas no estado desidratado, isto no por si s suficiente. A diminuio da Tm dos
fosfolpides desidratados tambm necessria para a manuteno da estabilidade dos
lipossomas. A presena de crioprotetores pode prevenir o aumento na permeabilidade da
bicamada e extravasamento do material encapsulado durante a rehidratao. Sabe-se que
dissacardeos, como trealose e sacarose, interagem com os grupos polares dos fosfolpides,
deprimindo a Tm e mantendo o fosfolpide em um estado fluido aps a desidratao (VAN
WINDEN et al., 1997). Quando a dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) desidratada na ausncia
de crioprotetores, sua Tm aumenta de 42 C (estado hidratado) para 120 C. A presena dos
dissacardeos sacarose e trealose impedem essa elevao brusca da Tm do DPPC durante o


74
processo de liofilizao, e ambos atuam diminuindo essa temperatura para 24 C (CROWE et
al., 1998). Dessa forma, sugere-se que no presente trabalho, estes acares atuem de maneira
semelhante, diminuindo a Tm dos lpides da formulao (DOPE e DSPE-PEG
2000
) e, portanto,
impedindo a perda da CDDP encapsulada nos SpHL-CDDP. Os mecanismos de ao da
sacarose e da trealose so diferentes, provavelmente devido estereoqumica do grupos
hidroxila da sacarose dispostos nas posies equatorial e axial. Entretanto, sob condies
drsticas, nas quais a gua completamente removida, os dois acares atuam de maneira
semelhante (LUZARDO et al., 2000).







































75
CONCLUSO E PERSPECTIVAS


A partir dessa dissertao de mestrado foi proposto um processo de preparao piloto
de SpHL-CDDP, o qual constitudo pelas etapas sucessivas de evaporao em fase reversa,
homogeneizao sob alta presso e ultrafiltrao. Com o emprego de uma presso de 500 Bar
durante nove ciclos na etapa de calibrao dos SpHL-CDDP, seguido de ultrafiltrao por
quatro ciclos, possvel obter uma preparao lipossomal monodispersa com dimetro mdio
igual a 99 nm. No entanto, consideramos que interessante a otimizao do teor de
encapsulao de CDDP nos SpHL-CDDP, uma vez que o teor encontrado foi igual a 13,0 %.
Uma investigao a ser proposta o emprego de somente 3 ciclos na etapa de
homogeneizao sob alta presso a 500 e 1000 Bar. Isto se justifica devido ao fato de se ter
observado que no existe diferena da distribuio de tamanho das vesculas de SpHL com o
emprego de 3 ou 9 ciclos a 500 Bar. Em relao obteno de uma populao de SpHL de
dimetro 100 nm foi observada uma diferena estatstica com o uso de 500 Bar (40,2 0,4
%) e 1000 Bar (54,8 0,2 %) durante 3 ciclos (p < 0,001). Isto motiva igualmente a avaliao
do emprego da homogeneizao sob presso a 1000 Bar, o que poder contribuir com uma
maior populao de vesculas de SpHL-CDDP de dimetro 200 nm aps a
liofilizao/rehidratao.
O emprego de crioprotetor, em especial a trealose, foi de extrema importncia para o
controle do dimetro das vesculas aps o processo de liofilizao/rehidratao. importante
ressaltar que o processo de liofilizao no comprometeu a reteno da CDDP encapsulada
nas vesculas, no sendo portanto, observada liberao da mesma aps a ressuspenso do
liofilizado. Apesar da quase totalidade das vesculas de SpHL-CDDP apresentar dimetro
inferior a 500 nm com o uso da trealose como crioprotetor, convm avaliar a funo
crioprotetora de outras substncias para a obteno exclusiva de uma populao de SpHL-
CDDP de dimetro 200 nm para o tratamento de tumores que no permitem o
extravasamento vascular de partculas maiores.
Em relao estabilidade fsica, os SpHL-CDDP na forma lquida e liofilizada
apresentaram manuteno do dimetro mdio e potencial zeta das vesculas durante 135 dias
de armazenamento. Entretanto, a forma lipossomal liofilizada foi mais eficiente quanto a
reteno da CDDP encapsulada durante o tempo de armazenamento. Para o estudo da
estabilidade qumica, outros parmetros como a degradao por reaes de hidrlise e
oxidao, devem ser investigados.


76
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS


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