QUMICA NOVA, 20(1) (1997) 5

APLICAO DA CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO E DA CROMATOGRAFIA GASOSA DE ALTA

RESOLUO NA ANLISE DO CAF
R. F. A. Moreira e L. C. Trugo
*
Departamento de Bioqumica - Instituto de Qumica - Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)
C. A. B. de Maria
Departamento de Cincias Fisiolgicas - Instituto Biomdico - Universidade do Rio de Janeiro (UniRio)
Recebido em 28/11/95; aceito em 24/10/96
APPLICATION OF EXCLUSION CHROMATOGRAPHY AND HIGH RESOLUTION GAS CHRO-
MATOGRAPHY TO COFFEE ANALYSIS. The combination of high performance exclusion chro-
matography (HPEC) and gas chromatography (GC) was applied to the analysis of six coffee samples
that were previously characterized by sensory tests as of good or poor quality. The data obtained
by the two techniques were statistically evaluated by Principal Components Analysis (PCA)
using selected peak areas. The results showed the potential of the described techniques for coffee
analysis. The HPEC technique monitored with the U.V. detector at 272 nm and followed by PCA
may be correlated with sensorial data, particularly if a wider group of samples is used.
Keywords: coffee quality; high performance exclusion chromatography; principal components analysis.
ARTIGO
1. INTRODUO
O caf reconhecido mundialmente pela grande receptivi-
dade que tem sua bebida, sendo considerado um dos produtos
de maior comercializao no mercado internacional. Este gro
possui particular importncia para o Brasil, pois seu cultivo e
industrializao geram um grande nmero de empregos e divi-
sas para o pas. Ainda hoje, o Brasil reconhecido como um
dos maiores produtores e exportadores mundiais de gros de
caf e de caf processado. Todos esses fatores citados anterior-
mente, deixam claro que estudos relacionados composio
do caf, deteco de fraudes e avaliao de sua qualidade so
indiscutivelmente importantes.
A qualidade do caf est diretamente relacionada com suas
caractersticas organolpticas. A baixa qualidade desse produto
pode ser atribuda a espcies e variedades menos nobres, a
tcnicas inadequadas de colheita e/ou de processamento ou,
ainda, a adio de substncias que no fazem parte de sua
composio natural. Atualmente, a avaliao da qualidade do
caf realizada com indivduos especialmente treinados, atra-
vs da anlise sensorial. A competitividade internacional tem
exigido padres de qualidade cada vez mais rigorosos. Dessa
forma, torna-se crescente busca de novas metodologias capa-
zes de diferenciar, de forma prtica e rpida, um caf de boa
qualidade de um de qualidade inferior. Dentre as novas
metodologias que tm surgido, h uma tendncia para a aplica-
o de tcnicas de cromatografia gasosa de alta resoluo
(CGAR) e / ou da cromatografia lquida com fase reversa como
mtodos complementares anlise sensorial
1
.
A CGAR muito empregada na anlise dos componentes
do aroma e, neste caso, os mtodos de headspace so prefe-
rencialmente usados, por serem geralmente mais rpidos, sim-
ples e por fornecerem perfis de compostos volteis mais genu-
nos do que as tcnicas de destilao, j que a possibilidade de
formao de artefatos menor
2,3
. Dessa forma, as tcnicas de
Headspace-CGAR fornecem resultados representativos do
atributo aroma. J as tcnicas envolvendo a cromatografia l-
quida de alta eficincia fornecem resultados mais representati-
vos do atributo sabor.
No presente trabalho, foi usada uma combinao de dados,
obtidos pelo emprego da cromatografia por excluso de alta
eficincia (CEAE) e da tcnica de Headspace-CGAR, para
avaliar a qualidade de seis amostras de caf aps tratamento
estatstico pelo mtodo Principal Components Analysis -
PCA. As caractersticas organolpticas destas amostras foram
previamente determinadas por anlise sensorial na prpria in-
dstria fornecedora das mesmas.
2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1. Amostras
A pesquisa foi realizada com seis amostras de caf verde,
originrias de diferentes pases, gentilmente cedidas pela em-
presa ILLYCAFF (Itlia). Estas amostras foram classificadas,
atravs da anlise sensorial, em A, B e C (amostras de boa
qualidade) e D, E e F (amostras de qualidade inferior).
2.2. CEAE
Para as anlises na CEAE, as amostras de caf verde
desengorduradas foram modas em um moinho com malha de
0,75 mm. Em seguida, realizou-se a extrao de 0,5 g de cada
amostra com gua bidestilada a 80
o
C por 15 minutos em um
banho com agitao. Na sequncia, as amostras foram resfria-
das temperatura ambiente e, logo depois, filtradas com pa-
pel-de-filtro Whatman 42 para bales volumtricos de 50,0 ml.
O volume destes bales foi ajustado com gua bidestilada e,
ento, as solues foram utilizadas para a cromatografia.
O trabalho foi realizado com dois sistemas isocrticos de
CLAE. No primeiro, foi utilizado um cromatgrafo Shimadzu
modelo LC-10AD (Japo) com bomba, detector por U.V. (0,16
AUFS e em 272 nm) e vlvula injetora Rheodyne (E.U.A.)
com ala externa de 20 l. A separao foi efetuada com uma
coluna do tipo TSK G-3000 SW (300 mm de comprimento x 8
mm de d.i.) com sua respectiva pr-coluna (Supelco, E.U.A.)
acoplada. A fase mvel foi composta de gua bidestilada com
0,05% de azida de sdio e a vazo utilizada foi de 0,5 ml/min..
* Envio de correspondncia: Departamento de Bioqumica, Instituto
de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, C. T. Bloco
A, Cidade Universitria, 21949 - 900 Rio de Janeiro, Brasil.
Fax: (021)290-4746
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No segundo sistema utilizou-se um detector por ndice de refra-
o diferencial (sensibilidade 64 e fator de escala 40) (Waters,
E.U.A.). A coluna empregada neste estudo, bem como todos os
demais equipamentos e condies cromatogrficas foram idnti-
cas as do outro sistema que utilizou o detector por U. V..
2.3. Headspace - CGAR
A anlise de Headspace - CGAR foi efetuada de acordo
com o mtodo descrito por De Maria et al
4
. Neste mtodo, 0,5
g de cada amostra moda de caf verde desengordurado foi
torrada a 220
o
C por 14 minutos em tubo de ensaio fechado,
contendo septo n
o
10043 (Chrompack, Holanda). As amostras
foram submetidas vcuo, previamente torrefao e, imedi-
atamente aps esse tratamento trmico, 4 ml da fase gasosa
produzida no interior do tubo foram coletados com uma serin-
ga gastight (Hamilton, E. U. A.), atravs do septo e injeta-
dos no cromatgrafo.
A cromatografia gasosa foi realizada com um cromatgrafo
Carlo Erba (Itlia) modelo FTV srie 4300. Utilizou-se uma
coluna capilar de slica com fase ligada Supelcowax 10, de 30
m x 0,25 mm d.i. (Supelco, E.U.A.). As anlises foram reali-
zadas com taxa de diviso de 1:20, temperatura do detector por
ionizao em chama de 280
o
C, temperatura do injetor de 260
o
C
e uma velocidade linear de 40 cm/s para o gs de arraste (hi-
drognio). De acordo com a programao utilizada, o forno
permaneceu por 10 minutos na temperatura inicial de 40
o
C, em
seguida, a temperatura foi acrescida de 3
o
C a cada minuto at
que fosse atingida a temperatura final de 190
o
C, onde perma-
necia por mais 15 minutos.
2.4. Anlise Estatstica dos Resultados
Para analisar os resultados obtidos atravs dos mtodos
cromatogrficos empregados, utilizou-se um mtodo estatstico
conhecido como Principal Components Analysis (PCA). Este
mtodo permite que variveis altamente correlacionadas sejam
determinadas, de modo que a variabilidade de um sistema com-
plexo possa ser expressa por estas variveis, to bem quanto
seria se usssemos o conjunto das variveis originais (Hewlett
- Packard Corporation, 1986)
5
.
3. RESULTADOS E DISCUSSO
A figura 1(a) representativa do perfil cromatogrfico de
um caf verde de qualidade inferior, obtido por CEAE atravs
de monitorao com detector por ultra-violeta em um compri-
mento de onda de 272nm. Como este cromatograma foi obtido
pela tcnica de excluso, o fracionamento das substncias ocor-
reu por diferena de massa molecular. As molculas de maior
massa molecular so eludas mais rapidamente do que as mo-
lculas que apresentam massas moleculares menores. A coluna
TSK G3.000 SW, com limite de separao por massa molecular
em torno de 1.000 a 300.000 daltons, foi padronizada, utilizan-
do-se padres de protenas. Dessa forma, pode-se dividir este
cromatograma em duas regies distintas. A primeira regio
compreende os compostos de alta massa
molecular. Esta regio compreende compos-
tos com massas moleculares superiores a 1.2
x 104 daltons (at 21 minutos). A resoluo
dessa regio menor do que a resoluo da
segunda regio (21 at 40 min.). A segunda
regio compreende as substncias de baixa
massa molecular. Podemos destacar, nesta
segunda regio, a presena de trs importan-
tes substncias, presentes no caf, que so o
cido clorognico, a trigonelina e a cafena,
correspondendo respectivamente aos picos A,
B e C, conforme descrito por De Maria et al
6
e confirmado neste trabalho. Segundo esses
autores, a separao entre estas trs substn-
cias envolve, alm do fenmeno convencional
de excluso, interaes hidrofbicas. Isto po-
deria explicar, inclusive, a melhor resoluo
da segunda regio em relao a primeira no
cromatograma. A figura 1(b) tambm
corresponde a um cromatograma caractersti-
co daquele mesmo caf verde de qualidade
inferior obtido por CEAE. Neste caso, porm,
utilizou-se um detector de ndice de refrao
diferencial. Este tipo de detector muito uti-
lizado para monitorar carboidratos em amos-
tras de caf. Este cromatograma apresenta um
perfil bem distinto do anterior, no que diz
respeito tanto a regio de alta como de baixa
massa molecular. A figura 2 apresenta um per-
fil cromatogrfico caracterstico de um caf
torrado de qualidade inferior obtido por
Headspace-CGAR. Este cromatograma apre-
senta uma grande quantidade de picos, que
embora no tenham sido identificados, mos-
traram claramente a complexidade da mis-
tura. Os resultados obtidos atravs das trs
tcnicas cromatogrficas citadas (Headspa-
ce-CGAR e CEAE-UV e IR) foram analisa-
dos estatisticamente, baseando-se nas reas dos
respectivos picos. Antes, porm, decidiu-se
Figura 1. Perfis cromatogrficos de um caf verde de qualidade inferior (amostra D). (a)
Obtido por CEAE-U.V. [(A) - cido clorognico (total), (B) - trigonelina, (C) - cafena];
(b) Obtido por CEAE-I.R.. Coluna TSK G3.000 SW, fase mvel gua bidestilada com
0,05% de azida de sdio e vazo de 0,5 ml/min.. Os picos 1, 2 e 3 sofreram tratamento
estatstico atravs do PCA.
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fazer uma triagem dos picos relacionados tcnica de
Headspace-CGAR, devido a complexibilidade de seus
cromatogramas. Utilizou-se como critrio para a seleo des-
ses picos o teste de reprodutibilidade. Este teste foi realizado
atravs do clculo dos coeficientes de variao das reas des-
ses picos para 10 replicatas de uma nica amostra. Para a an-
lise estatstica s foram aproveitados os picos que apresenta-
vam coeficiente de variao mximo de 15%
3
. Em seguida,
tratou-se separadamente o conjunto das reas dos picos dos
cromatogramas, obtidos por cada uma das tcnicas cromato-
grficas, com o PCA. Dessa forma, obtivemos os picos mais
representativos da variabilidade das amostras para cada um
desses mtodos cromatogrficos. No caso da CEAE-UV, estes
picos foram designados como picos 1 e 2, enquanto na CEAE-
IR como pico 3. J para o Headspace - CGAR foram os
picos 4, 5 e 6. As reas destes seis picos selecionados (de cada
uma das seis amostras) foram introduzidas simultaneamente no
PCA. A tabela 1 fornece o percentual de varincia obtido
pelo PCApara cada rea. Pela anlise desta tabela, podemos
verificar que as trs primeiras reas contribuem com mais de
90% da variabilidade entre as seis amostras estudadas. Dessa
forma, fica evidente que os dados obtidos pelas duas tcnicas
de CEAE so os principais parmetros representativos da vari-
abilidade do sistema.
Para evidenciar a disperso das amostras, foi feito um gr-
fico de disperso (scatterplot) com os valores das duas prin-
cipais reas representativas dessa variabilidade (figura 3), vi-
sando diferenciar melhor as amostras em termos de qualidade.
Pela anlise do scatterplot, pode-se verificar que a disperso
das amostras de caf estudadas foi alta. Esta alta disperso j
havia sido detectada de modo mais acentuado, quando os da-
dos fornecidos por cada uma das tcnicas cromatogrficas fo-
ram analisados isoladamente pelo PCA. Entretanto, a ten-
dncia de agrupamento, de acordo com as caractersticas das
amostras, deve se acentuar a medida que se aumente o tama-
nho da amostragem. Os resultados obtidos evidenciaram a in-
fluncia da tcnica de CEAE, particularmente da CEAE-UV,
Figura 2. Perfil cromatogfico de um caf torrado de qualidade inferior (amostra D) obtido por Headspace - CGAR. Coluna Supelcowax 10,
detector por ionizao em chama, temperatura da coluna programada de 40
o
C a 190
o
C com taxa de 3
o
C/min., split de 1:20. Os picos 4, 5 e
6 tambm sofreram tratamento estatstico atravs do PCA.
Tabela 1. Percentual de varincia para cada classe de rea
introduzida no PCA.
na variabilidade dos sistemas analisados. Alm disso, essa tc-
nica apresenta vantagens em relao a outras tcnicas de
cromatografia lquida de alta eficincia, como por exemplo,
em relao a fase reversa. Segundo De Maria et al
6
, o mtodo
de CEAE adequado para aplicao em anlises de rotina,
porque analisa simultaneamente o cido clorognico total, a
trigonelina e a cafena. J a cromatografia em fase reversa
analisa esses trs componentes separadamente, porque as con-
dies cromatogrficas necessrias so diferentes. Alm disso,
no mtodo de CEAE, usa-se somente gua como fase mvel, o
que atrativo em termos de custo. Os perfis cromatogrficos
obtidos por cromatografia gasosa nas amostras de headspace,
mostram o potencial da mesma para o estudo, atravs do aco-
plamento da espectrometria de massas, de fraes relevantes
para o aroma. A identificao de compostos majoritrios do
caf verde atravs de cromatografia lquida como descrita no
presente trabalho mostra a importncia dessa tcnica para an-
lise simultnea de compostos como sacarose, cidos clorogni-
cos, trigonelina e cafena, todos relacionados qualidade final
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da bebida do caf, quer seja pelos seus atributos organolpticos
naturais, quer seja pela formao de produtos de degradao
ou polimerizao originando pigmentos e componentes vol-
teis da frao de aroma, aps a torrefao. Os resultados obti-
dos no presente trabalho indicam a necessidade de estudos
subsequentes, visando, por exemplo, a discriminao mais de-
talhada de reas especficas na cromatografia de excluso, bem
como estudos mais detalhados de caracterizao de compostos,
atravs de tcnicas complementares como a espectrometria de
massa acoplada cromatografia gasosa. Acreditamos que o
avano na utilizao das tcnicas bsicas descritas aliado a
utilizao de uma amostragem mais significativa e complemen-
tadas com a anlise por PCA podero fornecer informaes
relevantes, que correlacionadas anlise sensorial, podero ser
instrumentos poderosos na caracterizao da qualidade de
amostras de caf.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos ao CNPq e a CAPES (Brasil) pelo suporte
Figura 3. Scatterplot dos dois componentes principais. A, B, C - Cafs de boa qualidade. D, E, F - Cafs de pssima qualidade.
financeiro e empressa ILLYCAFF (Itlia) pela doao das
amostras e da coluna de CEAE utilizadas neste estudo.
REFERNCIAS
1. Bicchi, C. P.; Binello, A. E.; Legovich, M. M.; Pellegrino,
G. M. and Vanni, A.; J. Agric. Food Chem. 1993, 41,
2324.
2. Dart, S. K. and Nursten, H. E.; Volatile components; In:
Coffee Chemistry; Clarke and Macrae Eds.; London, 1985,
vol. I, p. 223 - 265.
3. Shimoda, M. and Shibamoto, T.; J. Agric. Food Chem.
1990, 38, 802.
4. De Maria, C. A. B.; Trugo, L. C.; Moreira, R. F. A. and
Werneck, C. C.; Food Chem. 1994, 49, 141.
5. STSC (Statistical Graphics System by Statistical Graphics
Corporation); Statgraphics; Hewlett - Packard Corpo-
ration, 1986.
6. De Maria, C. A. B., Trugo, L. C. and Moreira, R. F. A.;
Food Chem. 1995, 52, 447.