DESINFESTAO E GERMINAO DE SEMENTES DE Acacia mearnsii De Wild.

E
MULTIPLICAO DE EXPLANTES NO CULTIVO IN VITRO
Dionia Felippe
Apresentador

Nilton Mantovani
Orientador

Fernanda Las Ril

Co-autor

Llian Gonalves Mariano

Co-autor

INTRODUO

A accia negra, Acacia mearnsiii De Wild. uma espcie pertencente a famlia das
leguminosas, subfamlia Mimosoidae (MARCHIORI, 1997), originria da Austrlia, que vem
sendo cultivada em escala comercial em vrios pases.
No Brasil cultivada por ser uma espcie de crescimento rpido e de mltiplos
propsitos, entre eles destaca-se a restaurao de ambientes degradados, fixao de
nitrognio, arborizao de parques e jardins, produo de tanino extrado da casca, alm de
ser produtora de carvo e celulose.
O crescente cultivo de accia-negra, entretanto, ainda estabelecido a partir de mudas
produzidas por sementes, resultando em florestas com alta variabilidade gentica entre os
indivduos do povoamento e, consequentemente, variabilidade na produtividade da floresta.
Com o intuito de aumentar a produtividade das florestas de A. mearnsii, a propagao
clonal de indivduos superiores selecionados dentro de um programa de melhoramento
gentico vem sendo desenvolvida atravs da cultura de tecidos (BECK et al., 2000;
VENGADESAN et al., 2002).
Uma das tcnicas que podem ser utilizadas o cultivo in vitro, que constitui um
mtodo eficiente para a multiplicao de plantas selecionadas em larga escala e em
curto espao de tempo. No entanto, de acordo com Ferrador e Marques (2008), a
micropropagao de espcies lenhosas depara-se com alguns problemas, entre eles, os das
contaminaes das culturas por diferentes microrganismos, com os consequentes prejuzos
econmicos.
A tcnica do cultivo in vitro para de o gnero Accia tem sua problemtica relatada
acerca da definio do meio bsico a ser utilizado e o balano adequado entre auxinas e
citocininas, principalmente na etapa de multiplicao de gemas.
Para tanto se faz necessrio que o meio nutritivo fornea substncias essenciais para
o crescimento da planta in vitro. Pierik (1987) afirma que o crescimento in vitro e o
desenvolvimento de plantas determinado por vrios fatores, como gentipo, concentrao de
macronutrientes e micronutrientes no meio de cultura, substncias orgnicas como
reguladores de crescimento, vitaminas e fontes de carbono.
Este trabalho teve como objetivo determinar a germinabilidade e desinfestao de um
lote de sementes de Acacia mearnsii para o cultivo in vitro, servindo como fonte de explantes
axnicos para a etapa de multiplicao, e avaliar a resposta desses explantes sob 2 diferentes
meios de cultura, suplementados da citocinina 6-benzilaminopurina (BAP).

MATERIAIS E MTODOS

Os experimentos foram realizados no Laboratrio de Biotecnologia e Melhoramento

Gentico Florestal do Departamento de Engenharia Florestal, da Universidade Federal de
Santa Maria, campus do Centro de Educao Superior Norte RS. Foram utilizadas, sementes
de Acacia mearnsii, oriundas da empresa TANAC S. A., identificadas pela empresa 852.12-G
e 852.12-I.
O primeiro experimento realizado foi o teste de germinao in vitro e a desinfestao
das sementes das duas procedncias. Para a determinao da melhor procedncia, foi
considerada a porcentagem de germinao e a presena de plntulas normais e com
capacidade de serem utilizadas para a multiplicao. A cultura foi mantida em sala de
crescimento sob controle de temperatura a 25C (2C) e fotoperodo de 16 horas sob
intensidade luminosa de aproximadamente 2000 lux, fornecida por lmpadas fluorescentes
branco-frias, permanecidas por um perodo inicial de sete dias as sementes foram mantidas no
escuro, nas mesmas condies de temperatura.
Para controle da assepsia, os procedimentos foram realizados em cmara de fluxo
laminar. Posteriormente imersas em lcool 70% por 1 min., aps em gua quente (no
fervente) por 5 min., visando quebra da dormncia das mesmas. Para a desinfestao foram
testadas diferentes concentraes de hipoclorito de sdio (0, 20, 30 ou 40%), com pH ajustado
para 6,5, durante 5 min. A inoculao foi realizada em tubos de ensaio, contendo cerca de 10
ml de meio MS, (MURASHIGE e SKOOG, 1962) acrescido de 30 gL-1 de sacarose e 6 gL-1
de gar com pH ajustado para 6,5 antes da esterilizao.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com 4
tratamentos, 5 repeties e 7 tubos por repetio. Aos 28 dias foi avaliada a porcentagem de
desinfestao e de contaminao por fungos e bactrias.
Para a etapa de multiplicao, utilizou-se como fonte de explantes segmentos nodais
com aproximadamente, 1 cm de comprimento excisados de plntulas oriundas da melhor
procedncia determinada pelo teste de germinao.
Testou-se os meios de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), MS
suplementado com 0,5mgL-1, de citocinina BAP (6- benzilaminopurina),WPM (Wood Plant
Medium, elaborados por LLOYD & MCCOWN, 1981) e WPM suplementado de 0,5mgL-1 da
citocinina BAP, acrescidos de 30 gL-1 de sacarose e 6 gL-1 de gar com pH ajustado para 6,5
antes da esterilizao.
Os meios de cultura foram distribudos em frascos de conserva, contendo
aproximadamente 40 ml de meio de cultura, os quais foram tampados com papel alumnio e
esterilizados em autoclave por 15 minutos temperatura de 120C e 1 atm de presso.
Para o controle da assepsia os segmentos nodais foram inoculados em cmara de fluxo
laminar. A cultura foi mantida sob as mesmas condies do teste de germinao. O
delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com 4 tratamentos, 5
repeties e 3 frascos por repetio. Aos 40 dias foi avaliado o nmero de brotos e o
comprimento dos explantes.

RESULTADOS E DISCUSSES

No teste de germinao realizado in vitro, com as procedncias 852.12-G e 852.12-I,

verificou-se uma porcentagem de 88,57% e 82,86% respectivamente de sementes germinadas
e de 80% e 57,14% respectivamente de plntulas normais e com capacidade de serem
utilizadas na etapa de multiplicao (Figura 1). Devido a isso, a procedncia que ser utilizada
para os prximos testes in vitro ser a 852.12-G.

Porcentagem de plntulas

Germinao de sementes de Acacia mearnsii De Wild.

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

Procedncias
852.12-G
852.12-I

1 Plntulas com capacidade de serem utilizadas na multiplicao

2 Plntulas germinadas mas sem capacidade de serem utilizadas na multiplicao
3 Plntulas no-germinadas

Figura 1: Porcentagem de germinao in vitro de sementes de Accia mearnsii De Wild.

em funo das diferentes procedncias .

No teste de desinfestao das sementes da procedncia 852.12-G, os tratamentos

utilizados afetaram a germinao. A maior porcentagem de germinao e obteno de
plntulas normais (88,6%) foi obtida com a utilizao de hipoclorito de sdio na concentrao
de 30%. J quando utilizou-se a concentrao de 40%, esta ocasionou uma brusca diminuio
na germinao (65,2%). A no utilizao de hipoclorito de sdio, ou a utilizao da
concentrao 20% ocasionaram porcentagens de germinao semelhantes, 80% e 77,1%
respectivamente.
Verificou-se ainda, 100% de sementes desinfestadas em todos os tratamentos testados
com uso do hipoclorito e 97,14% para a testemunha. Isso pode ter ocorrido devido imerso
das sementes em lcool 70% durante 1 minuto e a gua quente utilizada para a quebra de
dormncia das mesmas.
Na etapa de multiplicao realizada com a melhor procedncia (852.12-G) verificouse aps 40 dias de cultivo, que em todos os tratamentos testados houve o desenvolvimento das
gemas axilares, sendo que o nmero mximo foi aproximadamente 2 brotaes por segmento
nodal.
A porcentagem de nmero mdio de brotos e o comprimento dos mesmos sofreram
influncia da concentrao de BAP. De acordo com Preece (1995), as citocininas atuam na
quebra da dominncia apical e na induo e crescimento de brotaes em segmentos nodais.
Como pode ser visto na Tabela 1, os tratamentos que receberam BAP na concentrao
0,5mgL-1 obtiveram maior nmero e de brotos e maior comprimento dos mesmos.

Tabela 01: Valores mdios do primeiro subcultivo para o nmero de brotos por explante e
comprimento dos brotos de explantes de accia-negra (Acacia meanrsii de Wild.) cultivados
in vitro.
Tratamentos
Nmero mdio de brotos
Comprimento mdio dos
por explante
brotos (cm)
T1-Meio MS
1,25 b
0,39a
-1
T2-Meio MS+BAP0,5mgL
1,74a
0,53a
T3-Meio WPM
1,28 b
0,43a
T4-Meio WPM+BAP0,5mgL-1
1,53ab
0,44a
Mdias seguidas pela mesma letra no diferem estatisticamente pelo Teste de Tukey, a nvel de 5% de
probabilidade.

O melhor tratamento para a varivel nmero mdio de brotos por explante foi o T2,
(T2-Meio MS+BAP0, 5mgL-1 ) porm, este no diferiu estatisticamente do T4, (Meio
WPM+BAP0,5mgL-1) pelo teste de Tukey. J para o comprimento mdio dos brotos no
houve diferena estatstica entre os tratamentos testados. O meio MS acrescido de
BAP0,5mgL-1 proporcionou um maior estmulo ao desenvolvimento das gemas axilares, tanto
em nmero mdio de brotos por explante quanto no comprimento dos mesmos(1,74 brotos e
0,53 cm respectivamente).
Resultados semelhantes ao encontrado nesse trabalho foram verificados por
Mantovani et al (1999), que observaram que o aumento da concentrao de BAP
proporcionou aumento nas respostas de induo de brotaes, at a concentrao de 1,0 mg.l1, onde obteve-se a maior taxa, de 87,5% de segmentos nodais com gemas axilares induzidas
formando brotaes. Observaram tambm que a adio de BAP (1,0 mg.l-1) aos meios
proporcionou aumento na porcentagem de explantes com novas brotaes e tambm maior
expanso foliar.

CONCLUSO

O hipoclorito de sdio na concentrao de 30% possibilita a maior porcentagem de

sementes germinadas e a desinfestao eficiente de sementes de Acacia mearnsii De Wild. O
desenvolvimento de gemas axilares em segmentos nodais foi estimulado pela presena do
BAP no meio de cultura. A concentrao de 0,5 mg.l-1 desta citocinina proporcionou maior
nmero de segmentos nodais com brotaes de gemas, e tambm maior comprimento destas.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

BECK, S. L.; DUNLOP, R.; van STADEN, J. Meristem culture of Acacia mearnsii. Plant
Growth Regulation, v.32, n.1, p.49-58. 2000.
FERRADOR, S. & MARQUES, G. Contaminaes Endgenas na Micropropagao de
Castanea sativa Mill. 2008.
MANTOVANI, N. C., FRANCO, E. T. H., GUERRA,P.M., HOPPE,M.J. Micropropagao
de caixeta, Didymopanax morototoni (Aubl.) Dcne. et Planch. Revista Cincia Florestal,
Santa Maria, v.9, n.1, p.47-61. 1999.

MARCHIORI, J. N. C. Dendrologia das angiospermas: leguminosas. Santa Maria:

Universidade Federal de Santa Maria, 200p. 1997.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with
Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, n.1, p. 437-496. 1962.
PIERIK, R. L. M. In vitro culture of higher plants. Boston: Martinus Nijhoff, 344p. 1987.
PREECE, J. E. Can nutrient salts partially substitute for plant growth regulator Plant tissue
culture and biotechnology, n. 1, v.1, p.26-37, 1995.
VENGADESAN, G. GANAPATHI, A.; AMUTHA, S.; SELVARAJ, N. In vitro propagation
of Acacia species - A review. Plant Science. v.163, n.4, p.663-671. 2002.