Produo de Bromelina (rBRM) por expresso de gene em organismo procarionte.

ROCHA, A. C. P., SOUSA, A. F. G.

carolinapr.rocha@gmail.com angelicafgs@live.com
Bioqumica experimental Professora Ktia Castanho Scortecci

Resumo
As bromelinas so proteases cistenicas que possuem diversas propriedades teraputicas
exploradas pela indstria. Estas protenas so extradas do caule de abacaxi juntamente com
colides, sais inorgnicos e materiais orgnicos simples, em um extrato denominado bromelana
que comercializado. Este estudo visa o estabelecimento de protocolo para a expresso do gene de
bromelina em sistema bacteriano para a produo de bromelina recombinante, uma vez que sua
extrao limitada e apresenta baixo rendimento e alto custo.

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Palavras-chave: Ananas comosus, bromelana, transformao.
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!

INTRODUO

Bromeliaceae uma famlia de grande

diversidade da regio neotropical. Ocupa
significativa variedade de habitats, desde
ambientes montanhosos at a Mata Atlntica, e
pode apresentar hbito terrestre e epfito.
Abacaxi o nome popular da espcie mais
conhecida e explorada da famlia Bromeliaceae, Ananas cosmos.
Este fruto
extensivamente cultivado no Hava, Filipinas,
Caribe, Malsia, Austrlia, Mxico, frica do
Sul e Brasil (SO PAULO, 2015). Sua
popularidade d-se no somente pelo seu sabor
adocicado e valor nutricional, mas tambm por
sua utilidade na indstria e culinria, onde
utilizado, para alm do preparo de sucos, doces
e compotas, na dissoluo de gorduras e
amaciamento de carne, e ainda na clarificao
de cerveja (SPAT & OLIVEIRA, 2015). O
fruto tambm apresenta diversas propriedades
teraputicas amplamente utilizadas nas regies
tropicais e subtropicais, conhecidas pela

medicina popular dos povos da Amrica do Sul

e Central desde o sculo XVII (TAUSSIG &
BATKIN, 1988).
Tais propriedades so atribudas ao seu
extrato bruto, a bromelana, que geralmente
extrada do talo do vegetal e preparada atravs
de precipitao com acetona (AWANG &
RAZAK, 1978). O composto resultante
constitui-se de uma mistura de colides, sais
inorgnicos e materiais orgnicos simples, que
tambm so precipitados pela acetona. Neste
extrato, a protena bruta, conhecida como
bromelina, geralmente corresponde a cerca de
50% do total do peso do precipitado
desidratado (HEINICKE, & GORTNER,
1957).
As bromelinas so polipeptdeos bioativos
encontrados principalmente no caule e no fruto
da j referida espcie Ananas cosmos, sobre as
quais se descobriu que desempenham um papel
de defesa contra herbivoria (HARRISON &
BONNING, 2010). As bromelinas so
proteases cistenicas, sendo esta caracterstica

enzimtica que confere protena diversas de

suas propriedades teraputicas (MAURER,
2001), sendo as principais a inibio da
agregao plaquetria, atividade fibrinoltica,
ao antiinflamatria e antitumoral, modulao
de citocinas e da imunidade, propriedade
debridante de pele, aumento da absoro de
outras drogas, propriedades mucolticas,
facilitadora da digesto, aceleradora da
cicatrizao alm de promover melhora da
circulao e sistema cardiovascular (PAVAN et
al, 2012). Destarte este trabalho tenciona o
estabelecimento de um protocolo para a
expresso do gene de bromelina em sistema
bacteriano objetivando a produo de
bromelina recombinante, tendo em vista que
sua extrao limitada, e apresenta baixo
rendimento e alto custo (DEVAKATE et al,
2009).

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MATERIAIS E MTODOS
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Matria prima
Como matria prima para a extrao foram
utilizados caules de Ananas comosus
cultivados e coletados no campus central da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Extrao do RNA total do abacaxi

Amostras do caule foram separadas dos
galhos de abacaxi fresco e tiveram sua
superfcie esterilizada para remoo de
quaisquer impurezas exgenas. Em seguida,
foram lavadas com H2O DECP (gua Milli-Q
tratada com dietilpirocarbonato 0,01%) e
maceradas com nitrognio lquido, objetivando
o rompimento da parede e membrana celulares
para a liberao do contedo da clula. Para
toda tcnica de extrao de RNA, de suma
importncia a limpeza da rea de trabalho, e o

tratamento da gua a ser utilizada durante as

experimentaes com DEPC. Este reagente
modifica os resduos de Serina e tirosina das
RNases inativando-as, prevenindo indesejveis
degradaes de RNA, observando-se que essas
enzimas so muito resistentes e as molculas
de RNA muito instveis, tornando fcil a sua
degradao. O material assim obtido foi
transferido para tubos de microcentrfuga de
2,0 mL para a realizao das extraes de
RNA. O RNA foi isolado com a adio de 1
mL do reagente Trizol amostra e, com
auxlio de um agitador de tubos do tipo vrtex,
a amostra foi homogenizada durante 1 minuto.
O Trizol uma soluo monofsica de fenol,
guanidina isotioconato e outros componentes
que facilitam a extrao de vrias espcies de
RNA. Os componentes do Trizol rompem as
clulas, dissolvem os componentes celulares e
inibem RNAse. As amostras foram mantidas
por 5 minutos 24 C de modo a permitir a
completa dissociao dos complexos de
nucleoprotenas antes da adio de 200 L de
clorofrmio gelado (1:5 v/v). As amostras
foram homogeneizadas em por 1 minuto e
posteriormente incubadas por 3 minutos a
24C. O acrscimo do clorofrmio separa a
soluo em fase aquosa, onde est dissolvido o
RNA, e fase orgnica, onde esto dissolvidos
os outros componentes da mistura. A amostra
foi centrifugada (12.000 x g por 15 minutos a 4
C) e a fase aquosa foi transferido para um
novo tubo de 2mL. Para precipitao do RNA
foram adicionados 500L de isopropanol (1:2
v/v) com agitao por inverso, durante 2
minutos. Em seguida, as amostras foram
centrifugadas (12.000 x g por 10 minutos a 4
C) e o RNA precipitado, formou um
sedimento gelatinoso no fundo do tubo. O
sobrenadante foi descartado e esse precipitado

foi lavado com 1mL de etanol gelado 75%. As

amostras foram centrifugadas (7.500 x g por 5
minutos a 4 C) e o material sedimentado foi
seco a 24 C e solubilizado em 50 L de H2O
DEPC.

Obteno do mRNA e cDNA

O mRNA foi separado por cromatografia de
afinidade dos demais RNAs. Para a separao
foi utilizado um kit de gel de sepharose ligado
a oligonucleotdeos poli-T que capturam os
mRNAs pela extremidade poli-A. Aps lavar
com tampo todo o material no aderido,
deslocou-se o mRNA da coluna com uma
soluo de alta fora inica.
Para obter cDNA, foi empregado um primer
de poli-T contendo stio de restrio para a
enzima XhoI (5 CTCGAG 3). Dessa
forma, pde-se adicionar ao DNA de interesse
um stio de clivagem conhecido na
extremidade 3. Uma vez pareado, o primer
permite a sntese da primeira fita de DNA,
estendida atravs da ao da transcriptase
reversa e com dNTPs. Para proteger a fita de
DNA contra a ao de enzimas de restrio, o
sistema de reao tem, no lugar de
desoxicitosina-trifosfato, um precursor
metilado, a 5-metil-citosina-trifosfato, que
impede a ao das enzimas de restrio sobre
o DNA recm sintetizado.
Para a sntese da segunda fita de DNA foi
utilizado um kit que age atravs de traduo
por cortes. Inicialmente, com o uso da
atividade endonuclesica de uma enzima
adequada, inseriu-se pequenos cortes na cadeia
de fosfatos do RNA. Estes cortes criam
automaticamente extremidades 3-OH, que so
reconhecidos pela DNA polimerase. A partir
deles a DNA pol I sintetiza pequenos trechos
de DNA, apoiando-se nas extremidades 3-OH.

Ao trmino desta etapa, a DNA pol I produz

uma srie de fragmentos e reconstitui, em fita
dupla, o stio Xho I na extremidade 3 do DNA.
Em seguida, os fragmentos so ligados entre si
pela ao da ligase e eventuais salincias da
fita so retirados pela ao de uma
exonuclease adicionada ao tubo, numa ao
denominada trimming (reparo). Aps esta
etapa, foram adicionados adaptadores, que so
pequenos fragmentos de DNA fita dupla
contendo um stio de restrio para uma
segunda enzima. Estes adaptadores so
inseridos durante algumas horas pela
incubao do DNA na presena de ligase. A
seguir, clivou-se o fragmento de DNA de fita
dupla com as duas enzimas de restrio para as
quais adicionamos stios (Xho I e Eco RI). As
duas enzimas cortam o DNA formando
extremidades coesivas. O DNA recm
sintetizado est protegido pela adio das
bases metiladas, assim, no sofre ao das
enzimas de restrio caso contenha algum stio
de restrio interno. Os adaptadores e o stio
XhoI, contudo, no tm esta proteo e podem
ser clivados. Os fragmentos de DNA gerados
por estes cortes foram eliminados por
precipitao.
Amplificao do gene
A amplificao do gene completo de
bromelina (BRM) foi realizada por RT-PCR
com a utilizao de primers projetados e
especficos para o mesmo. O PCR foi realizado
em 25 L de soluo contendo 1 g de cDNA,
10 mM de dNTP, 25mM de MgCl2, 100 pmol de
iniciadores diretos e inversos e 1 unidade de
DNA Taq-polimerase. A reao ocorreu em
termociclador e teve incio com a
desnaturao do DNA durante 2 minutos a 95
C, em seguida, a amostra foi incubada

durante 30 segundos a 62C para a

hibridizao com os primers que se ligaram
com especificidade suas seqncias
complementares das fitas de DNA j
separadas. Aps isso, temperatura foi elevada
a 72C para a sntese pela DNApolimerase.
Esta sequncia decorreu por 35 ciclos de 30
segundos. A sntese do gene de interesse foi
acompanhada em tempo real pela leitura da
emisso de florescncia pelo composto Sybr
Green, capaz de intercalar as duplas de DNA e
emitir florescncia.

Lise alcalina de preparao de DNA

plasmdico em grande escala (Maxi-prep)
Bactrias portando os plasmdeos com
marca de resistncia foram inoculados em 3mL
de meio LB contendo a concentrao ideal do
antibitico necessrio e incubadas durante 12
horas sob agitao a 37C. Aps esse perodo,
as clulas foram inoculadas na proporo 1:500
em 400 mL de meio LB com antibitico e
novamente incubadas sob as mesmas
condies.
As bactrias foram ento centrifugadas a
3.000 x g por 15 minutos e o sedimento foi
solubilizado em 15mL de soluo de lise
(Glicose 50 mM; Tris-HCl 20 mM e EDTA 10
mM, pH = 8,0). A soluo foi mantida em 24C
por 10 minutos e em seguida, adicionou-se
30mL de soluo II (NaOH 0,2 M e SDS 1%).
Aps incubao no gelo por 10 minutos,
acrescentou-se 20 mL de soluo de KOAc (5/
M, pH=4,8). O material foi mantido no gelo
por 20 minutos e centrifugado a (6.000 x g por
20 minutos a 4C). O sobrenadante foi filtrado
e transferido para outro tubo. A seguir,
adicionou-se 0,6 vezes o volume de
isopropanol, e a soluo foi deixada para reagir
por 15 minutos a 24C. O material foi ento

centrifugado (8000 x g por 30 minutos a 4C) e

o sedimento solubilizado em 4 mL de tampo
TE (Tris.HCl 10mM; EDTA 1mM, pH = 8,0).
A esse volume de soluo acrescentou-se 4,1 g
de Cloreto de Csio (CsCl) e 200 L de
Brometo de etdeo (EtBr) (10 mg/mL). Agitouse com cuidado at o desaparecimento de
grumos antes de proceder centrifugao
(400.000 x g por 16 horas a 4C). O material
foi coletado com auxlio de seringa descartvel
e novamente purificada num segundo gradiente
de CsCl na mesma densidade que a anterior. O
gradiente foi centrifugado a 400.000 x g por 7
horas a 4C e a banda coletada transferida para
um tubo de 15 mL. Para a retirada do brometo
de etdio, cerca de 1 mL de lcool isoamnico
foi adicionado cuidadosamente e eliminado
junto com o brometo aps a decantao.
Repetiu-se a lavagem at o desaparecimento
completo do brometo da soluo de DNA. O
sal foi retirado por dilise em tampo TE sob
agitao (12 horas a 4C).

Produo de plasmdeo recombinante

O gene BRM amplificado foi clonado no
vetor pTZ57R/T e para este procedimento
inicialmente procedeu-se a digesto do
plasmdeo com enzima de restrio apropriada
para stio de clivagem (figura 1). Em um

Fig 1: Plasmdio de clonagem

microtubo, em gelo, foram adicionados

0,2-1g de DNA plasmidial, 2L de tampo
Tris (pH 7,5- 8,0 ,10x conc.) 19l de gua
ultra-pura esterilizada. A soluo foi agitada
em equipamento do tipo vrtex com o
microtubo ainda em gelo, e posteriormente
foram adicionados 1L da enzima EcoRI
seguidos de agitao em aparelho vrtex.
O gene BRM, depois de preparado para que
suas extremidades fossem complementares s
extremidades do plasmdeo, foi posto em
soluo incubada em temperatura apropriada
para a ao de DNAligase. Em um tubo de 0,5
mL, foram adicionados: 0,5 L do plasmdeo
pTZ57R/T (50 ng) digerido com a enzima
EcoRI, 0,5 L do produto de PCR purificado
(200 ng) 1,5 L do tampo de ligao (10X) 1
L de T4 DNA ligase (5U/L) e gua milli-Q
para completar um volume final de 15 L. A
reao de ligao foi incubada a 4C por 24 h.

Subclonagem em vetor de expresso

O gene BRM gene foi subclonado em
pET32b (Invitrogen) e com este vetor as
clulas de Escherichia coli JM109 foram
transformadas. Para isso, foi realizada a
clivagem do plasmdeo recombinante com as
enzimas de restrio de forma a retirar o gene
integro juntamente com seu marcador seletivo.
Este inserto isolado foi ento subclonado no
vetor de expresso pET32b (Invitrogen). O
vetor foi previamente linearizado com as
mesmas enzimas de restrio a fim de criar
terminais coesivos para a clonagem in frame
do inserto (figura 2).

Transformao bacteriana
O plasmdeo recombinante foi inserdeo
dentro da bactria atravs de canais situados
nas chamadas zonas de adeso, que so locais

Fig 2: Plasmdio de expresso

onde a membrana interna e externa da clula

bacteriana unem-se formando poros. Estes
poros s esto presentes durante o crescimento
bacteriano. Em condies naturais, a captao
do DNA torna-se difcil devido a repulso
eletrosttica existente entre as cargas
negativas da camada de fosfolipdeos da
membrana bacteriana e dos grupos fosfato da
molcula do DNA. O papel do clcio
explicado pela hiptese de que a 0C a fluidez
da membrana celular cristalizada,
estabilizando a distribuio dos fosfatos
carregados. Os ons Ca +2 formam um
complexo com este grupamento, cobrindo as
cargas negativas e assim facilitando a atrao
eletrosttica com as molculas do DNA na
zona de adeso. O choque trmico
complementa este processo de captao,
provavelmente criando um desbalano trmico
entre o interior e o exterior da clula
bacteriana, auxiliando o bombeamento do
DNA atravs da zona de adeso.

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!
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Preparao de bactrias competentes

Para a preparao de bactrias competentes
uma cepa de E. Coli foi incubada durante a
noite a 37 C em 50 mL de meio LB a 250
r.p.m. Foram aliquotados 4 mL desta cultura
que posteriormente foram incubados em 40 mL
de meio LB nas mesmas condies at que se
atingisse densidade ptica de 0,375 (DO590).
Neste ponto a cultura foi transferida para 8
tubos de 50 mL que foram incubados em gelo
durante 10 minutos. Em seguida a amostra foi
centrifugada (1600 x g durante 7 miutos a 4C),
o sobrenadante foi dispensado e o sedimento
foi solubilizado em 10 mL de soluo de CaCl2
em cada tubo. Posteriormente os tubos foram
centrifugados (1100 x g durante 5 minutos a
4C) e os sedimentos foram solubilizados do
mesmo modo. Em seguida os tubos foram
mantidos em gelo durante 30 minutos,
centrifugados e cada sedimento foi
solubilizado novamente em 2 mL de soluo de
CaCl2. E alquotas de 250 l foram separadas e
congeladas a -70C.

Transformao de bactrias competentes

As bactrias competentes foram
descongeladas e uma aliquota de 100l foi
utilizada para solubilizar 10 ng de DNA
plasmidial. Esta soluo foi mantida em gelo
durante 10 minutos e posteriormente foi
provocado um choque trmico nas clulas que
foram incubadas a 42C durante 2 minutos e
recolocadas em gelo.
A insero do plasmdeo pET32b-BRM
(figura 2) nestas clulas foi confirmada pela
digesto com enzima de restrio apropriada e
corrida em gel de eletroforese.
Os clones confirmados foram selecionados
por incubao em placas de agarose contendo
por LB suplementado com ampicilina (50 g /

ml) em 37C at que os valores de densidade

ptica atingissem 0,6-1 (OD 600 ). Como
controle o vetor pET32b sem o gene BRM foi
inserido em clulas de Escherichia coli JM109
e incubadoa nas mesmas condies. As
bactrias sobreviventes ao meio demonstraram
possuir o gene BRM ligado ao gene de
resistncia ao antibitico dentro do plasmdeo e
foram selecionadas.
A cultura foi armazenada a 4C por uma
noite e posteriormente 2 mL desta cultura foi
centrifugado (12.000 x g durante 2 minutos a
4C) e sedimento foi solubilizado em 2 mL de
meio LB lquido contendo ampicilina. Essa
amostra foi inoculada 50 mL de meio LB com
ampicilina e incubado a 37C at atingir a
densidade ptica de 0,4-1.

Purificao de Bromelina recombinante

(rBRM)
A expresso proteica de bromelina foi
induzida pela adio de IPTG (Isopropil-D-1-Tiogalactopiranosdeo) at a uma
concentrao final de 1 mM durante 3 h com
agitao a 37C. A cada hora decorrida da
solubilizao foram coletados 1 ml de cada
cultura, estas amostras foram mantidas a 4C e
a expresso do gene BRM foi analisada por
SDS-PAGE.
Foram aliquotados 50 mL de cultura aps 3
horas de inoculao. Esta amostra foi
centrifugada (5.000 x g durante 5 minutos a
4C), e o sedimento foi solubilizado em 1 mL
de soluo tampo fosfato-salino (PBS) gelado
com pH = 7,4. A suspenso celular foi
centrifugada e lavada duas vezes com PBS. O
sedimento formado foi solubilizado em 1 mL
de PBS e foram adicionados 5 L de aprotinina
(1 mg/mL) e 10 L de lisozima (10 mg/mL). A
lise celular foi realizada atravs de repeties

de congelamento e descongelamento em
nitrognio lquido. Adicionou-se 10 L de
DNAse (1 mg/mL) e RNAse A (10 mg/mL) ao
lisado que foi encubado por 10 minutos a 4C
sob agitao. Em seguida, o lisado foi
centrifugado (12.000 x g por 30 min. a 4C). O
sobrenadante foi coletado e o sedimento
formado foi solubilizado em tampo A
(NaH2PO4, 200 mM, NaCl 500 mM, Imidazol
5 mM e ureia 8 M). Esta amostra foi incubada
a 4C por 1 hora. A soluo foi centrifugada a
(14.000 x g por 60 min) e o sobrenadante
coletado foi armazenado e utilizado como fonte
de protena bromelina recombinante. A
protena recombinante foi purificada por
cromatografia de afinidade usando Ni+ e
tampo de eluo com Imidazol 200 mM. A
protena eluda foi dializada com PBS
contendo concentraes decrescentes de ureia
(6, 4, 2, 1, 0 M). A protena recombinante, que
foi diluda durante o processo de dilise foi
concentrada usando o composto higroscpico
de sacarose sobre a membrana de dilise
contendo a protena recombinante. A qualidade
da amostra purificada foi confirmada em gel de
SDS-PAGE 12%.

possivel confirmar a presena deste gene e seu

peso molecular.

Fig 3: Gene BRM de Ananas comosus

amplificado por PCR

!
Lise alcalina de preparao de DNA
plasmdico em grande escala (Maxi-prep)
O plasmdeo pTZ57R/T foi extrado das
bactrias previamente preparadas por processo
de amplificao de plasmdeo. Este plasmdeo
foi analisado em gel de eletroforese para
comprovar seu tamanho e eficincia da
extrao em grande escala (figura 4).

!
!

RESULTADOS E DISCUSSO

Extrao de RNA produo de cDNA e

amplificao.
O gene da bromelina (BRM) teve sua
sequncia amplificada por RT-PCR com a
utilizao de primers desenhados especficos,
diretos e reversos. A amplificao da sequncia
foi acompanhada em tempo real e,
posteriormente, a amostra amplificada foi
submetida a gel de eletroforese em agarose
com Sybr Green (figura 3). Neste gel

Fig 4: Vetor de clonagem pTZ57R/T em sua

forma no enovelada e supercoiled.

Neste gel, aps a irradiao com

transiluminador, puderam ser observadas duas

bandas principais, sendo a primeira

correspondente ao plasmdeo em sua forma no
enovelada. O plasmdeo linearizado corre de
forma mais lenta e aparece mais prxima
canaleta. A segunda banda, mais distante da
canaleta, equivale a forma superenovelada do
plasmdeo (super-coiled). Esta forma do
plasmdeo corre mais rapidamente com maior
facilidade entre as malhas do gel. Comparando
a distncia percorrida pela amostra com o
DNA padro, pode-se estimar o nmero de
pares de base da amostra. A intensidade da
banda comparada com a de um outro DNA
previamente quantificado pode indicar a
quantidade de material obtido na extrao.
Analisando os resultados obtidos pde-se
observar que a quantidade e o tipo de material
obtidos foram satisfatrios, indicando sucesso
dos procedimentos realizados e o rendimento
obtido foi em mdia 2 mg de DNA a cada 400
mL de cultura bacteriana.

Subclonagem em vetor de expresso

Aps a subclonagem e replaquemaneto em
LB com ampicilina apenas as cepas contendo
BRM ligado ao gene de resistncia
ampicilina foram capazes de multiplicarem-se.
A insero do gene pET32b-BRM em E.
coli JM109 foi confirmada por anlise da
digesto deste plasmdeo com enzimas de
restrio. A digesto com estas enzimas (que
tm um stio de clivagem) demonstrou o
tamanho correto esperado deste plasmdeo
quando da subclonagem (figura 5). No gel de
eletroforese, na digesto com algumas
enzimas, possvel observar duas bandas.
Estas bandas so referentes clivagem do
plasmdeo em at dois stios indicando
inespecificidade da enzima e ou a existncia de
stio de clivagem no interior da sequncia do

gene inserido. A clonagem em vetor pCR

Blunt e a subclonagem em vetor pET23a(+)
foram realizadas sem mutaes.

Fig 5: Vetor de expresso pET32b-BRM aps

digesto com enzimas de restrio diversas.

!
Expresso do gene BRM e purificao de
bromelina.
Clone do gene BRM foi expresso para
produzir a protena rBRM. O perfil de
expresso foi mostrado com a presena de uma
protena de fuso de 57 kDa (21 kDa do
marcador e 36 kDa da rBRM) com aumento de
intensidade de 1 a 3 h. No foram observadas
protenas nessa posio na cultura no induzida
e no controle, confirmando o sucesso da
produo da protena rBRM em sistema
procaritico (Fig. 6). Uma vez que as fraes
da protena rBRM so altamente concentradas
nos corpos de incluso, o pellet foi solubilizado
em 8 M de ureia e a protena recombinante foi
purificada. A purificao exibiu uma protena
de fuso
rBRM com peso molecular
apropriado de 57 kDa.

CONCLUSO
O processo de produo de bromelina pela
expresso do gene em bactria E. coli JM109

clonagem enquanto mtodo para obteno de

bromelinas.

!
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
!

Fig 6: Perfil de purificao de rBRM.

provou-se uma tcnica eficaz para produo

industrial dessa substncia. O rendimento
obtido por este mtodo foi superior ao da
extrao da protena do caule da planta. Este
resultado foi evidenciado pelo baixo custo de
produo por micrograma de protena pura.
A extrao de protenas configura um
processo dispendioso onde o produto pode
variar de acordo com as condies de extrao,
do clima, do local de cultivo ou at mesmo
entre plantas diferentes. Ademais, a cada passo
de purificao, parte da protena de interesse
perdida, de forma que, para obter uma
quantidade mnima de protena necessria
muita biomassa da planta de interesse que
contm a protena em pequena quantidade
(DEVAKATE et al, 2009).
A manipulao gentica, alm de permitir
uma padronizao qualitativa da protena
obtida, permite tambm que sejam adicionados
outros componentes adjuvantes dependendo da
finalidade para qual a bromelina utilizada,
objetivando maior controle, qualidade e
rendimento na produo. Posto isto, fica
evidenciada a importncia das tcnicas de

AWANG, M. I.; RAZAK, O. A. Proteolytic

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