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PROTEOMA
Ilustraes cedidas pelas autoras
Luciana Di Ciero
Doutora, Pesquisadora, Esalq USP
ldctleme@terra.com.br
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Eletroforese
Bidimensional (2DE)
um posterior tratamento.
A Protemica pode ser aplicada em
diversas reas de interesse como por
exemplo na investigao de marcadores moleculares em determinadas doenas indicando a resposta da clula ou
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Figura 2. Perfil da protena total (150 ug) de Xylella fastidiosa, bactria patognica de citros var. laranja doce. IEF ocorreu entre pH3-10 e a
2DE em gel gradiente (9-18%) de poliacrilamida. Gel corado com nitrato de prata. Projeto financiado pela FAPESP
2DE, diversas modificaes foram feitas, principalmente na primeira dimenso. Utilizava-se os anflitos para estabelecer o gradiente de pH para a
separao das protenas pelo ponto
isoeltrico. Entretanto, o uso de anflitos com esta finalidade tem diversos
problemas incluindo a incapacidade
de correr grandes quantidades de protenas necessrias para a micro seqncia, pouca estabilidade do gradiente de pH durante a eletroforese e
freqente falta de reprodutibilidade
dos gis entre os laboratrios. O uso
dos gradientes de pH imobilizados
(IPG) para a separao por cargas na
2DE solucionou muitos dos problemas. Encontra-se no mercado fitas de
gis IPG desidratadas (Amersham Biosciences) feitas de uma matriz de
poliacrilamida, a qual modificada
covalentemente com grupos cidos e
bsicos que formam o gradiente de pH
imobilizado em toda a extenso do gel.
H diversas faixas de pH, desde ampla
(3-10), como faixas estreitas, como
por exemplo de 4,5-5,5 ou 7,0-11,0.
Esta flexibilidade na escolha das faixas
de pH a serem utilizadas de grande
utilidade para separar eficientemente
o maior nmero de protenas possvel.
A 2DE combina duas tcnicas de
separao: a primeira separao (primeira dimenso) a focalizao isoeltrica (IEF), e a segunda dimenso
(2DE) a eletroforese em gel de
poliacrilamida, chamada de SDS-PAGE.
No IEF as protenas so separadas,
atravs de uma alta tenso, em um
gradiente de pH imobilizado em um
gel de acrilamida at alcanarem a
posio estacionria onde a carga total
zero. O pH no qual a protena tem
carga lquida zero chamado de ponto
isoeltrico (pI). Na 2DE, as protenas
so separadas pelo peso molecular,
atravs de uma tenso, tambm em
gel de poliacrilamida contendo ou no
o detergente sulfato dodecil de sdio
(SDS-PAGE). A mobilidade eletrofortica se d de acordo com o tamanho da
protena sendo restringida pelo tamanho do poro da matriz de poliacrilamida, de uma forma que as protenas
migram em uma velocidade proporcional ao seu tamanho. A matriz de
poliacrilamida usada pode ser homo-
desnaturadas em uma soluo contendo detergentes no inicos ou zwiterinicos, caotropes (uria, tiouria), e
pequenas quantidades de agentes redutores, como o ditiotreitol (DTT).
Uma soluo comum a composta de
uria (8 M), CHAPS (4%), DTT (70mM),
anflito (0,5 a 2%) e azul de bromofenol (0,005%). A concentrao do anflito deve ser determinada para cada
amostra empiricamente.
A solubilizao das protenas uma
etapa fundamental para o sucesso da
eletroforese bidimensional. Estas solues devem ser otimizadas baseada
nas amostras utilizadas no experimento. Sabe-se que protenas de membrana so de difcil visualizao em gel
devido, principalmente a dificuldade
de solubiliz-las, j que o uso do SDS
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