R E V I S TA P O R T U G U E S A

RPCV (2007) 102 (561-562) 113-117

DE

CINCIAS VETERINRIAS

Sexagem de embries bovinos: eficincia e preciso, distribuio do sexo

e viabilidade aps vitrificao
Sex determination of bovine preimplantation embryos: efficiency and
accuracy, sex ratio and viability of vitrified embryos
Isabel Carvalhais, Jorge Pimenta, Carla C. Marques, Maria C. Baptista, Maria I. Vasques,
Antnio E. M. Horta, Ingrid C. Santos, Maria R. Marques, Rosa M. L. N. Pereira*
Estao Zootcnica Nacional, 2005-048 Vale de Santarm, Portugal

Resumo: Pretendeu-se avaliar a eficincia e preciso da

determinao do sexo em biopsias obtidas por micro-seco de
embries bovinos produzidos in vitro. Avaliou-se tambm a
distribuio do sexo e a sobrevivncia destes embries
biopsiados congelao/ descongelao. Ocitos bovinos
aspirados de ovrios recolhidos no matadouro foram maturados
e fertilizados in vitro (FIV=D0) para produo de embries em
co-cultura (TCM199 + 10% soro + clulas da granulosa).
Embries D7/D8 foram biopsiados e vitrificados. O grupo
controlo no foi micromanipulado. Aps extraco do DNA das
amostras, foram utilizados dois pares de iniciadores no PCR
para determinao do sexo dos embries. A preciso do
mtodo, avaliada por comparao do sexo diagnosticado nos
blastmeros biopsiados e respectivo embrio (n=14) e em duas
biopsias (n=20) do mesmo embrio, foi 100% e 100%,
respectivamente. A eficincia do mtodo na determinao do
sexo dos embries (n=47) foi 93,6%. As taxas de clivagem e de
embries D7-8 foram 73,81,8% e 23,81,7%, no havendo
diferenas significativas na distribuio do sexo dos embries.
A sobrevivncia dos embries micromanipulados ou no micromanipulados aps descongelao foi de 59,49,4% e de
91,78,3% (P=0,04), respectivamente.
O mtodo de biopsia e o protocolo de PCR implementados para
a sexagem de embries bovinos so simples e precisos. A sobrevivncia dos embries micromanipulados vitrificao,
embora com taxas bastante aceitveis, ainda menor que a dos
embries no micromanipulados. Outras estratgias para
aumentar a resistncia destes embries congelao /descongelao podero valorizar os embries produzidos.
Palavras-chave: sexagem, embries, bovinos, vitrificao
Summary: The purpose of this study was to determine the
efficiency and accuracy of sex determination by polymerase
chain reaction (PCR) using micro-section for biopsy of in vitro
produced (IVP) bovine embryos. Embryo sex ratio and
post-thawing viability were also determined. Abattoir derived
oocytes were matured and fertilized in vitro (IVF day = D0) for
embryo production in a co-culture system (TCM199 + 10%
serum + granulosa cells). Day 7/8 embryos were biopsied for
sex determination. Biopsied and non-biopsied blastocysts
were vitrified as a control for embryo viability. For sex deter-

*Correspondncia: rosalnp@gmail.com
Fax: 243767307; Tel: 243767380

mination, the method utilizes two different sets of primers in a

pit-stop PCR. Accuracy of assays determined by comparing the
identified sex from biopsied blastomeres with that of its correlated embryo (n=14) and from two biopsies (n=20) of the same
embryo was 100 and 100% respectively. Embryo sexing
efficiency was 93.6%. Embryo production rates were
73.81.8% and 23.81.7% for cleavage and D7-8 embryo
respectively, with an absence of significant effect on blastocysts
sex ratio. Post-thawing embryo survival were 59.49.4% and
91.78.3% (P=0.04) for biopsied and non micromanipulated
bovine embryos, respectively. These data indicate that the
implemented embryo biopsy and the PCR protocol provided a
highly reliable method for sexing bovine embryos. Although
presenting acceptable post-thawing embryo survival rates,
results from biopsied embryos were even so inferior to those
in non-micromanipulated embryos, pointing to the need of
combining vitrification with new strategies for improving
embryo resistance to cryopreservation.
Keywords: sexing, embryos, bovine, vitrification

Introduo
O desenvolvimento de metodologias que permitam
a predeterminao do sexo dos embries tem sido
objecto de inmeras equipas de investigao em todo
o mundo. Diversos mtodos foram implementados.
No entanto, apenas a deteco de sequncias de DNA
especficas do cromossoma Y, aps recolha de biopsia
embrionria e amplificao pela PCR, suficientemente rpida e eficaz para ser usada na prtica
(Bredbacka, 2001; Lopes et al., 2001; Lopes da Costa
et al., 2002). No existe contudo unanimidade na
tcnica a utilizar. Os protocolos de PCR onde so
amplificados diferentes sequncias especficas do
cromossoma Y so numerosos (Peura et al., 1991;
Kirkpatrick e Monson, 1993; Machaty et al., 1993;
Bredbacka et al., 1995; Weikard et al., 2001;
Kageyama et al., 2004). Muitos destes protocolos prevem igualmente a amplificao de uma sequncia
comum a ambos os sexos para evitar os falsos diagnsticos de fmeas na ausncia de amostra e, quase todos,
referem taxas de eficincia elevadas (90-95%).
113

Carvalhais I et al.

Enquanto que as taxas de gestao em vacas aps

transferncia de embries sexados frescos so
elevadas, a transferncia de embries sexados aps
descongelao origina taxas de gestao significativamente inferiores (Shea, 1999; Lopes da Costa et al.,
2002). A menor viabilidade dos embries sexados
aps descongelao resulta de leses celulares e da
zona pelcida que decorrem durante a recolha da
biopsia, fragilizando o embrio. Os embries bovinos
IVP apresentam tambm uma grande susceptibilidade
criopreservao, apontada como uma das grandes
limitaes aplicao comercial desta tcnica,
situao agravada por qualquer micromanipulao
(Tominaga, 2004). Progressos recentes nas tcnicas de
congelao, nomeadamente a vitrificao associada a
novas formas de acondicionamento dos embries, que
permitem taxas de congelao ultra-rpidas (Vajta
et al., 1998; Tominaga e Hamada, 2004) podero
contribuir para aumentar a resistncia destes embries
criopreservao.
A maior produo de embries do sexo masculino
por IVP, referida por alguns autores, pode ser considerada um problema nas raas bovinas com aptido
leiteira, onde h um grande interesse econmico na
produo de fmeas. Estes autores tm identificado
alguns factores que influenciam o desvio na proporo
macho: fmea nos embries IVP, como sejam as
condies de cultura in vitro, nomeadamente altas
concentraes de glucose (Gutierrez-Adan et al.,
2001a, 2001b), a maior velocidade de desenvolvimento
dos embries do sexo masculino (Avery et al., 1992;
Nedambale et al., 2004), a maior sensibilidade dos
embries do sexo feminino manipulao (Gutirrez
et al., 1993), assim como o mtodo de preparao dos
espermatozides para a fertilizao in vitro (Pegoraro
et al., 2002; Madrid-Bury et al., 2003). Por outro lado,
muitos destes factores podero ser manipulados,
constituindo um mtodo simples e no invasivo para a
seleco de embries do sexo feminino ou masculino.
Neste trabalho pretendeu-se avaliar a preciso e
eficincia da determinao do sexo por PCR em
biopsias obtidas por micro-seco de embries
bovinos produzidos in vitro. Pretendeu-se tambm
quantificar a distribuio de embries machos e
fmeas obtidos no sistema de produo in vitro
praticado no Laboratrio de Embriologia da EZN e
avaliar a sobrevivncia destes embries biopsiados
congelao/descongelao.

Material e mtodos
Produo in vitro de embries
A produo de embries (17 sesses) foi realizada
a partir de ocitos aspirados de ovrios bovinos
provenientes do matadouro Santacarnes (Santarm),
segundo tcnica descrita por Pereira et al. (2007).
Resumidamente, os complexos cumulus-ocitos
114

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aspirados, aps lavagem e seleco, foram colocados

para maturao numa estufa incubadora a 39 C, com
5% de CO2 e saturada de humidade durante 22 a 24
horas. O meio de maturao era constitudo por
TCM199 (GibCo, ref. 22340-020), 10% de soro de
vaca superovulada em cio (SOCS), 10 g/mL FSH
(Sigma, ref. F-2293), 100 UI/mL de penicilina e
100 g/mL de estreptomicina (Sigma, ref. P-0781).
Os ocitos maturados foram inseminados com smen
bovino descongelado e submetido a um processo de
"swim-up" em meio Talp (meio modificado de
Tyrode) com cafena (2,4 mM, Sigma, ref. C-0750). A
fertilizao dos ocitos foi realizada em gotas de
40 L de meio de fertilizao constitudo por meio
TALP suplementado com 30 g/mL de heparina
(Sigma, ref. H-3393), 10 mM penicilamina (Sigma,
ref. P-4875), 20 mM de hipotaurina (Sigma, ref.
H-1384) e 0,25 mM de epinefrina (Sigma, ref. E-1635)
submersas em leo mineral (Sigma, ref. M-8410). Os
ocitos (10 por gota) e espermatozides (1 x 106/mL)
permaneceram 22 horas neste meio, aps o que foram
transferidos para monocamadas de clulas da granulosa. Os embries prosseguiram o seu desenvolvimento
in vitro, durante 7 ou 8 dias, em estufa incubadora a
39 C, com 5% de CO2 e saturada de humidade, sendo
refrescados diariamente (TCM199 + 10% de SOCS +
antibitico). As taxas de clivagem (embries 2-4
clulas /ocitos inseminados) e de embries D7/D8
(morulas e blastcitos / embries 2-4 clulas) foram
avaliadas s 48 horas aps a inseminao e nos 7 e 8
dias de cultura, respectivamente.
Micromanipulao e congelao dos embries
Os embries foram seleccionados para a micromanipulao ao 7 e 8 dias de cultura, nos estadios de
blastcitos e blastcitos expandidos, com uma
qualidade de muito bom (G1) e bom (G 2) (Lidner e
Wright, 1983). A micromanipulao foi realizada em
microscpio invertido (Olympus, IMT-2), com o
auxlio de micromanipuladores (Narishige, MO-8set
e MN-151), onde foram colocadas a pipeta de fixao
"holding" e a micro-lmina de bisturi (AB technology,
Ref. ESE020). As biopsias recolhidas do trofoblasto
foram congeladas em azoto liquido e guardadas a
30 C, para posterior identificao do sexo dos
embries.
A congelao dos embries de G1 e G2 (biopsiados,
n=20; no biopsiados, n=19) foi realizada por
vitrificao segundo a tcnica de Mermillod et al.
(1997) e os embries conservados em azoto lquido. A
resistncia dos embries congelao/descongelao
foi avaliada pelo nmero de embries vivos e ntegros/
embries descongelados *100. A classificao dos
embries descongelados considerou a ausncia de
fractura da zona pelcida ou separao de clulas do
embrio (integridade) e tambm a sua expanso e
aparncia (brilho, cor, blastmeros em degenerescncia)
(Pereira et al., 2007).

Carvalhais I et al.

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Sexagem dos embries

Anlise estatstica

O mtodo de sexagem de embries bovinos IVP

implementado baseou-se na tcnica de Forell (2001) e
Lopes et al. (2001). O DNA foi extrado das amostras
(biopsia ou embries) com auxilio de protenase
K (0,16 g/L) e do sangue de bovinos com sexo
identificado, utilizados como controlo masculino e
feminino no PCR, com um kit comercial (DNeasy
Tissue Kit; Ref. 69504).
Os pares de iniciadores utilizados para a amplificao do DNA foram o C1C2 (controlo) e Y1Y2
(especfico do macho). O par C1C2 foi descrito por
Peura et al. (1991) para amplificar um fragmento de
DNA satlite bovino 1.715 de 216 pb (Plucienniczak
et al., 1982). O par Y1Y2 foi descrito por Machty et
al. (1993) para amplificar um fragmento de 174 pb
especfico para o cromossoma Y. Os iniciadores foram
sintetizados pela BIOMERS (Bioportugal), tendo a
sequncia: C1C2 5- TGG AAG CAA AGA ACC CCG
CT - 3 e 5-TCG TGA GAA ACC GCA CAC TG3;
Y1Y2 5- CCC TTC CAG CTG CAG TGT CA - 3 e
5- GAT CTG TAA CTG CAA ACC TGG C - 3.
A reaco de amplificao do DNA foi realizada
num volume total de 25 L, contendo 5 U da Taq
polimerase (Fermentas, Ref. EP0402) adicionada em
HotStart a 95 C aps o incio da reaco, tampo de
10xPCR (Fermentas, Ref. B15), 1,5 mM de MgCl2
(Fermentas, Ref. EP0402), 10 mM de dNTPs
(Fermentas, Ref. RO192), 10 g/mL de BSA e 2 L
de cada par de iniciadores, com 10 pM para o par C1C2
e 30 pM para o Y1Y2. Os tubos foram colocados no
termociclador (Uno II, Alfagene) e submetidos
temperatura de 94 C durante 5 minutos. Em seguida
foram submetidos a 40 ciclos de 94 C por 1 minuto;
56,4 C por 30 segundos; 72 C por 45 segundos e a
uma extenso final de 72 C por 30 minutos. Ao final
do 7 ciclo da PCR, foi adicionado o segundo par de
iniciadores C1C2 s amostras em PitStop.
Aps a amplificao do DNA, as amostras foram
submetidas separao electrofortica (Sistema de
electroforese Mini-Sub Gell GT, BioRad), em gel
de agarose a 2% em 1x TBE (10xTris/cido
brico/tampo EDTA; BIO-RAD; Ref. 161-0733)
contendo 0,5 g/mL de brometo de etdio
(GibcoBRL; Ref. 15585-011). Os produtos de
amplificao foram visualizados sob luz ultravioleta
(Photo Print da Vilbert Loumart). A presena de
um fragmento de DNA de 216 pb foi diagnosticada
como fmea, e a presena de dois fragmentos (216 pb
e 174 pb) foi diagnosticada como macho.
A preciso do mtodo foi avaliada por comparao
do sexo diagnosticado nos blastmeros biopsiados e
no respectivo embrio (n=14) e do sexo diagnosticado
em duas biopsias (n=20) do mesmo embrio (Forell et
al., 2002; Tominaga e Hamada, 2004). A eficincia do
mtodo para a sexagem dos embries (n=47) foi
calculada pela razo entre o nmero de embries
com sexo identificado e o nmero de embries
biopsiados*100.

Os resultados do presente trabalho so apresentados

como a mdia erro padro (EP) das respectivas
sesses.
O tratamento estatstico para comparao da
distribuio do sexo dos embries IVP em funo
da idade (D7 versus D8), qualidade (grau 1 versus
grau 2) e estadio de desenvolvimento embrionrio
(BL Exp- versus BL Exp+) foi realizado pelo teste do
qui quadrado, em tabelas de contingncia 2X2.
A anlise de varincia foi utilizada para avaliar
a resistncia congelao/ descongelao dos
embries realizada em 4 sesses de descongelao.
As diferenas foram consideradas significativas
quando P0,05 (Statsoft Inc, 1995).

Resultados
As taxas de produo de embries obtidos nas 17
sesses realizadas esto representadas na tabela 1.
Tabela 1 - Taxas de produo in vitro de embries bovinos
(17 sesses)
n
1074
210

Embries 2-4 clulas

Embries D7/8

Taxa (mdia EP) %

73,8 1,8*
23,8 1,7**

*n de embries 2-4 clulas/ n de oocitos inseminados

**n de morulas e blastocitos / n de embries 2-4 clulas

Dos embries D7/8 produzidos, 4,4 2,1% eram de

G1, 26,7 3,0% de G2, 35,3 4,9% de G3 e 33,6
4,4% de G4. Apenas os embries de G1 e G2 foram
biopsiados para posterior identificao do sexo. Na
Figura 1 est representada a fotografia de um gel de
agarose, onde correram os produtos da reaco de
amplificao do DNA extrado das biopsias dos

Amostras de DNA de biopsias

de embries bovinos IVP

DNA de
sangue

216 pb
174 pb

? rgua
9 10 11 12 13

Figura 1 - Fotografia de gel de agarose aps electroforese dos produtos

de PCR das amostras de biopsias de embries IVP bovinos. Na posio
12 est o DNA controlo fmea (aparece a banda autossmica especfica
do DNA bovino 216 pb) na posio 13 est o DNA controlo macho
(aparece primeiro a banda autossmica especifica do DNA bovino - 216
pb e em seguida a banda especifica para o cromossoma Y - 174 pb). O
marcador de pesos moleculares - rgua (posio 11) foi o 100 pb. Da
esquerda para a direita foram colocadas amostras de biopsias de
embries IVP, posies 1, 2, 6 e 10, diagnosticados machos; nas
posies 3, 4, 5, 7 e 8, diagnosticados fmeas; na posio 9, no houve
diagnstico (ausncia de bandas de DNA).

115

Carvalhais I et al.

embries IVP bovinos. A taxa de preciso do mtodo

foi de 100%, quer quando comparado o sexo de duas
biopsias (20/20) do mesmo embrio quer quando
comparado o sexo da biopsia e respectivo embrio
(14/14). A eficincia do mtodo para a sexagem dos
embries foi de 93,6% (44/47).

Discusso
A tecnologia da determinao do sexo de embries
antes da implantao pode contribuir no s para
aumentar a eficincia econmica em programas de
transferncia de embries mas tambm para a optimizao do maneio reprodutivo bovino em programas
de seleco e melhoramento (Shea, 1999). O mtodo
de sexagem utilizado neste trabalho econmico,
simples e preciso. A biopsia dos embries realizada
por micro-seco de fcil execuo e permite retirar
10 clulas por embrio. O nmero de clulas da
biopsia importante para a optimizao do PCR, pois
embora seja possvel utilizar apenas um blastmero
para a sexagem (Machaty et al., 1993), o que diminui
a fragilidade do embrio, a probabilidade de erro na
amplificao dos produtos de PCR devido a contaminao ou por aneuploidia muito maior. Segundo
Shea (1999) e Bredbacka (2001) esta tcnica no
constitui uma mais valia devido aos numerosos falsos
diagnsticos.
O uso do iniciador autossmico foi de grande
importncia para reduzir o nmero de diagnsticos
duvidosos, que no presente trabalho foi de 0%, e para
salvaguardar a ocorrncia de falsas identificaes de
embries do sexo feminino. A adio deste iniciador
somente aps 7 ciclos de amplificao do DNA permitiu
evitar interferncias na amplificao da sequncia
especfica do cromossoma Y, que ocorre quando ambos
os pares de iniciadores so adicionados ao mesmo
tempo, antes de iniciar a reaco da PCR (Peura et al.,
1991; Bredbacka et al., 1995; Lopes, 1998). A ausncia
de diagnstico ocorreu em cerca de 6% dos embries
produzidos, no tendo sido observadas as bandas no
especfica e especfica do macho aps o PCR. Esta falta
de diagnstico pode ter resultado da perda da biopsia ou
por problema na amplificao do DNA. A taxa de eficincia do diagnstico do sexo dos embries pelo mtodo
implementado semelhante s referidas por vrios
autores que variam entre 90 e 98% (Peura et al., 1991;
Kirkpatrick e Morgon, 1993; Matchay et al., 1993;
Garcia et al., 1997; Weikard et al., 2001; Kageyama et
al., 2004).
A biopsia por micro-seco apresenta como grande
vantagem o uso de equipamento mais simples podendo ser utilizada para sexagem de embries em
condies de campo (Lopes et al., 2001). Bredbacka
(2001) refere que esta metodologia no altera os
ndices de gestao obtidos comparando embries
116

RPCV (2007) 102 (561-562) 113-117

bovinos IVP sexados e no sexados. Contudo, esta

tcnica apresenta como grande desvantagem o prejuzo
da qualidade embrionria aps a criopreservao
(Shea, 1999; Tominaga, 2004), como constatado no
presente trabalho, embora a vitrificao tenha aumentado a taxas de integridade e expanso dos embries
ps descongelao (91,7%) quando comparado com
resultados anteriores (59,4% embries no biopsiados
descongelados) do nosso laboratrio utilizando a
tcnica da congelao lenta (Pereira et al., 2004).
A obteno da biopsia embrionria por microaspirao poder melhorar a resistncia dos embries
micromanipulados congelao. No entanto, esta
tcnica mais difcil, necessitando de equipamento e
operadores mais sofisticados, apresentando taxas de
preciso menores (Garcia et al., 1997; Lopes et al.,
2001). No presente trabalho, a preciso do mtodo de
sexagem obtida pelo diagnstico do sexo de 2 biopsias
ou biopsia e respectivo embrio foi de 100%. Outras
alternativas para melhorar a congelabilidade dos
embries micromanipulados podero passar pela optimizao dos protocolos de vitrificao e alteraes no
sistema de cultura in vitro, como seja a incluso do
ismero conjugado do cido linleico trans-10 cis-12
que melhora a resistncia congelao/ descongelao
dos embries produzidos in vitro micromanipulados
ou no (Carvalhais et al., 2006, Pereira et al., 2007).
Como referido, alguns autores encontraram um
desequilbrio na proporo macho:fmea nos
embries IVP sugerindo que este desequilbrio um
artefacto resultante de alguns sistemas de produo de
embries. Contudo, no nosso sistema de cultura com
clulas da granulosa, TCM199 e 10% soro no houve
diferenas significativas na proporo de embries
machos e fmeas produzidos. De igual modo, a teoria
de que os embries machos se desenvolvem mais
depressa que as fmeas (Avery et al., 1992;
Nedambale et al., 2004) tambm no confirmada
pelos presentes resultados. Estes resultados podem ter
origem na conjugao de vrios factores como a
utilizao de TCM199 como meio de cultura base que
segundo De La Fuente (1998), ao contrrio do meio
Menezo B2, no induz diferena na proporo de
embries machos:femas, apesar da presena de
clulas em co-cultura e da utilizao do swim-up para
preparao dos espermatozides que favorece os
embries machos (Pegoraro et al., 2002). Outros
autores tambm no encontraram diferenas significativas entre sexos dos embries produzidos.
O mtodo de biopsia e o protocolo de PCR
implementados para a sexagem de embries bovinos
so simples e precisos. A sobrevivncia dos embries
micromanipulados congelao, embora com taxas
bastante aceitveis, ainda menor que a dos embries
no micromanipulados. A aplicao da vitrificao
aliada a outras estratgias para aumentar a resistncia
destes embries congelao/descongelao permitir
valorizar os embries produzidos.

Carvalhais I et al.

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