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FACULDADE INTEGRADO DE CAMPO MOURÃO- PARANÀ

FACULDADE INTEGRADO DE CAMPO MOURÃO- PARANÀ MEDICINA VETERINÁRIA KRISTHIAN FELIPE SPACKI “A MICROBIOLOGIA COMO AUXÍLIO DIAGNÓSTICO

MEDICINA VETERINÁRIA

KRISTHIAN FELIPE SPACKI

“A MICROBIOLOGIA COMO AUXÍLIO DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE

DOENÇAS NA MEDICINA VETERINÁRIA-

PIOMETRA EM CADELAS”

CAMPO MOURÃO

2014

FACULDADE INTEGRADO DE CAMPO MOURÃO- PARANÀ

MEDICINA VETERINÁRIA

KRISTHIAN FELIPE SPACKI

“A MICROBIOLOGIA COMO AUXÍLIO DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE

DOENÇAS NA MEDICINA VETERINÁRIA-

PIOMETRA EM CADELAS”

TRABALHO INTEGRADOR

Trabalho apresentado ao curso de Medicina Veterinária da Faculdade Integrado de Campo Mourão- PR como requisito parcial para avaliação no Projeto Integrador.

PROFESSORA: ROBERTA RIBEIRO FERNADES

CAMPO MOURÃO

2014

SUMÁRIO

A MICROBIOLOGIA COMO AUXÍLIO DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE DOENÇAS NA MEDICINA VETERINÁRIA- PIOMETRA EM CADELAS

1.0

RESUMO

.......................................................................................................................

3

  • 2.0 INTRODUÇÃO ...............................................................................................................4

  • 3.0 REVISÃO.BIBLIOGRÁFICA ...........................................................................................5

    • 3.1 PIOMETRA EM CADELAS................................................................................5

      • 3.1.1 Sinais clínicos

............................................................................

5

  • 3.1.2 Diagnóstico.................................................................................6

  • 3.1.3 Danos causados.........................................................................7

  • 3.2 AGENTES ENVOLVIDOS NA PIOMETRA EM CADELAS...............................7

    • 3.2.1 Infecção......................................................................................7

    • 3.2.2 Microbiologia da piometra..........................................................7

      • 3.2.2.1 Escherichia coli..........................................................................8

      • 3.2.2.2 Streptococcus spp.....................................................................8

      • 3.2.2.3 Staphylococcus spp...................................................................9

      • 3.2.2.4 Corinebacterium spp...............................................................10

      • 3.2.2.5 Clostridium spp........................................................................11

  • 3.3 MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS...............................................................11

    • 3.3.1 Ágar Mc Conkey.......................................................................12

    • 3.3.2 Ágar sangue.............................................................................12

    • 3.3.3 BHI brain heart infusion........................................................13

  • 3.4 ANTIBIÓTICOS INDICADOS PARA O TRATAMENTO..................................13

  • 3.5 RESISTÊNCIA BACTERIANA.........................................................................14

    • 3.5.1 Mecanismo de formação da resistência...................................15

    • 3.5.2 Controle e prevenção...............................................................16

    • 4.0 CONCLUSÃO..............................................................................................................19

    REFERÊNCIAS..................................................................................................................20

    LISTA DE FIGURAS

    Figura 1Cadela com corrimento vulvar sanguinolento..........................................................6 Figura 2- Ultrassom anecóico característico de piometra em cadela

    6

    ...................................... Figura 3- Estrutura E. coli ........................................................................................................8 Figura 4- E. coli corada no teste de gram................................................................................8 Figura 5- Streptococcus spp corados no procedimento de gram............................................9 Figura 6- Staphylococcus spp corados no procedimento de gram........................................10 Figura 7- Corinebacterium spp, bastonetes em raquete........................................................10 Figura 8- Clostridium spp, esporos e células vegetativas......................................................11 Figura 9- Classificação da hemólise em ágar sangue...........................................................12 Figura 10- Útero da cadela poodle durante a OSH ...............................................................17 Figura 11- Técnica de semeadura por esgotamento.............................................................18 Figura 12- 2 Formação de alos pelos antibióticos ................................................................22

    LISTA DE TABELAS

    Tabela 1Tabela de fundamentos das provas do Bactray para amostras I-II.......................20 Tabela 2- : Tabela de fundamentos das provas do Bactray para amostras III.......................21 Tabela 3- : Tabela com os resultados do antibiograma.........................................................21

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    1.0 RESUMO

    O complexo de alterações que induzem ao quadro conhecido por piometra em cadelas inclui diversos fatores, ganhando destaque as alterações hormonais e a infecção oportunista. O quadro clínico pode evoluir para lesão tecidual por toxicemia, pois as bactérias produzem toxinas que podem inclusive chegar a circulação. Os sinais inespecíficos incluem a letargia, depressão, inapetência, anorexia, poliúria, polidipsia, diarreia e vômito. Além destes há o corrimento vulvar em piometra aberta e o inchaço do útero em caos de piometra confinada. Como formas de diagnóstico pode-se optar pelo ultrassom e raio-x, que irão evidenciar o aumento do volume uterino assim como alterações na imagem decorrentes do acúmulo de líquido. Caso o quadro não seja tratado pode-se evidenciar: hipotermia ou hipertermia, taquicardia, bradipinéia leucopenia ou leucocitose, e em caso mais extremos de infecção e imunossupressão a lesão pulmonar aguda, distúrbio dos fatores de coagulação, trombocitopenia, alteração do estado mental e falência cardíaca/ hepática/ renal. Os agentes causadores são em principal Escherichia coli, sendo isolada em 59% a 96% dos casos. No ambiente aeróbio podem ser isoladas também colônias de Streptococcus spp e Staphylococcus spp, e no cultivo anaeróbio ganham destaque Corinebacterium spp e Clostridium spp. Para os processos laboratoriais são usados diferentes meios de cultura que se baseiam em fornecer ambiente ótimo de proliferação e em alguns seletividade quanto ao tipo de população microbiótica. Testes utilizando-se a cominação de meios de cultura e administração de antibióticos são bons exemplos da interação entre farmacologia e microbiologia veterinária. O caso em questão engloba o estudo da piometra em cadela poodle, e devido a problemas durante os procedimentos de cultivo mostrou como resistência bacteriana é um problema que precisa ser solucionado.

    Palavras-chave: Microbiologia; Piometra; Bactérias.

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    2.0 INTRODUÇÃO

    Conforme Evangelista (2000) e Lima (2009), a infecção caracterizada como piometra denomina o quadro inflamatório onde o útero encontra-se em estado de infecção bacteriana. O complexo-piometra é uma das enfermidades que acometem o trato reprodutivo das cadelas e está presente na rotina veterinária. A infecção ocorre pela interação de fatores hormonais que predispõem o organismo a invasão. Sendo relacionada a fêmeas no diestro a progesterona é o principal hormônio ativo, tendo as funções de aumentar a proliferação do tecido endometrial e relaxamento da cervix. A microbiota do ambiente externo se aproveita dessa oportunidade para proliferar-se em um ambiente com condições ideais e com pouca interferência do sistema imune. O quadro clínico pode evoluir para lesão tecidual por toxicemia, pois as bactérias produzem toxinas que podem inclusive chegar a circulação. Desta forma a piometra não tratada pode ser a primeira etapa de uma infecção generalizada. Desta forma, fazem-se necessários os estudo de métodos de diagnóstico e tratamento, e isto envolve também exames microbiológicos. O trabalho microbiológico é de extrema importância no cotidiano veterinário e este estudo engloba testes e técnicas relacionada a piometra, juntamente com a relação de possíveis tratamentos e manejo antibiótico. Tem também o intuito de agregar conhecimentos a respeito da dinâmica dos fármacos antibióticos, assim como sobre o desenvolvimento de resistência, tema que assola toda a área. O trabalho a seguir se baseia nestes tópicos e tem o objetivo apresentar um estudo de caso clínico relacionado a piometra, além de relacionar de forma didática pontos importantes no estudo microbiológico da piometra em cadelas.

    5

    • 3.0 REVISÃO. BIBLIOGRÁFICA

    • 3.1 PIOMETRA EM CADELAS

    Sendo uma enfermidade relacionada a fêmeas, o ponto básico para a instalação do quadro é a colaboração entre desarranjo hormonal e entrada de bactérias no ambiente uterino. Esta invasão está comumente atribuída ao relaxamento da cérvix no diestro, uma ação direta da progesterona (EVANGELISTA, 2009). De acordo com Chen, Addeo e Sasaki (2014), o quadro clínico denominado piometra ocorre pela combinação entre alterações hormonais específicas, somadas a proliferação bacteriana no tecido endometrial. A alteração hormonal é relacionada a fase de formação lútea do ciclo estral, a fase do diestro, sendo que neste momento as concentrações plasmáticas de progesterona são altas, levando a diferentes mecanismos: crescimento do tecido endometrial, secreção glandular e supressão das contrações do miométrio. Este ambiente colabora para o acúmulo de exsudato no interior do útero, que somado a desarranjos do sistema imune é ideal para a proliferação de bactérias, que em caso patológico podem trazer vários danos que serão discutidos a seguir (LIMA, 2009).

    • 3.1.1 Sinais clínicos

    Segundo Oliveira (2014), a piometra ocorre mais comumente em cadelas adultas, de sete a oito anos. Após os nove anos de idade, a prevalência da infecção pode chegar a mais de 60% em cadelas inteiras. Em cadelas com idade inferior a seis anos, o aparecimento da enfermidade está relacionado com a administração de progesterona ou estrógeno. Após a visualização da piometra em cadelas cabe uma segunda classificação, que altera em muito a demonstração dos sinais clínicos e também o dano decorrente. O primeiro tipo é a aberta, onde a secreção passa pela cérvix e escorre pela vagina. O segundo é a apresentação fechada, onde a cérvix confina a secreção no útero, causando a distensão abdominal (CHEN; ADDEO; SASAKI, 2014). A observação dos sinais clínicos se baseia nos pontos mais comuns de qualquer infecção, que são a letargia, depressão, inapetência, anorexia, poliúria, polidipsia, diarreia e vômito. Porém, estes sintomas não são garantias de um diagnóstico decisivo, e cabem além destes fatores comportamentais outras observações e testes complementares. Na piometra aberta a secreção característica pode variar do aspecto purulento a mucoso, e possivelmente apresentar sangue (Figura 1). A palpação revela o útero aquecido, e nas piometras de caso fechado o aspecto dilatado do órgão (LIMA, 2009).

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    6 Figura 1: Cadela com corrimento vulvar sanguinolento Fonte: Lima (2009) 3.1.2 Diagnóstico A partir do

    Figura 1: Cadela com corrimento vulvar sanguinolento Fonte: Lima (2009)

    3.1.2 Diagnóstico

    A partir do momento em que é instaurada a suspeita de piometra, parte-se para o segundo patamar, o diagnóstico. De acordo com Evangelista (2009), o hemograma é uma das principais ferramentas, onde em animais com piometra observa-se: anemia de grau leve ou moderado, causada pelo efeito supressor das toxinas bacterianas sobre a medula óssea, e também a grande migração de hemácias para a região da infecção; volume dos glóbulos pode estar aumentado, devido a desidratação; leucograma alterado levemente em casos de piometra aberta e severamente em caso de piometra fechada, apresentando leucocitose acentuada caracterizada por neutrofilia com desvio à esquerda, somada a possível monocitose com evidência de toxicidade de leucócitos Segundo Lima (2009), uma segunda ferramenta extremamente prática e funcional no diagnóstico de piometra em cadelas é o ultrassom. O raio-x pode ser útil, mas por critérios de mobilidade e possíveis dúvidas na interpretação prefere-se o ultrassom. Com este pode- se avaliar o aumento do volume uterino, assim como o tipo de conteúdo. Na piometra observa-se o útero como uma estrutura tubular, com fluido anecóico (Figura 2).

    6 Figura 1: Cadela com corrimento vulvar sanguinolento Fonte: Lima (2009) 3.1.2 Diagnóstico A partir do

    Figura 2: Ultrassom anecóico característico de piometra em cadela. Fonte: Lima (2009)

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    • 3.1.3 Danos causados

    Conforme Kalenski (2014), em cadelas a infecção uterina pode causar dano tecidual e supressão dos sistemas orgânicos, em decorrência do grave processo inflamatório e excessiva quantidade de toxinas bacterianas que entram na corrente sanguínea. Em casos onde o processo avança pode ocorrer a sepse, que consiste numa resposta inflamatória sistêmica como forma de conter a infecção bacteriana que atinge a circulação e tecidos adjacentes. Nestes casos podem ser constatados os seguintes sinais clínicos: hipotermia ou hipertermia, taquicardia, bradipinéia leucopenia ou leucocitose (KALENSKI, 2014). No seguindo estágio, conhecido como sepse grave, podem ocorrer:

    Lesão pulmonar aguda, distúrbio dos fatores de coagulação, trombocitopenia, alteração do estado mental e falência cardíaca/ hepática/ renal (EVANGELISTA, 2009).

    • 3.2 AGENTES ENVOLVIDOS NA PIOMETRA EM CADELAS

      • 3.2.1 Infecção

    O complexo que culmina com a piometra tem início com as alterações hormonais decorrentes do período do diestro. O principal hormônio envolvido inicialmente é o estrógeno, que estimula a proliferação das células endometriais e formação de criptas com receptores para a progesterona. Uma ação da progesterona é a inibição do tônus da cervix, que ao se relaxar permite a infecção pela flora bacteriana da vagina e oriunda do ânus, que invadem por via ascendente (LIMA, 2009). Os principais grupos presentes na infecção piometrosa estão comumente dispersos no ambiente e quando existe a oportunidade migram para o útero, onde tem a combinação de ambiente adequado e pouco incomodo por parte do sistema imune, que se encontra suprimido por ação da progesterona. Podem se listar outros fatores que levariam a infecção uterina, mas de forma pratica a ação hormonal é a principal e mais comum porta de entrada (COGGAN, 2014).

    • 3.2.2 Microbiologia da piometra

    Segundo Oliveira (et al., 2014), a Escherichia coli é a principal bactéria associada a piometra, sendo isolada em 59% a 96% dos casos. No ambiente aeróbio podem ser isoladas também colônias de Streptococcus spp e Staphylococcus spp, e no cultivo anaeróbio ganham destaque Corinebacterium spp e Clostridium spp.

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    • 3.2.2.1 Escherichia coli A Escherichia coli tem grande importância no quadro,

    sendo esta um bacilo

    pertencente a família Enterobacteriaceae. No caso de cadelas está presente em tecidos epiteliais, estando em comensalismo com o organismo, e em especial abundância na vagina e ânus (GOMES, 2014). O ambiente preferido por estas é o aeróbio, mas também sobrevivem em anaerobiose. Por isso são classificadas como anaeróbio-facultativas. Na coloração de gram encontra-se no grupo negativo, tomando coloração rósea devido a conformação da parede celular. Uma segunda forma de identificação é o teste de lactase, onde se comporta produzindo gás carbônico a partir de açúcares, como a lactose (GOMES, 2014). A morfologia da bactéria é caracterizada pela presença de flagelos ao redor da célula, podendo ser confundida com a Shigela spp. Biologicamente é pouco exigente em quesitos de nutrição, e os danos caudados referem-se basicamente a sua proliferação e produção de toxinas. Possui fimbrias que lhe permitem aderir a parede do tecido, dificultando seu arrasto (HIRSH, 2003). Na proliferação excessiva produzem citocinas vasodilatadoras, estando comumente relacionadas a casos de choque séptico e morte por septicemia (COGGAN, 2014).

    8 3.2.2.1 Escherichia coli A Escherichia coli tem grande importância no quadro, sendo esta um bacilo
    8 3.2.2.1 Escherichia coli A Escherichia coli tem grande importância no quadro, sendo esta um bacilo

    Figura 3: Estrutura E. coli Fonte: (GOMES, 2014)

    Figura 4: E. coli corada no teste de gram Fonte: (GOMES, 2014)

    • 3.2.2.2 Streptococcus spp

    Os Streptococcus compreendem um grupo heterogêneo de cocos que se dividem em um só plano, agrupando-se em cadeias de tamanho variável. Estes microrganismos fazem parte da microbiota normal e são importantes agentes infecciosos tanto em animais quanto humanos (TRABULSI, 2005).

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    Para o cultivo destas bactérias necessita-se de meio rico, geralmente os baseados em sangue. No teste de gram adquirem a cor roxa (Figura 5), característica das gram positivas. São consideradas imóveis por não possuir estruturas como cílios e flagelos. São catalase negativas e proliferam-se tanto em ambiente aeróbio quando anaeróbio, sendo por isso denominadas anaeróbio-facultativas (TRABULSI, 2005). Segundo Hirsh (2003) a identificação dos Streptococcus é, entretanto, até hoje, relativamente complexa e fundamentada num sistema dicotômico, com base na observação inicial das propriedades hemolíticas das amostras. Desta forma são classificados como beta-hemolíticos (quando causam a lise total das hemácias) e não-beta-hemolíticos (quando causam a lise parcial das células). Desta forma nos casos de piometra a infecção da circulação pode se tornar grave em pouco tempo, devido a agressiva hemólise bacteriana.

    9 Para o cultivo destas bactérias necessita-se de meio rico, geralmente os baseados em sangue. No

    Figura 5: Streptococcus spp corados no procedimento de gram

    Fonte: Trabulsi (2005)

    3.2.2.3 Staphylococcus spp Possuem as mesmas características biológicas descritas para os Streptococcus, e diferem-se pelo seu arranjo espacial, que se assemelha a um cacho de uva (Figura 6). Segundo Gomes (2014), o diferencial e principal teste utilizado para estas bactérias é o teste de coagulase, separando o grupo em coagulase positivos e coagulase negativos. Os Staphylococcus são mais ativos na produção de toxinas e são devastadores ao cair na circulação sistêmica. Sua faixa de temperatura ideal é a do organismo, por isso estão sempre me estado de comensalismo com o indivíduo e se proliferam rapidamente ao encontrar portas de entrada.

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    10 Figura 6: Staphylococcus spp corados no procedimento de gram. Fonte: : Gomes (2014). 3.2.2.4 Corinebacterium

    Figura 6: Staphylococcus spp corados no procedimento de gram. Fonte: : Gomes (2014).

    3.2.2.4 Corinebacterium spp

    As espécies do gênero Corynebacterium são bastonetes Gram positivos, curtos, pleomórficos, imóveis, não esporulados. O gênero pertence à classe Actinobacteria dos quais fazem parte os gêneros Corynebacterium, Mycobacterium e Nocardia. As bactérias deste grupo possuem parede celular, contendo ácidos graxos de cadeia longa que são os ácidos micólicos. Os ácidos micólicos dos corines possuem cadeias curtas com 28- 40 carbonos. As espécies do gênero Corynebacterium estão distribuídas em uma ampla gama de ambientes ecológicos como: solo, esgoto e superfície de plantas, sendo que algumas delas patógenos para os animais e o homem (GOMES, 2014)”.

    Estas bactérias não estão no grupo dos bacilos álcool ácido resistentes, são catalase positivos e são anaeróbios-facultativos. São imóveis e exigentes nos meios de cultura, se proliferando melhor em meio sangue. Tem o formato de clava (Figura 7), e não formam esporos (TRABULSI, 2005).

    10 Figura 6: Staphylococcus spp corados no procedimento de gram. Fonte: : Gomes (2014). 3.2.2.4 Corinebacterium

    Figura 7: Corinebacterium spp, bastonetes em raquete. Fonte: Gomes (2014).

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    O gênero Corynebacterium spp é um parasito preferencialmente obrigatório das mucosas ou pele de mamíferos. Ocasionalmente são encontrados em outras fontes, alguns são patogênicos para os mamíferos, possuindo um grande número de espécies; muitos habitats, incluindo importantes patógenos para os animais e para o homem (COGGAN,

    2014).

    3.2.2.5 Clostridium spp O gênero é definido como aquele que reúne bacilos Gram positivos esporulados (Figura 8), e anaeróbios obrigatoriamente (na sua grande maioria). As células vegetativas da maioria das espécies são bacilos retos ou curvos, variando de pequenas formas de bastonetes cocóides a formas longas, filamentosas com extremidades alongadas ou retas. Os endósporos ovais ou esféricos usualmente são maiores que as células vegetativas. A maioria das espécies não é capsulada e praticamente todas são catalase negativas, e também a grande maioria é formadora de gás por meio do metabolismo (GOMES, 2014). Por se proliferar em anaerobiose o cultivo em laboratório depende da criação de um ambiente condizente. Muitas espécies produzem potentes exotoxinas, sendo que algumas espécies são patogênicas para os animais, tanto pela infecção de ferimentos quanto pela absorção de toxinas. Na piometra estes atingem a circulação e podem infectar diversos tecidos do organismo (TRABULSI, 2005).

    11 O gênero Corynebacterium spp é um parasito preferencialmente obrigatório das mucosas ou pele de mamíferos.

    Figura 8: Clostridium spp, esporos e células vegetativas.

    Fonte: : Gomes (2014).

    • 3.3 MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS

    De acordo com os estudos de Hirsh (2003), a infecção piometra engloba uma grande variedade de bactérias que estão presentes em diversas infecções. Sendo assim, para suas

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    classificações e diagnóstico são utilizados diferentes meios de cultura que se baseiam em fornecer ambiente ótimo de proliferação e em alguns seletividade quanto ao tipo de população microbiótica.

    • 3.3.1 Ágar Mc Conkey

    Meio que leva em sua composição cristal violeta e sais biliares, utilizados para inibir a proliferação de microorganismo gram-positivos (Especialmente enterococos e estafilococos). É utilizada para identificar bactérias gram-negativas e sua reação de fermentação a lactose. A mistura comercial é homogeneizada ao ágar e hidratada, para que desta forma possam ser cultivadas colônias em meio sólido (ANVISA, 2014). A incubação com este meio prolifera as colônias em 18 a 24 horas de estufa, e a conservação das amostras pode durar longos períodos se mantida entre 4 a 8°C. A interpretação do meio Mc Conkey depende da variação de cora, que em original é rosa avermelhado. Os bacilos que se desenvolvem nesta são gram negativos e as colônias cor de rosa são fermentadoras de lactose, enquanto as incolores não fermentadoras (HIRSH,

    2003).

    • 3.3.2 Ágar sangue

    Este é um dos meios mais indicados para bactéria exigentes, pois é extremamente nutritivo. Oferece ótimas condições de crescimento e proliferação e é utilizado na maioria das vezes por conter eritrócitos íntegros dispersos em forma homogênea, sendo necessário para a identificação de bactéria hemolíticas como Streptococcus e Staphylococcus (TRABULSI, 2005).

    12 classificações e diagnóstico são utilizados diferentes meios de cultura que se baseiam em fornecer ambiente

    Figura 9: Classificação da hemólise em ágar sangue. Fonte: Trabulsi (2005).

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    Como incubação a 35 °C as bactérias levam até 24 horas para formar colônias nítidas, e a hemólise fica bem definida, podendo ser classificada quanto ao tipo e tamanho do anel formado pela colônia (Figura 9). A interpretação desta hemólise consiste em: Beta hemólise, quando há um anel transparentes ao redor das colônias semeadas; Alfa hemólise:

    presença de um anel esverdeado ao redor das colônias; Gama hemólise: Ausência de anel oriundo de hemólise (ANVISA, 2014).

    • 3.3.3 BHI brain heart infusion

    Meio nutritivo derivado da extração de componentes de cérebro e coração. Tem grande quantidade de peptona, nitrogênio, carbono, enxofre, vitaminas e dextose. O meio é tamponado através da utilização do fosfato dissódico. É indicado para testes de antibiograma, reação de coagulase em tubo e meio caldo para detecção de turvação (ANVISA, 2014). Conforme Hirsh (2003) a incubação de bactérias a 35°C leva de 24 a 48 horas, e a de fungos precisa de 5 dias para expressar proliferação. Em meio caldo a turvação deixa a amostra esbranquiçada e opaca. Em meio sólido as colônias se apresentam de diferentes formas. Outro fator positivo deste meio é seu ph, que se mantém em 7,4, sendo ideal para a maioria dos microorganismos .

    • 3.4 ANTIBIÓTICOS INDICADOS PARA O TRATAMENTO

    Segundo Lima (2009), o uso de antibióticos bactericidas é o mais indicado no tratamento da piometra. Os principais antibióticos utilizados são trimetropin sulfonamidas, ampicilina, amoxicilina mais clavulanato, cefazolina ou cefozolina. Antibióticos sistêmicos de amplo espectro devem ser administrados concomitantemente durante o período de tratamento para prevenir uma septicemia e outras complicações relacionadas. Quando a piometra estiver resolvida, é recomendado acasalar a fêmea no ciclo subsequente para prevenir uma recorrência (LIMA, 2009). O efeito das sulfanomidas consiste m promover a açaõ bacteriostática por meio da inibição do metabolismo do ácido fólico. As bactérias dependem desse coponente, e sem ele entram em estado de quase inatividade. Comumente é feita a consorciação das sulfatonomidas com trimetropim, um diamini-pirimidina. O efeito das duas drogas é sinérgico, pois atuam em passos diferentes da síntese do ácido tetra-hidrofólico (folínico), necessária para a síntese dos ácidos nucléicos. O sulfametoxazol inibe um passo intermediário da reação e o trimetoprim a formação do metabólito ativo do ácido tetra- hidrofólico no final do processo (SPINOSA; GORNIAK; BERNARDI, 2011) . A ampicilina é uma variante farmacológica do grupo das penicilinas, com ação bactericida. O mecanismo de ação depende de sua capacidade de se ligar as proteínas da

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    membrana citoplasmática bacteriana. Deste modo inibe o crescimento e proliferação microbiana, podendo também provocar a lie de algumas espécies. É mais efetiva contra bactérias de alta atividade metabólica e pode ser administrada por via oral, com absorção de 35 a 50 %, sendo metabolizada pelo fígado e excretada pelos rins (MADSON; PAGE; CHURCH, 2010). Segundo Spinosa, Gorniak e Bernardi, (2011) a amoxicilina tem uma grande abrangência, sendo neste caso indicada especialmente pra o controle de E.coli. É uma penicilina semissintética de amplo espectro de ação, derivada do núcleo básico da penicilina, e assim como o ácido clavulânio tem via de absorção parental e entérica. Sua consorciação se deve ao fato de não ser efetiva contra bactérias produtoras de betalactamatases, por isso é administrada com o ácido clavulânico, um inativador desta enzima. Assim, amoxicilina + clavulanato de potássio é um medicamento capaz de destruir e eliminar ampla variedade de micro-organismos. A cefazolina é uma cefalosporina injetável indicada para o tratamento de bactérias gram positivas em principal, sendo efetiva também contra algumas do grupo gram negativo. A via de administração é parenteral e a de excreção é renal. Como todos os antibióticos beta-lactâmicos (e.g. penicilinas), as cefalosporinas interferem na síntese da parede celular de peptidoglicano via inibição de enzimas envolvidas no processo de transpeptidação (MADSON; PAGE; CHURCH, 2010).

    • 3.5 RESISTÊNCIA BACTERIANA

    “A resistência microbiana refere-se a cepas de microrganismos que são capazes de multiplicar-se em presença de concentrações de antimicrobianos mais altas do que as que provêm de doses terapêuticas dadas. O desenvolvimento de resistência é fenômeno biológico natural que se seguiu à introdução de agentes antimicrobianos na prática clínica. O uso desmedido e irracional desses agentes tem contribuído para o aumento daquele problema. As taxas de resistência variam localmente na dependência do consumo local de antimicrobianos” (WANNMACHER, 2004).

    Os primeiros casos de resistência aos antimicrobianos ocorreram entre os anos 1930-1940, logo após a introdução das primeiras classes de antibióticos, sulfonamidas e penicilina. A partir deste momento o problema só se agravou e inúmeros estudos são feitos apontando as causas e futuros problemas decorrentes desta situação. Com o uso de protocolos antimicrobianos inapropriados e sem baseamento teórico está se criando uma nova geração de micro-organismos, praticamente imunes a antibióticos se comparados a suas mutações antigas.

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    No cotidiano veterinário são utilizados diversos grupos de antibióticos, cada qual com sua posologia estudada. O descumprimento destas indicações e uso indiscriminado de fármacos são os principais meios de seleção que estão causando a resistência de bactérias. Isso agrava casos clínicos e diminui as chances de tratamento na maioria dos casos (SPINOSA; GORNIAK; BERNARDI, 2011).

    • 3.5.1 Mecanismo de formação da resistência

    A resistência bacteriana surge como forma de adaptação dos indivíduos mais adaptados ao ambiente e suas variações. Desta foram bactérias que entraram em contato com o antibiótico e se recuperaram ou não sofreram lesão criam um grupo novo, totalmente tolerante ao fármaco (MADSON; PAGE; CHURCH, 2010). Outros fatores cruciais são o uso inadequado de antibióticos, que são administrados sem se saber ao certo suas características, indicações e programa correto de administração. Assim animais são tratados de forma leiga, e as bactérias ao invés de serem contidas e eliminadas são selecionadas e fortificadas. O descarte de embalagens de antibióticos no ambiente age da mesma foram, proporcionando a população bacteriana ambiental uma das principais bases da resistência: a seleção de indivíduos adaptados (SPINOSA; GORNIAK; BERNARDI, 2011).

    O desenvolvimento da resistência é um fenômeno biológico natural originado do próprio princípio evolutivo e da adaptação genética de cepas de microrganismos que são capazes de multiplicar-se em presença de concentrações de antimicrobianos mais altos do que as que provêm de doses terapêuticas dadas a humanos. Nas células a resistência bacteriana desenvolve-se a partir de mutações cromossômicas ou aquisição de um novo material genético pela troca direta de DNA ou plasmídeo, através de transdução por um bacteriófago ou pela transformação, que consiste na incorporação de DNA pela bactéria. A informação nesse material genético possibilita a bactéria desenvolver resistência através da produção de uma enzima que inativa ou destrói o antibiótico, altera o sítio de ligação do medicamento ou impede a ação do mesmo (WANNMACHER, 2014).

    O resultado

    de todo

    este

    descaso é o aumento dos gastos com tratamento,

    diminuição das possibilidades de cura, perda de todo o avanço na criação dos antibióticos aos quais se criou resistência e o aumento no número de óbitos de animais que foram infectados por “super-bactérias”.

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    • 3.5.2 Controle e prevenção

    Como um dos principais problemas no setor farmacológico a resistência deve ser tratada com seriedade. Deve ser realizada a conscientização sobre o assunto, uso consciente, venda de antibióticos só para profissionais qualificados e capacitação destes para que possam administrar os antibióticos em casos corretos e na posologia determinada. Para o controle destas novas bactérias resistentes cabe aos setores de pesquisa criar novas alternativas. Mas de nada adianta este avanço se não existe o uso consciente. Por isso deve ser de conhecimento que o uso inadequado gera prejuízos, complicações e perca de pacientes (MADSON; PAGE; CHURCH, 2010). Com isso podem-se estabelecer bases para uma nova abordagem na luta contra o desenvolvimento de resistência bacteriana: desenvolvimento de protocolos terapêuticos para os antibióticos de uso comum; promover a conscientização sobre o uso consciente de antibióticos e seu descarte; prescrição de fármacos só sob receituário profissional e autorização de comércio apenas para antibióticos que atendam os padrões de eficácia, segurança e qualidade (WANNMACHER, 2014).

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    • 4.0 MATERIAL E MÉTODOS

    O material foi coletado de uma cadela da raça poodle, com nove anos, pesando 6.1 Kg. O animal apresentava estado de nutrição regular, desidratação de 6%, sua temperatura retal era de 39,9ºC, frequência respiratória de 40 respirações por minuto e frequência cardíaca de 140 batimentos por minuto. Apresentava um comportamento apático, pele e anexos com perda de elasticidade cutânea (des. 6%), mucosas levemente hipercoradas e linfonodos não reativos. Sistema digestivo foi observado dor a palpação abdominal, tempo de perfusão capilar era de 2” e o sistema gênito-urinário apresentava secreção vaginal purulenta fétida e esbranquiçada, o proprietário não soube informar a data do último cio. Em seguida, foram colhidas amostras de sangue para realização de hemograma completo e avaliação de bioquímica sérica da função renal. A cadela apresentou hematócrito de 39.3%. A série branca revelou severa leucocitose (40.2x10³/uL). Na bioquímica sérica observou-se 1.2 mg/dL de creatinina (0,5 a 1,6mg/dL). O laudo ultrassonográfico revelou a presença de uma dilatação em um dos cornos uterinos, paredes espessadas e com conteúdo líquido de grande celularidade. Após a confirmação do diagnóstico, optou-se pelo tratamento cirúrgico (Ovariosalpingohisterectomia terapêutica) para reversão do quadro (Figura 10).

    17 4.0 MATERIAL E MÉTODOS O material foi coletado de uma cadela da raça poodle, com

    Figura 10: Útero da cadela poodle durante a OSH. Fonte: Arquivo próprio

    Após a retirada do útero foi armazenado e refrigerado, depois retirado para ser feito a coleta por meio de swabs estéreis, foi aberto o útero e retirado direto da secreção interna,

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    imediatamente após a coleta o swab foi acondicionado individualmente no tubo contendo meio de transporte (Stuart) para logo após serem semeados. Para que a bactéria fosse conservada até o dia da semeadura, foi feita a inoculação do swab com amostra no meio BHI caldo para ser incubado a 37º C, durante 48 horas garantindo que houve o crescimento de microorganismos. Um swab foi colocado em local aerobiose (com presença de oxigênio) e o outro em local anaerobiose (sem oxigênio). O processo para anaerobiose foi feito através do anaerobac (gerador de atmosfera com teor reduzido de oxigênio), colocando o swab em um recipiente juntamente com o anaerobac, em seguida foram distribuídos lentamente 20 ml de água sobre toda a superfície absorvente do anaerobac com o auxílio de uma pipeta; o recipiente foi lacrado e levado à estufa. Após as 48 horas as amostras foram retiradas do recipiente para realizar a semeadura por esgotamento, se acordo com o procedimento padrão (Figura 11).

    18 imediatamente após a coleta o swab foi acondicionado individualmente no tubo contendo meio de transporte

    Figura 11: Técnica de semeadura por esgotamento Fonte: JUNIOR, 2014

    A semeadura foi realizada nas placas de cultura: Ágar Sangue e Ágar MacConkey. Duas placas foram para aerobiose e duas para anaerobiose, por 48 horas. Posterior a isso as placas foram retiradas da estufa e deixadas na geladeira para conservação. Passados dois dias as placas foram re-semeadas para obter um melhor isolamentos das colônias, onde metade das placas foram para anaerobiose e a outra para aerobiose. No dia posterior obteve-se o crescimento bacteriano, e as amostras foram utilizadas para ser feito o fixamento das bactérias nas lâminas e serem coradas. O processo de coloração inicia adicionando o cristal violeta e escorrendo-o após um minuto, em seguida foi

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    adicionado o lugol (fixador) e desprezado após um minuto, para a descoloração foi usado o álcool absoluto e em seguida lavado com água corrente. Por último adicionou-se a fucsina, deixando-a por dez segundos e lavando com água. Após secas, as lâminas foram visualizadas no microscópio óptico, contatando-se bacilos gram-positivos. A bactéria que desejava ser isolada (E. colli) é gram-negativa, sendo assim foram descartadas as culturas utilizadas para o processo de gram (Ágar Sangue). A cultura de meio Ágar MacConkey foi utilizada para recolher uma amostra da mesma e refazer a semeadura de colônias semelhantes para se obter o resultado esperado, sendo deixado novamente em BHI caldo. Na aula prática foram realizados três procedimentos, o primeiro é a fita de oxidase que determina se a bactéria contém essa enzima ou não, se o resultado for positivo a fita ficará roxa. O segundo procedimento feito foi a catalase, onde retirou-se com a pipeta uma quantidade da amostra de caldo BHI e colocou-se na lâmina, em seguida adicionou-se uma gota de peróxido de hidrogênio que nesse caso iria formar bolhas se fossem gram- negativas. O último procedimento feito foi o Bactray, que é dividido em I-II e III. Iniciou-se o processo adicionando 1,0 ml da amostra bacteriana no Bactray de forma homogênea, inclinou-se para trás o conjunto, num ângulo de aproximadamente 45° para a esquerda e em seguida para a direita, por fim apoiou-se o tray na mesa e inclinou-se para frente para obter uma perfeita distribuição do inóculo em todos os substratos. O procedimento foi realizado em quatro tray, sendo encaminhados dois para anaerobiose e dois para aerobiose. O procedimento de antibiograma se iniciou com a coleta de amostra do conteúdo bacteriológico, que foi adicionado a solução salina estéril (NaCl 0,85%) até se obter turvação compatível com a suspenção desejada. Como meio de cultura foi utilizado Agar Mueller Hinton, método não seletivo que é compatível e indicado para o processo. Utilizando-se o bico de Bunsen para se formar um ambiente estéril ao redor da chama foram coletados 100 µl da suspenção de bactérias utilizando-se o micropipetador, e adicionado ao meio de cultura. Com o auxílio de um swab estéril procedeu-se a homogeneização da amostra pela placa, e em disposição de estrela foram colocados os discos embebidos em antibióticos utilizando pinça para sua devida fixação. Os antibióticos testados foram: Amoxacilina + clavunalato; Cefalexina; Sulfametoxazol + Trimetoprim; Ciprofloxacina; Enrofloxacin. A placa permaneceu em incubação na estufa a 36 °C, por 24 horas para que se pudesse evidenciar a formação de alos ao redor dos monodiscos, base da avaliação do antibiograma.

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    5.0 RESULTADO E DISCUSSÃO

    Obtivemos os seguintes resultados: na oxidase obteve-se uma coloração lilás; na catalase o resultado foi negativo (sem presença de bolhas). O término do procedimento com o Bactray é realizado através da observação da coloração de cada inóculo e um comparativo com a tabela fixa (uma para o teste I-II e outra para o teste III) dos resultados das cores (Tabela 1 e 2). O resultado pode ser negativo e positivo para cada um, sendo que o cálculo final para determinar a bactéria é feito virtualmente através do site do Bactray.

    20 5.0 RESULTADO E DISCUSSÃO Obtivemos os seguintes resultados: na oxidase obteve-se uma coloração lilás; na

    Tabela 1: Tabela de fundamentos das provas do Bactray para amostras I-II Fonte: Bactray, 2014

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    21 Tabela 2: Tabela de fundamentos das provas do Bactray para amostras III Fonte: Bactray, 2014

    Tabela 2: Tabela de fundamentos das provas do Bactray para amostras III Fonte: Bactray, 2014

    Após os cálculos finais, a bactéria esperada (E. colli) não foi a isolada, o resultado que procedeu-se foi o da Acinetobacter baumannii. Como via didática escolheu-se o antibiograma com amostra de Escherichia coli, e os resultado são demonstrados na tabela 3 e figura 12.

    Antibiótico

    Classificação

    Amoxicilina +

     

    clavulanato

    Sensível

    Cefalexina

    Sensível

    Sulfametoxazol

     

    + Trimetoprim

    Sensível

    Ciprofloxacina

    Sensível

    Enrofloxacin

    Sensível

    Tabela 3: Tabela com os resultados do antibiograma Fonte: Arquivo próprio

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    22 Figura 12 Formação de alos pelos antibióticos. Fonte: Arquivo próprio É possível concordar com Hirsh

    Figura 12 Formação de alos pelos antibióticos. Fonte: Arquivo próprio

    É possível concordar com Hirsh (2003) quanto ao fato de que a utilização de meios de cultura seletivos e multiplicadores são o melhor caminho pra se conseguir identificar uma infecção bacteriana através de amostra, e por meio dos sinais de proliferação restringir o número de possíveis agentes etiológicos. Os sinais clínicos foram compatíveis com as afirmações de Evangelista (2009), Lima (2009) e Chen (2014), e isso se deve ao comportamento previsível das infecções bacterianas no trato reprodutivo de cadelas. Os resultados de exames clínicos também se mostraram bem próximos dos exemplos destes autores. As etapas de isolamento da bactéria causadora tiveram resultados pouco esperados, mas segundo Trabulsi (2005) podem ocorrer casos de infecção de culturas por Acinetobacter baumannii, pois isso pode ocorrer em ambientes hospitalares, como o local de coleta do material, ou por acidentes durante as etapas de processamento das culturas. Também pode se relacionar aos materiais deste autor a informação de que a bactéria mais comum em infecções do trato reprodutivo de cadelas ser Escherichia coli. Os fármacos antibióticos citados por Lima (2009) disponíveis para a prática se mostraram efetivos no controle da bactéria, formando alos descritos pelo autor. Confirmando os estudos de Wannmacher (2014), pode-se dizer que o isolamento de Acinetobacter baumannii exemplifica bem a utilidade de se combater o uso de antibióticos de forma descuidada, pois foi esta prática que criou a resistência destas bactérias. No momento não são relatados casos de infecções por ete agente em casos de piometra, mas o uso indiscriminado de fármacos deve ser abolido para evitar transtornos futuros, como dito por Spinosa, Gorniak e Bernardi (2011).

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    6.0 CONCLUSÃO

    A abordagem de caso clínico se mostrou a forma mais prática de se integrar os conhecimentos teóricos e a metodologia prática. A revisão revelou que o complexo de fatores que levam a piometra é comum, e por isso deve ser estudado para uma melhor abordagem na rotina veterinária. Os testes de antibiograma revelaram como estudos laboratoriais são extremamente úteis, uma vez que por meio deste exemplo pode se escolher o fármaco baseando-se no efeito em pequena escala na placa de cultivo. A resistência bacteriana se mostrou evidente na metodologia deste caso, uma vez que a contaminação por Acinetobacter baumannii se deve ao efeito de seleção ao qual esta foi submetida, criando exemplares presentes em ambientes hospitalares e laboratoriais. Os conhecimentos adquiridos e assimilados por este projeto serão de grande ajuda no futuro acadêmico e profissional, devido a importância e relativa frequência de casos de infecção piometrosa em cadelas.

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