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INSTITUTO DE BIOLOGIA
DEPARTAMENTO DE CINCIAS FISIOLGICAS
Curso Prtico
Professores Idealizadores:
Adriana Rayol Pedrenho
Svio Amado da Silva
Generoso Manoel Chagas
Humberto Macharetti
Consideraes importantes:
a) Antes das aulas prticas importante que o aluno esteja de posse do
procedimento prtico que ser elaborado.
b) indispensvel o uso de jaleco no laboratrio. De preferncia para que
o avental seja de algodo.
c) Quando necessrio, prenda os cabelos.
d) No coloque sua bolsa sobre a bancada de prtica, existe uma estante
para este fim.
e) No permitido fumar no laboratrio.
f) No procure sentir o odor dos reagentes utilizados nas prticas.
g) Ao aquecer um tubo de ensaio verifique se no haver a possibilidade
do lquido espirrar na direo de seu rosto ao ferver.
h) Comunique imediatamente ao professor qualquer acidente. E tenha
calma.
i) Faa silncio.
PROCEDIMENTO PRTICO
Testes para a caracterizao da mucina
Fundamento: A mucina o maior componente protico da saliva. Dessa forma, a
positividade de testes para protena indicar a presena de mucina. Para evidenci-la
vamos utilizar duas reaes, a reao da ninidrina e a reao xantoproteica. A reao da
ninidrina positiva para aminocidos e seus compostos e d como produto uma colorao
azul/violeta. A reao xantoproteica positiva para aminocidos aromticos (especialmente
tirosina) e d como produto uma cor amarela que se intensifica por alcalinizao.
Reao da ninidrina tomar em um tubo de ensaio 1 mL de saliva previamente filtrada e 1
mL de soluo aquosa de ninidrina 0,1%. Aquecer em banho-maria fervente por cerca de
10 minutos. O desenvolvimento de cor azul/violeta indica a positividade da reao.
Reao xantoproteica tomar em tubo de ensaio 1 mL de saliva filtrada, adicionar 1 gota
de HNO3 e trs gotas de H2SO4 concentrado. A reao positiva se revela pelo
desenvolvimento de cor amarela resultante da nitrao dos aminocidos aromticos.
Resfriar e adicionar NaOH concentrado suficiente para promover alcalinizao. A cor se
intensifica.
2
Caracterizao do cloreto
O cloreto pode ser identificado pela reao com o nitrato de prata, em meio cido,
dando cloreto de prata que forma um precipitado branco:
+
H
Cl + AgNO3
AgCl + NO3
3SCN + FeCl3
( SCN ) 3 Fe + 3Cl
Como o cloreto frrico corado em amarelo, nos casos de haver pouco sulfocianeto
na saliva, o mais freqente, s poderemos identific-lo fazendo a reao do branco com
gua em lugar da saliva.
Tomar em tubo de ensaio 1 mL de saliva filtrada, 5 gotas de cido clordrico e 5
gotas de cloreto frrico 5%. A reao positiva se revela pelo aparecimento de cor vermelha
(laranja).
Caracterizao do nitrito
O nitrito encontrado na saliva resulta da detoxicao heptica de nitrato proveniente
naturalmente de alimentos como o espinafre ou adicionado como conservante a alimentos
de origem animal. Sua presena pode ser identificada por sua reao com o iodeto de
potssio que ocorre com liberao de iodo.
Colocar em tubo de ensaio 1 mL de saliva filtrada, duas gotas de cido sulfrico
diludo (10%) e duas gotas de iodeto de potssio (10%). Desprende-se iodo que pode ser
melhor observado pela adio de 1 mL de goma de amido 1% levando ao desenvolvimento
de cor azul.
amilases so maltose e a -D-glicose. Por outro lado, como estas enzimas no atuam nos
pontos de ramificao (ligaes -1,6) os produtos finais de hidrlise da amilopectina so
maltose, glicose e dextrinas ramificadas de baixo PM.
A caracterizao da atividade amiloltica pode ser obtida pela evidenciao de seus
produtos de hidrlise, as dextrinas. Observemos a seguinte sequncia:
AMILOSE
ERITRODEXTRINAS
ACRODEXTRINAS
MALTOSE
+ I2
+ I2
+ I2
+ I2
azul
vermelho
incolor
A sequncia descreve os produtos obtidos da reao da amilose com as amilases e
as cores que os mesmos do em presena do iodo. Dessa forma, se tomarmos uma
soluo de goma de amilo (amilose) e a ela adicionarmos iodo obteremos um produto azul.
Se permitirmos que a goma de amilo seja hidrolisada parcialmente pela amilase obteremos
a formao da eritrodextrina que, pela adio de iodo, fornece a cor vermelha. Com
hidrlise em maior grau obteremos acrodextrinas e maltose que no reagem com o iodo.
Material
Zero Um
Dois
Trs Quatro Cinco
Saliva Filtrada
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
Soluo Fisiolgica
2,9
2,9
2,9
2,9
2,9
2,9
TCA 5%
1,0
-----Goma de amido 0,1% 5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
NESTE INTERVALO MARCAR O TEMPO DE REAO
TCA 5%
-1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Lugol (gotas)
2
2
2
2
2
2
Para estipular o tempo, inicie com 30 segundos e provavelmente haver a necessidade de
encurtar esse tempo. Observe e anote os resultados.
Anotar os resultados
10
0,1-100 nm
Figura 2 - Esquema do Espectrofotmetro: A fonte de luz tem seu feixe focalizado pelo
colimador (C) sobre um prisma de quartzo. A luz decomposta em ultravioleta (UV), violeta
(VI), azul (AZ), verde (VE), amarelo (AM), laranja (LA), vermelho (VR) e infravermelho (IV).
Ume fenda seletora escolhe uma fina poro desse espectro como luz monocromtica (luz
MC). A luz MC passa atravs da cubeta que contm a soluo, e parte absorvida, parte
transmitida. Uma fotoclula acoplada a um galvanmetro mede a luz transmitida. A
diferena a luz absorvida. O galvanmetro tem uma escala especial de 0,0 a 2,00, que
indica leituras lineares (aritimeticamente proporcionais absoro da luz). As fontes de luz
para ultravioleta so geralmente lmpadas de Hidrognio, ou de Deutrio. Para o visvel e
infravermelho, lmpadas de tungstnio e irradiadores de cermica so usados. A
decomposio da luz feita, alm de primas, por grades de difrao. Um mtodo simples
de obter luz MC usar filtros, que so pedaos de vidro colorido especiais, que deixam
passar a luz da sua cor. A luz MC dos filtros de qualidade inferior dos primas e grades.
Existem duas razes para a utilizao da luz monocromtica:
1 Razo qualitativa: O nico modo de saber quais as cores (comprimentos de onda) que
so absorvidos, passar luz MC de vrios comprimentos de onda, uma de cada vez,
atravs da soluo teste (ver Figura 3). Na Figura abaixo est demonstrado que para se
medir a soluo teste usada deve-se usar a luz verde, pois foi a mais absorvida (90%) pela
amostra, e assim, proporcionar grande sensibilidade medida. A luz violeta e amarela so
so adequadas porque so pouco absorvidas.
12
I = I 0 e k .c.l
I = Intensidade da luz emergente
I0 = Intensidade da luz incidente
e = Base do sistema de logartimos neperianos (2,718228)
13
T
I
=
100 I 0
2. O uso do expoente de base e complicado. A melhor soluo utilizar a base 10.
Esta operao se constitui numa mudana da base do sistema de logaritmos que
pode ser obtida multiplicando-se o expoente p 0,4342.
T
= 10 a.c.l
100
O fato de a correlao entre concentrao e transmitncia ser expressa por uma
exponencial determina que a interpolao seja uma operao complicada porque
envolve o uso de logaritmos diretamente expresso como segue:
T
a .c .l
log
= log 10
100
log T 2 = a.c.l
2 log T = a.c.l
A nova funo, gerada na transformao: 2 logT recebe o nome de Absorvncia e
costuma ser representada pela letra A ou por Abs. Dessa forma a equao pode ser
reescrita como:
A = a.c.l
Ap = a.Cp.l
Ad = a.Cd .l
Ap Ad
=
Cp Cd
Objetivos:
1.Conceituar colorimetria e espectrofotometria.
2. Distinguir um fotolocormetro de um espectrofotmetro.
3. Dar o enunciado da lei de Lambert-Beer.
4. Discutir os requisitos bsicos para a execuo das tcnicas colorimtricas.
5. Conceituar: Ensaio em branco, ensaio padro e ensaio desconhecido.
6. Tendo conhecimento dos passos seguidos na execuo de um ensaio colorimtrico e da
concentrao do padro, calcular a concentrao do ensaio desconhecido.
PROCEDIMENTO PRTICO
Determinao do espectro de absoro de corantes e construo de curva padro
Material
Objetivos
Procedimento
A) Determinao do Espectro de Absoro:
1. Com a soluo de ABF varrer o espectro determinando as absorvncias nos
comprimentos de onda relacionados abaixo. Repetir a operao utilizando uma soluo
de ABF diluda duas vezes. Utilizar gua como Branco, calibrando o aparelho em cada
.
(nm)
AbsABF
AbsABF/2
520
535
550
580
610
640
16
(nm)
AbsMO
AbsMO/2
415
445
460
490
520
535
415
445
460
490
520
535
550
580
610
640
TUBO
ABF
H2O
(ml)
(ml)
--
5,0
1,0
4,0
2,0
3,0
3,0
2,0
4,0
1,0
5,0
--
TUBO
MO
H2O
(ml)
(ml)
--
5,0
1,0
4,0
2,0
3,0
3,0
2,0
4,0
1,0
5,0
--
Abs
Concentrao
Abs
Concentrao
17
CONH 2
NH
CONH 2
Quando o biureto tratado com uma soluo alcalina de tartarato de potssio e
cobre, forma-se um complexo de cor violeta no qual os ons Cu2+ esto envolvidos por
molculas de biureto. Como as molculas das protenas contm essas ligaes, elas
reagem com Cu2+ para dar cor violeta. A quantidade desta cor diretamente proporcional
concentrao das protenas.
Quando as amostras so turvas ou muito coradas, como acontece nos soros
ictricos, deve-se incluir um branco de soro para compensar a turvao ou a cor amarela.
Os mtodos para dosagem das protenas devem ser executados em soro e no em
plasma, uma vez que o fibrinognio existente no plasma, uma vez que o fibrinognio uma
protena e constitu uma interferncia quando se dosam as protenas do soro. O soro
hemolisado d resultados pouco exatos e por isso no deve ser usado.
Pode-se empregar o mtodo do biureto para determinar a concentrao das
protenas na maior parte dos lquidos biolgicos, mas no diretamente aplicvel urina
nem ao lquido cefalorraquidiano. Embora geralmente se encontrem nesses lquidos os
mesmos tipos de protenas que existem no soro, a concentrao total de protenas muito
mais baixa, tornando difcil uma anlise exata. Este fato particularmente importante no
caso do LCR em que a quantidade de lquido disponvel para o exame habitualmente
muito pequena. A dosagem de protenas na urina ainda mais difcil, devido presena de
grandes quantidades de substncias interferentes, especialmente ons inorgnicos, que
precipitam quando se junta uma base.
Por estas razes, os mtodos usados de rotina para a determinao de protenas
totais no LCR e na urina so um pouco diferentes dos que se utilizam para soro, embora
haja algumas coincidncias. Os mtodos turbidimtrico e de Folin so largamente utilizados
para determinar as protenas no LCR, enquanto que para a urina usam os mtodos
turbidimtrico e de fixao a corantes.
A confeco da curva padro exige que inicialmente a concentrao de protenas no
soro seja ajustada para a faixa de sensibilidade do mtodo. Sabemos que a concentrao
total de protenas no soro de mamferos est em torno de 10g/dL, o que excede muito a
sensibilidade do mtodo. Por esse motivo, o primeiro tempo do trabalho se constitui em
18
uma diluio do soro de 1:10 na qual ajustamos a concentrao de protenas para a faixa
adequada.
No segundo tempo fazemos diluies variadas a partir do soro previamente diludo
1/10 para obter 4 padres e confeccionarmos um ensaio em branco. As leituras no
espectrofotmetro so feitas em 550 nm.
PROCEDIMENTO PRTICO
1. Diluio inicial do soro padro (1:10) tomar em tubo de ensaio 0,4 mL de soro (a
concentrao de protenas ser fornecida na aula) mais 3,6 mL de soluo salina
fisiolgica. Misturar bem.
2. Diluio do soro desconhecido (1:20) tomar em tubo de ensaio 0,1 mL do soro
desconhecido e 1,9 mL de soluo salina fisiolgica. Misturar bem.
3. Confeco da curva padro partindo do soro padro diludo, obtido na operao
anterior, proceder conforme a tabela abaixo:
Tubo
Salina
(mL)
B
P1
P2
P3
P4
D
1,0
0,8
0,6
0,4
---
Concentrao Reativo do
Soro padro
Soro
(g%)
Biureto
diludo (mL) desconhecido
diludo (mL)
(mL)
--4,0
0,2
-4,0
0,4
-4,0
0,6
-4,0
1,0
-4,0
-1,0
4,0
19
Salina
(mL)
Soro padro
diludo (mL)
Soro diludo
(mL)
B
Padro
Total
Albumina
1,0
----
-1,0
---
--1,0
--
Fracionamento Reativo do
(mL)
Biureto
(mL)
-4,0
-4,0
-4,0
1,0
4,0
20
Sexo
M
F
F
M/F
Albumina g/dL
3,20
3,44
2,96
3,95
3,4
2,6
3,36
3,32
Globulina g/dL
3,87
4,19
2,95
2,63
4,00
4,12
1,90
2,90
Rel A/G
0,83
0,82
1,00
1,50
0,85
0,63
1,70
1,20
21
B
Padro
Desconhecido
gua
destilada
(mL)
1,0
---
Reativo
cprico
(mL)
1,0
1,0
1,0
22
ABSdesconhecido
mg / dl
ABSpadro
OBS: A concentrao do padro multiplicada por 100 para converter de mg/mL para
mg/dL e por 20 para corrigir a diluio introduzida no ato de desproteinizao.
Animal
Humanos
Bovdeos Adultos
Caprinos
Ovinos
Sunos
Caninos
Gatos
Galinhas
23
tecidos com material nitrogenado, carrear no plasma sanguneo substncias que so pouco
solveis em gua e fazer a manuteno da presso osmtica do plasma sanguneo. As
globulinas dos grupos alfa e beta tambm so produzidas no fgado e funcionam como
carreadoras de lipdeos (lipoprotenas), glicdeos, metais, hormnios, protenas, etc. As
globulinas do grupo gama so sintetizadas no sistema imunolgico (linfcitos) e funcionam
como anticorpos.
PROCEDIMENTO PRTICO
1. O sistema da eletroforese
Para fazermos uma eletroforese necessitamos essencialmente de uma fonte de
corrente contnua, uma cuba, um sistema de cabos para interconectar as duas unidades,
uma soluo tampo de pH e concentrao convenientes e um suporte slido onde
aplicaremos a amostra. Adicionalmente, necessitaremos de um corante para podermos ver
o resultado da separao.
A fonte de corrente continua essencial porque necessitamos manter durante todo o
tempo da corrida uma corrente cujo sentido seja constante e cuja intensidade seja estvel.
A corrente que nos fornecida pela companhia de iluminao pblica alternada, muda de
sentido 60 vezes por segundo, alm de variar muito de intensidade. A fonte de eletroforese
, basicamente um retificador de corrente alternada, semelhante ao encontrado nos
carregadores de baterias de automveis, complementado por um circuito eletrnico que
assegura a estabilidade da intensidade e do potencial da corrente contnua fornecida.
2. Suporte
O suporte para a corrida um meio slido e poroso no qual embebemos o tampo
escolhido. Vrios suportes so usados na dependncia dos objetivos da corrida: papel de
filtro, acetato de celulose, goma de amilo, bloco de amilo, gel de poliacrilamida, etc. Na
presente prtica estaremos trabalhando com o acetato de celulose.
3. Tampo
O tampo escolhido para a presente corrida constitudo por uma mistura de TRIS
60,5 g/L, cido brico 4,6 g/L e EDTA 6,0 g/L, pH 9,0. Depois de pronto dever diludo ao
meio com gua destilada. Este tampo adequado para o fracionamento de protenas do
soro em suporte de acetato de celulose.
4. Condies da corrida
A corrida deve ser feita durante 60 minutos com a intensidade de 125 volts.
3. Colorao e lavagem
A colorao feita com o corante Poncaeu S, dissolvido em TCA (cido
tricloroactico) a 3% na concentrao final de 0,2 %. A funo do cido tricloroactico
fixar as protenas ao suporte (acetato de celulose) promovendo sua desnaturao. A
lavagem, feita com o objetivo de remover o excesso de corante do suporte, realizada com
cido actico 5%.
O perfil eletrofotrico - Chamamos de perfil eletrofortico o grfico que expressa o
resultado de uma corrida eletrofortica. Ele descreve as propores com que cada um dos
grupos de protenas participa no total. Cada soro tem o seu perfil eletrofortico normal e
perfis caractersticos de diversos tipos de enfermidades. O perfil eletrofortico um recurso
til no diagnstico de doenas como o mieloma que alteram a proporo entre os diversos
tipos de protenas do soro.
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2 - Identificao da glicose
Fundamento - A glicose um acar redutor. Se aquecermos um meio onde exista a
glicose na presena de um sal cprico ocorrer a reduo do ion cprico a cuproso que
precipitar na forma de xido de cor amarela. O teste feito com o reagente de Benedict
qualitativo que uma soluo de sulfato cprico em meio alcalino.
Tcnica - Colocar em tubo de ensaio 5 mL do reagente de Benedict qualitativo e 8 gotas de
urina. Misturar e levar a banho-maria fervente durante o tempo que for necessrio para a
urina entrar em ebulio.
Resultados
1 -O lquido permanece azul -negativo
2 -Colorao esverdeada -traos
3 -Verde sujo -0,50 a 0,75 g %
4 -Amerelo ou marrom -1 g %
5 -Vermelho ou tijolo -2 g % ou mais.
3 - Identificao dos corpos cetnicos
Fundamento - Os corpos cetnicos so formados a partir do metabolismo dos lipdeos
sendo os principais o cido acetilactico, o cido betahidroxibutirico (formas circulantes) e a
acetona (forma de excreo). No caso especfico da cetose dos ruminantes tambm pode
ocorrer o lcool isoproplico.
Essas substncias se formam normalmente em nosso metabolismo e representam formas
de circulao de reservas lipdicas no plasma sanguneo da mesma forma que a glicose
uma forma de circulao de reservas glicdicas. Normalmente a sua concentrao to
baixa que todos os corpos cetnicos filtrados so reabsorvidos nos tbulos renais. Quando,
em decorrncia de um distrbio metablico, ocorre sobrecarga o excesso eliminado na
urina.
Os corpos cetnicos presentes na urina (especialmente a acetona) podem ser
reconhecidos por uma reao de complexao com o nitroprussiato de sdio que produz
cor violeta intensa. No caso presente, estamos usando o reagente de Lange que uma
soluo de nitroprussiato de sdio em cido actico glacial.
Tcnica -Tomar em tubo de ensaio 1 mL de urina e 5 gotas do reagente de Lange. Misturar
bem. Deixar correr pela borda do tubo 1 a 1,5 mL de hidrxido de amnio concentrado. Na
interface aparece um anel de cor violeta.
4. Identificao do sangue
Fundamento - A evidenciao da presena de sangue (hemoglobina ou hemcias ntegras)
se faz pelo aproveitamento da propriedade catalsica do grupamento heme que o habilita a
decompor a gua oxigenada fornecendo gua e oxignio nascente:
heme
H 2 O2
H 2 O + O
27
28
pK'
3,3
3,5
4,0
5,0
7,1
7,8
9,7
Faixa de pH e Cores
vermelho
2,9 - 4,0 amarelo
vermelho
3,1 - 4,4 amarelo
amarelo
3,1 - 4,7 azul
vermelho
4,2 - 6,3 amarelo
amarelo
6,1 - 7,7 azul
amarelo
7,0 - 8,6 vermelho
incolor
8,2 - 10,0 vermelho
PROCEDIMENTO PRTICO
1) Colher quantidade suficiente de urina.
2) Em um becher, colocar 20 ml de urina.
3) Utilizar a fita indicadora universal de pH: Mergulhar rapidamente a fita na urina e
comparar com a escala de cores. Anotar o valor de pH encontrado.
4) Em outro becher, colocar 20 ml de gua destilada, e num terceiro, o mesmo volume de
uma soluo tampo com pH fisiolgico.
5) Adicionar nos bechers 2 a 3 gotas do corante indicador fenolftalena.
6) Adicionar a cada um dos bechers, 0,1 ml de NaOH 1N. Verificar a cor que cada soluo
apresentou aps este passo.
Que concluses podem ser tiradas destes resultados?
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Digesto do Leite
FUNDAMENTOS TERICOS
A casena uma fosfoprotena na qual o fosfato est esterificado hidroxila e um
resduo de serina. Por sua riqueza em aminocidos essenciais, possui elevado valor
biolgico. a protena do crescimento animal.
Apresenta-se sob trs formas diferentes: -casena, -casena e -casena como
pesos moleculares que variam de 75.000 a 100.000. No seu conjunto as casenas
constituem 80% da protena do leite. Deste total, 60% so de -casena, 17% de -casena
e 2,4% de -casena.
A casena pode ser precipitada pela adio de cido actico at pH 4,7 que seu pI.
Essa precipitao facilmente obtida com leite desnatado. Alm disso a casena do leite
tambm pode ser precipitada por ao do labfermento ou renina.
A coagulao por auto acidificao tem como conseqncia da fermentao da
lactose por bactrias do gnero Lactobacillus, cujo produto final o cido lctico. Ao atingir
o ponto isoeltrico da casena por acidificao do meio como conseqncia do cido lctico
formado, ocorre a precipitao da mesma formando o cogulo, fenmeno que utilizado
para produzir leites fermentados do tipo do iogurte ou quefir.
Na mucosa gstrica dos animais jovens existe uma enzima proteoltica, o
labfermento ou renina, que age sobre a casena dependendo do Ca2+.
As micelas de casena so mantidas no leite pela ao estabilizante da k-pasena.
Esta quebrada por hidrlise pela renina, ativada pelo Ca2+, liberando um
glicomacropeptdeo de 52 a 58 resduos de aminocidos, o que faz com que perca sua
ao estabilizante e permita que a casena (, e ) se coagule na forma de paracaseinato
de clcio que insolvel.
A coagulao da casena do leite pelo labfermento a base da indstria do queijo,
se bem que atualmente proteases de origem basteriana esto sendo j utilizadas para
propsitos semelhantes.
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PROCEDIMENTO PRTICO
Identificao de:
1. Nitratos Em um tubo de ensaio, colocar 2 mL de leite, 2 mL de cido sulfrico
(D=1,825) e algumas gotas de formol a 10%.
Reao: Positiva anis azuis
Negativa cor inaltervel
2. Amido Colocar em um tubo de ensaio 10 mL de leite. Aquecer. Em seguida juntar
6 gotas do reativo de lugol.
Reao: Positiva flocos azuis
Negativa leve cor amarela uniforme (iodo)
3. Urina Pipetar 5 mL de leite e colocar num tubo de ensaio; juntar em seguida 5 mL
de cido clordrico, 5 mL de etanol e 0,5 mL de cido ntrico.
Reao: Positiva colorao rseo-violcea
4. Gelatina Colocar num frasco de Erlenmeyer 5 mL de leite e 5 mL de soluo de
nitrato de mercrio a 5%. Agitar. Adicionar 10 mL de gua destilada. Agitar. Deixar
32
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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Annino, J. S. e Giese, R. W. (1978) Qumica Clnica Princpios e Mtodos 4 Edio.
Editora Monole, SP.
Burtis, C. A. e Ashwood, E. R. (1998) Tietz Fundamentos de Qumica Clnica 4 Edio,
Editora Guanabara Koogan, RJ.
Nepomuceno, M. F. (1998) Bioqumica Experimental Roteiros Prticos Editora UNIMEP.
Santos Neto, A. L.C.; Vasconcellos, A.M H.; Valle, A. B. F.; Oliveira, M. L. C.; Panek, A. D.;
Ferreira Pinto, G.; Operti, M.S.; Chaloub, R.M. e Carvalho, V. L. A. C. (1988) Manual de
cursos prticos em bioqumica (5 Edio) Departamento de Bioqumica IQ UFRJ.
Villela, G.G.; Bacila, M. e Tastaldi (1973) Tcnicas e Experimentos de Bioqumica Editora
Guanabara Koogan, RJ.
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