Preparo das sementes de caf para avaliao da

viabilidade pelo teste de tetrazlio1

Preparation of coffee seeds to assess viability using the

tetrazolium test

Aline da Consolao Sampaio ClementeI; Maria Laene Moreira de

CarvalhoII; Renato Mendes GuimaresII; Walmes Marques ZevianiIII
Eng. Agr., Doutoranda do curso de Fitotecnia/Sementes, DAG/UFLA; C.P. 3037,
37200-000, Lavras, MG; alineagrolavras@gmail.com
II
Profs. Drs. Departamento de Agricultura, DAG/UFLA; Caixa Postal 3037, 37200000, Lavras, MG; E-mail: mlaenemc@dag.ufla.br; E-mail:renatomg@dag.ufla.br
III
Prof. Ms. Departamento de Estatstica, UFPR, Caixa Postal 19081, CEP: 81531990, Curitiba-PR, E-mail: walmes@ufpr.br
I

RESUMO
O teste de tetrazlio (TZ) uma alternativa para avaliao rpida da viabilidade de
sementes j adotada para a comercializao de sementes de caf. Um dos entraves
para a utilizao do teste a dificuldade na extrao do endocarpo que demanda
tempo e mo de obra especializada. A utilizao de hipoclorito de sdio
recomendada para extrao do endocarpo de sementes de caf para acelerar o
processo de germinao, no entanto essa metodologia ainda no foi testada na
realizao do teste de tetrazlio. Sementes de caf de quatro lotes de duas
cultivares foram submetidas a quatro metodologias para a realizao do teste:
extrao manual ou utilizao de hipoclorito de sdio (200 mL de NaClO a 5%) para
remoo do pergaminho e perodos de embebio das sementes em gua (36 e 48
horas) para a retirada dos embries. Os resultados de viabilidade pelo TZ foram
comparados com os de germinao das sementes com diferentes teores de gua. O
uso do NaClO na concentrao de 5% por 6 horas de embebio no eficiente
para a retirada do pergaminho e afeta negativamente os resultados do TZ em
semente de caf com teor de gua abaixo de 25%. O perodo de embebio de
sementes de caf em gua por 48 horas na fase de preparo, para a realizao do
TZ, facilita a extrao dos embries, no afetando os resultados do teste.
Termos para indexao: hipoclorito de sdio, Coffea arabica, embebio.

ABSTRACT

The tetrazolium test (TZ) is a rapid alternative for evaluating seed viability and has
been adopted for the commercialization of coffee seeds. One of the barriers to
using this test is the difficulty of extracting the parchment, which requires time and
specialized labor. The use of sodium hypochlorite has been recommended for
parchment extraction in coffee seeds but this method has not been tested for the
TZ. Coffee seeds of four lots of two varieties were submitted to four methods in the
test: manual extraction or use of sodium hypochlorite (200 mL 5% NaClO) to
remove the parchment and various periods for soaking seeds in water (36 to 48
hours), to remove the embryos. The results of the viability from the TZ were
compared with those from the germination of seeds with different moisture
contents. The use of 5% NaClO with 6 hours of soaking is not effective in removing
the parchment and adversely affects the results of the TZ in coffee seeds with a
moisture content below 25%. The imbibition period of coffee seeds in water for 48
hours in the preparation phase for the TZ, facilitates embryo extraction without
affecting the test results.
Index Terms: sodium hypochlorite, Coffea arabica, imbibitions.

INTRODUO
A importncia econmica do caf indiscutvel pelo fato de ser um dos mais
valiosos produtos primrios comercializados no mundo. O Brasil o maior produtor
mundial de caf, responsvel por 30% do mercado internacional, e o Estado de
Minas Gerais responde por 48,6% da produo nacional (CONAB, 2009). A
implantao da cultura do cafeeiro feita por mudas, o que requer a utilizao de
sementes de alta qualidade. No entanto, pelas caractersticas relacionadas
sensibilidade dessecao e lenta germinao, em torno de 30 dias, sob condies
ideais de laboratrio (Brasil, 2009), a avaliao da qualidade das sementes de lotes
comerciais dificultada.
Dentre os fatores relacionados com a germinao lenta e desuniforme das
sementes, podem ser citados: maturao dos frutos e os processos de ps-colheita,
como secagem e armazenamento (Pammenter e Berjak, 1999), a presena do
espermoderma, tambm conhecido como "pelcula prateada", devido conter
inibidores naturais (Pereira et al., 2002) e a presena do endocarpo ou
"pergaminho" que considerada a principal caracterstica responsvel pelo atraso
na germinao (Guimares et al., 1998).
A remoo do endocarpo uma alternativa usada para acelerar o processo de
germinao e, consequentemente, a avaliao da qualidade das sementes de caf
(Guimares, 1998). O endocarpo tambm conhecido como pergaminho, um
componente fibroso que representa de 28,7 a 38,8% da casca e composto
basicamente por 37% de celulose, 25% de hemicelulose e de 9,3 a 13,5% de
lignina em base seca (Figueiredo et al., 2008; Barcelos et al., 2002) e tais
componentes conferem ao pergaminho textura rgida e impermeabilidade ao tecido.
O procedimento de remoo de pergaminho na avaliao da qualidade trabalhoso
e demanda muita mo de obra. Uma alternativa recentemente recomendada a
utilizao do hipoclorito de sdio (NaClO), tcnica investigada por Meirelles et al.
(2007), Lima (2008) e Sofiatti et al. (2009) com resultados satisfatrios. O uso da
soluo de hipoclorito de sdio, na concentrao de 5,0% durante 6 horas, foi

eficiente na degradao do pergaminho, observado por Meirelles et al. (2007). J

Sofiatti et al. (2009) observaram efeito negativo do hipoclorito para sementes com
teor de gua abaixo de 23%, nos resultados do teste de germinao. Tambm Lima
(2008) observou que a imerso de sementes de caf com teor de gua de 12, 16 e
20% em soluo de hipoclorito nas concentraes 3, 4 e 5% foi eficiente na
remoo do pergaminho, acelerando a emergncia de plntulas, em condies de
viveiro.
Na indstria de celulose, o hipoclorito de sdio utilizado para degradar a lignina
(Hise, 1996). O cido hipocloroso (HOCl-), quando em contato com tecido orgnico
age como um solvente, liberando cloro que, combinado com as protenas do grupo
amina, formam as cloraminas e juntamente com os ons hipoclorito (OCl-) provocam
a degradao e hidrlise de aminocidos (Estrela et al., 2002). Devido a tais
caractersticas, o cido hipocloroso e os ons hipoclorito em contato com o
endosperma e embrio podem afetar a qualidade fisiolgica da semente.
A necessidade de remoo do pergaminho ocorre no s na realizao do teste de
germinao, mas tambm para outros testes como o teste de tetrazlio que vem
sendo recomendado para a anlise da viabilidade das sementes de caf de acordo
com a Portaria n 482, de 29 de novembro de 2001, do Instituto Mineiro de
Agropecurio-IMA (2000).
O teste de tetrazlio baseia-se na atividade das enzimas desidrogenases, que
reduzem o sal 2,3,5 trifenil cloreto de tetrazlio nos tecidos vivos da semente, pela
reao de ons de hidrognio que so transferidos para o referido sal (Delouche et
al., 1976). A reduo do sal ocorre apenas nas clulas vivas, resultando na
formao do trifenilformazam, composto vermelho e indifusvel que confere cor
vermelha ao tecido vivo do embrio.
Para realizao do teste de tetrazlio, alm da retirada do pergaminho, h
necessidade de extrao do embrio que s pode ser feita em sementes
umedecidas, j que o endosperma um tecido muito duro. De acordo com as
Regras para Anlise de Sementes (Brasil, 2009); Dias e Silva (1986), deve-se
embeber as sementes em gua por 18 horas, em seguida fazer um corte na regio
onde se encontra o embrio, retir-lo aderido ainda ao endosperma e embeber em
soluo de tetrazlio a 1% por mais 24 a 28 horas a 30 C. J Vieira et al. (1998)
relataram que o perodo de condicionamento das sementes varia em funo da
idade das mesmas, sendo indicado 18 a 24 horas para sementes recm-colhidas e
72 horas para sementes de safras anteriores, para que o embrio seja extrado
diretamente. Em funo das variaes das metodologias indicadas, a pesquisa foi
realizada com o objetivo de verificar o efeito do hipoclorito de sdio na retirada do
endocarpo e do tempo de embebio para a extrao do embrio de sementes de
caf, na realizao do teste de tetrazlio.

MATERIAL E MTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratrio Central de Sementes do Departamento
de Agricultura da Universidade Federal de Lavras (UFLA), Minas Gerais. Foram
utilizadas sementes de caf recm colhidas na regio de Lavras e Sul de Minas no
ano agrcola de 2006/2007, as quais apresentavam diferentes teores de gua e
qualidade fisiolgica. Foram utilizados 4 lotes das cultivares Mundo Novo 376-4 e
Topzio MG 1190, avaliadas quanto viabilidade pelo teste de tetrazlio e
germinao.

No intuito de reduzir o tempo de execuo do teste de tetrazlio, 4 metodologias

foram avaliadas: 2 mtodos para remoo dos pergaminhos e 2 perodos de
embebio das sementes para retirada dos embries. A remoo do pergaminho foi
efetuada pela embebio de 400 sementes em soluo de 200 mL de hipoclorito de
sdio (NaClO) a 5% por 6 horas temperatura de 25 C (Meireles et al. 2007). Este
mtodo de remoo foi comparado ao mtodo convencional, em que o pergaminho
foi retirado manualmente. Para a extrao dos embries, as sementes foram
embebidas diretamente em gua pelos perodos de 36 e 48 horas, temperatura
de 30 C.
Teste de tetrazlio: foram utilizadas quatro repeties de 50 sementes para cada
tratamento; aps os perodos de embebio (36 e 48 horas), os embries foram
extrados e mantidos em soluo do antioxidante polivinilpirrolidona (PVP), desde o
momento da sua extrao dos endospermas at serem colocados na soluo de
tetrazlio. Ao trmino da extrao dos embries, estes foram lavados em gua
corrente com auxlio de uma peneira e embebidos em soluo de tetrazlio 0,5%
utilizando-se frascos escuros e submetidos temperatura de 30 C por 2 horas. A
anlise da viabilidade dos embries foi realizada com auxilio de uma lupa
estereoscpica com aumento de 10 vezes para melhor visualizao das estruturas
internas e externas dos mesmos. Para isso, foi realizado um corte longitudinal ao
meio dos embries, os quais foram classificados em viveis e inviveis de acordo
com a localizao e extenso dos danos.
Teste de Germinao: foram utilizadas quatro repeties de 50 sementes sem
pergaminhos (extrados manualmente) para cada tratamento. A semeadura foi
realizada em papel toalha tipo "germitest" (rolos de papel), umedecidos com gua
destilada na quantidade de duas vezes e meia a massa do papel seco, e colocadas
para germinar a 30 C, na presena de luz. A contagem final foi realizada no
trigsimo dia aps a semeadura, computando-se as plntulas normais em cada
repetio, conforme os critrios estabelecidos pelas Regras para Anlise de
Sementes (Brasil, 2009).
Determinao do grau de umidade: realizada pelo mtodo da estufa 105 C
durante 24 horas, utilizando 2 repeties para cada amostra conforme prescries
das Regras para Anlise de Sementes (Brasil, 2009). Os resultados foram expressos
em percentagem mdia por amostra.
Procedimentos estatsticos: o delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4 x 2 x 2 (quatro lotes, duas
metodologias de extrao do pergaminho e dois tempos de embebio), para cada
cultivar isoladamente. Foi realizada a anlise de varincia dos dados e a
comparao das mdias foi feita pelo teste de Scott-Knott, a 5% de probabilidade
(caractersticas qualitativas) por meio do programa estatstico SISVAR (Ferreira,
2000). As anlises estatsticas para a comparao entre os resultados do teste de
germinao e do teste de tetrazlio foram realizadas considerando distribuio
binomial (com funo de ligao cannica ou logstica). A avaliao da diferena
entre as metodologias e o efeito do tempo foi realizada por meio de contrastes e
por reduo na deviance residual do ajuste sequencial de modelos. O procedimento
foi desenvolvido no software R (R Development Core Team, 2008).

RESULTADOS E DISCUSSO
Os efeitos do hipoclorito de sdio, utilizado para extrao do pergaminho de
sementes de caf, sobre a viabilidade avaliada pelo teste de tetrazlio variou em

funo dos lotes. Na Tabela 1 verificam-se valores inferiores de viabilidade das

sementes quando se utilizou a soluo de hipoclorito de sdio para a retirada do
pergaminho, para a maioria dos lotes das duas cultivares estudadas. Apenas o lote
3 da cultivar Mundo Novo 376-4 e o lote 4 da cultivar Topzio MG 1190 no foram
afetados negativamente pelo uso do hipoclorito de sdio para a extrao do
pergaminho. Vale ressaltar que, para estes lotes, o grau de umidade das sementes
era superior a 26,5%.
De acordo com Sofiatti et al. (2009), a soluo de hipoclorito de sdio eficiente na
degradao e remoo de pergaminho em sementes de caf quando estas
apresentam grau de umidade acima de 23%. Assim, provavelmente as sementes
dos lotes com maiores graus de umidade no foram afetadas pelo cloro ativo devido
quantidade de gua presente na semente, o que diminuiu a absoro dessa
substncia, minimizando os efeitos negativos na viabilidade dos embries. O
mesmo autor considerou que, quanto menor o grau de umidade inicial das
sementes, maior a absoro da soluo de hipoclorito, o que ocasiona a
degradao das membranas, menor seletividade, maior susceptibilidade entrada
de solutos e absoro mais rpida, causando a perda de viabilidade dessas
sementes. Sofiatti et al. (2009) ainda sugeriram que a reao do hipoclorito de
sdio pode ter ocasionado aumento na temperatura da soluo de pr-embebio,
favorecendo o aumento da absoro da soluo. Bewley e Black (1982) afirmaram
que a exposio de sementes ao hipoclorito de sdio por longos perodos pode
provocar danos ao embrio.
Na presente pesquisa, as sementes de caf ficaram expostas por 6 horas soluo,
o que pode ter provocado uma maior absoro de substncias prejudiciais ao
embrio, efeito constatado nos embries que apresentavam maior descolorao na
radcula.
Alm do efeito negativo do hipoclorito de sdio na retirada do pergaminho de
sementes com grau de umidade inferior a 25%, vale ressaltar que no presente
trabalho, a soluo de hipoclorito de sdio utilizada no foi eficiente para a
completa degradao do pergaminho, necessitando a retirada manual
complementar dos pergaminhos remanescentes da maioria das sementes.
Pelos resultados do teste de tetrazlio referentes ao tempo de condicionamento
(Tabela 2), pode-se observar que os dados de viabilidade das sementes prcondicionadas no tempo de 48 horas foi superior para a maioria dos lotes das duas
cultivares, com exceo do lote 4 da cultivar Topzio MG 1190. A porcentagem de
viabilidade das sementes pelo teste de tetrazlio, quando submetidas ao perodo de
48 horas de embebio, foi igual ou superior quelas embebidas por 36 horas.
Observa-se, tambm, que os resultados de viabilidade parecem no ser
influenciados pelo teor de gua ou qualidade inicial das sementes. De acordo com
Dias e Silva (1986), o recomendado a embebio das sementes por 18 a 24 horas
a 30 C, porm a anlise de resultados de pr-testes permite inferir que o tempo
indicado insuficiente para amolecer as sementes, o que dificulta a extrao dos
embries. Vieira et al. (1998) relatou que sementes de caf, devem ser embebidas
em gua por um perodo maior, para que acontea a ativao suficiente do sistema
enzimtico, o que melhora e torna o processo de colorao mais rpido, sendo
indicados perodos de pr-condicionamento de at 72 horas. Alm disto, maior
perodo de embebio facilita a exciso dos embries. No presente trabalho
tambm foi observado melhor desempenho das sementes embebidas por um
perodo maior (48 horas), alm de facilidade na extrao do embrio pelo
amolecimento do endosperma da semente.

As mdias das porcentagens de germinao das duas cultivares esto apresentadas

na Tabela 3. Observa-se que os lotes apresentam diferentes nveis de qualidade e
esto dentro dos padres mnimos de germinao (70%) exigidos para a
comercializao de sementes de caf, de acordo a Portaria n 388 IMA (2000).

Os resultados das quatro metodologias utilizadas na realizao do teste de

tetrazlio foram comparados com os dados do teste de germinao considerando
um modelo binomial. Na Tabela 4 esto apresentados apenas valores mdios das
cultivares submetidas ao teste de germinao e s quatro metodologias de
tetrazlio, uma vez que o comportamento das cultivares em relao s
metodologias no diferiram entre si. A comparao se d entre a germinao e
cada metodologia do teste de tetrazlio.

 possvel observar que as mdias de germinao das cultivares so semelhantes

aos resultados do teste de tetrazlio quando utilizado a extrao do pergaminho
com soluo de hipoclorito de sdio e com 36 e 48 horas de embebio, diferindo
das demais metodologias.
O teste de tetrazlio realizado sob condies mais favorveis de ambiente do que
as proporcionadas para o teste de germinao, alm de ser realizado em menor
perodo de tempo, o que atenua a ao de possveis fatores adversos, como
exemplo microrganismos, no permitindo que esses fatores interfiram na avaliao
dos embries, e segundo Frana Neto et al. (1998) e Krzyzanowski et al. (1999)
so aceitveis diferenas de at 5% entre o teste de viabilidade e de germinao.
Apesar dos resultados do teste de tetrazlio com uso de hipoclorito de sdio se
assemelharem mais com os do teste de germinao, um maior potencial de
viabilidade foi observado com a extrao manual do pergaminho. Dessa forma,
pde ser observada a interferncia negativa do uso de hipoclorito de sdio na
realizao do teste de tetrazlio.

CONCLUSES
O uso do hipoclorito de sdio na concentrao de 5% por 6 horas de embebio
afeta negativamente os resultados do teste de tetrazlio em semente de caf com
grau de umidade abaixo de 25%.
O perodo de embebio de sementes de caf por 48 horas na fase de preparo, para
a realizao do teste de tetrazlio, facilita a extrao dos embries, no afetando os
resultados do teste.

REFERNCIAS
BARCELOS, A.F.; PAIVA, P.C. de A.; PEREZ, J.R.O.; SANTOS, V.B.; CARDOSO, R.M.
Parmetros bromatolgicos da casca e polpa desidratada de caf (Coffea arabica L.)
armazenadas em diferentes perodos. Cincia e Agrotecnologia, v.26, n.4, p.780790. 2002.
[ Links ]
BEWLEY, J.D.; BLACK, M. Physiology and Biochemistry of Seeds in Relation to
Germination: Viability, Dormancy and Environmental Control. Berlin: SpringerVerlag, 1982. 375p.
[ Links ]
BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Regras para Anlise
de Sementes. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Secretaria de
Defesa Agropecuria. Braslia, DF: Mapa/ACS, 2009. 395p.
[ Links ]
COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO (CONAB). Segundo levantamento
de caf 2009: maio 2009. Disponvel em:
<http://www.conab.gov.br/conabweb/download/safra/2cafe_09.pdf>. Acesso em:
30 maio 2009.
[ Links ]
DELOUCHE, J.C.; STILL, T.W.; RASPET, M.; LIENHARD, M. O teste de tetrazlio
para viabilidade da semente. Braslia, DF: AGIPLAN, 1976. 103p.
[ Links ]

DIAS, M.C.L.L.; SILVA, W.R. Determinao da viabilidade de sementes de caf

atravs do teste de tetrazlio.Pesquisa Agropecuria Brasileira, v.21, n.11,
p.1139-1145. 1986.
[ Links ]
ESTRELA, C.; ESTRELA, C.R.A.; BARBIN, E.L.; SPAN, J.C.E.; MARCHESAN, M.A.;
PCORA, J.D. Mecanismo de ao do hipoclorito de sdio. Brazilian Dental
Journal, v.13, n.2, p.113-117. 2002.
[ Links ]
FERREIRA, D.F. Anlise estatstica por meio do SISVAR (Sistema para Anlise de
Varincia) para Windows verso 4.0. In: REUNIO ANUAL DA REGIO BRASILEIRA
DA SOCIEDADE INTERNACIONAL DE BIOMETRIA, 45., 2000, So Carlos. Anais...
So Carlos: UFSCar, 2000. p.255-258.
[ Links ]
FIGUEIREDO, M.P.; LOPES, I.O.; SOUSA, F.G.; MOREIRA, G.R.; SOUSA, L.F.; CRUZ,
P.G.; FERREIRA, J.Q.Parmetros cinticos da degradao ruminal da casca de caf
(Coffea arabica, L.) tratada com hidrxido de sdio (NaOH). Cincia Animal
Brasileira, v.9, n.1. 2008.
[ Links ]
FRANA NETO, J.B.; KRZYZANOWSKI, F.C.; COSTA, N.P. da. O teste de tetrazlio
em sementes de soja. Londrina: EMBRAPA-CNPSo, 1998. 72p. (EMBRAPA-CNPSo.
Documentos, 116).
[ Links ]
GUIMARES, R.J.; FRAGA, A.C.; MENDES, A.N.G.; CARVALHO, M.L.M.; PASQUAL,
M.; CARVALHO, G.R. Efeitos da citocinina, giberelina e remoo do endocarpo na
germinao de sementes de cafeeiro (Coffea arabica L.).Cincia e
Agrotecnologia, v.22, n.3, p.390-396, 1998.
[ Links ]
HISE, R. Chlorination. In: DENCE, C.W.; REEVE, D.W. Pulpe bleaching: principles
and practice. Atlanta: Tapi, 1996. cap.2, p.241-259.
[ Links ]
INSTITUTO MINEIRO DE AGROPECURIA (IMA). Normas e padres para a
produo de sementes bsicas e fiscalizadas de caf. Portaria n 388, de 22
de maio de 2000. Belo Horizonte, 2000. Disponvel em:
<http://imanet.ima.mg.gov.br/nova/legis/portarias.pdf/0388.pdf>. Acesso em: 10
mar. 2009.
[ Links ]
KRYZANOWSKI, F.C.; VIEIRA, R.D.; FRANA NETO, J.B. Vigor de sementes:
conceitos e testes. Londrina: ABRATES, 1999. 218p.
[ Links ]
LIMA, J.S. Efeito da reidratao do hipoclorito de sdio na germinao de
sementes e emergncia de plntulas de cafeeiro. 2008. 68f. Dissertao
(Mestrado em Fitotecnia)-Universidade Federal de Viosa, Viosa, 2008.
[ Links ]
MEIRELES, R.C.; ARAUJO, E.F.; REIS, M.S.; SEDIYAMA, C.S.; SAKIYAMA, N.S.;
REIS, L.S. Secaf: metodologia para acelerar a germinao das sementes de
caf. Revista Brasileira de Sementes, v.29, n.3, p.90-96, 2007.
[ Links ]
PAMMENTER, N.W.; BERJAK, P. A review of recalcitrant seed physiology in relation
to desiccation-tolerance mechanisms. Seed Science Research, v.9, p.13-37,
1999.
[ Links ]
PEREIRA, C.E.; PINHO, E.V.R.V.; OLIVEIRA, D.F.; KIKUTI, A.L.P. Determinao de
inibidores da germinao no espermoderma de sementes de caf (Coffea

arabica L.). Revista Brasileira de Sementes, v.24, n.1, p.306-311, 2002.

[ Links ]
R DEVELOPMENT CORE TEAM. R, A language and environment for statistical
computing. Vienna: R Foundation for Statistical Computing, 2008. Disponvel em:
<http://www.R-project.org>. Acesso em: 10 fev. 2009.
[ Links ]
SOFIATTI, V.; ARAUJO, E.F.; ARAUJO, R.F.; CARGNIN, A.; REIS, M.S.; SILVA,
L.V.B.D. Uso de hipoclorito de sdio para acelerar a emergncia das plntulas e o
desenvolvimento das mudas de cafeeiro. Bragantia, v.68, n.1, p.233-240, 2009.
[ Links ]
VIEIRA, M.G.G.C.; GUIMARES, R.M.; PINHO, E.V.R.; GUIMARES, R.J.; OLIVEIRA,
J.A. Testes rpidos para determinao da viabilidade e da incidncia de
danos mecnicos em sementes de cafeeiro. Lavras: UFLA, 1998. 34p. (Boletim
Agropecurio, 26).
[ Links ]