Versão Final - Tese - Biblioteca Impressão

MARIA CAROLINA MARTINS MUSSI
Parmetros salivares, proteoma e sade bucal na sndrome de Moebius
So Paulo
2015
MARIA CAROLINA MARTINS MUSSI
Parmetros salivares, proteoma e sade bucal na sndrome de Moebius
Verso Original
Tese apresentada Faculdade de Odontologia

da Universidade de So Paulo, para obter o
ttulo de Doutor, pelo Programa de PsGraduao em Odontologia.
rea
de
Concentrao:
Patologia
Estomatologia Bsica e Aplicada
Orientador: Profa. Dra Marina Helena Cury

Gallottini
So Paulo
2015
Catalogao da Publicao
Servio de Documentao Odontolgica
Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo
Mussi MCM. Estudo das alteraes salivares em pessoas com a sndrome de Moebius. Tese
apresentada Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo
de Doutor em Odontologia.
Aprovado em:
/2015
Banca Examinadora
Prof(a). Dr(a).______________________________________________________
Instituio:________________________Julgamento:______________________
Prof(a). Dr(a).______________________________________________________
Prof(a). Dr(a).______________________________________________________
Prof(a). Dr(a).______________________________________________________
Prof(a). Dr(a).______________________________________________________
Dedico esse trabalho aos meus pais, Csar e Neusa, minha irm Juliana, aos meus
familiares e aos amigos que me apoiaram durante a realizao deste trabalho e aos pacientes
que tanto me auxiliaram.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Csar e Neusa, pelo amor incondicional e por estarem sempre presentes,
tornando a distncia algo insignificante diante do amor que sinto por vocs. Todo caminho se
torna menos rduo quando sabemos que as pessoas que amamos esto conosco. Obrigada por
me ensinarem tudo que sei hoje e a me tornar a pessoa que sou. Amo muito vocs.
minha irm, Juliana, por todo apoio e companheirismo. Por me ensinar todos os dias
algo novo da maneira mais doce possvel. Obrigada por toda cumplicidade e por estar sempre
ao meu lado para enfrentarmos juntas as dolorosas questes da vida! Te amo
incondicionalmente e sei que sempre estaremos juntas. Ao meu cunhado e amigo, Bruno, que
se tornou em to pouco tempo mais que um amigo, um irmo.
Ao meu irmo Gabriel, por me tornar uma pessoa mais leve e alegre. Agradeo por
estar sempre presente, por me por fazer enxergar a vida com menos seriedade e me ajudar a dar
menor valor aos problemas. Mesmo longe voc continua sendo muito importante pra mim.
Amo voc.
Ao meu namorado Cris, por me apoiar de maneira to carinhosa sempre. Agradeo por
tornar tudo que passei mais leve e sereno. Saiba que voc tem me ensinado demais e tenho me
tornado uma pessoa melhor ao seu lado! Obrigada pelo ombro quando precisei chorar e pela
ajuda irrestrita, sempre me auxiliando a ver que algo bom espera por ns. Amo voc.
Aos meus tios, tias, primos, primas e avs por sempre estarem por perto mesmo
distantes. Em especial ao meu tio Roberto e minha tia Cristina, por sua imensa alegria e
companheirismo, Maiara por toda doura, ao Cau por toda alegria proporcionada e a minha
av, Nena, pelo carinho e cuidado. Amo muito todos vocs e sei me apoiaro sempre. Aos meus
tios, Paulo e Made, por estarem sempre torcendo por mim. Obrigado por estarem sempre
presentes e fornecerem tanto apoio e ajuda. Ao meu amigo Fbio, por todo apoio, incentivo e
compreenso. Algumas pessoas levamos para a vida toda e voc uma delas.
minha grande companheira inseparvel, Fer Pigatti, por ter me ajudado tanto na
realizao desse trabalho. Mais que isso, por ser minha parceira de angustias, sonhos e
frustaes. Agradeo por me levantar em todos os momentos em que me senti fraca e pequena
diante dos problemas. Sei que poderemos contar uma com a outra para sempre afinal 11 anos
no so 11 meses. E como Vinicius de Moraes menciona em uma de suas poesias: A gente
no faz amigos, reconhece-os. Agradeo a toda sua famlia, em especial ao Gabriel, que foi
to solicito e me ajudou demais com sua habilidade em Excel.
As minhas irms de time (Wallys Rugby) por todos os bons momentos passados juntas.
Pelo apoio e compreenso no final da tese, e por animarem minhas noites com risadas, msicas
e dancinhas.
A minha orientadora, Profa. Dra. Marina Gallottini, por todo o tempo e ateno
destinados a mim. Agradeo imensamente por toda confiana desde o incio e por me fazer
acreditar em mim mesma. Levo dessa convivncia uma imensa gratido e uma admirao
enorme por sua dedicao aos seus alunos, pacientes e pela pesquisa. Vejo em voc muitas
qualidades das quais almejo alcanar um dia.
A Prof. Dr. Walter Siqueira, por ter aberto as portas de seu laboratrio e ter me tratado
com imenso carinho e ateno. Mais de que um professor, conheci uma pessoa que admiro e
que se tornou um grande amigo. Agradeo demais por todas explicaes sobre bioqumica,
sobre as conversas, conselhos e por sempre me acalmar. Tive um dos melhores anos da minha
vida no Canad e grande parte se deve estrutura proporcionada por voc. Agradeo
imensamente tambm Michelle, ao Joseph e ao Thomas, por me receberem to bem e me
fazerem sentir em casa, mesmo estando a quilmetros do Brasil. Sou eternamente grata a vocs
e levo comigo timas lembranas. Sinto muita saudade das confraternizaes com vocs.
For all the Walter Siqueira's lab staff: Flavia, Tayebeh, David, Cindy, Yuliya, Cathy
and Raj, I thank you all for making the work environment so funny and pleasant. Thanks a lot
for the companionship and motivation. I deeply thank Heide to shelter myself so nicely and
treat me like a brazilian daughter. Thank you so much for the available suport and affection. I
miss you all. You guys live in my heart.
A todo pessoal do laboratrio do Prof. Dr. Walter Siqueira. Flavia, Tayebeh, David,
Cindy, Yuliya, Cathy e Raj, agradeo a todos por tornarem o ambiente de trabalho to
divertido e prazeroso. Obrigada pelo companheirismo e estmulo. Agradeo imensamente a
Heide por me acolher to bem e me tratar como uma filha brasileira. Muito obrigado pelo
auxlio disponibilizado e pelo carinho. Sinto muito falta de todos. Vocs moram no meu
corao.
Atravs de palavras se torna praticamente impossvel agradecer ao Eduardo Moffa e
Marcia Tanaka. Obrigada por me receberem to bem e serem essenciais para a minha
adaptao. Vocs foram parceiros de passeios, de momentos de tristeza e, principalmente, de
muita risada e companheirismo. Com vocs ri, chorei, briguei, mas mais importante, vivi
momentos que guardarei para sempre no meu corao. Obrigada ainda por todo suporte e por
sanar minhas dvidas em relao a tese, vocs foram essenciais. Sei que ainda nos encontramos
muitas vezes.
Aos professores da disciplina de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da
Universidade de So Paulo, Profa. Dra. Suzana Cantanhede Orsini Machado de Sousa,
Prof. Dr. Fbio Daumas Nunes, Prof. Dr. Dcio dos Santos Pinto Jnior, Profa. Dra.
Marilia Trierveiler Martins, Profa. Dra. Andrea Mantesso Pobocik e Profa. Dra. Karem
Lopez Ortega pelos ensinamentos e ateno voltados aos alunos, contribuindo para nosso
engrandecimento.
Zilda, Nia, Vinicius, Ftima e Nair por toda disponibilidade e ateno dirigidos a
todos, sem distino. Aos tcnicos do laboratrio de Patologia Bucal, Juvani, Adriana e Elisa
por toda eficincia e convvio.
Ao querido amigo, Bruno, pelos conselhos, pelo estimulo no final da tese, pelo carinho
e por me fazer rir quando queria chorar. Agradeo Karin, por sempre me ajudar e facilitar
tudo que estava ao seu alcance. Obrigada por ser to solicita e uma amiga que tenho imenso
carinho e admirao. Agradeo Gabrielle que me ajudou durante todas as etapas desse
trabalho e sempre se mostrou to interessada e disponvel. O curso deste caminho tornou-se
muito mais leve por saber que podia contar com vocs.
Agradeo Priscila, minha grande amiga, pelos inmeros ensinamentos e por sempre
estar ao meu lado. J passamos muitas coisas que nos fizeram crescer e aprender juntas a lidar
com as adversidades. Os problemas se tornam menos intimidantes por saber que posso contar
com pessoas como voc. Voc sabe o quanto especial. Amo voc.
s funcionrias no Centro de Atendimento a Pacientes Especiais, Gilmara, Sandra,
Isabel, Marlene, Nia, Cristina, Jeane e Andressa pelo convvio to alegre e por toda ateno e
carinho destinados mim. Agradeo Talita por toda ajuda e disponibilidade durante a
realizao desse trabalho.
Aos demais colegas de Ps-Graduao da Faculdade de Odontologia da
Universidade de So Paulo pela convivncia e trocas de experincias nesses anos.
Aos pacientes que participaram da pesquisa. Vocs foram fundamentais, no apenas
pelas doaes de material, mas por me mostrar dia dia o quanto ainda tenho a evoluir. Espero,
do fundo corao, que os resultados aqui apresentados possam servir para um melhor
entendimento e aceitao dessa condio. Muito obrigada pela pacincia e disposio.
Que nada nos limite, que nada nos defina que nada nos sujeite.
Que a liberdade seja nossa prpria substncia,
j que viver ser livre.
Simone de Beauvoir
RESUMO
Mussi MCM. Parmetros salivares, proteoma e sade bucal na sndrome de Moebius [tese]. So
Paulo: Universidade de So Paulo, Faculdade de Odontologia; 2015. Verso Original.
A sndrome de Moebius (SM) uma diplegia congnita rara caracterizada por paralisia total
ou parcial do VI e VII nervos cranianos, que leva ausncia ou deficincia dos movimentos
dos msculos envolvidos na mmica facial e ao estrabismo convergente. As caractersticas
bucais descritas nesses indivduos incluem o palato ogival, micrognatia, malformao de
lngua, filtro curto, falta de coaptao de lbios, e maior incidncia de leses de crie. O objetivo
deste estudo foi avaliar as caractersticas salivares quantitativas e qualitativas, incluindo o
proteoma salivar, de indivduos com SM, associ-las com a sade bucal, e compar-las com as
caractersticas salivares de um grupo controle, no afetado pela SM. Foram includos 15
indivduos com SM e 15 controles. O comprometimento facial do individuos com a SM foi
avaliada e graduada em scores 0,1 ou 2, uni ou bilateral, para os nervos II, III, IV, V, VI, VII
e XI. Os pesquisadores determinaram o ndice de crie (ICDAS), de doena periodontal (PSR)
e de placa (Silness Le) nos dois grupos de estudo. Tambm realizaram coletas de saliva total
no estimulada, estimulada e parotdea bilateral, sendo o fluxo salivar estabelecido em ml/min.
A capacidade tampo foi avaliada na saliva total estimulada atravs da titulao de HCl 0,01N.
A atividade de -amilase nas amostrasmfoi medida atravs da produo de maltose. Para a
anlise protemica optou-se pela diviso das amostras de saliva de acordo com o fluxo em
ml/min. Desta forma, para cada grupo, estudo e controle, os 4 tipos de saliva (estimulada, no
estimulada, parotdea esquerda, parotdea direita) foram subdivididos de acordo com baixo
fluxo (abaixo da mdia do grupo) ou alto fluxo (acima da mdia do grupo), resultando em 16
subgrupos. O proteoma foi obtido por duas metodologias distintas, a primeira a partir da
cromatografia lquida tandem espectrometria de massas e a segunda que utilizou a tcnica de
eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE) associada
eletroforese em gel de poliacrilamida (native cationic). A ocorrncia das leses de crie foi
significativamente mais alta entre os participantes com SM (p>0,05) no corte 2, bem como a
ocorrncia de doena periodontal (p>0,05), quando comparado ao grupo controle. No houve
diferena no ndice de placa entre os grupos. A anlise protemica mostrou diminuio de
cistatinas B, S e SN nos indivduos com SM. No houve diferena no perfil proteico entre os
grupos de baixo e de alto fluxo salivar, para indivduos com SM e controle. Houve aumento na
quantidade de amilase salivar em e de histatina 1,3 e 5 em indivduos com SM. Conclumos que
indivduos com SM apresentam diminuio de fluxo salivar, de capacidade tampo e alteraes
proteicas que colocam esses indivduos em situao de maior risco para crie e para doena
periodontal.
Palavras-chave: Sndrome de Moebius. Paralisia Facial. Saliva. Protenas e Peptdeos Salivares.

Proteoma.
ABSTRACT
Mussi MCM. Salivary parameters, proteome and oral health in Moebios syndrome [thesis]. So
Paulo: Universidade de So Paulo, Faculdade de Odontologia; 2015. Verso Original.
The Moebius syndrome (MS) is a rare congenital diplegia characterized by total or partial palsy
of the VI and VII cranial nerves, leading to the absence or disability of the movements of facial
expression muscles and to convergent strabismus. The oral features described in these
individuals include high-arched palate, micrognathia, tongue malformation, short filter, lack of
lips coaptation, and higher incidence of caries lesions. The aim of this study was to evaluate the
quantitative and qualitative salivary characteristics, including the salivary proteome of
individuals with MS, associate them with the oral health, and compare them to the salivary
characteristics of a control group, unaffected by SM. We included 15 subjects with MS and 15
controls. The facial involvement of individuals with MS was evaluated and graded on scores 0,
1 or 2, uni or bilateral to the nerves II, III, IV, V, VI, VII and XI. The researchers established
the caries (ICDAS), periodontal disease (PSR) and plate (Silness Le) indexes in both groups.
We also performed unstimulated, stimulated and bilateral parotid saliva collections, and
salivary flow was calculated (ml / min). The buffer capacity was measured in stimulated saliva
by titration of 0.01N HCl. The -amylase activity was determined by maltose production. For
proteomic analysis it was decided to split the saliva samples in accordance with the flow in
ml/min. Thus, for each group, study and control, the 4 types of saliva (stimulated, unstimulated,
left parotid, right parotid) were subdivided according to low flow (below the group average) or
high flow (above average group), resulting in 16 subgroups. The proteome was obtained by two
different methodologies, the first was liquid chromatography tandem mass spectrometry and
the second one used the electrophoresis in polyacrylamide gel containing sodium dodecyl
sulfate (SDS-PAGE) associated with polyacrylamide gel electrophoresis (native cationic). The
occurrence of caries lesions, related to cut-off 2, as well as the occurrence of periodontal
disease, was significantly higher (p> 0.05) in participants with MS when compared to the
control group. There was no statistical difference in plaque index between groups. Proteomics
analysis showed decrease of cystatin B, S and SN in individuals with MS. There was no
difference in protein profile between the low and high salivary flow groups, for individuals with
MS and control. There was an increase in the amylase amount and histatin 1, 3 and 5 in
individuals with MS. We concluded that individuals with MS present decreased salivary flow,
decreased buffer capacity and protein alterations that place these individuals at increased risk
for caries and periodontal disease.
Keywords: Mobius Syndrome. Saliva. Salivary Proteins and Peptides. Proteome.
LISTA DE SMBOLOS
porcentagem
graus Celsius
>
maior
<
menor
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
SM
Sndrome de Moebius
HOXB 1
homeobox protein Hox-B1
Ca2+
on clcio
HCO3-
bicarbonato
K+
on potssio
Cl-1
on cloro
Na+
on sdio
H2CO3
cido carbnico
MUC 5B
mucina 5 B
kDa
kilodaltons
MUC 1
mucina 1
CAPE
Centro de Atendimento a Pacientes Especiais
FOUSP
Facudade de Odontologia da Universidade de So Paulo
PSR
Periodontal Screening and Recording
ICDAS
International Caries Detection and Assessment System
normal
SDS-PAGE dodecil-sulfato de sdio (SDS) de poliacrilamida (PAGE)

l
microlitro
molar
mM
Milimolar
microgramas
ml
mililitro
ml/min
mililitro por minuto
pH
potencial de hidrognio
kDa
kilodaltons
MALDI-MS Ionizao e dessoro a laser assistida por matriz associadas ao espectrmetro

de massas
DTT
Ditiotreitol
HPLC
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia
nvel de significncia
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 - Aspectos faciais de indivduos com SM ............................................................. 25
Figura 5.1 - Valores preditos para o Corte 1 do ICDAS segundo NE (ml/min) e Grupo, fixando
PE em 0,3 ml/min ............................................................................................... 65
Figura 5.2 - Valores preditos para o Corte 2 do ICDAS segundo NE (ml/min) e Grupo, fixando
PE em 0,3 ml/min ............................................................................................... 65
Figura 5.3 - Atividade da enzima amilase salivar (U/mg) para indivduos do grupo de SM e
controle (*P<0,05) .............................................................................................. 67
Figura 7.1
Diagrama de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em

cada grupo e suas interrelaes; G1- Saliva no estimulada de SM (fluxo acima);
G2- - Saliva no estimulada de SM (fluxo abaixo); G9- Saliva no estimulada dos
controles (fluxo acima), G10- Saliva no estimulada dos controles (fluxo abaixo).
............................................................................................................................ 75
Figura 7.2

cada grupo e suas interrelaes; G3- Saliva estimulada de SM (fluxo acima); G4Saliva estimulada de SM (fluxo abaixo); G11- Saliva estimulada dos controles
(fluxo acima), G12- Saliva estimulada dos controles (fluxo abaixo). ................ 76
Figura 7.3-

cada grupo e suas interrelaes; G5- Saliva parotdea direita de SM (fluxo acima);
G6- Saliva parotdea direita de SM (fluxo abaixo); G13- Saliva parotdea direita
dos controles (fluxo acima), G14- Saliva parotdea direita dos controles (fluxo
abaixo) ................................................................................................................ 77
Figura 7.4 - Diagrama de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em

cada grupo e suas interrelaes; G7- Saliva parotdea esquerda de SM (fluxo
acima); G8- Saliva parotdea esquerda de SM (fluxo abaixo); G15- Saliva
parotdea esquerda dos controles (fluxo acima), G16- Saliva parotdea esquerda
do grupo controle (fluxo abaixo) ........................................................................ 78
Figura 7.5 - Diagramas de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em

cada grupo e suas interrelaes ........................................................................... 79
Figura 7.6 - Bandas avaliadas atravs de SDS-PAGE para saliva no estimulada de indivduos
com SM (G1 e G2) e controles (G1 e G9). ......................................................... 82
Figura 7.7 - Bandas avaliadas atravs de SDS-PAGE para saliva estimulada de indivduos
com SM (G3 e G4) e controles (G11 e G12). ..................................................... 83
Figura 7.8 - Bandas avaliadas atravs de SDS-PAGE para saliva parotdea esquerda e direita
(acima da mdia de fluxo do grupo) de indivduos com SM (G5 e G7) e controles
(G13 e G15) ........................................................................................................ 84
Figura 7.9 - Bandas avaliadas atravs de SDS-PAGE para saliva parotdea esquerda e direita
(abaixo da mdia de fluxo do grupo) de indivduos com SM (G6 e G8) e controles
(G14 e G16).. ...................................................................................................... 85
Figura 7.10 - SDS-PAGE mostrando identificao das respectivas bandas submedidas ao nLCESI-MS/MS ........................................................................................................ 86
Figura 7.11 - Quantificao de histatina 1, 3 e 5 (em g) provenientes em 25 g de saliva

parotdea esquerda e direita acima da mdia de fluxo do grupo (G5, G13, G7,
G15) atravs da eletroforese em gel de poliacrilamida (native cationic). .......... 87
Figura 7.12 - - Quantificao de histatina 1, 3 e 5 (em g) provenientes em 25 g de saliva

parotdea esquerda e direita acima da mdia de fluxo do grupo (G6, G14, G8,
G16) atravs da eletroforese em gel de poliacrilamida (native cationic). .......... 87
Figura 7.13 - Teste de ELISA com anticorpo anti-amilase (1:1000). A chave mostra a
comparao realizada entre os grupos e * representa p<0,05. Grupos de indivduos
com SM (G1 e G8) e controle (G9 e G16) ......................................................... 88
LISTA DE TABELAS
Tabela 5.1 - Dados demogrficos dos participantes do estudo ............................................ 60
Tabela 5.2-Mdias do fluxo da saliva total no estimulada (NE), total estimulada (ES) e das
glndulas partidas direita (PD) e esquerda (PE), pH inicial, capacidade tampo
da saliva ES, e ndices de doena periodontal (PSR), placa e ICDAS de
indivduos do grupo Mebius e controle ............................................................. 62
Tabela 5.3 -Correlao entre achados clnicos como ndice de crie ICDAS (Cortes 1 a 5)
com aspectos salivares ...................................................................................... 64
Tabela 7.1 Comparao entre dois grupos onde foi determinado o total de protenas
quantificadas, a quantidade de protenas que apresentaram razo de abundncia.
Com base na razo entre os grupos foi determinada a quantidade de protena
mais abundante em cada grupo (<1,25 ou >0,75) ............................................. 80
Tabela 7.2 Comparao, em porcentagem, das bandas de saliva no estimulada. O primeiro
grupo de cada comparao (grupo em negrito) foi considerado como controle,
ou seja, 100%. Desse modo, valores considerados positivos significam que o
segundo grupo apresentou maior concentrao na banda analisada (B1 a
B13)................................................................................................................... 82
Tabela 7.3- Comparao, em porcentagem, das bandas de saliva estimulada. O primeiro
grupo de cada comparao (grupo em negrito) foi considerado como controle,
ou seja, 100%. Desse modo, valores considerados positivos significam que o
segundo grupo apresentou maior concentrao na banda analisada (B1 a
B14)................................................................................................................... 83
Tabela 7.4 -Comparao, em porcentagem, das bandas de saliva parotdea esquerda e direita
com fluxo acima da mdia do grupo. O primeiro grupo de cada comparao
(grupo em negrito) foi considerado como controle, ou seja, 100%. Desse modo,
valores considerados positivos significam que o segundo grupo apresentou
maior concentrao na banda analisada (B1 a B14) ......................................... 85
Tabela 7.5- Comparao, em porcentagem, das bandas de saliva parotdea esquerda e direita
com fluxo abaixo da mdia do grupo. O primeiro grupo de cada comparao
(grupo em negrito) foi considerado como controle, ou seja, 100%. Desse modo,
valores considerados positivos significam que o segundo grupo apresentou
maior concentrao na banda analisada (B1 a B14) ......................................... 86
Tabela 7.6- Quantidade de histatinas (Hst) 1,3 e 5 (g) na saliva partidea dos grupos de
Moebius e controle com fluxo salivar acima da mdia (G5, G13, G7 e G15).. 86
Tabela 7.7- Quantidade de histatinas (Hst) 1,3 e 5 (g) na saliva partidea dos grupos de
Moebius e controle com fluxo salivar acima da mdia (G6, G14, G8 e G16).. 86
SUMRIO
INTRODUO........................................................................................................... 21
REVISO DE LITERATURA .................................................................................. 22
2.1
Histrico da Sndrome de Moebius .......................................................................... 22
2.2
Critrios de diagnstico e diagnsticos diferenciais da SM .................................... 23
2.3
Achados orofaciais descritos na SM .......................................................................... 25
2.4
Etiopatogenia da SM .................................................................................................. 26
2.5
Saliva ............................................................................................................................ 28
2.5.1 Secreo salivar ............................................................................................................ 28

2.5.2 Inervao das glndulas ................................................................................................ 30
2.5.3 Propriedades e componentes da saliva ......................................................................... 32
2.5.4 Protenas salivares ........................................................................................................ 36
3
PROPOSIO ............................................................................................................ 43
MATERIAL E MTODOS ....................................................................................... 44
4.1
Avaliao clnica ......................................................................................................... 44
4.1.1 Higiene bucal ................................................................................................................ 45

4.1.2 Sade periodontal ......................................................................................................... 45
4.1.3 ndice de crie ............................................................................................................... 46
4.1.4 Avaliao das caractersticas faciais ............................................................................. 47
4.2
Anlise quantitativa e qualitativa da saliva.............................................................. 47
4.2.1 A coleta da saliva total no estimulada......................................................................... 48

4.2.2 A coleta da saliva total estimulada ............................................................................... 48
4.2.3 A coleta da saliva estimulada da partida..................................................................... 48
4.2.4 Fluxo salivar, pH e capacidade tampo ........................................................................ 49
4.2.5 Teste de atividade da amilase salivar............................................................................ 49
4.2.6 Anlise estatstica dos parmetros clnicos (crie, condio
periodontal, higiene) e salivares (fluxo salivar, capacidade tampo,
amilase e pH) do grupo controle e Moebius ................................................................. 50
4.2.7 Anlise protemica da saliva ........................................................................................ 51
4.2.7.1 Anlise protemica da saliva por cromatografia de massas........................................ 53
4.2.7.2 Anlise prote6omica da saliva por eletroforese em gel de

poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE)
associada eletroforese em gel de poliacrilamida (native cationic) ........................... 54
4.2.7.3 Ensaio imunoenzimtico (Elisa) ................................................................................... 55
5
Captulo 1: RESULTADOS ....................................................................................... 57
5.1
Avaliao da sade periodontal, ndice de crie e ndice de placa ......................... 58
5.2
Avaliao do comprometimento motor .................................................................... 61
5.3
Fluxo salivar, pH e capacidade tampo .................................................................... 61
5.4
Atividade da amilase salivar ...................................................................................... 64
Captulo 1: DISCUSSO ........................................................................................... 66
Captulo 2: RESULTADOS ....................................................................................... 71
7.1
Cromatografia lquida tandem espectrometria de massas ..................................... 72
7.1.1 Identificao das protenas ........................................................................................... 72

7.1.2 Razo de abundncia das protenas na quantificao relativa da
saliva ............................................................................................................................. 78
7.2
Eeletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato

de sdio (SDS-PAGE) associada eletroforese em gel de
poliacrilamida (native cationic) .............................................................................. 879
7.3
Teste imunoenzimtico (Elisa) .................................................................................. 86
Captulo 2: DISCUSSO ........................................................................................... 87
CONCLUSES ........................................................................................................... 93
REFERNCIAS ..................................................................................................................... 94
ANEXOS ............................................................................................................................... 114
APNDICES ......................................................................................................................... 128
21
1 INTRODUO
A Sndrome de Moebius (SM) uma desordem neuromuscular congnita incomum,

caracterizada pela paralisia perifrica total ou parcial de alguns nervos cranianos,
obrigatoriamente do VI (nervo abducente) e VII (nervo facial) (1), podendo estar associada a
anormalidades dos membros, e mais raramente, associada ao comportamento autista,
artrogripose e sndrome de Poland (2-4).
A expressividade da SM varivel, mas de modo geral, os indivduos acometidos so
incapazes de mover os msculos envolvidos na mmica facial, o que os confere o aspecto de
face em mscara acompanhada de estrabismo convergente. Alteraes bucais, descritas na
literatura, incluem lbio superior hipoplsico, microstomia, hipoplasia de mandbula, palato
alto e arqueado, lngua hipoplsica, alterao de fora de mordida, mordida aberta e alta
incidncia de crie (3, 5).
Alguns trabalhos reportam alta incidncia de crie nos indivduos com SM e as hipteses
aventadas, mas no testadas, incluem o comprometimento da auto limpeza bucal resultante da
paralisia do nervo facial em associao ingesto de dieta pastosa e rica em carboidratos (5,
6). Apesar da descrio dessas alteraes, a secreo salivar no tem sido uma preocupao dos
pesquisadores que estudam a SM. Sabe-se que a fora da mordida influencia na capacidade de
secreo salivar total estimulada e secreo parotdea, e que quanto menor a fora e o estmulo
mastigatrios, menor a secreo salivar (7, 8).
Considerando que as glndulas salivares so inervadas por alguns dos nervos que podem
estar comprometidos na SM, nossa hiptese a de que pessoas com a SM exibam reduo do
fluxo e alterao da composio salivar, e que essa alterao pode ter impacto na sade bucal
do indivduo.
22
2 REVISO DE LITERATURA
A SM uma condio clnica caracterizada pela paralisia uni ou bilateral, completa ou

parcial dos VI e VII nervos cranianos (9, 10). Os indivduos com SM apresentam ausncia ou
deficincia de mmica facial, caracterizando a face em mscara, alm de estrabismo
convergente, com graus variados de acometimento (3).
2.1 Histrico da Sndrome de Moebius
Dados no oficiais estimavam que aproximadamente 2000 pessoas em todo o mundo

vivam com a SM, em 2008 (11). No Brasil, mais de 400 casos foram notificados at 2007 (12).
A primeira descrio desta diplegia facial congnita foi dada por Von Graaefe em 1880, Mbius
foi o primeiro a estabelecer a associao entre diplegia facial congnita com outras
malformaes, em 1888. Para isso, o autor reuniu 43 casos de paralisia facial adquirida e
congnita e as separou em sete grupos conforme o acometimento. Um dos grupos apresentava
seis casos de paralisia facial associada aos nervos cranianos facial e abducente. O autor associou
esse padro a degenerao e atrofia no ncleo envolvido (13). Devido a essas descries iniciais
realizadas por Mbius, a sndrome leva o seu epnimo, embora sinonmias sejam utilizadas,
tais como, diplegia facial congnita, agenesia nuclear, hipoplasia nuclear congnita, paralisia
oculofacial congnita, paralisia abducente-facial congnita e sequncia de Moebius (3, 14).
23
Figura 2.1 Aspectos faciais de indivduos com SM em repouso (A) e durante movimentao dos
msculos faciais (B)
2.2 Critrios de diagnstico e diagnsticos diferenciais da SM
Clinicamente a SM caracteriza-se por paralisia facial congnita e incapacidade da

abduo ocular, totais ou parciais, determinadas por uma malformao do rombencfalo (9, 10).
A falta de estabelecimento preciso de critrios de diagnstico dificulta a avaliao
clnica de indivduos com SM. Kumar (3) estabeleceu alguns critrios de diagnstico: 1acometimento completo ou incompleto do nervo facial como sendo essencial 2- malformaes
em membros so frequentes, 3- acometimento de outros nervos cranianos, entre eles o autor
destaca a paralisia uni ou bilateral ocular associada ao acometimento do nervo abducente,
possvel (3). Verzijl (15) avaliaram 37 indivduos com SM e definiram a sndrome como uma
paralisia facial com acometimento ocular abdutor. Apesar de frequentes, outras alteraes no
foram consideradas essenciais para o estabelecimento do diagnstico de SM (15).
A primeira conferncia cientfica sobre a SM, intitulada Moebius Syndrome Scientific
Conference, realizada em 2007, nos Estados Unidos, determinou como critrios clnicos
mnimos para o diagnstico da SM, a presena de fraqueza facial no progressiva (uni ou
bilateral) associada limitao de abduo de um ou ambos olhos (16).
Recentemente, a Academia Americana de Oftalmologia props critrios para diferenciar
as caractersticas fenotpicas faciais e oculares de indivduos com SM. O objetivo foi determinar
24
se esses indivduos previamente diagnosticados com SM apresentavam os critrios mnimos

para o diagnstico estabelecido pela Moebius Syndrome Scientific Conference. Do total de
112 indivduos, 88 indivduos apresentavam os critrios mnimos que os classificassem como
SM clssica. Os indivduos excludos do estudo apresentavam: limitao do movimento de
abduo mas movimentos faciais normais (1 indivduo), 20 apresentavam paralisia facial mas
no preenchiam o critrio de falta de movimento de abduo, 2 apresentavam oftalmoplegia e
1 apresentava exotropia associada limitao ocular vertical. Os autores propem que os
critrios necessrios para o diagnstico de SM clssica so a paralisia facial e dficit no
movimento de abduo. Eles ainda sugerem a diferenciao entre a SM clssica e atpica. Para
isso deve-se observar se h deficincia dos movimentos oculares verticais, associados ou no
exotropia (comum na SM atpica). Nesse contexto, os autores incluram os indivduos com
oftalmoplegia (2 indivduos) e exotropia associada limitao ocular vertical (1) no grupo com
SM, mas do tipo atpica (17).
A SM pode ainda apresentar outras caractersticas adicionais tais como desordens
comportamentais,
envolvimento
de
outros
nervos
cranianos,
malformaes
musculoesquelticas, problemas motores, perda de audio, entre outras (3, 15, 18).
Malformaes de msculos e ossos em membros superiores e/ou inferiores esto
freqentemente presentes (3, 10). Geralmente, os pacientes com SM no tm acometimento
mental nem evidncia de disfuno de ateno e memria, mas alguns podem se encaixar no
espectro autista (9, 18-20). A associao com sndrome de Poland (21), artogripose (15),
hidrosiringomielia (22), sndrome de Kallmann (associao de hipogonadismo hipogonadotrfico e anosmia) (23) , holoprosencefalia (24) e hipolasia unilateral do disco ptico e nanismo
hipofisrio (25) foram observadas em casos espordicos.
Todas essas apresentaes tornam a sndrome SM extremamente varivel em relao
aos seus aspectos clnicos (26). As alteraes encontradas na SM so comuns ao espectro das
sndromes de hipognese oromandibular-membro. A sobreposio desses quadros
problemtica porque os relatos dessas sndromes so raros, portanto torna extremamente difcil
a determinao dos limites entre sndromes desse grupo. Alm da SM, cinco sndromes fazem
parte desse grupo e so consideradas, desse modo, importantes no diagnstico diferencial:
sndrome hipoglossia-hipodactilia, sndrome de Hanhart, sndrome de anquilose glossopalatina,
sndrome de fuso esplenogonadal - anomalias dos membros e sndrome de Charlie M (27).
Outro importante diagnstico diferencial para SM a paralisia facial congnita, a qual apresenta
acometimento restrito ao nervo facial, enquanto a SM acomete o desenvolvimento do tronco
25
enceflico (15, 26, 27). Em neonatais, o diagnstico diferencial inclui a distrofia miotnica
(27).
2.3 Achados orofaciais descritos na SM
As alteraes craniofaciais so as que causam maior impacto na qualidade de vida das

pessoas com a SM, pois tm implicao na fala, na alimentao, alm do prejuzo social (9).
Ocasionalmente, alm do VI e VII, o III (oculomotor), IV (troclear), V (trigmeo), IX
(glossofarngeo), X (vago), XI (acessrio) e XII (hipoglosso) nervos cranianos esto
envolvidos, resultando em dificuldade de mastigao, deglutio e diminuio do reflexo de
tosse, que pode levar a complicaes respiratrias (3, 9, 10, 28).
Caractersticas orofaciais relatadas so a falta de vedamento labial, micrognatia, palato
alto e perda da tonicidade do palato mole (29). Alteraes motoras e morfolgicas na lngua,
representadas por dificuldade de protruso, hipoplasia lingual e paralisias unilaterais tm sido
relatadas com frequncia (5, 9, 10). Perda de sensibilidade em lngua e bochechas tambm
sugere comprometimento parcial da raiz sensorial do nervo trigmeo, podendo ser uni ou
bilateral (9, 10).
A alta incidncia de crie em indivduos com SM foi descrita por alguns autores e
atribuda ao prejuzo da auto limpeza bucal ocasionado pela paralisia dos msculos faciais e a
ingesto de alimentos semisslidos ricos em carboidratos (5, 30).
A funo motora oral tambm pode estar alterada pela SM, resultando principalmente
em falta de vedamento labial e selamento lingual anterior durante a deglutio. Contudo, em
um estudo com 33 indivduos com SM, conduzido pelo nosso grupo, foi observado que as
funes motoras orais em indivduos as idades de 11 a 20 anos eram mais eficientes quando
comparadas aos indivduos mais jovens. Portanto, apesar da sndrome causar danos
neurolgicos irreversveis, esses indivduos podem recuperar parte da funo motora das reas
afetadas. Acredita-se que indivduos SM tenham adquirido essa habilidade motora oral atravs
do aprendizado que ocorre com avano da idade, inerente prtica e como um mecanismo de
adaptao funcional devido s suas restries motoras. Os autores descreveram ainda que cerca
de 45% dos indivduos com SM apresentavam algum grau de envolvimento do nervo trigmeo
(par craniano V) (31).
26
2.4 Etiopatogenia da SM
Na dependncia da teoria que suporta a etiopatogenia da alterao, alguns autores optam

pela nmina sndrome de Moebius enquanto outros usam o termo sequncia, por
acreditarem que o defeito final decorre de uma cascata de eventos aps um trauma embrionrio
(19).
Towifighi et al. (32) classificaram as alteraes neuropatolgicas da SM e
correlacionaram as com as possveis causas da sndrome. Para isso, os autores utilizaram um
caso de autpsia em uma criana com SM associado a 14 casos de autpsia descritos na
literatura.
Baseado nos achados neuropatolgicos encontrados nas autpsias desses 15
indivduos com SM, os autores propuseram quatro classificaes para a SM de acordo com os
achados neuropatolgicos encontrados em ncleos do tronco cerebral: grupo I, caracterizado
por hipoplasia de ncleos dos nervos cranianos afetados; grupo II, caracterizado por perda
neuronal e degenerao neuronal secundria a injuria fsica do nervo facial, possivelmente
causada por malformao do osso temporal ou uso de frceps durante o parto; grupo III,
caracterizado pela diminuio na quantidade de neurnios e alteraes reativas, assim como
degenerao, necrose focal e calcificaes nos ncleos do tronco cerebral devido a insuficincia
vascular ou infeco; e grupo IV, caracterizada por alteraes de miopatias primrias sem leses
nos tronco cerebral ou nervos cranianos. Os autores concluram que a SM apresentou etiologias
diferentes e, por vezes, desconhecidas, contudo a patologia se correlacionava principalmente
com algumas reas anatmicas como ncleos do tronco cerebral, nervos e msculos .
Apesar de no existir uma etiologia estabelecida para a SM, h duas hipteses bastante
discutidas na literatura. A primeira hiptese descreve que a SM pode ser causada por mal
desenvolvimento dos rombmeros envolvendo o ncleo motor que origina as fibras do nervo
facial, responsveis pela musculatura da mmica (15, 33). A segunda, e mais aceita, versa
acerca da interrupo do sistema vascular em desenvolvimento e a hipoperfuso fetal, que
podem ser resultados de uma isquemia fetal transitria, principalmente das artrias vertebrais
(24). O suporte sanguneo deficiente pode resultar em necrose e calcificao secundria dos
ncleos do tronco cerebral (34). Dentre os fatores ambientais que levariam a alterao no fluxo
sanguneo e que tm sido relacionados com a SM destacam-se as substncias vasoconstritivas.
A exposio a agentes teratognicos, tais como benzodiazepnicos (35), talidomida (36),
cocana (37), ergotamina (38) e misoprostol (39) tm sido associados SM.
27
O uso do misoprostrol merece destaque devido ao uso ilcito em nossa sociedade, como a
droga abortiva mais utilizada no Brasil (40, 41). O misoprostol (Citotec) um anlogo
sinttico da prostaglandina E1 que reconhecidamente eficiente no tratamento de lceras
peptdicas. No entanto, sua capacidade de agir no tnus uterino, provocando contraes e
sangramentos com expulso parcial ou total do contedo do tero, (42) fez com que essa droga
se popularizasse como abortiva, no mercado negro brasileiro. Apesar disso, frequentemente o
misoprostol falha na induo do aborto quando utilizado durante o primeiro trimestre, de
maneira que at 80% das tentativas so fracassadas (39). A tentativa frustra de aborto atravs
do uso do misoprostol pode levar a instalao de distrbios no desenvolvimento no feto, dentre
eles, a SM (43, 44).
A etiologia da SM permanece especulativa, mas certamente influenciada por fatores
genticos e ambientais. O preenchimento dos critrios de diagnstico da SM extremamente
importante quando se estuda a etiopatogenia da sndrome. Sabe-se que mutao homozigtica
de HOXB1 est associada a paralisia facial congnita, perda de audio, caractersticas
dimrficas e, possivelmente, estrabismo. Contudo, esse gene no est associado abduo
ocular limitada, condio essencial para o diagnstico da SM clssica (45). Web et al. (2012)
estudaram 4 indivduos com mutao HOXB1 e nenhum deles apresentou limitao de abduo
ocular. Esse resultado corrobora os achados em ratos Hoxb1/, que apresentaram as mesmas
alteraes fenotpicas descritas. Desse modo, sugere-se que essa seja uma entidade distinta da
SM, causada por mutao de HOXB1, contudo mais estudos so necessrios com a finalidade
de se identificar mais indivduos com essa mutao e determinar melhor o espectro fenotpico
da sndrome Webb, Shaaban (45).
Em relao ao campo gentico relacionado SM, muitas regies cromossmicas foram
relacionados SM, sendo que os locus mais acometidos so 1p22, 3q21-q22 (MBS2), 10q21.3q22.1 (MBS3), e 13q12.2-13 (MBS1) (33).
Desse modo, o aspecto gentico da SM bastante complexo e mltiplos modos de herana
foram relatados. No entanto, mesmo em casos familiares de SM, a gentica parece desempenhar
parte do papel na patognese da SM, evidenciado pela taxa de penetrncia em diferentes
padres familiares relatados. Mais ainda, a SM tem apresentado associao a mltiplos genes e
cromossomos descritos na literatura. Tal fato favorece uma heterogeneidade gentica que
resulta em diferentes anomalias de gravidade varivel (33).
28
Embora a maioria dos casos reportados na literatura sejam casos espordicos, a ocorrncia
familiar existe e se apresenta de maneiras diversas, desde a autossmica recessiva autossmica
dominante e ligada ao X (46).
Apesar do acometimento do nervo facial pela SM, responsvel pela inervao das glndulas
submandibluares e sublinguais, a relao da SM com as caractersticas salivares e bucais nunca
foi explorada.
2.5 Saliva
A saliva um fluido seromucoso, ligeiramente acdico, proveniente da secreo das

glndulas salivares. A saliva total composta por fludos secretados pelas glndulas salivares,
fludo crevicular e contm ainda debris de alimentos e substncias produzidas por
microrganismos orais (47).
As principais funes da saliva so a lubrificao e proteo dos tecidos bucais,
capacidade tampo, clearance bucal, manuteno da integridade dos dentes, capacidade
antimicrobiana e exerce ainda um papel essencial na digesto e palatibilidade dos alimentos
ingeridos (47).
2.5.1 Secreo salivar
A maioria dos componentes salivares como gua, protenas e ons so secretados pelas
glndulas salivares, mais especificamente, grande parte dos componentes proteicos secretada
pelas unidades secretrias acinares (48).
O fluxo salivar possui uma grande variabilidade entre indivduos. A saliva no
estimulada apresenta fluxo de aproximadamente 0,5 ml/min na maioria das pessoas adultas (49,
50). O fluxo salivar sofre influncia do ciclo circadiano, onde apresenta maior fluxo durante a
tarde quando comparado ao perodo da manh (51).
Proporcionalmente, as glndulas salivares participam de maneira distinta na produo e
secreo salivar. Durante o fluxo de saliva no estimulada, a partida contribui com 20% da
29
secreo salivar, a submandibular com 65%, a sublingual com 7 a 8% e as glndulas menores

com menos de 10%. Durante a secreo de saliva estimulada, ocorre uma alterao em relao
a produo salivar de cada glndula, sendo que a partida passa a ser a principal participante
contribuindo com mais de 50% da secreo salivar (52).
Algumas glndulas possuem a capacidade inerente de secretar saliva, como as glndulas
salivares menores. Embora essas glndulas sejam inervadas e aumentem a secreo em resposta
ao estmulo nervoso, elas podem ainda secretar saliva em baixa quantidade, mesmo quando no
so submetidas estmulos exgenos como durante o perodo da noite (48).
A secreo da saliva pode ser estimulada e ela varia de acordo com a natureza do
estmulo.
O ato de comer proporciona grande estmulo a produo de saliva devido a
estimulao de muitos receptores sensoriais como os gustatrios, os mecanorreceprores, os

nociceptores e os olfatrios (48). Mesmo entre os estmulos gustativos (salgado, doce, azedo e
amargo) h diferena na excitao dos ncleos salivatrios, sendo que o azedo o mais efetivo
(53).
Outro estmulo a mastigao que, atravs da movimentao lateral dos dentes, causa a
estimulao de mecanorreceptores localizados na regio de ligamento periodontal. Alm disso,
h tambm a estimulao de mecanorreceprotres localizados no tecido gengival. Outro
importante tipo de receptores so os olfatrios localizados na lamina crivosa que so
estimulados por molculas volteis (48).
Inicialmente acreditava-se que a ao de nervos era a nica responsvel pela secreo
salivar, contudo alguns estudos mostram conexo entre alguns hormnios, como a progesterona
e a secreo salivar (54-56).
As glndulas salivares so compostas por dois tipos celulares: os cinos e os ductos. Os
cinos so responsveis pela produo de saliva e os ductos pela modificao e distribuio
salivar (50). Os cinos so especializados de acordo com a glndula salivar que compem. As
glndulas partidas contm principalmente cinos serosos, as submandibulares so
caracteristicamente glndulas seromucosas (10% das clulas so mucosas e 90% serosas) e as
glndulas sublinguais e menores so glndulas principalmente mucosas (48). Os lbulos
acinares esto unidos aos segmentos ductais, que exercem diferentes funes baseadas na
localizao dessas clulas e em seu tamanho. H diferentes tipos de clulas ductais como
secretoras, mucinosas e ciliadas. Essa heterogeneidade celular encontrada em todos os
segmentos do ducto salivar (57).
30
As clulas acinares so responsveis pela secreo de fludo e da maioria das protenas, j

os ductos contribuem de uma maneira menor para a produo de protenas. Basicamente, a
produo de fludo salivar ocorre a partir da secreo de um fluido isotnico rico em NaCl pelas
clulas acinares serosas, semelhante ao plasma (57). Devido fora osmtica exercida pela
presena de NaCl intraluminal, ocorre o transporte de grande volume de gua pelas passagens
transcelulares e paracelulares. A composio inica desse fludo modificada durante sua
passagem pelo sistema ductal, onde ocorre a secreo de HCO3- e K+ em nveis inferiores em
que ocorre a absoro de Cl- e NA+ (48). Desse modo formada a saliva secundria, hipotnica,
que serve como veculo para transporte de macromolculas para fora das glndulas salivares.
Com a secreo de HCO3-, ocorre a neutralizao de cido, o que propicia um ambiente com
pH timo que facilita esse transporte de macromolculas (57).
A secreo de protenas salivares ocorre de duas maneiras. A primeira a secreo
constitutiva que est relacionada liberao de protenas assim que so sintetizadas nas
vesculas do complexo de Golgi. Esse processo responsvel pela secreo contnua de muitas
protenas, independentemente de estmulos externos, contudo influenciado pela atividade
nervosa. Outro processo responsvel pela secreo de protenas a secreo granular, que o
tipo de secreo regulada. Inicialmente, as protenas so armazenadas em grnulos aps sua
sntese. Devido a alguns estmulos, os grnulos esvaziam seus contedos proteicos para dentro
do lmen ductal. Devido a esses dois mecanismos diferentes de secreo de protenas para a
formao de saliva, pode-se notar variaes na composio salivar (48).
2.5.2 Inervao das glndulas
As glndulas submandibulares e sublinguais apresentam a mesma inervao. Ambas

glndulas recebem inervao autnoma (simptica e parassimptica) atravs do nervo corda do
tmpano, ramo do nervo facial (VII nervo craniano). A inervao sensitiva dessas glndulas
feita pelo nervo lingual, do ramo mandibular do nervo trigmeo (V nervo craniano). Nas
glndulas partidas, tipicamente, ocorre inervao sensitiva atravs do nervo aurculotemporal
do ramo mandibular (V nervo craniano). A inervao autnoma (simptica e pasrassimptica)
provem de ramos do nervo timpnico, cuja origem o nervo glossofarngeo (IX nervo craniano)
(58).
31
As glndulas salivares so inervadas pelo sistema nervoso autnomo, atravs de inervao

simptica e parassimptica. Porm, ao contrrio do que se observa em outros lugares do corpo,
as funes simpticas e parassimpticas no funcionam de maneira antagnica, mas sim de
maneira complementar culminando na secreo de saliva (59). De modo geral, impulsos
provenientes da estimulao parassimptica estimulam alto fluxo salivar com baixa
concentrao proteica, diferentemente da estimulao simptica que est associada a um fluxo
salivar menor com aumento da concentrao de protena da saliva (60-62). Contudo, nem
sempre esse processo uma regra, como na importncia de estmulos parassimpticos para a
secreo de mucina (63). As glndulas (mais especificamente clulas acinares, mioepiteliais e
ductais) recebem grande suprimento de nervos parassimpticos, contudo, a intensidade de
inervao simptica difere, em relao a sua intensidade, entre as glndulas salivares (48).
O centro salivatrio parassimptico localizado no bulbo raquidiano e so divididos em
ncleos superiores, inferiores e em uma zona intermediria. O ncleo superior responsvel
pela conexo do nervo facial com as glndulas sublinguais e submandibulares. O ncleo inferior
conecta o nervo glossofarngeo s glndulas partidas. A zona intermediria proporciona
conexes tanto com as glndulas submandibulares quanto com as partidas. O controle da
liberao de saliva depende de impulsos nervosos reflexos. O centro salivatrio simptico
localiza-se nos segmentos torcicos superiores da medula espinhal. Os centros superiores do
crebro podem exercer tanto influncias inibitrias quanto excitatrias nos centros salivatrios
(64, 65).
Estmulos
aferentes,
como
aqueles
provenientes
de
receptores
gustativos
mecanorreceptores, vo para centros salivatrios localizados no tronco cerebral. O estmulo da

via aferente processado nos centros salivatrios que, por sua vez, so influenciados pelos
centros superiores (64). O impulso eferente passado para as glndulas salivares atravs de
nervos parassimpticos e simpticos que emergem dos centros salivatrios. Os nervos eferentes
parassimpticos conduzem estmulos para as glndulas salivares atravs de gnglios
parassimpticos localizados prximo glndula alvo. Sabe-se muito pouco sobre as conexes
entre os centros salivatrios e outros ncleos e seu funcionamento no bem entendido (66).
Em relao inervao pr-ganglionar eferente da glndula partida, alguns estudos
sugerem que ela no receba apenas impulsos de fibras do nervo glossofarngeo, mas tambm
de fibras do nervo facial. Mais ainda, acredita-se que o nervo facial que atravessa o parnquima
da glndula partida , atravs de suas ramificaes, fornea inervao colinrgica s clulas
secretoras glandulares, participando da secreo salivar (48).
32
De modo geral, a acetilcolina o transmissor ps-ganglionar parassimptico e a adrenalina

o transmissor ps-ganglionar simptico. A adrenalina age nos receptores adrenrgico 1 e 1,
enquanto a acetilcolina estimula receptores muscarnicos M1 e M3. A inervao parassimptica
das glndulas salivares utiliza ainda outros mecanismos de transmisso, alm do colinrgico,
tais como peptdeos (substncia P, neurocinina A, entre outros). Esses mecanismos
parassimpticos auxiliares evocam efeitos secretrios e potencializam as respostas causadas
pela acetilcolina (67).
Os dois tipos mecanismos de inervao autonmica, simptica e parassimptica, esto
envolvidos no processo de sntese proteica pelas glndulas salivares. O estmulo parassimptico
parece ser bastante importante para o processo de secreo de mucina (50). Alm disso, os
receptores muscarnicos M1, M3 causam aumento de Ca+2 intracelular, que est associado
abertura da membrana apical e dos canais de potssio e cloreto da membrana basolateral das
clulas acinares, levando a secreo de gua e eletrlitos (48, 68).
Os estmulos simpticos, atravs da atuao em receptores adrenrgicos, principalmente ,
atuam na via intracelular do monofosfato cclico de adenosina, sendo responsveis pela fuso
dos grnulos secretrios com a membrana apical das clulas glandulares (50).
2.5.3 Propriedades e componentes da saliva
A saliva desempenha um papel importante na manuteno das condies fisiolgicas

normais dos tecidos da boca, exercendo diversas funes, tais como, mineralizao, capacidade
de tamponamento, homeostase microbiana, participao no processo gustativo, participao na
digesto, reparo tecidual, lubrificao e clearance (69).
O pH salivar normal varia de 6 a 7, portanto, a saliva ligeiramente cida. Contudo, o pH
salivar pode variar com a alterao do fluxo salivar, passando a apresentar pH de 5.3 (durante
baixo fluxo salivar), a 7.8 (durante aumento do fluxo salivar) (70). A hipofuno das glndulas
salivares se caracteriza quando o fluxo menor que 0,16 ml/min (71). O fluxo salivar varia
muito, sendo que, para saliva total no estimulada considerado normal o fluxo que varia de
0,3ml/min a 0,5 ml/min, enquanto a saliva estimulada apresenta fluxo de 1,5ml/min (49, 72).
Para uma anlise individualizada, par clnicos que visem monitorar pacientes que apresentem
33
reduo no fluxo salivar, estabelece-se uma taxa de fluxo base e, se houver reduo de 50% no
fluxo salivar deve ser considerado hipofuno das glndulas salivares (73).
A saliva influencia no estabelecimento da integridade dos dentes, atravs do processo de
desmineralizao e remineralizao. Ocorre um dinamismo entre o processo de
desmineralizao e remineralizao, onde esses processos se intercalam. Se houver tempo
adequado entre os desafios acidognicos possvel que ocorra a remineralizao, dessa forma
haver tempo suficiente para que os efeitos advindos da desmineralizao possam ser revertidos
(74).
Um exemplo desse balano entre desmineralizao e remineralizao o processo de
formao de leses de crie, que se inicia com a disponibilidade de sacarose s bactrias
acidognicas presentes no biofilme dental. Com isso, ocorre uma reduo rpida de pH, de 7,0
para 5,0 na regio de contato entre a superfcie do dente e o biofilme, bem como dentro do
fludo que compe o biofilme. O pH crtico para a dissoluo do esmalte de aproximadamente
5,5. A placa dental apresenta saturao de clcio e fosfato, porm, o rpido aumento de ons
hidrognio resulta na sua difuso para dentro do fludo adjacente aos cristais de hidroxiapatita
na superfcie do esmalte. O aumento de hidrognio nesses espaos resulta na sada de clcio e
fosfato da superfcie do esmalte para o biofilme que recobre a superfcie de esmalte, causando
desmineralizao. Esse egresso de clcio e fosfato da superfcie dental ocorre devido a maior
concentrao de clcio e fosfato solveis na placa dental em comparao com a concentrao
da superfcie do esmalte. Determinada quantidade de clcio e fosfato sofrem precipitao na
superfcie de esmalte afetada pelo processo de crie, devido alta concentrao de clcio e
fosfato na pelcula e placa dental. Esse processo auxilia na manuteno da superfcie do esmalte.
Aps esse desafio cariognico, ocorre o restabelecimento de pH na placa dental, o que permite
o incio do processo de remineralizao (74).
A presena de clcio e fosfato, bem como um pH neutro ou mesmo bsico, essencial
para o estabelecimento da remineralizao (75). Clcio, fosfato e algumas protenas salivares
atuam de maneira sinrgica, modulando o processo de desmineralizao e remineralizao (70).
A saliva supersaturada de clcio em relao hidroxiapatita, o que previne a
dissoluo dentria quando ocorre exposio dos dentes aos fludos orais, comida e cidos
provenientes da dieta (76-78). O clcio no ionizado pode ser encontrado na saliva ligado s
protenas salivares, como estaterinas A estaterina permite a manuteno de supersaturao de
clcio e fosfato na saliva impedindo tanto a precipitao espontnea de fosfato de clcio e a
formao de cristais, prevenindo a formao de clculo (75, 79, 80).
34
Outra funo importante da saliva capacidade tampo, que constitui um mecanismo

de correo das mudanas de pH ocorridas com a formao de ons cidos e bsicos,
provenientes, por exemplo, da fermentao dos acares. A alterao do fluxo salivar e,
consequentemente, dos componentes salivares, influencia diretamente na realizao dessa
funo. H trs sistemas maiores que contribuem para a capacidade tampo inerente saliva,
eles so: o sistema bicarbonato, o sistema fosfato e o sistema de protenas. A atividade de cada
um desses sistemas relacionada taxa de saliva produzida, ou seja, ao fluxo salivar (81, 82)
O sistema tampo bicarbonato considerado o principal responsvel pela capacidade
tampo da saliva estimulada. Sua concentrao bastante varivel, sendo desde 5mmol/l para
saliva no estimulada (com fluxo aproximado de 0,3 ml/min) a 24mmol/l na saliva estimulada
(com fluxo aproximado de 2ml/min).
Alm disso, esse sistema apresenta sua mxima
efetividade em pH de 6,1 (83). A concentrao de HCO3- na saliva determinada pela

estimulao da saliva e por protenas reguladoras do fludo epitelial e de secreo de HCO 3-,
dentre elas destacam-se as anidrases carbnicas. Foi demonstrado que um inibidor de anidrase
carbnica, o acetazolamida, inibe significantemente o fludo salivar e a secreo de HCO3- (57).
Com aumento da taxa de fluxo de saliva, ocorre maior produo de HCO3- como um
subproduto do metabolismo da clula. Esse HCO3-se difunde na placa dentria e auxilia na
neutralizao de cidos produzidos por microrganismos orais. Com aumento na concentrao
de HCO3-, ocorre maior remoo de H+ produzido por bactrias, ocorrendo desse modo
produo de cido carbnico (H2CO3). Contudo, a concentrao de H2CO3 mantida em nveis
constantes, no havendo aumento da concentrao salivar. Desse modo, o cido carbnico
removido e CO2 produzido atravs da ao da anidrase carbnica, que promove a converso
rpida de H2CO3 em CO2 e gua. Uma vez que essa reao ocorre no interior da boca, que um
sistema aberto, e que a presso parcial de CO2 na saliva maior que da atmosfera, ocorre difuso
da saliva para o ambiente externo (83).
Com a reduo da concentrao de H2CO3, a partir da ao da anidrase carbnica, mais
ons de hidrognio (H+) se ligam ao bicarbonato (HCO3-) para formar cido carbnico (H2CO3),
restabelecendo o equilbrio. Dessa forma, o sistema bicarbonato capaz de neutralizar e
remover o excesso de H+, como, por exemplo, aqueles produzidos por microrganismos (81).
Durante baixo fluxo de saliva no estimulada essa capacidade tampo quase ineficaz
e exercida principalmente pelo sistema fosfato (70). Em pH fisiolgico da saliva, a maioria
do fosfato encontrado na forma dihidrogenada (H2PO-) ou hidrogenada (HOP42-). O sistema
fosfato tambm influenciado pelo fluxo salivar, sendo que alm da reduo na concentrao
35
de fosfato com aumento do fluxo, tambm ocorre variao na forma de fosfato disponvel na
saliva. Na saliva estimulada, devido ao maior pH, a maioria encontrada na forma hidrogenada
e na saliva no estimulada na forma dihidrogenada Com aumento do fluxo salivar, a
concentrao de fosfato reduz e, associada ela, ocorre a reduo da capacidade desse sistema
(81).
O sistema tampo de protenas menos efetivo do que os sistemas bicarbonato e fosfato.
A saliva total contm inmeras protenas com funes biolgicas especficas. Alm das suas
propriedades especficas, muitas dessas protenas ainda possuem a capacidade de agirem como
tamponantes, contudo, elas apenas exercem essa funo quando o pH est abaixo ou acima de
seus pontos isoeltricos, que geralmente, encontra-se dentro da faixa do pH fisiolgico (83).
A saliva apresenta ainda propriedades antimicrobianas, associadas s protenas
imunolgicas e no imunolgicas. A imunoglobulina A, seguida pela imunoglobulina G, so os
principais componentes imunolgicos da saliva. A imunoglobilina A sofre transporte ativo
atravs das clulas ductais e acinares utilizando, para isso, uma protena transportadora
chamada receptor de imunoglobulina polimrica. Nas glndulas, a imunoglobulina A
produzida por clulas plasmticas e se liga ao receptor de imunoglobulina polimrica localizado
na superfcie basolateral de clulas acinares e ductais. Uma vez no interior das clulas, ela
transportada em vescula para a membrana apical, onde o receptor de membrana sofre clivagem
e libera a imunoglobulina. Embora o processo de transporte ativo de imunoglobulina A possa
ser super-regulado pela atividade neural, as clulas no armazenam essa protena. Desse modo,
mesmo que as clulas plasmticas produzam a mesma quantidade de outras imunoglobulinas
(como G ou M), a imunoglobulina A se liga preferencialmente ao receptor de imunoglobulina
polimrica, o que resulta na sua maior abundancia na saliva quando comparada s outras
imunoglobulinas (84-86).
A imunoglobulina uma das primeiras linhas de defesa antimicrobiana e age
inicialmente inativando os microrganismos atravs da ligao e aglutinao dos mesmos,
impedindo sua adeso mucosa oral. Desse modo, esses microrganismos, bem como suas
toxinas, so mais facilmente eliminados (87). A imunoglobulina A reativa contra vrias
bactrias encontradas na boca, mas mesmo assim o papel da resposta imune no estabelecimento
da microbiota residente ainda no completamente entendido. A microbiota residente persiste
na cavidade oral mesmo na presena de anticorpos (88-90).
36
As protenas no imunolgicas encontradas na saliva, tais como lisozima, histatinas,

estaterina, cistatina, tambm apresentam propriedades antimicrobianas e sero descritas
detalhadamente abaixo.
2.5.4 Protenas salivares
A saliva total contm uma grande quantidade de protenas e peptdeos, os quais

apresentam funes biolgicas especficas. Alm disso, composio proteica referente saliva
no estimulada diferente quando comparada saliva total estimulada e/ou parotdea (70).
Essas protenas exercem funes particulares, como atividade antimicrobiana, importncia na
formao da pelcula adquirida, papel na modulao de biofilme, participao no processo de
desmineralizao, entre outras funes (87).
A -amilase uma protena muito abundante na saliva, sendo que a glndula partida e
as glndulas palatinas menores secretam saliva com maiores concentraes dessa protena (91).
Sua funo mais conhecida digesto de algumas macromolculas, como amido e glicognio,
devido a sua capacidade de catalisar a hidrolise de ligaes -1,4- glicosdicas (87).
Apesar do seu importante papel na digesto, a -amilase apresenta como funo
secundria a interao com algumas bactrias e com a superfcie do dente (92). Nesse contexto,
uma habilidade importante da -amilase sua participao na pelcula adquirida, onde ela
interage com outras protenas e apresenta um aumento ao longo da maturao da pelcula
adquirida de esmalte (93).
Muitos microrganismos, em especial um grupo referido como -amylase-binding
streptococci, se ligam a essa protena. Esse grupo formado por muitas bactrias tais como,
Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus cristatus, Streptococcus
parasanguinis, Streptococcus salivarius, entre outros (92, 94, 95). A -amilase parece ser um
fator importante na colonizao desse grupo, uma vez que esses microrganismos foram
encontrados apenas em animais que secretam -amilase salivar (96).
Uma vez que os estreptococos so colonizadores iniciais da cavidade oral e favorecem
a colonizao do biofilme por outras espcies (97), a -amilase pode ter uma funo importante
na colonizao desses microrganismos (92).
37
A -amilase apresenta ainda outras funes, no estando apenas limitada adeso de

estreptococos pelcula. Ela participa da adeso entre bactrias, fornece substncias
importantes para a nutrio de estreptococos e outros coabitantes do biofilme, alm de ser
importante na clearance de bactrias uma vez que interage com algumas dessas bactrias
impedido sua adeso placa dental ou mesmo seu crescimento (98-102).
Nos ltimos anos tem sido sugerido o uso da -amilase como marcador de mudanas
relacionadas ao estresse emocional o, o que estaria associado conexo entre essa protena e o
sistema nervoso simptico. A secreo salivar de -amilase sofre influncia do sistema nervoso
autnomo, em especial da inervao simptica, atravs dos mecanismos alfa e beta
adrenrgicos. Por conseguinte, esperado um aumento da secreo de -amilase salivar durante
situaes de estresse psicolgico, uma vez que esse estresse exige grande ativao do sistema
nervoso autnomo (103).
A lisozima uma pequena protena, de 145kDA, presente na saliva e tambm no fludo
crevicular. A lisozima possui efeito antimicrobiano que est associado hidrlise de ligaes
-1,4-glicosdicas entre o cido N-acetilmurmico e N-acetil-D-glucosamina, ambos
encontrados no componente peptidoglicano da parede celular das bactrias. Desse modo, a
hidrlise do peptidoglicano resulta em lise celular. A lisozima mais efetiva contra bactrias
gram-positivas, isso ocorre, provavelmente, devido presena de membrana externa nas
bactrias gram-negativas, o que funcionaria como proteo da camada peptidoglicana dessas
bactrias. Contudo sua atividade antimicrobiana no se restringe a sua atividade enzimtica.
Acredita-se que a lisozima exera propriedade antimicrobiana no enzimtica contra bactrias
gram-negativas, gram-positivas e fungos (87, 104-106).
Embora a lisozima possua a capacidade de hidrolisar peptidoglicanos, ela pode se ligar
ainda aos lipopolissacardeos, o que causa a mudana na conformao dos mesmos, resultando
na reduo da atividade imunoestimulatria (107). Os lipopolissacarideos so componentes da
membrana exterior de bactrias Gram-negativas e so considerados fatores de virulncia de
vrias bactrias, contribuindo desde a aderncia at a invaso das clulas hospedeiras (108).
A estaterina uma protena que exerce diversas propriedades importantes. A estaterina
possui alta afinidade por hidroxiapatita e um dos precursores na formao da pelcula
adquirida de esmalte. A estaterina bastante susceptvel degradao proteoltica da saliva,
porm quando aderida ao esmalte para formao da pelcula adquirida, ela mantm seus nveis
constantes desde os estgios inicias at os finais da formao da pelcula adquirida de esmalte
(93). Essa fosfoprotena parece contribuir ainda para a atividade de proteo contra a
38
desmineralizao da pelcula adquirida (109, 110), participa da manuteno do estado de

supersaturao de clcio e fosfato da saliva (75) e auxilia na capacidade de lubrificao da
saliva (111). A estaterina atua tambm no desenvolvimento e modulao de virulncia do
biofilme, uma vez que inibe a adeso de alguns microrganismos, como Streptococcus mutans e
promove a adeso de outros como Actinomyces viscosus e Fusobacterium nucleatum (112116). Alm de participar na modulao do biofilme, a estaterina pode participar do
estabelecimento de candidase. Culturas de Candida albicans, na forma de hifa, quando
expostas estaterina, apresentaram aumento na transio de hifa para levedura. Com a deleo
de cinco aminocidos carregados negativamente no stio N-terminal da estaterina, o efeito que
induz a transio para levedura foi aumentado. Esse fato pode ser explicado pela diminuio de
foras que se repelem entre aminocidos carregados negativamente e a superfcie carregada
negativamente de Candida albicans. Uma vez que a forma de hifa de Candida albicans mais
invasiva, essa protena pode desempenhar um papel importante na defesa do hospedeiro contra
o estabelecimento da candidase (117).
As histatinas so um grupo de peptdeos catinicos ricos em histidina que exercem,
dentre outras funes, atividade antibacteriana (112, 118-120), antifngica (121, 122),
participao na formao da pelcula adquirida (93), proteo contra o processo de
desmineralizao (123) e possvel efeito cicatricial (124, 125). Os principais membros desse
grupo so as histatinas 1 (com 38 aminocidos), 3 (com 32 aminocidos) e 5 (com 24
aminicidos). A histatina 1 e histatina 3 so produtos dos genes HIS e HIS 2 respectivamente,
enquanto a histatina 5 um produto da clivagem da histatina 3 (126-128).
As histatinas 1 e 3 so mais abundantes durante os estgios iniciais da formao da
pelcula adquirida, apresentando uma drstica reduo depois de 60 e 120 minutos de formao
de pelcula adquirida de esmalte (93). Apesar de serem altamente susceptveis degradao
proteoltica, a histatina 1 pode sofrer uma diminuio dessa susceptibilidade quando aderida
ao esmalte (129).
Dentre as histatinas, a histatina 5 a que exibe a maior atividade antifngica tanto contra
Candida albicans, quanto contra Cryptococcus neoformans e Aspergillus fumigatu. (130-132).
A histatina 5 apresenta uma potente atividade contra Candida albicans, incluindo as cepas
resistentes aos antifngicos comumente utilizados (131, 133). Essa capacidade antifngica da
histatina 5 contra Candida.albicans, abrange clulas planquitnicas, biofilme
e quando
adsorvida sobre resina ou hidroxiapatita impede a adeso da cepa essas superfcies (121, 134).
Adicionalmente, foi demonstrado que a histatina 5 exerce um efeito sinrgico com drogas
39
antifngicas, demonstrando o seu potencial para uso em terapia de combinao (135, 136).
Acredita-se que a capacidade antifngica da histatina 5 ocorra, inicialmente, atravs da sua
ligao aos receptores localizados na parede celular fngica, como Ssa1 e Ssa2, seguida por sua
internalizao (137). Uma vez no interior da clula fngica, a histatina 5 induzir a formao
de espcies reativas de oxignio, danos mitocndria e membrana citoplasmtica, efluxo de
ATP e ons e morte fngica (137, 138).
Alguns autores identificaram a famlia das histatinas como potente agente cicatrizante
de feridas, presente na saliva humana, sugerindo at sua utilizao como base de um novo
medicamento para a cicatrizao de feridas de pele. Os autores ressaltaram ainda que as
hitatinas 1 e 2 so, in vitro, as mais potentes na cicatrizao de feridas, enquanto que a histatina
5, com notvel ao antimicrobiana, virtualmente ineficaz no processo de reparo. A histatina
3 estimulou a migrao de clulas epiteliais e poderia, portanto, ser um dos principais agentes
que medeiam atividade de cicatrizao da saliva humana (124, 125).
As cistatinas so uma famlia de inibidores de proteases de cistena com capacidade
antibacteriana e participao no controle da mineralizao. As cistatinas so encontradas em
maior concentrao na saliva da glndula submandibular, embora tambm seja encontrada, em
uma concentrao muito inferior, na saliva de partida. Elas so agrupadas em famlia, sendo
que as cistatinas salivares so membros da famlia 2 e pelo menos 9 isoformas foram descritas,
incluindo as citatinas S, C, SN e AS (139, 140). As cistatinas C e S parecem inibir o crescimento
de Porphyromonas gingivalis, um agente importe durante o incio e a progresso da doena
periodontal severa (141). A cistatina AS mostrou atividade antimicrobiana contra
Aggregatibacter actinomycetemcomitan, contudo essa atividade mostrou-se independente da
sua funo de inibio de protease. Notou-se ainda uma reduo significativa na ligao de
Aggregatibacter actinomycetemcomitan s clulas epiteliais bucais (142).
Apesar das cistatinas serem componentes constituintes da saliva, elas so encontradas,
especialmente a cistatina C, em nveis aumentados durante a progresso da doena periodontal
(143, 144). H evidncias experimentais que apontam que a cistatina C, apesar de no ser a
principal constituinte da saliva dentro da famlia das cistatinas, possui a maior capacidade de
inibio de cisteno proteases da saliva (145, 146).
As cistatinas participam tambm da formao da pelcula adquirida, sendo que a
cistatina D no apresenta variao de abundancia ao longo da formao da pelcula adquirida.
Diferentemente, as cistatinas S e As apresentam-se aumentadas aps 10 e 60 minutos de
40
formao de pelcula adquirida de esmalte, reduzindo sua abundncia aps 120 minutos de
formao dessa pelcula (93).
As mucinas so glicoprotenas secretadas, na cavidade oral, pelas glndulas
submandibulares, sublinguais e pelas glndulas salivares menores (147). As mucinas so as
terceiras protenas mais abundantes na saliva e formam complexos com outras protenas da
saliva (128). As mucinas exercem diversas funes como formao de pelcula nas superfcies
da mucosa oral, lubrificao e modulao de microrganismos (128, 147).
Na boca existem, pelo menos, duas grandes populaes distintas de mucinas, as ligadas
membrana e as secretadas (148, 149). As mucinas secretadas so muito mais abundantes na
boca, e apresentam pelo menos dois subtipos distintos: as de alto peso molecular polimricas
formadoras de gel, com massa molecular aproximada de 24104 kD (MUC5B) e as de baixo
peso molecular monomricas, MUC7 , com massa molecular de 130180 kDa (128, 150, 151).
As mucinas so glicoprotenas altamente glicosiladas sintetizadas e N-glicosiladas no
retculo endoplasmtico, enquanto que a O-glicosilao ocorre no aparato de Golgi. Aps isso,
elas so armazenadas em grnulos especficos de clulas secretoras, que liberam seus contedos
no lmen acinar, que atravs do sistema de ductos alcanam a cavidade oral (152, 153).
As mucinas apresentam elevador teor de oligossacardeos O-ligados e seus monmeros
apresentam variveis de repeties em srie (VNTR) de sequncia peptdica no centro da cadeia
polipeptdica, ligadas s cadeias de O-glicanos. As VNTR so ricas em serina, treonina, alanina,
glicina e resduos de prolina (128, 154). As mucinas exibem vrias cadeias de N-glicanos apesar
de ocorrer preponderncia de O-glicanos (154).
As mucinas formadoras de gel possuem, geralmente, um tamanho grande e so
caracterizadas pela grande quantidade de cadeias de oligossacardeos.
Prximo s
extremidades N- e C- terminais das mucinas h cistenas, que esto envolvidas no processo de

polimerizao atravs das pontes de dissulfeto (128, 154).
As mucinas secretadas, como a MUC5B e MUC7, exercem diversas funes como
lubrificao, proteo da superfcie dos tecidos oral e modulao dos microrganismos orais.
MUC5B possui maior capacidade de lubrificao do que MUC7, isso pode ocorrer
principalmente devido sua poro de carboidrato (155).
MUC5B participa da formao da pelcula adquirida de esmalte, principalmente nas
camadas sucessivas s camadas iniciais de protenas que adsorvem superfcie de esmalte. A
MUC5B apresentou aumento significativo durante o desenvolvimento, in vivo, da pelcula
adquira de esmalte (93). Foi descrita a capacidade da MUC5B de formar complexos proteicos
41
com outras protenas, como -amilase, histatina e estaterina, o que justificaria seu aumento nos
estgios finais da formao dessa da pelcula (93, 156).
MUC5B tambm parece apresentar participao no estabelecimento da microbiota oral,
uma vez que a placa dental degrada a cadeia polipeptdica dessa protena. Contudo essa
degradao requer uma atuao sinrgica dos microrganismos que compe a placa dental, no
ocorrendo na presena de microrganismos isolados da placa dental (157, 158).
As mucinas salivares, em especial MUC7, exibem propriedades antimicrobianas. Uma
delas a participao na aglutinao de bactrias, sendo uma das principais protenas salivares
na execuo desse papel. Sabe-se que essa protena apresenta afinidade alta a vrias bactrias,
como Streptococcus sanguis, Streptococcus. mitis, Streptococcus. Gordonii, Aggregatibacter
actinomycetemcomitans, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli (159-162). A ligao de
MUC 7 s cepas de estreptococos ocorre independentemente da formao de complexos entre
MUC7 e outras protenas salivares.
A capacidade da MUC7 interagir com bactrias tem sido atribuda regio N-terminal
dessa protena (163). Mais ainda, a ligao entre Streptococcus mutans e MUC7 parece ocorrer
atravs da regio N-terminal da mucina e a superfcie bacteriana e ser dependente do domnio
contendo cistena, dentro da regio N-terminal da MUC7 (164). Peptdeos de MUC7 foram
testados contra cepas de Streptococcus mutan e exibiram atividade antibacteriana, inibio da
formao de biofilme e foram efetivos na reduo de biofilme (165). A regio N-terminal de
MUC7 tambm parece exibir atividade fungicida semelhante a histatina 5, contra cepa padro
de Candida albicans (164).
Indivduos
com
doena
periodontal
associada
Aggregatibacter
actinomycetemcomitans apresentaram concentraes reduzidas de MUC7, o que sugere que

concentraes baixas dessa protena possam ter contribudo para o aumento da susceptibilidade
desses indivduos para a doena periodontal (166).
As glndulas salivares, bem como o epitlio da cavidade oral, expressam mucina ligada
membrana MUC1 (167, 168). Aps sua secreo, a MUC1 permanece na superfcie das
clulas epiteliais orais, agindo como segunda linha de defesa, e participa, possivelmente, na
mediao de sinais intracelulares (168, 169). MUC1 parece ser um componente crtico da
barreira que protege a mucosa de patgenos. Alm disso, acredita-se que esse efeito de proteo
da MUC1 pode ser bastante importante na cavidade oral, uma vez que seu epitlio est exposto
constantemente a grande quantidade de microrganismos (170). A infeco por Porphyromonas
42
gingivalis ou o aumento de algumas citocinas pro-inflamatrias aumentam a expresso de

MUC1 nas clulas epiteliais de cavidade oral (168).
Tendo em vista a importncia da saliva na manuteno da sade bucal e a escassez de
trabalhos cientficos sobre o tema, nossa hiptese a de que pessoas com a sndrome de
Moebius exibam alteraes quantitativas e qualitativas salivares que os coloca em situao de
maior risco para desenvolverem crie.
43
3 PROPOSIO
O objetivo deste estudo foi avaliar as caractersticas salivares quantitativas e

qualitativas, incluindo o proteoma salivar, de indivduos com SM, associ-las com a sade
bucal, e compar-las com as caractersticas salivares de um grupo controle, no afetado pela
SM.
Especificamente pretendemos:
Avaliar o fluxo de saliva total estimulada, no estimulada e parotdeo;
Avaliar o pH e capacidade tampo da saliva total estimulada;
Avaliar a atividade da amilase salivar;
Correlacionar esses resultados com os achados de sade bucal ( ndices de crie,

periodontal e de placa);
Avaliar o proteoma e peptidoma salivar.
44
4 MATERIAL E MTODOS
Este projeto de pesquisa foi submetido e aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da
FOUSP. O Termo de Consentimento Livre e Esclarecido foi obtido para todos os sujeitos desta
pesquisa (Anexo A e B).
Foi realizado um estudo caso controle, prospectivo, no qual foram includos 30 sujeitos,
divididos em dois grupos. O grupo 1 foi composto por 15 indivduos com a sndrome de
Moebius (SM) e o grupo 2 por 15 indivduos no sindrmicos, pareados quanto ao gnero e
idade, que constituram o grupo controle. Todos os participantes, do grupo 1 e 2, foram
avaliados quanto as caractersticas faciais, sade bucal, proteoma e peptidoma salivar, bem
como em relao as alteraes no fluxo de saliva, atividade de amilase, capacidade tampo e
pH da saliva total estimulada.
Foram includos indivduos com SM com diagnstico prvio dado por geneticistas e
atendidos no Centro de Atendimento a Pacientes Especiais (CAPE - FOUSP). Os participantes
do grupo controle foram atendidos na Clnica de Adolescentes e na Clnica de Pediatria
(FOUSP) no exibiam paralisia de nenhum msculo facial ou qualquer outra alterao da
normalidade, condies estas determinadas para a incluso do sujeito no grupo controle.
Consideramos como critrios de excluso indivduos com SM associada outra doena
(hidrocefalia, autismo, etc), indivduos que no colaboravam com a coleta salivar e indivduos
que fizeram uso de medicaes no ms anterior ao da coleta.
Todas as avaliaes clnicas foram realizadas no Centro de Atendimento a Pacientes
Especiais (CAPE - FOUSP) e na Clnica de Odontopediatria (FOUSP).
4.1 Avaliao clnica
Todos os participantes do grupo de estudo e controle, foram examinados sempre pelo

mesmo pesquisador, cirurgio dentista. Avaliamos a higiene bucal pelo ndice de placa, a sade
periodontal por meio do Registro Periodontal Simplificado (PSR) e a presena de leses de
crie, pelo International Caries Detection and Assessment System (ICDAS). Avaliamos
tambm todos os participantes em relao a paralisia facial.
45
4.1.1 Higiene bucal
Para determinamos a higiene bucal aplicamos o ndice de placa de Silness-Le (171).

Para a determinao do ndice de placa, cada uma das quatro faces dos dentes (vestibular,
lingual, mesial e distal) recebeu uma pontuao 0-3. As pontuaes das quatro faces do dente
foram somadas e divididas por quatro, a fim de dar o ndice de placa para o dente com a seguinte
pontuao e critrios:
0: Sem placa;
1: Placa aderida ao dente e margem gengival que apenas pode ser vista aps
aplicao de evidenciador de placa;
2: Acmulo moderado de depsitos moles dentro da bolsa gengival ou no dente e

margem gengival que pode ser visto a olho nu;
3: Acmulo abundante de matria mole dentro da bolsa gengival e/ou no dente e

margem gengival.
4.1.2 Sade periodontal
Avaliamos a condio periodontal atravs do Registro Periodontal Simplificado

(PSR). Dez dentes foram sondados com a sonda periodontal, na face vestibular e lingual em 3
regies distintas (mesial, distal e cervical). A boca foi dividida em sextantes e os terceiros
molares no foram analisados. Os dentes utilizados para obteno desses ndices foram 17, 16,
27, 26, 37, 31, 11, 47 e 46. Para determinar a condio periodontal, apesar da anlise de dez
dentes, apenas 6 anotaes foram feitas, uma para cada sextante, utilizando a pior condio
encontrada (172). As avaliaes seguiam o seguinte critrio para o PSR:
0: Sade- A faixa colorida (3,5 a 5,5 mm) da sonda est totalmente visvel e no h
sangramento sondagem;
1: Gengivite- A faixa colorida da sonda encontra-se totalmente visvel, no h presena

de clculos ou margens de restaurao mal adaptadas, porm sangramento percebido
sondagem;
2: Gengivite ou periodontite leve- A faixa colorida da sonda encontra-se totalmente
46
visvel, presena de clculos e/ou margens de restauraes mal adaptadas na regio

intra-sulcular, podendo ou no ocorrer sangramento sondagem;
3: Periodontite moderada- A parte colorida da sonda est parcialmente intrasulcular;
4: Periodontite grave- A faixa colorida da sonda encontra-se totalmente no interior da

bolsa;
Cdigo *- Utilizado para indicar mobilidade dentria, envolvimento de furca, retraes

gengivais superiores a 3mm e problemas mucogengivais;
4.1.3 ndice de crie
Para avaliao do ndice de crie foi utilizado o ICDAS-II (International Caries Detection
and Assessment System), que fornece informaes sobre leses no cavitadas de crie ou leses
iniciais. O ICDAS-II foi designado para diagnosticar seis estgios do processo carioso, desde
alteraes iniciais na translucidez do esmalte at grandes cavitaes, graduando-as de acordo
com escores.
Feita a profilaxia e isolamento relativo e sob iluminao artificial, foram avaliadas todas as
superfcies dentrias (mesial, distal, vestibular, lingual e oclusal), um quadrante de cada vez,
classificando-as de acordo com os seguintes escores:
0: Nenhuma alterao na translucidez do esmalte aps secagem de 5s;
1: Opacidade visvel aps secagem de 5 segundos;
2: Opacidade visvel mesmo na presena de umidade;
3: Cavidade localizada em esmalte opaco ou pigmentado;
4: Sombreamento da dentina subjacente;
5: Cavidade em esmalte opaco ou pigmentado com exposio da dentina subjacente;
6: Cavitao em esmalte opaco ou pigmentado com exposio da dentina subjacente,

envolvendo mais de metade da superfcie.
47
4.1.4 Avaliao das caractersticas faciais
A avaliao do comprometimento motor da face de todos os indivduos do grupo de

estudo foi realizada sempre pelo mesmo pesquisador, em cadeira odontolgica, sob luz
artificial.
Avaliamos a atividade dos nervos II, III, IV, V, VI, VII e XI bilateralmente. Para tanto,
solicitvamos que o participante executasse um movimento especfico e em seguida
executvamos o movimento para que ele compreendesse. A descrio do movimento solicitado
para testar cada nervo est descrita no Anexo C. Conforme a execuo do movimento solicitado,
o resultado obtido se enquadrou em: nervo totalmente comprometido (score 2), parcialmente
comprometido (score 1) ou no comprometido (score 0). Foi obtida ento a mdia em relao
ao nervo testado, somando os resultados obtidos por nervo e dividindo pela quantidade de
movimentos realizados.
Os resultados foram transcritos para uma ficha especialmente
desenvolvida para este estudo (Anexo C). O escore total foi obtido pela soma dos escores
atribudos para cada movimento.
4.2
Anlise quantitativa e qualitativa da saliva
Foram coletadas saliva total no estimulada, saliva total estimulada e saliva parotdea
bilateral. As amostras foram coletadas em sala ventilada e iluminada, com os pacientes sentados
confortavelmente, no perodo da manh, entre 9 e 11 horas, com o objetivo de minimizar o
efeito do ritmo circadiano. O paciente foi orientado a abster-se de ingesto de qualquer alimento
ou bebida uma hora antes das coletas. A boca foi lavada com gua deionizada antes das coletas.
A anlise da capacidade tampo e pH foram realizados no Laboratrio de Bioqumica da
Faculdade de Odontologia da USP. Toda saliva coletada foi estocada em freezer, a -80C e
posteriormente liofilizada a fim de facilitar o transporte para o laboratrio da University of
Western Ontario (Canad), onde foi realizada a anlise protemica e peptidmica.
48
4.2.1 A coleta de saliva total no estimulada
A coleta de saliva total no estimulada permitiu a anlise do fluxo, atividade de amilase

e do proteoma e peptidoma. O indivduo foi orientado a cuspir a saliva em tubo estril mantido
em gelo a cada 1 minuto, por 11 minutos, sendo que o primeiro minuto foi descartado (173,
174). A saliva, utilizada para anlise protemica e peptidmica, foi centrifugada (20,000 g
por 20 minutos a 4C) (175) e o sobrenadante foi separado em alquotas de 1 ml e armazenado
em freezer -80C.
4.2.2 A coleta de saliva total estimulada
A coleta de saliva total estimulada permitiu a realizao do proteoma e peptidoma, assim

como o pH, a capacidade tampo e atividade de amilase. A coleta de saliva total estimulada foi
realizada atravs da mastigao de Parafilm (1 movimento a cada 1 segundo). O indivduo foi
orientado a cuspir a saliva em tubo estril mantido em gelo a cada 1 minuto e a no engolir. O
primeiro minuto de coleta foi descartado e a coleta de saliva estimulada continuou por mais 10
minutos. Ao final, o paciente foi orientado a cuspir a saliva com o Parafilm (176). A saliva,
utilizada para anlise protemica e peptidmica, foi centrifugada e o sobrenadante foi separado
em alquotas de 1 ml e armazenado em freezer -80 C.
4.2.3 A coleta de saliva estimulada da partida
A coleta de saliva estimulada da partida permitiu a avaliao do fluxo salivar, anlise

da atividade de amilase, realizao do proteoma e peptidoma. A coleta de saliva das glndulas
partidas, direita e esquerda, foi realizada individualmente. A produo salivar foi estimulada
pela aplicao de 20 l de soluo de cido ctrico a 2%, colocadas sobre a poro dorsal da
lngua, no tero posterior, em intervalos regulares de 30 segundos, em ambos os lados da lngua,
exatamente por 6 minutos. A saliva relativa ao primeiro minuto foi descartada. A coleta da
49
saliva foi feita com dispositivo de Carlson-Crittenden modificado (176). O coletor composto
por dois crculos concntricos de plstico. O ajuste do crculo interno foi feito em cima da
abertura do ducto de Stensen, na face da mucosa jugal direita e esquerda, em direo oposta ao
primeiro molar superior direito. O portal de sada deste crculo estava conectado por um tubo
plstico de centrfuga, com fundo cnico (Tipo Falcon, 15ml) descartvel. O crculo exterior
foi conectado mangueira de suco do sugador, que quando pressionada, criou vcuo,
puxando desta forma a mucosa jugal que cerca a abertura do ducto de Stensen, e mantendo o
coletor em posio. Esse procedimento foi realizado na abertura do ducto de Stensen localizado
na mucosa jugal esquerda e direita (176). Durante a coleta o recipiente de saliva foi mantido
em gelo e aps a coleta. A amostra foi ineditamente plaqueada em gar sangue por 48 horas,
visando confirmar se no houve contaminao da amostra por saliva total, e o restante foi
congelada imediatamente em freezer -80C.
4.2.4 Fluxo salivar, pH e capacidade tampo.
O fluxo foi obtido a partir do clculo do volume da amostra pelo tempo de coleta da
amostra. Imediatamente aps a coleta, foi verificado o pH inicial da saliva com auxlio de
pHmetro de bancada (Quimis, So Paulo, Brasi). A capacidade de tamponamento foi realizada
conforme por titulao com soluo de HCl 0,01 N, imediatamente aps a coleta (177). A
capacidade de tamponamento e o pH da saliva foram realizados no Laboratrio de Patologia
Molecular da Disciplina de Patologia Bucal, da FOUSP.
4.2.5 Teste de atividade da amilase salivar
O ensaio enzimtico foi feito para determinar da atividade de -amilase na saliva para os 6
grupos, a saber: saliva no estimulada, estimulada e parotdea do grupo de estudo e saliva no
estimulada, estimulada e parotdea, do grupo controle. A -amilase metaboliza o substrato,
convertendo o amido em maltose. A intensidade da cor desenvolvida proporcional atividade
de -amilase na amostra. Os tubos foram incubados por 5 minutos em estufa a 37C e colocados
50
em gua fervendo por 5 minutos. Foi colocado 200l de cada tubo por poo, em triplicata, em
microplaca de 96 poos de polipropileno, e a leitura foi realizada em espectrofotmetro 560
nm (178). Os reagentes utilizados seguem no apndice A.
4.2.6 Anlise estatstica dos parmetros clnicos (crie, condio periodontal, higiene) e
salivares (fluxo salivar, capacidade tampo, e pH) do grupo controle e Moebius
Foi realizado um estudo caso-controle, com 15 indivduos com Sndrome de Moebius,

comparado com 15 indivduos de idade similar, sem a sndrome.
A maioria das variveis coletadas de ordem contnua e foram descritas por meio de
estatsticas de posio (mnimo, mximo, mdia, mediana) e escala (desvio padro e intervalo
interquartil).
Comparaes entre os grupos, ou entre indivduos com e sem PSR, foram realizadas por
testes no paramtricos de Mann-Whitney. E a correlao entre variveis ordinais e contnuas,
como os cortes do ICDAS, o escore do PSR e as variveis de fluxo, placa e idade, foram
avaliadas pelo coeficiente de correlao de Pearson e grficos de disperso (179).
Para avaliar os efeitos conjuntos de fluxo e grupo na variao dos cortes do ICDAS,
ajustaram-se modelos de regresso beta com interao, utilizando funo de ligao logstica
para a mdia, uma vez que a distribuio da varivel respostas era uma proporo (proporo
de leses sobre o nmero de dentes), e a suposio de normalidade dos resduos de uma
regresso linear simples no estava satisfeita (180). Para exemplificar os resultados ajustados
pelo modelo, construram-se grficos com as estimativas de saliva no estimulada variando
segundo o fluxo no por grupo e fixando o valor de saliva parotdea esquerda em 0,3 ml/min.
A atividade de amilase salivar foi avaliada atravs do teste t-Student, comparando o
grupo controle com o grupo Moebius.
Os testes foram interpretados considerando um nvel de significncia de 5%. Para as
anlises utilizou-se o software R 3.1.1 (R Core Team) com auxlio do pacote betareg (181).
51
4.2.7 Anlise protemica da saliva
Inicialmente as amostras foram centrifugadas para remover materiais insolveis,

armazenadas a -80C e posteriormente liofilizadas. A anlise do proteoma e peptidoma salivar
foi realizada no laboratrio do Prof. Walter Siqueira, na University of Western Ontario, Canad.
A concentrao de protena total de cada indivduo, controle e com SM, foi estabelecida
atravs da tcnica do cido bicinconnico (Pierce BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher
Pierce, Rockford, IL, USA).
O proteoma foi obtido por duas metodologias distintas, a primeira a partir da
cromatografia lquida tandem espectrometria de massas (LTQ-Velos, Thermo Scientific),
atravs de separao de protenas intactas por cromatografia de alta resoluo. A segunda
utilizou a tcnica de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sdio
(SDS-PAGE) associada eletroforese em gel de poliacrilamida (native cationic).
Uma vez que o proteoma pode sofrer influncia do fluxo salivar, as amostras dos
diferentes tipos de saliva, de ambos os grupos, foram agrupadas de acordo com o fluxo em ml
por min. Desta forma, para cada grupo, estudo e controle, os 4 tipos de saliva (estimulada, no
estimulada, parotdea esquerda, parotdea direita) foram subdivididos de acordo com baixo
fluxo (abaixo da mdia do grupo ou alto fluxo (acima da mdia do grupo). Foram excludos:
1- Um indivduo com SM que apresentou as amostras de saliva estimulada e no estimulada
com quantidade de protenas totais menor que 30g/ml; 2- Indivduos que apresentaram
ausncia de saliva durante a coleta de partidas esquerda e direita (7 sujeitos cada). Esta diviso
resultou em 16 grupos descritos no Quadro 4.1:
Tipo da saliva (mdia do

fluxo salivar do grupo)
Grupos de acordo com o fluxo

(nmero
de
indivduos Sigla
inseridos no grupo)
Acima do fluxo do grupo
Indivduos com SM
G1
Saliva total no estimulada
(5 indivduos)
(0,17 ml/min)
Abaixo do fluxo do grupo (8

indivduos)
Saliva total estimulada
(0,45 ml/min)
(6 indivduos)
G2
G3
continua
52
concluso
Tipo da saliva (mdia do

fluxo salivar do grupo)
Grupos de acordo com o fluxo

(nmero
de
indivduos Sigla
inseridos no grupo)
indivduos)
Saliva partida direita

(0,15 ml/min)

(2 indivduos)
Abaixo do fluxo do grupo
(5 indivduos)
Saliva partida esquerda

(0,14 ml/min)

(3 indivduos)
indivduos)
Saliva total no estimulada (7 indivduos)

(0,68 ml/min)

indivduos)
Saliva total estimulada
(9 indivduos)
(1,19 ml/min)

indivduos)
Indivduos controle

Saliva partida direita
(6 indivduos)
(0,32 ml/min)

indivduos)
Saliva partida esquerda
(6 indivduos)
(0,33 ml/min)

indivduos)
G4
G5
G6
G7
G8
G9
G10
G11
G12
G13
G14
G15
G16
Quadro 4.1 - Divises das amostras em 16 grupos de acordo com o fluxo e condio (Sndrome de
Moebius ou controle) dos indivduos
53
4.2.7.1 Anlise protemica da saliva por cromatografia lquida tandem espectrometria de

massas
Foi realizado um pool com quantidades iguais de protenas de cada paciente para que
totalizasse 10g para cada grupo estudado (G1-G16). Em seguida, as amostras foram secas com
a auxlio do evaporador rotacional (VacufugeTM, Eppendorf AG, Barkhausenweg, HH, DEU)
por 2 horas. Foi adicionado, 50 L da soluo 1 (4M urea+10mM DTT (dithiothreitol)+50mM
NH4HCO3 com pH=7,8) e incubado por 1 hora a temperatura ambiente. A digesto foi realizada
adicionando-se 150 L de soluo 2 (50mM NH4HCO3 com pH=7,8) e 5% em peso de tripsina
(Promega, Madison, WI, USA). A purificao e dessalinizao dos peptdeos resultantes da
digesto e preparo das amostras para espectrometria de massas foram feitas com auxlio de
microcolunas de fase reversa (ZipTip Pipette Tips Millipore (Millipore, Billerica, MA, USA).
A separao dos peptdeos e anlises espectromtricas foram realizadas nas amostras
dos 16 grupos (G1 a G16) utilizando nano- HPLC Proxeon LTQ Velos (Thermo Scientific, San
Jose, CA, EUA), que permite cromatografia lquida in-line com a coluna capilar de 75mm X
610cm (Pico TipTM EMITTER, New Obective Woburn, MA) preenchida com resina C18 com
poros de 5 m de dimetro e 200 (Michrom BioResources, Aubum, CA), acoplado ao
espectrmetro de massas (LTQ-Velos, Thermo Scientific, San Jose, CA, EUA) usando
ionizao por electrospray em modo de busca, na faixa de valores m/z 390-2000 em tandem
MS/MS. Para isso 10g de amostra referente aos grupos (G1-G16) foram ressuspendidas em
20l (0,5g/l) de cido frmico a 0,1% ento submetidas a nLC-ESI-MS/MS. O HPLC de
fase reversa nanoflow foi desenvolvido com gradiente linear de 85 minutos variando de 0 a 100
% de solvente B (cido frmico 0,1% em acitonitrila), em fluxo de 200 nL/min, com presso
mxima de 280 bar (182).
Os dados de MS/MS foram confrontados com o banco de dados de protenas humanas
(UniProt
TrEMBL,
Swiss
Institute
of
Bioinformatics,
Geneva,
Switzerland,
http://ca.expasy.org/sprot) usando o algoritmo SEQUEST no software Proteome Discoverer 1.3

(Thermo Scientific, San Jose, CA, USA). Os filtros utilizados no SEQUEST como critrio
aplicado aos espectros MS/MS foram: 1.5; 2.5; 3.1; 3.1; 4.5 para o Xcorr aplicado em adio
ao filtro Percolator. Os resultados das buscas foram filtrados a uma taxa de falsas descobertas
de 1% utilizando uma estratgia de pesquisa de banco de dados inversa.
54
Para anlise protemica quantitativa, trs arquivos a partir dos dados MS de cada grupo
foram analisados usando o software SIEVE (Verso 2.0 Thermo Scientific, San Jose, CA,
EUA). O fluxo de trabalho experimental do SIEVE foi definido como controle de comparao
para as anlises, onde uma classe de amostras comparada com uma ou mais diferentes classes
de amostras. Neste estudo, as seguintes amostras foram comparadas: G1 X G9, G2 X G10, G3
X G11, G5 X G13, G6 X G14, G7 X G15, G8 X G16, G1 X G2, G3 X G4, G5 X G6, G7 X G8,
G11 X G12, G13 X G14.
Para a etapa de alinhamento, um nico arquivo MS pertencente ao grupo padro para
essa comparao foi selecionado como o arquivo de referncia e todos os outros processos
foram ajustados para gerar a melhor correlao a este. Aps o alinhamento, os processos de
deteco e integrao (ou framing) foram realizados utilizando o nvel de dados MS com um
recurso denominado ''quadros de MS2 Scans''. Com este tipo de enquadramento (framing),
somente os valores MS com razo massa-carga (m/z) associados s anlises MS2 foram
utilizados. Quaisquer medies de m/z que no estivessem presentes em MS2 foram ignoradas.
O software gerou ento os quadros (frames), e a partir da integrao foram feitas as anlises
estatsticas para cada quadro. Em seguida as sequncias de peptdeos obtidas a partir da
pesquisa de banco de dados usando o Algoritmo SEQUEST no Proteome Discoverer 1.3 foram
importadas para o SIEVE. O filtro Percolator foi aplicada s sequncias peptdicas durante a
importao, eliminando todas as sequncias com q-value maiores que 1% (taxa de falsa
deteco). Os peptdeos foram agrupados em protenas e ento foi calculada a relao de
protenas e o valor de p. A abundncia relativa de uma protena individual foi considerada
significativamente diferente quando os valores observados foram, 0,75 para diminuio e 1,25
para aumento de abundncia. Alm disso, foi considerado o valor de p <0.05, como descrito
(182) .
4.2.7.2
Anlise protemica da saliva por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo
dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE) associada eletroforese em gel de poliacrilamida (native

cationic)
Foi realizada ainda a separao proteica atravs da separao baseada na diferena de

peso molecular, utilizando a tcnica de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil
55
sulfato de sdio (SDS-PAGE) a 12% (182). Para esse ensaio foram utilizadas 35 g por grupo
ressuspendidas em 15 l de tampo de amostra de SDS (0.125 M TrisHCl, 4% SDS, 2% de
glicerol, 10% 2 mercaptoetanol). Para controle foi utilizado 5 l do padro Precision Plus
Protein All Blue Standards (10-250 kD) (Bio-Rad Laboratories Ltd., Mississauga, ON,
Canada). Os gis foram corados com 0.2% Coomassie Brilliant Blue em 40% de metanol, 10%
de cido actico para o volume final de 1litro. A descolorao foi feita em 40% de metanol,
10% de cido actico e 50% de gua. Os resultados foram analisados em Image Lab software
(Bio-Rad). Aps isso, as bandas evidenciadas por SDS-PAGE foram retiradas do gel,
descoloridas, tratadas com acetonitrile, digeridas (com soluo de tripsina a 1g/0,1ml) e
purificadas em microcolunas de fase reversa (ZipTip Pipette Tips Millipore) e ento
submetidas nLC-ESI-MS/MS.
A anlise quantificativa de histatinas (1, 3 e 5) foi realizada por eletroforese em gel de
poliacrilamida (native cationic) (183). Protenas catinicas migram do nodo para o ctodo
durante a eletroforese. Para isso, 25 g de protenas dos grupos referentes saliva parotdea
(G5-G8, G13-G16) foram dissolvidas em tampo de amostra (4g de sacarose, 4mg de Methyl
Green para volume final de 10 ml). Os gis de empilhamento e de separao foram
polimerizados sob incidncia de luz (120 volts e 60 volts respectivamente) por 2 horas cada.
Como controle foram utilizados 2g de cada histatina (1, 3 e 5). Os gis foram corados com
0.1% Coomassie Brilliant Blue em 8% de metanol, 7% de cido actico para o volume final
de 1litro. A descolorao foi feita em 40% de metanol, 10% de cido actico e 50% de gua.
Os resultados foram analisados em Image Lab software (Bio-Rad).
4.2.7.3 Ensaio imunoenzimtico (Elisa)
A quantificao da concentrao de amilase salivar foi realizada nos 16 grupos.

Portanto, como antgeno para sensibilizao da microplaca foi utilizada a amilase (178). As
amostras dos 16 grupos (100 L) e os padres foram adicionadas placa de 96 poos e
incubados por 1 hora a 37C. Em seguida, a microplaca foi lavada 3 vezes com 250 L de
soluo salina tamponada (250 L Tris Buffered Saline -TBS) por poo. Aps a lavagem, foram
adicionados 200 L de TBST contando 3% de BSA em cada poo, com a finalidade de bloquear
os stios no cobertos e a placa foi incubada a 4C overnight. A placa foi ento lavada trs vezes
56
com TBST (250 L por poo).

O anticorpo primrio para amilase utilizado foi o anti-alfa amilase (diluio 1:1000, PA
1- 29115, Pierce Biotechnology, IL, USA) diludo em TBST contando 1% de BSA que foi
incubado (100 L por poo) por 1 hora a 37C. A placa foi lavada com trs vezes com TBST e
ento o anticorpo secundrio horse radish peroxidase ligado ao anti-rabbit IgG (diluio de
1:5000 em TBST contando 1% de BSA, Rockland, PA, USA) foi adicionado a placa (100 L
por poo) e incubado a temperatura ambiente por 1 hora, em um ambiente escuro. Aps duas
lavagens com TBST e uma com TBS, foi adicionado o OPD (o-phenylediamine
dihydrochloride, Sigma-Aldrich, MO, USA) e incubado por 30 minutos a temperatura ambiente
em local escuro. Aps a incubao foi adicionado H2SO4 a 10% (50 L por poo) e o produto
foi analisado em espectofotmetro ajustado ao comprimento de onda de 490nm. Para a curva
padro foram utilizadas as seguintes concentraes de amilase: 1g/mL, 0.75g/mL, 0.5g/mL,
0.25g/mL, 0.1g/mL. O experimento foi realizado em triplicata.
57
Captulo 1
Resultados referentes :
5.1 Avaliao da sade periodontal, ndice de crie e ndice de placa

5.2 Avaliao das caractersticas faciais
5.3 Fluxo salivar, pH e capacidade tampo.
5.4 Atividade da amilase salivar
Discusso
58
RESULTADOS
Dos 15 indivduos com SM, 7 eram do gnero feminino (46,7%) e 8 eram do gnero
masculino (53,3%). Dos 15 indivduos do grupo controle, 6 eram do gnero feminino (40%) e
9 do gnero masculino (60%) (Tabela 1).
Tabela 5.1- Dados demogrficos dos participantes do estudo
Grupos
Grupo SM
Grupo
controle
Gnero
Etnia
Idade
masculino
feminino
branco
negro
mdia mediana
8 (53,3%)
7 (46,7%)
12 (80%)
3 (20%)
13,23
14
9 (60%)
6 (40%)
13 (86,67%)
2 (13,33%)
13,43
13,81
O grupo formado por indivduos com SM apresentava faixa etria entre 4 e 21, com mdia
de idade de 13,23 e mediana de 14. O grupo controle apresentava idade entre 10 e 19, com
mdia de 13,43 e mediana de 13,81 (Tabela 5.1).
5.1 Avaliao da sade periodontal, ndice de crie e ndice de placa
Em relao a sade periodontal, a maioria dos indivduos com SM apresentou gengivite,

enquanto que a maior parte dos pacientes do grupo controle apresentou boa sade periodontal.
O grupo Moebius apresentou escores superiores de PSR quando comparado ao grupo controle.
Dentre os 15 participantes afetados pela SM, 4 apresentaram os ndices PSR iguais a 0
(zero), que indica boa sade periodontal; 6 indivduos apresentaram PSR igual a 1 (sangramento
a sondagem); 2 indivduos apresentaram PSR igual a 2 (gengivite ou periodontite leve); e 3
indivduos apresentaram PSR igual a 3 (periodontite moderada). No grupo controle, 9
indivduos apresentaram PSR igual a 0 (zero), isto , boa sade periodontal; 5 indivduos
apresentaram PSR igual a 1; apenas 1 indivduo apresentou PSR igual a 2; e nenhum paciente
59
apresentou PSR igual a 3. O grupo SM apresentou mdia de PSR superior (p<0,05) ao do grupo
controle (Tabela 5.2).
Dos 15 indivduos com SM avaliados, 9 apresentaram ndice de placa inferior a 1,
representando pouco acmulo de placa; e 6 pacientes apresentaram ndice de placa entre 1 e 2,
representando um moderado acmulo de placa. Em relao ao grupo controle, dos 15 indivduos
avaliados, 10 indivduos apresentaram ndice de placa entre 0 e 1 (pouco acmulo de placa)\ e
5 indivduos apresentaram ndice de placa entre 1 e 2 (acmulo moderado de placa). A mdia
do ndice de placa do grupo de Moebius foi 0,99, e maior que a do grupo controle, que foi de
0,75, contudo no houve diferena estatisticamente significante entre os grupos (Tabela 5.2).
Tabela 5.2 Mdias do fluxo da saliva total no estimulada (NE), total estimulada (ES) e das glndulas partidas direita (PD) e esquerda (PE),
pH inicial, capacidade tampo da saliva ES, e ndices de doena periodontal (PSR), placa e ICDAS de indivduos do grupo Mebius
e controle
Controle
Anlise
Mdia
15
13,43
Idade
15
0,47
PSR
15
0,75
Placa
15
0,68
NE (ml/min)
15
1,19
ES (ml/min)
15
0,32
PD (ml/min)
15
0,33
PE (ml/min)
15
7,43
pH inicial ES
15
471,33
pH 7,0 (ul/ml)
15
1150,67
6,9-6,0
15
493,33
5,9-5,0
15
325,33
4,9-4,0
14
0,24
ICDAS - Corte 1
14
0,19
ICDAS - Corte 2
14
0,07
ICDAS - Corte 3
14
0,02
ICDAS - Corte 4
14
0,01
ICDAS - Corte 5
(*) Teste de Mann-Whitney
Moebius
Desvio
padro
2,65
0,64
0,44
0,34
0,5
0,23
0,17
0,19
340,94
928,79
338,69
294,71
0,21
0,16
0,07
0,03
0,01
Mdia
15
15
15
15
15
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13,23
1,27
0,99
0,17
0,45
0,15
0,14
7,39
466,67
643,08
239,23
265,38
0,47
0,49
0,11
0,05
0,04
Desvio
padro
5,59
1,1
0,57
0,13
0,28
0,22
0,16
0,21
250,25
239,49
52,99
82,83
0,38
0,35
0,12
0,06
0,06
Valor p*
0,922
0,033
0,191
<0,001
<0,001
0,01
0,01
0,779
0,751
0,013
<0,001
0,595
0,126
0,012
0,292
0,056
0,108
60
61
Em relao ao ndice de crie, a ocorrncia das leses de crie foi mais alta entre os
participantes com SM em todos os limiares. O ICDAS apresentou valores superiores no grupo
Moebius, sendo significativa ao nvel de 5% apenas no Corte 2, porm, como mostra o Anexo
D, a correlao entre os cortes do ICDAS moderada para alta. O que indica que essa relao
pode ser importante em todos os cortes (Anexo D).
5.2 Avaliao do comprometimento motor
Os pares de nervos avaliados foram agrupados por indivduo, conforme os nervos

afetados (VII, VI, IV, III, II, XII, V, XI) e o grau de acometimento. Os resultados demostram a
ampla variabilidade de acometimento pela sndrome, e denota que no h um padro bilateral
de acometimento (Anexo E).
5.3 Fluxo salivar, pH e capacidade tampo
Indivduos com SM apresentaram fluxo de saliva no estimulada (NE), saliva

estimulada (ES), saliva da partida direita (PD) e saliva da partida esquerda (PE) menor em
relao ao grupo controle.
A mdia referente ao pH inicial da saliva estimulada do grupo Moebius foi semelhante
ao do grupo controle, como mostra a Tabela 5.2.
A capacidade tampo da saliva estimulada foi analisada de acordo com a quantidade de
cido (soluo de HCL a 0,01N) adicionado saliva durante os seguintes intervalos de pH: pH
inicial pH 7,0; pH 6,9 pH 6,0; pH 5,9 pH 5,0; pH 4,9 pH 4,0. A capacidade tampo da
saliva estimulada dos indivduos com Moebius foi menor em todas as faixas de pH analisadas,
em relao aos controles. Na faixa entre pH 6,9 6,0, a quantidade de cido adicionado foi
maior para os dois grupos estudados (Moebius e controle). As faixas de pH entre 6,9 6,0 e 5,9
5,0 apresentaram maior resistncia ao cido no grupo controle quando comparado ao grupo
Moebius. Esta diferena foi estatisticamente significante (P<0,05) (Tabela 5.2).
62
Foi realizada a correlao entre os ndices clnicos como ndice periodontal (PSR), ndice
de crie (ICDAS) com o ndice de placa e com os achados salivares como fluxo salivar,
capacidade tampo e pH. O PSR no exibiu correlao com nenhum aspecto avaliado, como
fluxo salivar (saliva no estimulada, estimulada e parotdea bilateral), placa, pH e capacidade
tampo (Apndice B).
A Tabela 5.3 aponta correlaes de Pearson entre os cortes do ICDAS e as variveis
coletadas. Nota-se correlao entre medidas de fluxo (saliva no estimulada e saliva partidea)
e ICDAS de indivduos com SM (Tabela 5.3).
Tabela 5.3 - Correlao entre achados clnicos como ndice de crie ICDAS (Cortes 1 a 5) com aspectos
salivares
Varivel
Idade
PLACA
NE (ml/min)
ES (ml/min)
PD (ml/min)
PE (ml/min)
pH inicial ES
pH 7,0 (ul)
6,9-6,0
5,9-5,0
4,9-4,0
Proporo sobre o nmero de dentes

Corte 1 Corte 2 Corte 3 Corte 4 Corte 5
-0,336
-0,121
-0,241
-0,122
-0,275
0,188
0,324
0,046
-0,027
0,092
-0,43*
-0,451*
-0,286
-0,415*
-0,498*
-0,306
-0,366
-0,265
-0,201
-0,087
-0,164
-0,268
-0,367
-0,274
-0,233
-0,214
-0,423* -0,414* -0,502*
-0,415*
-0,083
0,056
-0,043
0,096
-0,003
0,104
0,087
0,057
0,091
-0,091
-0,276
-0,463*
-0,281
-0,31
-0,215
-0,55*
-0,717*
-0,52*
-0,474*
-0,513*
-0,338
-0,224
-0,29
-0,26
-0,246
(*) valor p < 0,05 para testar nulidade do coeficiente
Em relao a regresso beta realizada para analisarmos a influncia da saliva no

estimulada no ICDAS, quando comparados indivduos com um baixo fluxo de saliva no
estimulada, o ICDAS dos indivduos com SM tende a ser superior ao do controle. Porm, se o
fluxo do paciente com a sndrome for ligeiramente superior (em relao a outros pacientes com
sndrome), em torno de 0,2, a 0,3 ml/min o seu ICDAS tende a ser similar ao do indivduo
controle. O fluxo no est associado ao ICDAS no grupo controle (Figuras 5.1 e 5.2 e Apndice
C e D).
63
Figura 5.1 - Valores preditos para o Corte 1 do ICDAS segundo NE (ml/min) e Grupo, fixando PE em
0,3 ml/min
Figura 5.2 - Valores preditos para o Corte 2 do ICDAS segundo NE (ml/min) e Grupo, fixando PE em
0,3 ml/min
64
Notou-se correlao entre fluxo de saliva no estimulada em todos os cortes de ICDAS,

com exceo do 3. Essa correlao associa o baixo fluxo salivar ao alto ndice de crie. O fluxo
de saliva parotdea esquerda mostrou correlao com todos os cortes de ICDAS com exceo
do corte 1. A capacidade tampo, na faixa entre 6,9 6,0 mostrou correlao com o corte 2. A
faixa entre 5,9 5,0 mostrou correlao com todos os cortes do ICDAS (Tabela 5.3). Ou seja,
a capacidade tampo reduzida dos indivduos com SM apresenta relao com o ndice de crie.
Foi realizada ainda a anlise relacionando o fluxo de partida direita e partida esquerda
segundo o lado da paralisia do caso. Testou-se esses valores segundo os lados da paralisia pelo
teste no paramtrico de Kruskal-Wallis com valores de p respectivos 0,307 e 0,921. Desse
modo, no houve correlao entre o lado acometido pela sndrome e o fluxo parotdeo referente
a esse lado.
5.4 Atividade da amilase salivar
A saliva no estimulada e a saliva estimulada apresentaram atividade de amilase salivar

significantemente maior (P<0,05) em indivduos com SM quando comparada ao grupo de
indivduos sem a sndrome. No houve diferena estatisticamente significante para a saliva
parotdea entre o grupo controle e o grupo de SM (Figura 5.3).
65
2,5
Amilase salivar (U/mg)
*
1,5
0,5
Grupos de saliva de indivduos com SM e controle

Figura 5.3 - Atividade da enzima amilase salivar (U/mg) para indivduos do grupo de SM e controle
(*P<0,05)
66
7 DISCUSSO
Nossos resultados confirmaram a nossa hiptese de que pessoas com a SM tm mais leses
de cries e que este grupo tambm exibe fluxo salivar diminudo, capacidade tampo
prejudicada e alterao em sua composio, quando comparada ao grupo controle. Alm disso
os participantes com a SM exibiram maiores ndices de doena periodontal e crie, embora no
tenha sido observada diferena no ndice de placa.
Acreditamos que a diminuio do fluxo de saliva no estimulada que constatamos nos
indivduos com SM, esteja relacionada com o envolvimento do nervo facial (VII), uma vez que
ele responsvel pela inervao parassimptica das glndulas submandibular e sublingual
(184). Nenhum autor, dentro do nosso conhecimento, havia, at o momento apontada essa
caracterstica da SM.
Mais ainda, sabe-se que a manuteno da populao progenitora de clulas
indiferenciadas essencial para o desenvolvimento de rgos, tais como as glndulas salivares
submandibulares. Um recente estudo demonstrou que a inervao parassimptica mantm essas
clulas em estado indiferenciado, o que essencial para a organognese. Desse modo, uma vez
que indivduos com SM apresentam provvel deficincia de inervao parassimptica das
glndulas submandibulares e sublinguais, devido ao acometimento do nervo facial pela SM,
eles podem exibir alterao no desenvolvimento dessas glndulas. Nesse aspecto, estudos de
imagem seriam importantes para avaliarem o grau de desenvolvimento morfolgico das
glndulas salivares de indivduos com SM (185, 186)
Segundo Navazesh et al. (71), fluxo de saliva no estimulada que varie entre a faixa de
0,12 a 0,16 ml/min pode ser considerado hipofuno das glndulas salivares. Nossos resultados
mostraram mdia do fluxo salivar de indivduos com SM de 0,169 ml/min, e 9 indivduos com
fluxo inferior a 0,16 ml/min. O fluxo salivar diminudo, como o fluxo salivar estimulado
variando 0,8-1,0 ml / min, considerada uma condio patolgica e tem sido um forte indicador
de um risco aumentado para crie (187). Nos indivduos com SM a mdia de fluxo salivar
encontrada foi muito inferior (0,452 ml/min), sendo que em todos os indivduos avaliados o
maior fluxo foi de 0,9 ml/min. Uma vez que os indivduos que participaram do presente estudo
no tinham nenhuma outra alterao concomitante com a SM, tal como espectro autista ou
dficit mental, a diminuio significante no fluxo salivar pode ser um dos fatores que
67
justificariam a maior incidncia de crie apesar da higienizao adequada realizada pelos

mesmos, representada pela ausncia de diferena estatstica entre os ndices de biofilme.
Em relao a crie, o baixo fluxo salivar apresenta maior embasamento cientfico do
que a diminuio da capacidade tampo (187). Alguns estudos realizados com indivduos
classificados como crie ativos e livres de crie demonstraram reduo da capacidade
tampo em indivduos crie ativos (188, 189). Contudo, no est bem estabelecido a influncia
da atividade da capacidade tampo no processo de estabelecimento de crie, uma vez que a
literatura apresenta resultados contraditrios (190-192).
Em nosso estudo, os indivduos SM expressaram uma reduo na capacidade tampo na
faixa entre 6,9-6,0, e na faixa de 5,9-5,0. Na faixa de pH de 6,9-6,0 foi necessrio adicionar
mais cido para a reduo do pH para ambos os grupos. Este fato pode ser explicado pelo tipo
de sistema tampo envolvido neste processo na saliva estimulada. A capacidade tampo da
saliva estimulada regulada principalmente pelo sistema de bicarbonato e da saliva no
estimulada pelo sistema fosfato, os quais apresentam valor de pK em torno do pH 6,1 e 6,8,
respectivamente (177). Portanto, os indivduos com SM podem apresentar reduo na funo
do sistema tampo bicarbonato. O fluxo salivar parece estar associado capacidade tampo,
sendo que qualquer fator responsvel pela diminuio no fluxo salivar tende a diminuir tambm
a capacidade tampo da saliva (49, 191). No nosso estudo, os indivduos com SM apresentaram
tanto o fluxo de saliva estimulada reduzido, quanto diminuio da capacidade tampo dessa
saliva. E houve relao entre essa diminuio e maior frequncia de leses de crie.
No nosso estudo no houve correlao entre a condio periodontal encontrada em
indivduos com SM e a diminuio da capacidade tampo ou a diminuio dos fluxos salivares.
Todavia, realmente difcil estabelecer uma conexo precisa entre esses parmetros devido ao
fator etiolgico complexo da doena periodontal que envolve vrios nveis, como o microbiano,
o hospedeiro, o status de sade e fatores ambientais. No est estabelecido o papel da
capacidade tampo e sua influncia da progresso periodontal, uma vez que h resultados muito
contraditrios na literatura (193-196). Nesse contexto torna-se necessria a realizao de
estudos clnicos longitudinais avaliando a relao da capacidade tampo e o fluxo salivar com
os parmetros da doena periodontal como perda de osso e formao de clculo.
Todos os fluxos salivares avaliados (saliva estimulada, no estimulada e parotdea
bilateral) estavam reduzidos no grupo Moebius, quando comparados ao grupo controle (Tabela
5.2). Os estudos recentes tm correlacionado composio salivar e formao de pelcula
68
adquirida com um aumento da susceptibilidade para o desenvolvimento de crie em indivduos

saudveis (197, 198).
Nossos resultados demonstraram o aumento na atividade da amilase salivar em
indivduos com SM, quando comparados aos controles, para a saliva estimulada e no
estimulada. importante salientar que a quantidade dessa enzima no pode ser diretamente
relacionada sua atividade, portanto, um aumento na sua capacidade no significa
necessariamente um aumento na sua quantidade.
Streptococcus mutans desempenha um papel fundamental na modulao da transio de
forma no-patognica para a forma altamente cariognica do biofilme. Na cavidade bucal, h
interao de componentes bacterianos e salivares com carboidratos nos biofilmes aderidos
sobre a superfcie do dente. A alfa amilase possui a capacidade de digerir amido em maltose,
maltodextrinas e outros oligossacardeos. Portanto, ocorre maior disponibilidade de
suprimentos para algumas bactrias entre elas, Streptococcus mutans. H evidencias que
demonstram que a interao da sacarose e amido com alfa amilase e glicosiltransferases de
estreptococos podem modular o desenvolvimento de biofilme modificando tanto sua estrutura
quanto seu metabolismo. Essas interaes podem ainda aumentar a patogenicidade do
Streptococcus mutans dentro do biofilme (199, 200). Desse modo, todas essas alteraes
poderiam contribuir para aumentar o risco para o estabelecimento de leses de crie nos
indivduos com SM. Contudo mais estudos so necessrios a fim de avaliar essa hiptese, como
por exemplo, avaliao microbiolgica do biofilme desses indivduos.
Em relao ao acometimento facial pela SM Rucker, Webb (201) caracterizaram o perfil
de deficincia em relao movimentos oculares e faciais s de 40 indivduos com SM. Desses,
37 apresentaram fraqueza facial em ambos os lados e 3 apresentaram em apenas um dos lados.
Todos os 15 participantes de nosso estudo, com a SM, apresentaram fraqueza facial bilateral.
Contudo, o acometimento facial encontrado no era simtrico, sendo que em 13 indivduos,
havia predomnio da paralisia em um dos lados da face.
Uma possvel explicao para a diminuio da atividade parotdea em pessoas com a
SM seria a possvel influncia da corda do tmpano, ramo no nervo facial, na inervao da
glndula partida (202, 203). Apesar desse fato ser inconclusivo devido a achados
contraditrios na literatura, alguns estudos sugerem que no apenas fibras do nervo
glossofarngeo influenciem o fluxo parotdeo, mas tambm fibras do nervo facial (nervo corda
do tmpano) (202). Contudo deve-se ressaltar que mais estudos devem ser feitos visando estudar
69
o papel da corda do tmpano na secreo de saliva parotdea e sua relao fisiolgica com essa
glndula.
Keur et al., (204), estudou a relao entre fluxo de partida em indivduos com paralisia
de Bell. Os autores relataram que no houve diferena no fluxo parotdeo entre esses indivduos
e os controles. Tambm no houve diferena entre o lado afetado pela paralisia e o lado
considerado saudvel. Nossos resultados demostraram que no houve correlao entre o lado
afetado e o fluxo parotideo, contudo, indivduos com SM apresentaram fluxo protdeo reduzido.
Tal achado pode ser explicado devido ao acometimento congnito de mltiplos nervos
cranianos pela sndrome de Moebius, diferentemente da paralisia de Bell, que acomete apenas
o nervo facial tardiamente (205). Outro fator que pode estar relacionado, contudo no h
pesquisas acerca do assunto, a influncia da SM e dos nervos que podem ser acometidos pela
sndrome na formao e desenvolvimento das glndulas salivares desses indivduos.
Nossos resultados sugerem que as alteraes salivares encontradas em indivduos com
SM, como reduo do fluxo salivar e baixa capacidade de tamponamento, podem estar
relacionadas com alguns achados clnicos desses indivduos, como maior frequncia de leses
de crie. Assim, nossos resultados podem fornecer informaes adicionais importantes sobre
maior susceptibilidade de crie em indivduo com SM. Estes achados clnicos, associados
capacidade tampo e fluxos reduzidos reforam a importncia do acompanhamento e uso de
mtodos motivacionais e de preveno de crie e doena periodontal entre esses pacientes.
A aplicabilidade dos resultados est diretamente relacionada com os procedimentos
clnicos que devem ser adotadas durante o planejamento do tratamento odontolgico de
portadores de SM. Os dentistas devem estar cientes de que esses pacientes tm muitas
caractersticas inerentes da sndrome que favorecem o estabelecimento de leses de cries e o
desenvolvimento de doena periodontal. Algumas destas caractersticas foram evidenciados
pelo nosso estudo, tais como baixo fluxo salivar e capacidade tampo modificado. Portanto, a
identificao de leses de mancha branca incipientes no deve ser subestimada e deve receber
a ateno imediata de um dentista. Alm de diagnostic-las, o dentista deve trat-los
prontamente e utilizar estratgias preventivas com base na caracterstica de reversibilidade da
leso.
70
Captulo 2
7 Resultados referentes anlise protemica:

7.1 Cromatografia lquida tandem espectrometria de massas
7.1.1 Identificao das protenas
7.1.2 Razo de abundncia de protenas na quantificao relativa da saliva
7.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sdio (SDSPAGE) associada eletroforese em gel de poliacrilamida (native cationic)
7.3 Teste imunoenzimtico (Elisa)
8 Discusso
71
7 RESULTADOS
Os resultados foram organizados conforme a tcnica protemica utilizada.
7.1 Cromatografia lquida tandem espectrometria de massas
Para a realizao da metodologia cromatografia lquida tandem espectrometria de

massas dois passos foram empregados: a identificao das protenas e arazo de abundncia
de protenas na quantificao relativa da saliva
7.1.1 Identificao das protenas
Primeiramente foram comparadas as amostras de indivduos com SM e controles em

relao saliva no estimulada, para ambos os parmetros, acima e abaixo do fluxo salivar do
grupo. Desse modo, 4 grupos de saliva no estimulada estavam inclusos: SM acima do fluxo
salivar (G1), SM abaixo do fluxo salivar (G2), controles acima do fluxo salivar (G9) salivar e
controles abaixo do fluxo salivar (G10). Foram encontradas um total de 1246 protenas, sendo
que 89 eram exclusivas do G1, 325 encontravam-se apenas no G2, 187 apenas no G9 e 441
apenas no G10. Os quatro grupos apresentaram 29 protenas semelhantes, tais como -amilase,
anidrase carbnica, albumina, mucina-19, mucina 5B, cistatina S, cistatina SN, mucina 5 C,
entre outras. Foram encontradas 16 protenas comuns aos grupos G1 e G2, 8 protenas comuns
aos grupos G1 e G9, 13 aos grupos G1 e G10, 24 protenas aos grupos G2 e G9, 49 protenas
aos grupos G2 e G10 e 26 protenas comuns aos grupos G9 e G10. Para os grupos G1, G2 e G9,
foram encontradas 5 protenas comuns a todos esses grupos. Quando analisados os grupos G1,
G2 e G10, eles apresentavam 9 protenas semelhantes (Figura 7.1).
72
Figura 7.1 - Diagrama de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em cada
grupo e suas interrelaes; G1- Saliva no estimulada de SM (fluxo acima); G2- - Saliva
no estimulada de SM (fluxo abaixo); G9- Saliva no estimulada dos controles (fluxo
acima), G10- Saliva no estimulada dos controles (fluxo abaixo)
Para a anlise da saliva estimulada, foram utilizadas amostras de indivduos com SM

e do grupo controle, para ambos os parmetros, acima e abaixo da mdia de fluxo do grupo.
Assim, 4 grupos de saliva estimulada foram includos: SM acima do fluxo salivar (G3), SM
abaixo do fluxo salivar (G4), controles acima do fluxo salivar (G11) salivar e controles abaixo
do fluxo salivar (G12). Um total de 833 protenas foram encontradas, sendo que 298 eram
exclusivas do G3, 193 do G4, 153 do G11 e 53 encontravam-se apenas no G12. Os quatro
grupos apresentaram 16 protenas em comum, tai como -amilase, albumina, anidrase
carbnica, mucina 5B, cistatina S, cistatina SN, cistatina B, entre outras. Foram encontradas 19
protenas comuns aos grupos G3 e G4 (como mucina 17), 27 comuns aos grupos aos grupos G3
e G11, 17 comuns aos grupos G4 e G11, 8 aos grupos G11 e G12, 13 aos grupos G3 e G12 e 6
aos grupos G4 e G12. Para os grupos G3, G4 e G11 foram encontradas 11 protenas em comum
e 10 protenas em comum para os grupos G3, G11 e G12. Para os grupos G4, G11 e G12 foram
encontradas 2 protenas em todos os grupos. Para os grupos G3, G4 e G12 foram encontradas
7 protenas em comum nesses grupos (Figura 7.2).
73
Figura 7.2 - Diagrama de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em

cada grupo e suas interrelaes; G3- Saliva estimulada de SM (fluxo acima); G4Saliva estimulada de SM (fluxo abaixo); G11- Saliva estimulada dos controles
(fluxo acima), G12- Saliva estimulada dos controles (fluxo abaixo)
A anlise proteica tambm foi realizada nas amostras de saliva proveniente da

partida direita, tanto para indivduos com SM quanto para controles, respeitando os parmetros
relativos ao fluxo salivar do grupo. Desse modo, 4 grupos referentes a saliva de partida direita
foram avaliados: indivduos com SM acima do fluxo salivar (G5), indivduos com SM abaixo
do fluxo salivar (G6), controles acima do fluxo salivar (G13), controles abaixo do fluxo salivar
(G14). Um total de 1008 protenas foram observadas, sendo que 11 encontravam-se apenas no
grupo G5, 28 apenas no G6 (entre elas a cistatina C), 315 exclusivas do G13 e 536 exclusivas
do G14. Os quatro grupos apresentaram 6 protenas em comum (dentre elas a anidrase carbnica
e a -amilase). Apenas 1 protena foi comum aos grupos G5 e G6, 1 protena ao grupo G5 e
G13, 3 protenas comuns aos grupos G5 e G14, 3 protenas comuns aos grupos G6 e G13, 14
protenas comuns aos grupos G6 e G14 e 75 protenas comuns aos grupos G13 e G14. Para os
grupos G5, G6 e G14 foram encontradas 2 protenas em comum e 2 protenas em comum para
os grupos G5, G13 e G14. Para os grupos G6, G13 e G14 foram encontradas 11 protenas em
todos os grupos (Figura 7.3).
74
Figura 7.3 - Diagrama de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em cada
grupo e suas interrelaes; G5- Saliva parotdea direita de SM (fluxo acima); G6- Saliva
parotdea direita de SM (fluxo abaixo); G13- Saliva parotdea direita dos controles (fluxo
acima), G14- Saliva parotdea direita dos controles (fluxo abaixo)
Para avaliao da saliva de partida esquerda, foram analisadas amostras de

indivduos com SM e controles, levando em considerao o fluxo salivar dos mesmos. Desse
modo, 4 grupos de saliva parotdea esquerda foram avaliados: indivduos com SM acima do
fluxo salivar (G7), indivduos com SM abaixo do fluxo salivar (G8), controles acima do fluxo
salivar (G15), controles abaixo do fluxo salivar (G16). Foram encontradas um total de 702
protenas, sendo que 16 eram exclusivas do G7, 95 encontravam-se apenas no G8, 248 apenas
no G15 e 235 apenas no G16. Os quatro grupos apresentaram 10 protenas semelhantes (entre
elas a -amilase e a anidrase carbnica). Foram encontradas 3 protenas comuns aos grupos G7
e G8, 9 protenas comuns aos grupos G7 e G15, 5 aos grupos G7 e G16, 10 protenas aos grupos
G8 e G15, 16 protenas aos grupos G8 e G16 e 34 protenas comuns aos grupos G15 e G16.
Para os grupos G7, G8 e G15, foram encontradas 2 protenas comuns a todos esses grupos.
Quando analisados os grupos G7, G8 e G16, eles apresentavam 2 protenas semelhantes. Os
grupos G7, G15, G16 apresentavam 2 protenas em comum. Para os grupos G8, G15 e G16,
foram encontradas 15 protenas semelhantes (Figura 7.4).
75
Figura 7.4 - Diagrama de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em cada grupo
e suas interrelaes; G7- Saliva parotdea esquerda de SM (fluxo acima); G8- Saliva
parotdea esquerda de SM (fluxo abaixo); G15- Saliva parotdea esquerda dos controles
(fluxo acima), G16- Saliva parotdea esquerda do grupo controle (fluxo abaixo)
Foram tambm estabelecidas as interseces entre o grupo composto por saliva no

estimulada de indivduos com SM e o grupo de saliva no estimulada de indivduos sem SM
(controle). Um total de 1.246 protenas foram encontradas, sendo que 162 estavam em ambos
os grupos, 430 foram encontradas apenas nos indivduos com SM e 654 exclusivas do grupo
controle (Figura 7.5 A). Para interseces entre o grupo composto por saliva estimulada de
indivduos com SM e o grupo de saliva estimulada de indivduos controle, um total de 833
protenas foram encontradas. Dessas, 109 eram comuns a ambos os grupos, 510 eram exclusivas
da saliva estimulada de indivduos com SM e 214 eram exclusivas dos controles (Figura 7.5 B).
As interseces entre o grupo composto por saliva parotdea de indivduos com SM e o grupo
de saliva parotdea de indivduos controle revelaram um total de 1.378 protenas. Dessas, 125
protenas eram comuns aos dois grupos, 109 eram exclusivas dos indivduos com SM e 1.253
dos indivduos sem sndrome (Figura 7.5 C).
76
Saliva no estimulada
Moebius
Saliva no estimulada
Controle
162
430
654
Saliva estimulada
Moebius
Saliva estimulada
Controle
109
510
214
Saliva partida
Controle
Saliva partida
Moebius
125
109
1253
C
Figura 7.5 - Diagramas de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em cada
grupo e suas interrelaes.
77
7.1.2 Razo de abundncia das protenas na quantificao relativa da saliva
A partir da quantidade inicial de protenas encontradas nas comparaes prdeterminadas, foram estabelecidas as protenas que tiveram uma razo na quantificao relativa
entre os grupos comparados. Desse modo, a razo de abundncia de cada protena para cada
comparao estudada foi considerada significante quando o nvel de protena apresentava valor
<0,75 (para as protenas menos abundantes e >1,25 (para as protenas mais abundantes). Foram
realizados um total de 16 cruzamentos, dos quais 8 foram feitos entre grupo de indivduos com
SM (G1 a G8) e grupo controle (G9-G16). O restante visou avaliar a abundncia em relao ao
fluxo salivar dentro condio (SM ou Controle). A razo de abundncia e as protenas mais
abundantes em cada combinao entre os grupos est descrita na Tabela 7.1. A descrio
detalhada e a funo das protenas esto descritas nas Apndice F.
Tabela 7.1- Comparao entre dois grupos onde foi determinado o total de protenas quantificadas, a
quantidade de protenas que apresentaram razo de abundncia. Com base na razo entre
os grupos foi determinada a quantidade de protena mais abundante em cada grupo (<1,25
ou >0,75)
Razo
Total de
Protenas
Protenas com
Protenas com
entre os
protenas
com razo de razo de
grupos
quantificadas
abundancia
G9/G1
45
14
14
G2/G10
109
G3/G11
64
12
10
G5/G13
G6/G14
33
G7/G15
23
G8/G16
43
G1/G2
59
G3/G4
53
G5/G6
G7/G8
17
G12/G11
36
12
11
G13/G14
94
18
18
razo de
abundancia >0,75 abundancia <1,25
78
7.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE)

associada eletroforese em gel de poliacrilamida (native cationic)
O SDS-PAGE uma tcnica bioqumica responsvel pela separao de protenas e

peptideos baseado na diferena de peso molecular. Esta tcnica proporciona evidenciar da
separao das protenas e peptdeos atravs do seu tamanho. Foram feitas 4 comparaes para
saliva no estimulada (G9XG1, G10XG2, G1XG2, G9XG10) estimulada (G11XG3, G12XG4,
G3XG4, G11XG12) e parotdea direita e esquerda (G13XG5, G15XG7, G5XG7, G13xG15,
G14XG6 G16XG8, G6XG8, G14XG16). Em todos os casos o primeiro grupo foi considerado
como 100%, e comparado ao segundo grupo. No presente estudo foi possvel notar diferena
na quantidade de algumas bandas quando comparadas as amostras de indivduos com SM e
controle. Nota-se um aumento na intensidade de algumas bandas nos indivduos com SM,
principalmente aquelas relacionadas s protenas de alto peso molecular. Esse perfil foi
observado principalmente na saliva estimulada e no estimulada de indivduos com SM. As
amostras de partida tambm mostraram alteraes porem no seguiam um padro. A banda
correspondente amilase no apresentou grande variao entre os grupos analisados. A banda
8, que correspondia cadeia leve de imunoglobulina, tambm se mostrava mais intensa na
saliva estimulada e no estimulada de indivduos com SM. A banda 1, que continha Mucina5B, apresentou colorao mais intensas na saliva estimulada e no estimulada de indivduos
com SM (Tabelas 7.2 a 7.5) (Figuras 7.6 a 7.9).
As bandas cortadas dos gis SDS-PAGE que foram submedidas ao nLC-ESIMS/MS, confirmaram a presena das protenas de alto peso molecular (Muc 5B), peso
molecular mdio (amilase), e baixo peso molecular (cistatina) nas amostras estudadas (Figura
7.10).
A eletroforese em gel de poliacrilamida (native cationic) foi realizada com o objetivo
de analisar a quantidade de histatinas (1, 3 e 5) na saliva das partidas esquerda e direita de
indivduos com SM e controle. Comparando grupo controle com grupo SM, para os grupos
determinados como acima da mdia de fluxo salivar (G5, G7, G13 e G15), para ambas as
partidas, nota-se uma tendncia a maior abundncia de histatina 1, 3 e 5, tanto do lado direito
quanto esquerdo, em saliva parotdea de indivduos com SM. Houve exceo da Histatina-1
(G5XG13) e histatina-3 (G7XG15). Foram tambm confrontados os grupos controle com
grupos SM, para os grupos determinados como abaixo da mdia de fluxo salivar (G6, G8, G14
e G16). Nota-se que o G6 apresentou menor quantidade das trs histatinas quando comparado
79
ao grupo G14. O oposto foi observado para os grupos G8 e G16, onde os indivduos com SM
(G8) apresentaram maior quantidade de histatinas 1,2 e 3 quando comparados ao controle (G16)
(Tabelas 7.6 e 7.7; Figuras 7.11 e 7.12).
G9
G10
G1
G2
Standard
All Blue
Figura 7.6 - Bandas avaliadas atravs de SDS-PAGE para saliva no estimulada de indivduos com SM
(G1 e G2) e controles (G1 e G9)
Tabela 7.2 - Comparao, em porcentagem, das bandas de saliva no estimulada. O primeiro grupo de
cada comparao (grupo em negrito) foi considerado como controle, ou seja, 100%. Desse
modo, valores considerados positivos significam que o segundo grupo apresentou maior
concentrao na banda analisada (B1 a B13)
Bandas G9XG1 G10XG2 G1XG2 G9XG10

B1
30,2
27,3
1,3
3,6
B2
15,5
11,0
-3,5
0,5
B3
21,7
8,3
1,9
14,5
B4
25,3
23,3
-2,1
-0,5
B5
-3,9
8,8
2,1
-9,9
B6
24,2
21,3
-9,1
-7,0
B7
29,1
15,3
-9,8
1,1
B8
19,0
8,4
2,2
12,1
B9
1,8
24,7
-1,6
-19,6
B10
13,3
15,7
-11,0
-12,9
B11
9,8
-24,6
-35,0
-5,3
B12
52,1
2,8
-32,4
-0,1
B13
-11,2
-8,6
-22,5
-24,7
80
G11
G3
G12
G4
Standard
All Blue
Figura 7.7 - Bandas avaliadas atravs de SDS-PAGE para saliva estimulada de indivduos com SM (G3
e G4) e controles (G11 e G12)
Tabela 7.3 - Comparao, em porcentagem, das bandas de saliva estimulada. O primeiro grupo de cada
comparao (grupo em negrito) foi considerado como controle, ou seja, 100%. Desse
modo, valores considerados positivos significam que o segundo grupo apresentou maior
concentrao na banda analisada (B1 a B14)
Bandas
G11XG3 G12XG4 G3XG4 G11XG12
B1
39,5
11,3
-9,1
14,0
B2
24,6
17,1
-4,0
2,1
B3
19,5
4,8
9,1
24,3
B4
30,2
20,1
-1,9
6,4
B5
2,7
-3,7
-6,4
-0,2
B6
19,5
3,2
-9,0
5,4
B7
26,0
7,0
-2,6
14,6
B8
21,4
4,3
-2,7
13,3
B9
-11,1
11,6
1,6
-19,1
B10
4,8
12,0
7,3
0,4
B11
12,0
9,1
-5,5
-3,0
B12
-2,3
-4,7
-0,7
1,7
B13
-16,6
25,6
-1,6
-34,7
B14
-7,9
20,5
2,3
-21,8
81
G13
G5
G15
G7
Standard
All Blue
Figura 7.8 - Bandas avaliadas atravs de SDS-PAGE para saliva parotdea esquerda e direita (acima da
mdia de fluxo do grupo) de indivduos com SM (G5 e G7) e controles (G13 e G15)
Tabela 7.4 - Comparao, em porcentagem, das bandas de saliva parotdea esquerda e direita com fluxo
acima da mdia do grupo. O primeiro grupo de cada comparao (grupo em negrito) foi
considerado como controle, ou seja, 100%. Desse modo, valores considerados positivos
significam que o segundo grupo apresentou maior concentrao na banda analisada (B1 a
B14)
Bandas G13XG5
G15XG7
G5XG7
G13xG15
B1
B2
B3
B4
B5
-2,5
-0,6
1,4
45,9
-13,7
16,9
16,2
1,1
14,5
-9,7
30,6
5,6
-0,5
-27,4
9,7
8,9
4,9
0,9
5,9
-5,4
B6
9,4
20,1
-5,3
3,6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
B13
B14
11,8
28,7
31,4
30,8
15,1
26,9
61,5
-9,3
-1,8
3,4
10,6
17,7
11,8
10,1
6,3
-3,6
-3,1
-20,6
-24,4
-15,0
-20,7
-34,0
-22,0
14,2
8,3
2,2
-0,6
11,2
-8,7
-16,3
25,9
3,6
82
G14
G6
G16
G8
Standard
All Blue
Figura 7.9 - Bandas avaliadas atravs de SDS-PAGE para saliva parotdea esquerda e direita (abaixo da
mdia de fluxo do grupo) de indivduos com SM (G6 e G8) e controles (G14 e G16)
Tabela 7.5 - Comparao, em porcentagem, das bandas de saliva parotdea esquerda e direita com fluxo
abaixo da mdia do grupo. O primeiro grupo de cada comparao (grupo em negrito) foi
considerado como controle, ou seja, 100%. Desse modo, valores considerados positivos
significam que o segundo grupo apresentou maior concentrao na banda analisada (B1 a
B14)
Bandas
B1
B2
B3
B4
B5
B6
B7
B8
B9
B10
B11
B12
B13
B14
G14XG6
13,9
10,4
0,0
-2,2
-5,4
-3,2
-2,3
-5,7
-8,1
-6,9
-1,1
-8,7
-8,9
-12,4
G16XG8
-4,0
0,9
4,4
0,1
14,5
2,2
-6,8
6,9
13,6
9,8
8,3
36,5
32,8
-12,6
G6XG8
-9,1
4,1
2,4
-1,1
20,3
6,4
-5,8
3,2
20,0
9,8
11,2
38,5
25,8
-1,6
G14XG16
7,8
14,0
-1,9
-3,4
-0,5
0,7
-1,2
-8,9
-2,9
-6,9
1,5
-7,3
-13,7
-1,4
83
Figura 7.10 - SDS-PAGE mostrando identificao das respectivas bandas submedidas ao nLC-ESIMS/MS
Tabela 7.6 - Quantidade de histatinas (Hst) 1,3 e 5 (g) na saliva partidea dos grupos de Moebius e
controle com fluxo salivar acima da mdia (G5, G13, G7 e G15)
Protena
G5
G13
G7
G15
Histatina 1
0,13
0,17
0,24
0,19
Histatina 3
0,55
0,24
0,26
0,28
Histatina 5
0,80
0,73
0,80
0,54
Tabela 7.7 - Quantidade de histatinas (Hst) 1,3 e 5 (g) na saliva partidea dos grupos de Moebius e
controle com fluxo salivar acima da mdia (G6, G14, G8 e G16)
Protena
G6
G14
G8
G16
Histatina 1
0,18
0,30
0,28
0,15
Histatina 3
0,12
0,55
0,28
0,15
Histatina 5
1,06
1,52
1,38
1,23
84
Histatinas
(2g cada)
G5
G13
G7
G15
Histatina 1
Histatina 3
Histatina 5
Figura 7.11 - Quantificao de histatina 1, 3 e 5 (em g) provenientes em 25 g de saliva parotdea

esquerda e direita acima da mdia de fluxo do grupo (G5, G13, G7, G15) atravs da
eletroforese em gel de poliacrilamida (native cationic)
Figura 17.12 - Quantificao de histatina 1, 3 e 5 (em g) provenientes em 25 g de saliva parotdea

esquerda e direita acima da mdia de fluxo do grupo (G6, G14, G8, G16) atravs da
eletroforese em gel de poliacrilamida (native cationic)
85
7.3 Teste imunoenzimtico (Elisa)
Em relao a quantificao de amilase salivar, houve diferena estatstica (p<0,05) entre

os grupos G2XG10, G4XG12, G5XG13 e G6XG14. Os outros grupos no apresentaram
diferena estattica, sempre que comparado grupos de indivduos com SM com controle (Figura
7.13).
*
*
*
Figura 7.13 - Teste de ELISA com anticorpo anti-amilase (1:1000). A chave mostra a comparao
realizada entre os grupos e * representa p<0,05. Grupos de indivduos com SM (G1 e
G8) e controle (G9 e G16).
86
8 DISCUSSO
As alteraes bucais encontradas em indivduos com SM, tais como maior ndice
periodontal (PSR) e maior ndice de crie, denotam a importncia de um maior aprofundamento
em relao composio salivar de indivduos com SM. Uma vez que o fluxo salivar desses
indivduos encontra-se alterado e a SM envolve nervos responsveis pela inervao das
glndulas salivares, a nossa hiptese foi que a composio proteica da saliva desses indivduos
tambm estaria alterada. A secreo proteica salivar ocorre devido o processo de exocitose
principalmente das clulas acinares. Esse processo regulado pelo sistema nervoso simptico
e parassimptico nas glndulas salivares maiores. A secreo proteica controlada pelo sistema
nervoso autnomo que atravs da inervao simptica estimula a liberao de protenas dos
cinos presentes nas glndulas partida e submandibulares. A inervao parassimptica induz
o mesmo processo nos cinos das glndulas sublinguais bem como das glndulas partidas
(103, 206, 207).
Atravs da anlise dos diagramas de Venn possvel notar que as amostras de saliva de
indivduos com SM apresentam menor nmero de protenas do que indivduos controle, com
exceo da saliva estimulada. Mais ainda, na saliva parotdea essa caracterstica se acentua, ou
seja, havia muito mais protenas identificadas na saliva do grupo controle (1.378) do que do
grupo SM. Essa alterao na saliva estimulada pode ser justificada pela participao de outros
fatores na composio da saliva total (estimulada e no estimulada), tais como transudato da
mucosa oral, fludo crevicular, muco da cavidade nasal e faringe, clulas epiteliais descamadas,
produtos bacterianos, entre outros (47, 69). Uma vez que o fluxo salivar desses indivduos
encontrava-se diminudo, sugere-se que a SM afete tambm o perfil proteico da saliva desses
indivduos. Outro fator interessante o tipo de estmulo aplicado para o estmulo da saliva total
(mastigao) e parotdea (gustatrio), o que pode ter influenciado na secreo de protenas.
Uma vez que o paladar de indivduos de SM pode encontrar-se alterado devido ao
acometimento do nervo facial e possvel acometimento do glossofarngeo em alguns
indivduos, o estimulo exclusivamente gustatrio pode estar diminudo nesses indivduos.
Essa mesma anlise, utilizando o Diagrama de Venn, pode ser realizada para indivduos
com a mesma condio (SM ou controle) mas com fluxo salivar diferente. Desse modo, podese avaliar a possvel influncia do fluxo salivar no perfil proteico. possvel notar que para
saliva no estimulada do grupo SM (G1 e G2) e controle (G9 e G10) houve um aumento no
nmero de protenas identificadas para indivduos com baixo fluxo (G2e G10), quando
87
comparados aos seus pares com fluxo mais alto (G1 e G9). Praticamente o mesmo padro foi
observado para a saliva parotdea bilateral, contudo, com uma discrepncia no to acentuada
na quantidade de protenas identificadas. Contudo, para saliva estimulada nota-se o oposto, um
maior nmero de protenas identificadas para indivduos com fluxo superior (G3 e G11),
quando comparado aos seus pares com fluxo abaixo da mdia (G4 e G12). Essa alterao
encontrada no nmero de protenas identificadas na saliva estimulada, tanto de indivduos
controle quanto SM, pode estar associada ao tipo de estmulo aplicado para coleta da saliva, ou
seja, estmulo mecnico. Sabe-se que diferentes estmulos influenciam de maneira distinta na
sntese e secreo proteica na saliva (208). Os resultados encontrados para saliva no
estimulada, em relao ao fluxo, corroboram os achados de Wu et al. (209), que notou que um
grupo de adolescentes apresentavam aumento do fluxo salivar mas reduo da secreo de
protena total. Nesse contexto, devido escassez de trabalhos sobre o assunto, seria interessante
a realizao de novos estudos que avaliem o perfil proteico em relao ao fluxo salivar,
utilizando para isso LC-ESI-MS/MS, considerada o padro ouro para esse tipo de anlise.
Em relao abundncia de protenas, quando comparados grupos SM com grupos
controle, foi possvel notar que algumas protenas estavam presentes com mais abundncia em
indivduos com sndrome de Moebius. As cistatinas S e SN foram mais abundantes na saliva
no estimulada de indivduos controle, enquanto que a cistatina B foi mais abundante no grupo
controle quando comparado ao grupo SM apenas para o grupo com fluxo acima da mdia
(G9XG1). Acredita-se que a cistatina S iniba o crescimento de Porphyromonas gingivalis, um
patgeno importante para a progresso da doena periodontal (141). Outros estudos
demonstraram que indivduos saudveis apresentaram maior concentrao de cistatina S
quando comparados com indivduos com periodontite (145), 1996. A cistatina SN possui
capacidade de inibir (in vitro) catepsinas (B, H e L), umas das proteases responsveis pela
degradao e destruio periodontal tecidual (210). A cistatina B parece down-regulate a
atividade intracelular de catepsina K e desse modo diminui a reabsoro ssea, uma vez que a
catepsina K a principal proteinase osteoclstica associada a esse processo (211). Indivduos
com SM tambm apresentaram reduo da protena histone. Sabe-se que essa protena participa
da sinalizao celular, inibe angiognese, regula negativamente a resposta inflamatria e exerce
papel protetor no osso (212). Outra caracterstica importante das cistatinas que elas mantem
o estado de supersaturao da saliva. Os indivduos com SM avaliados no presente estudo
apresentaram ndice periodontal superior aos controles e diminuio de cistatinas (S, SN e B) e
histone.
88
O papel das cistatinas no processo de crie no est bem estabelecido. Hong et al. (213)
observaram aumento de cistatinas C, SN e S em indivduos com alto crie quando comparados
a indivduos livres de crie. De maneira conflitante, Vitorino et al. (197) notaram que cistatinas
S e SN encontradas na pelcula adquirida de indivduos livres de carie apresentaram forte
correlao com baixos ndices de crie e parecem exercer efeito inibidor na degradao de
outras protenas salivares. No presente estudo, os indivduos com SM apresentaram ndice de
crie elevado e diminuio e reduo das cistatinas.
Acredita-se que fatores de ambos os ramos do sistema nervoso autnomo, simptico e
parassimptico, participem na expresso do gene cistatina S na glndula submandibular (214,
215). Alm disso, quando ocorre supresso parassimptica unilateral, a variante contraleteral
dessa inervao possa dispor de uma resposta neurocompenssatria para o gene cistatina S em
resposta a um agonista B adrenrgico isoproterenol. Ademais, nota-se quase a mesma
diminuio de RNAm de cistatina S quando ocorre remoo da inervao simptica ou
parassimptica da glndula submandibular. Esse fato pode ocorrer devido similaridade de
neuropeptdios e ou neurotransmissores envolvidos na regulao da expresso do gene cistatina
S (214). Portanto, indivduos com SM podem apresentar expresso desse gene modificada, uma
vez que a sndrome acomete o nervo facial, responsvel pela inervao autnoma das glndulas
submandibulares. Mais ainda, a atividade compensatria descrita quando apenas um lado
suprimido provavelmente encontra-se modificada, uma vez que a sndrome acomete os dois
lados com frequncia. Dos 15 indivduos com SM avaliados no presente estudo, apenas 1
apresentava acometimento facial unilateral pelo nervo facial.
No foi possvel correlacionar o fluxo salivar com a abundncia de protenas, quando
foram analisados pares com fluxo acima e abaixo. Diante do achado, sugere-se que a alterao
encontrada nos indivduos com SM pode no estar associada diminuio de fluxo salivar
diminudo nesses indivduos. Contudo, torna-se necessrio uma amostra maior para que essa
hiptese seja confirmada.
As histatinas, observadas atravs da eletroforese em gel de poliacrilamida (native
cationic) encontraram-se elevadas na saliva parotdea de indivduos com SM. Esse achado pode
ter ocorrido devido maior produo dessas protenas pelos indivduos com SM quando
comparados aos controles. Outra hiptese est relacionada a susceptibilidade das histainas
degradao proteica, que embora seja mais exacerbada na saliva total tambm acomete a saliva
parotdea. Um exemplo a presena de produtos resultantes da clivagem de histatina 3 na saliva
89
parotdea (216). Com base no exposto, os indivduos com SM podem apresentar maior
concentrao devido a maior estabilidade (menor degradao dessas protenas.
Os resultados imunoenzimticos revelaram uma maior quantidade de amilase salivar
para indivduos com SM. Cerca de 80% da amilase salivar sintetizada nas glndulas partidas
(103). Estudos demonstraram que o sistema nervoso parassimptico exerce uma funo
sinrgica ao simptico na produo de amilase salivar (59). O sistema nervoso simptico,
atravs de estmulo de mecanismo -adrenergicos e -adrenergicos, desempenha um papel
fundamental na secreo de amilase salivar. Sabe-se que as vias eferentes parassimpticas das
glndulas sublinguais e submandibulares originam-se do nervo facial e da glndula partida
originam-se do nervo glossofarngeo (103). As vias simpticas ps-ganglionares so
provenientes do gnglio cervical da cadeia simptica. Contudo o papel do sistema nervoso
simptico e parassimptico, isoladamente e sinergicamente, parece muito mais complexo e
ainda no est completamente elucidado (54). Com base no exposto, duas hipteses podem
justificar a maior quantidade de amilase salivar em nesses indivduos. A primeira estaria
relacionada a uma menor taxa de degradao de amilase salivar nos indivduos com SM. A
segunda hiptese estaria associada a uma maior produo de amilase salivar devido influncia
do sistema nervoso simptico e parassimptico. Por isso, torna-se extremamente difcil
estabelecer como esses sistemas influenciariam na secreo da amilase salivar nos indivduos
com SM.
No presente estudo foram utilizadas duas tcnicas distintas para identificao proteica:
eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE) e a
cromatografia lquida tandem espectrometria de massas. Como descrito, foi observado maior
abundancia de cistinas S, SN e B nos indivduos controle atravs da tcnica nLC-ESI-MS/MS.
O contrrio foi observado atravs da anlise das intensidades das bandas dos gis SDS-PAGE,
onde observou-se uma maior abundncia dessas protenas no grupo SM quando analisadas. A
banda da amilase salivar tambm apresentou ligeira alterao quando comparado os grupos de
saliva estimulada, no estimulada e parotdea bilateral (acima e abaixo do fluxo). Essa diferena
foi maior para a comparao entre os grupos G10XG2, onde a banda da amilase apresentou
intensidade 8,8% superior no G2. Todas as outras bandas de amilase apresentaram diferena
inferior a 5% para todos as comparaes entre grupos SM com grupos controle (G1XG9,
G3XG11, G4XG12, G5XG13, G6XG14, G7XG15 e G8XG16). Esses achados corroboram os
resultados encontrados atravs da tcnica nLC-ESI-MS/MS.
90
Ao longo dos ltimos 30 anos, diferentes metodologias tm sido desenvolvidas para

eletroforese em gel de poliacrilamida, visando solucionar os diferentes problemas. A
eletroforese em gel de poliacrilamida unidimensional uma ferramenta simples, barata e
altamente sensvel no estudo das protenas. Dentre as diferentes apresentaes dessa tcnica, o
sistema de eletroforese descontnuo contendo poliacrilamida e dodecil sulfato de sdio
(SDS-PAGE) a mais utilizada para fracionar as protenas conforme seu tamanho (217). Os
gis de poliacrilamida podem ser corados com diferentes substancias, entre elas destacam-se
Coomassie Brilliant Blue (CBB) e mtodos de colorao de prata. Esse segundo mtodo de
colorao consideravelmente mais sensitivo e permite a deteco de pequenas quantidades,
em nanogramas, de protenas. Contudo a analise proteica por gis de poliacrilamida pode no
ser muito apreciada, em partes devido dificuldade de quantificar as protenas coradas com
preciso (218). Outro problema que pode ser encontrado na tcnica SDS-PAGE a migrao
anormal das glicoprotenas, resultando em um peso molecular diferente conforme a
concentrao do gel. Isso ocorre devido caracterstica hidroflica de sua poro glicano, que
causa reduo na interao hidrofbica entre a protena e o SDS, impedindo a correta ligao
da mesma ao SDS (219).
Atualmente, mtodos de protemica reconhecidos como state of art tm se mostrado
bastante promissores na anlise de peptdeos e protenas salivares. Essa abordagem consiste no
emprego de vrias ferramentas para caracterizar as protenas expressas a parir de determinado
genoma (220). O uso dessas ferramentas permitiu no s a identificaes das protenas mais
conhecidas (como amilase, MUC 5B, histatinas, cistatinas, etc) como tambm um grande
nmero de traos de protenas, at ento desconhecidas, foram detectas na saliva (221). Dentre
os diversos mtodos de quantificao de protenas descritos na literatura, a espectrometria
tornou-se uma das principais tecnologias para a anlise protemica, devido a sua alta preciso
e sensibilidade para medio da massa dos peptdeos e protenas, o que viabiliza a identificao
de macromolculas (222).
A tcnica protemica padro envolve a separao das protenas por eletroforese em gel
bidimensional e sua evidenciao por colorao. Para identificar as protenas, as bandas de
interesse so removidas e digeridas com tripsina. Aps isso, elas so submetidas Ionizao e
dessoro a laser assistida por matriz associadas ao espectrmetro de massas (MALDI-MS)
para obteno da massa molecular dos peptdeos. Adicionalmente, informaes suplementares
acerca da sequncia podem ser obtidas por cromatografia lquida tandem espectrometria de
massas, uma vez que essa ferramenta fornece uma identificao mais precisa (223, 224). Uma
91
tcnica alternativa, que pode ser utilizada para identificao de protenas, conhecida como
shotgun. Essa abordagem mais rpida pois elimina a fase de separao pelo gel de
eletroforese. A abordagem shotgun baseada na clivagem, qumica ou enzimtica, de uma
mistura complexa de protenas (como a saliva), seguida pela sua classificao atravs da
cromatografia (225).
Nos ltimos anos houve um aumento na quantidade de publicaes relacionadas ao
proteoma salivar e espectrometria de massa, o que consequentemente acarretou no aumento
significante do nmero de protenas descritas (221).
Hu (225) propem a identificao proteica atravs da abordagem shotgun e da
eletroforese eletroforese em gel bidimensional seguida pela espectrometria de massa. Os
autores observaram que, de modo geral, a abordagem shotgun abrangeu protenas dentro das
escalas mais amplas de ponto isoeltrico e de massa molecular do que a eletroforese
bidimensional associada espectrometria de massa. 2-DE / MS. Apenas a abordagem shotgun
foi capaz de identificar protenas pequenas como protenas ricas em prolina, estaterinas, histatinas
e defensinas. As menores protenas identificadas pela eletroforese bidimensional associada

espectrometria de massa foram as cistatinas e cadeias de imunoglobulina, que apresentaram
mais do que 10 kDa. A abordagem shotgun foi capaz de identificar tanto protenas pequenas
(<10kDA) quanto protenas maiores (>100kDa), que no foram identificadas pela outra tcnica.
Esses achados reiteram a escolha da tcnica para identificao de protenas no nosso estudo,
demonstrando sua grande eficcia e facilidade de execuo quando comparada tcnica
tradicional (eletroforese em gel bidimensional seguida pela espectrometria de massa.
No h estudos que comparem a tcnica de eletroforese em gel de poliacrilamida SDSPAGE com a cromatografia lquida tandem espectrometria de massas. Contudo as informaes
expostas corroboram as diferenas observadas no nosso trabalho entre as duas tcnicas, onde
foi observado que a primeira tcnica apresenta baixa especificidade e algumas outras
limitaes, tais como identificao de glicoprotenas e dificuldade na quantificao.
Dessa forma, o presente trabalho mostrou que indivduos com SM apresentaram tanto
alterao na abundncia de algumas protenas (como cistatinas S, SN e B) quanto modificao
na quantidade de protenas identificadas. Essa alterao pde ser evidenciada mais
precisamente atravs do emprego cromatografia lquida tandem espectrometria de massas.
92
9 CONCLUSES
O fluxo salivar diminudo, capacidade tampo menos eficiente, e aumento da

atividade da amilase salivar apresentado pelos indivduos com SM explicam, em
parte, a maior ocorrncia de cries observada nesse grupo;
Indivduos com SM exibiram mais frequentemente doena periodontal e

gengivite embora no apresentassem maior quantidade de placa que o grupo
controle;
Foram poucas as alteraes encontradas no perfil proteico da saliva de pessoas

afetadas pela SM, sendo a mais relevante, a diminuio das cistatinas.
93
REFERNCIAS
1.
Wayne M, Wang W, Bratcher J, Cumani B, Kasmin F, Cooperman A. Renal cell
cancer without a renal primary. World Journal of Surgical Oncology. 2010;8:3.
2.
Sudarshan A, Goldie WD. The spectrum of congenital facial diplegia (Moebius
syndrome). Pediatric Neurology. 1985;1(3):180-4.
3.
Kumar D. Moebius syndrome. Journal of Medical Genetics. 1990;27(2):122-6.
4.
Domingos A, Lopes S, Almeida S, Boscolo F, Whaites E. PolandMoebius Syndrome:
a case with oral anomalies. Oral Diseases. 2004;10(6):404-7.
5.
De Serpa Pinto MV, De Magalhaes MH, Nunes FD. Moebius syndrome with oral
involvement. International Journal of Paediatric Dentistry. 2002;12(6):446-9.
6.
Ha CY, Messieha ZS. Management of a patient with Mobius syndrome: a case report.
Special Care in Dentistry. 2003;23(3):111-6.
7.
Yeh C-K, Johnson D, Dodds M, Sakai S, Rugh J, Hatch J. Association of salivary flow
rates with maximal bite force. Journal of Dental Research. 2000;79(8):1560-5.
8.
Ikebe K, Matsuda K-i, Kagawa R, Enoki K, Yoshida M, Maeda Y, et al. Association
of masticatory performance with age, gender, number of teeth, occlusal force and salivary
flow in Japanese older adults: Is ageing a risk factor for masticatory dysfunction? Archives of
Oral Biology. 2011;56(10):991-6.
9.
Sjogreen L, Andersson-Norinder J, Jacobsson C. Development of speech, feeding,
eating, and facial expression in Mobius sequence. International Journal of Pediatric
Otorhinolaryngology. 2001;60(3):197-204.
10.
Verzijl HT, van der Zwaag B, Cruysberg JR, Padberg GW. Mobius syndrome
redefined: a syndrome of rhombencephalic maldevelopment. Neurology. 2003;61(3):327-33.
11.
Broussard AB, Borazjani JG. The faces of Moebius syndrome: recognition and
anticipatory guidance. MCN: The American Journal of Maternal/Child Nursing.
2008;33(5):272-8.
94
12.
AMOB AmdB. Boletim Informativo da Associao Moebius do Brasil - AMoB -.
2007;5(7):1.
13.
Thomas H. Congenital facial paralysis. The Journal of Nervous and Mental Disease.
1898;25(8):571-93.
14.
Pitner SE, Edwards JE, Mccormick WF. Observations on the pathology of the
Moebius syndrome. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 1965;28(4):362.
15.
Verzijl HT, van der Zwaag B, Cruysberg JR, Padberg GW. Mbius syndrome
redefined A syndrome of rhombencephalic maldevelopment. Neurology. 2003;61(3):327-33.
16.
Carta A, Mora P, Neri A, Favilla S, Sadun AA. Ophthalmologic and Systemic
Features in Mbius Syndrome: an italian case series. Ophthalmology. 2011;118(8):1518-23.
17.
MacKinnon S, Oystreck DT, Andrews C, Chan W-M, Hunter DG, Engle EC.
Diagnostic distinctions and genetic analysis of patients diagnosed with Moebius syndrome.
Ophthalmology. 2014;121(7):1461-8.
18.
Briegel W, Schimek M, Kamp-Becker I, Hofmann C, Schwab KO. Autism spectrum
disorders in children and adolescents with Moebius sequence. European Child & Adolescent
Psychiatry. 2009;18(8):515-9.
19.
Bandim JM, Ventura LO, Miller MT, Almeida HC, Costa AE. Autism and Mobius
sequence: an exploratory study of children in northeastern Brazil. Arquivos de NeuroPsiquiatria. 2003;61(2A):181-5.
20.
Gillberg C, Steffenburg S. Autistic behaviour in Moebius syndrome. Acta Paediatrica
Scandinavica. 1989;78(2):314-6.
21.
etin , Akta D, Tunbilek E. Ipsilateral foot and controlateral hand anomalies in a
patient with PolandMoebius syndrome. European Journal of Medical Genetics.
2005;48(2):183-7.
22.
Losito L, Gennaro L, Cacudi M, De Rinaldis M, Trabacca A. Moebius Syndrome and
Hydrosyringomyelia Description of a New Association. Journal of Child Neurology.
2013;28(6):798-801.
23.
MacKinnon S, Oystreck DT, Andrews C, Chan W-M, Hunter DG, Engle EC.
Diagnostic Distinctions and Genetic Analysis of Patients Diagnosed with Moebius Syndrome.
Ophthalmology. 2014.
95
24.
Pirmez R, Freitas MET, Gasparetto EL, Arajo AP. Moebius syndrome and
holoprosencephaly following exposure to misoprostol. Pediatric Neurology. 2010;43(5):3713.
25.
Hashimoto N, Sakakihara Y, Miki Y, Kagawa J, Egi S, Kamoshita S. Moebius
syndrome associated with pituitary dwarfism and hypoplastic optic disc. Pediatrics
International. 1993;35(2):144-7.
26.
Verzijl HT, Padberg GW, Zwarts MJ. The spectrum of Mbius syndrome: an
electrophysiological study. Brain. 2005;128(7):1728-36.
27.
Gorlin RJ, Cohen MM, Hennekam RCM. Syndromes of the Head and Neck. New
York: Oxford University Press; 2001.
28.
Verzijl H, Van Der Zwaag B, Lammens M, Ten Donkelaar H, Padberg G. The
neuropathology of hereditary congenital facial palsy vs Mbius syndrome. Neurology.
2005;64(4):649-53.
29.
Magalhes M, Arajo LCA, Chiaradia C, Fraige A, Zamunaro M, Mantesso A. Early
dental management of patients with Mobius syndrome. Oral Diseases. 2006;12(6):533-6.
30.
Aren G. Mobius syndrome: a case report. Journal of Clinical Pediatric Dentistry.
2003;26(2):207-9.
31.
Ortega AdOL, MarquesDias MJ, Santos MTBRd, Castro T, Gallottini M. Oral motor
assessment in individuals with Moebius syndrome. Journal of Oral Pathology & Medicine.
2014;43(2):157-61.
32.
Towfighi J, Marks K, Palmer E, Vannucci R. Mbius syndrome. Acta
Neuropathologica. 1979;48(1):11-7.
33.
Kadakia S, Helman SN, Schwedhelm T, Saman M, Azizzadeh B. Examining the
genetics of congenital facial paralysisa closer look at Moebius syndrome. Oral and
Maxillofacial Surgery. 2015:1-8.
34.
Bavinck JNB, Weaver DD, Opitz JM, Reynolds JF. Subclavian artery supply
disruption sequence: Hypothesis of a vascular etiology for Poland, KlippelFeil, and Mbius
anomalies. American Journal of Medical Genetics. 1986;23(4):903-18.
35.
Courtens W, Vamos E, Hainaut M, Vergauwen P. Moebius syndrome in an infant
exposed in utero to benzodiazepines. The Journal of Pediatrics. 1992;121(5):833-4.
96
36.
Elsahy NI. Moebius syndrome associated with the mother taking thalidomide during
gestation. Plastic and Reconstructive Surgery. 1973;51(1):93-5.
37.
Puvabanditsin S, Garrow E, Augustin G, Titapiwatanakul R, Kuniyoshi KM. PolandMbius syndrome and cocaine abuse: a relook at vascular etiology. Pediatric Neurology.
2005;32(4):285-7.
38.
Smets K, Zecic A, Willems J. Ergotamine as a possible cause of Mbius sequence:
additional clinical observation. Journal of Child Neurology. 2004;19(5):398-.
39.
Pastuszak AL, Schler L, Speck-Martins CE, Coelho K-EF, Cordello SM, Vargas F, et
al. Use of misoprostol during pregnancy and Mbius' syndrome in infants. New England
Journal of Medicine. 1998;338(26):1881-5.
40.
da Silva Dal Pizzol T, Knop FP, Mengue SS. Prenatal exposure to misoprostol and
congenital anomalies: systematic review and meta-analysis. Reproductive Toxicology.
2006;22(4):666-71.
41.
Vargas FR, Schuler-Faccini L, Brunoni D, Kim C, Meloni VF, Sugayama SM, et al.
Prenatal exposure to misoprostol and vascular disruption defects: a case-control study.
American Journal of Medical Genetics. 2000;95(4):302-6.
42.
Coelho HL, Teixeira AC, Santos AP, Forte EB, Morais SM, La Vecchia C, et al.
Misoprostol and illegal abortion in Fortaleza, Brazil. Lancet. 1993;341(8855):1261-3.
43.
Marques-Dias MJ, Gonzalez CH, Rosemberg S. Mobius sequence in children exposed
in utero to misoprostol: neuropathological study of three cases. Birth Defects Research.
2003;67(12):1002-7.
44.
Nunes ML, Friedrich MA, Loch LF. Association of misoprostol, Moebius syndrome
and congenital central alveolar hypoventilation. Case report. Arquivos de Neuro-Psiquiatria.
1999;57(1):88-91.
45.
Webb BD, Shaaban S, Gaspar H, Cunha LF, Schubert CR, Hao K, et al. HOXB1
founder mutation in humans recapitulates the phenotype of Hoxb1/ mice. The American
Journal of Human Genetics. 2012;91(1):171-9.
46.
Van Der Zwaag B, Verzijl H, De Bernabe DB-V, Schuster V, Van Bokhoven H,
Kremer H, et al. Mutation analysis in the candidate Mbius syndrome genes PGT and
GATA2 on chromosome 3 and EGR2 on chromosome 10. Journal of Medical Genetics.
2002;39(6):e30-e.
97
47.
Humphrey SP, Williamson RT. A review of saliva: normal composition, flow, and
function. The Journal of Prosthetic Dentistry. 2001;85(2):162-9.
48.
Ekstrm J, Khosravani N, Castagnola M, Messana I. Saliva and the control of Its
secretion. Dysphagia: Springer; 2012. p. 19-47.
49.
FenolI-Palomares C, Muoz-Montagud J, Sanchiz V, Herreros B, Hernndez V,
Mnguez M, et al. Unstimulated salivary flow rate, pH and buffer capacity of saliva in healthy
volunteers. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 2004;96(11):773-83.
50.
Carpenter GH. The secretion, components, and properties of saliva. Annual Review of
Food Science and Technology. 2013;4:267-76.
51.
Navazesh M. Methods for collecting saliva. Annals of the New York Academy of
Sciences. 1993;694(1):72-7.
52.
Edgar W. Saliva and dental health. Clinical implications of saliva: report of a
consensus meeting. British Dental Journal. 1989;169(3-4):96-8.
53.
Dawes C, Watanabe S. The effect of taste adaptation on salivary flow rate and salivary
sugar clearance. Journal of Dental Research. 1987;66(3):740-4.
54.
Garrett J. Glandular mechanisms of salivary secretion. Vol 10. NewYork : Karger.
1998. 226p.
55.
Minicucci E, Pires R, Vieira R, Miot H, Sposto M. Assessing the impact of menopause
on salivary flow and xerostomia. Australian Dental Journal. 2013;58(2):230-4.
56.
Mirzaii-Dizgah I, Agha-Hosseini F. Stimulated and unstimulated saliva progesterone
in menopausal women with oral dryness feeling. Clinical Oral Investigations. 2011;15(6):85962.
57.
Lee MG, Ohana E, Park HW, Yang D, Muallem S. Molecular mechanism of
pancreatic and salivary gland fluid and HCO3 secretion. Physiological Reviews.
2012;92(1):39-74.
58.
de Oliveira MG. Manual de anatomia da cabea e do pescoo. 4a ed. Rio Grande do
Sul: EDIPUCRS; 2002. 135 p.
98
59.
Asking B. Sympathetic stimulation of amylase secretion during a parasympathetic
background activity in the rat parotid gland. Acta Physiologica Scandinavica.
1985;124(4):535-42.
60.
Anderson L, Garrett J, Johnson D, Kauffman D, Keller P, Thulin A. Influence of
circulating catecholamines on protein secretion into rat parotid saliva during parasympathetic
stimulation. The Journal of Physiology. 1984;352(1):163-71.
61.
Asking B, Proctor G. Parasympathetic activation of amylase secretion in the intact and
sympathetically denervated rat parotid gland. Quarterly Journal of Experimental Physiology.
1989;74(1):45-52.
62.
van Stegeren A, Rohleder N, Everaerd W, Wolf OT. Salivary alpha amylase as marker
for adrenergic activity during stress: effect of betablockade. Psychoneuroendocrinology.
2006;31(1):137-41.
63.
Endoh T. Modulation of voltage-dependent calcium channels by neurotransmitters and
neuropeptides in parasympathetic submandibular ganglion neurons. Archives of Oral Biology.
2004;49(7):539-57.
64.
Standring S, Ellis H, Healy J, Johnson D, Williams A, Collins P, et al. Gray's anatomy:
the anatomical basis of clinical practice. American Journal of Neuroradiology.
2005;26(10):2703.
65.
Matsuo R. Central connections for salivary innervations and efferent impulse
formation. In: Garrett JR, Ekstrm J, Anderson LC. Neural mechanisms of salivary gland
secretion. New York: Karger. 1999;11:26-43.
66.
Proctor GB, Carpenter GH. Regulation of salivary gland function by autonomic
nerves. Autonomic Neuroscience. 2007;133(1):3-18.
67.
Ekstrm J. Role of nonadrenergic, noncholinergic autonomic transmitters in salivary
glandular activities in vivo. In: Garrett JR, Ekstrm J, Anderson LC. Neural mechanisms of
salivary gland secretion. New York: Karger. 1999;6:94-130.
68.
Melvin JE, Yule D, Shuttleworth T, Begenisich T. Regulation of fluid and electrolyte
secretion in salivary gland acinar cells. Annual Review of Physiology. 2005;67:445-69.
69.
De Almeida PDV, Grgio AMT, Machado MAN, de Lima AAS, Azevedo LR. Saliva
composition and functions: a comprehensive review. The journal of Contemporary Dental
Practice. 2008(9):72-80.
99
70.
Humphrey SP, Williamson RT. A review of saliva: normal composition, flow, and
function. The Journal of Prosthetic Dentistry. 2001;85(2):162-9.
71.
Navazesh M, Christensen C, Brightman V. Clinical criteria for the diagnosis of
salivary gland hypofunction. Journal of Dental Research. 1992;71(7):1363-9.
72.
Navazesh M, Mulligan R, Kipnis V, Denny P, Denny P. Comparison of whole saliva
flow rates and mucin concentrations in healthy Caucasian young and aged adults. Journal of
Dental Research. 1992;71(6):1275-8.
73.
Ship JA, Fox PC, Baum BJ. How much saliva is enough? 'Normal' function defined.
Journal of the American Dental Association. 1991;122(3):63-9.
74.
Garca-Godoy F, Hicks MJ. Maintaining the integrity of the enamel surface: the role
of dental biofilm, saliva and preventive agents in enamel demineralization and
remineralization. The Journal of the American Dental Association. 2008;139:25S-34S.
75.
Buzalaf MAR, Hannas AR, Kato MT. Saliva and dental erosion. Journal of Applied
Oral Science. 2012;20(5):493-502.
76.
Hay D, Schluckebier S, Moreno E. Saturation of human salivary secretions with
respect to calcite and inhibition of calcium carbonate precipitation by salivary constituents.
Calcified Tissue International. 1986;39(3):151-60.
77.
McCann H. Inorganic components of salivary secretions. Art and science of dental
caries research. New York: Academic Press. 1968. p. 55-73.
78.
Larsen M, Pearce E. Saturation of human saliva with respect to calcium salts. Archives
of Oral Biology. 2003;48(4):317-22.
79.
Schlesinger DH, Hay D. Complete covalent structure of statherin, a tyrosine-rich
acidic peptide which inhibits calcium phosphate precipitation from human parotid saliva.
Journal of Biological Chemistry. 1977;252(5):1689-95.
80.
Hay DI, Smith DJ, Schluckebier SK, Moreno EC. Relationship between concentration
of human salivary statherin and inhibition of calcium phosphate precipitation in stimulated
human parotid saliva. Journal of Dental Research. 1984;63(6):857-63.
81.
Fejerskov O, Kidd EA, Fejerskov O, Kidd EA. Dental caries: the disease and its
clinical management. Oxford: Blackwell. 2003. 640 p.
100
82.
Tenovuo J. Salivary parameters of relevance for assessing caries activity in individuals
and populations. Community Dentistry and Oral Epidemiology. 1997;25(1):82-6.
83.
Bardow A, Moe D, Nyvad B, Nauntofte B. The buffer capacity and buffer systems of
human whole saliva measured without loss of CO 2. Archives of Oral Biology. 2000;45(1):112.
84.
Carpenter G, Garrett J, Hartley R, Proctor G. The influence of nerves on the secretion
of immunoglobulin A into submandibular saliva in rats. The Journal of Physiology.
1998;512(2):567-73.
85.
Mega J, McGhee JR, Kiyono H. Cytokine-and Ig-producing T cells in mucosal
effector tissues: analysis of IL-5-and IFN-gamma-producing T cells, T cell receptor
expression, and IgA plasma cells from mouse salivary gland-associated tissues. The Journal
of Immunology. 1992;148(7):2030-9.
86.
Brandtzaeg P. Synthesis and secretion of human salivary immunoglobulins. In: Garrett
J. Glandular mechanisms of salivary secretion. Vol 10. NewYork : Karger.Glandular.
1998;10:167-99.
87.
Fbin TK, Hermann P, Beck A, Fejrdy P, Fbin G. Salivary defense proteins: their
network and role in innate and acquired oral immunity. International Journal of Molecular
Sciences. 2012;13(4):4295-320.
88.
Berg RD, Savage DC. Immune responses of specific pathogen-free and gnotobiotic
mice to antigens of indigenous and nonindigenous microorganisms. Infection and Immunity.
1975;11(2):320-9.
89.
VeigaMalta I, Duarte M, Dinis M, Tavares D, Videira A, Ferreira P. Enolase from
Streptococcus sobrinus is an immunosuppressive protein. Cellular Microbiology.
2004;6(1):79-88.
90.
Casarin R, Del Peloso Ribeiro , Mariano F, Nociti Jr F, Casati M, Gonalves R.
Levels of Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, inflammatory
cytokines and speciesspecific immunoglobulin G in generalized aggressive and chronic
periodontitis. Journal of Periodontal Research. 2010;45(5):635-42.
91.
Veerman E, Keybus Pvd, Vissink A, Amerongen A. Human glandular salivas: their
separate collection and analysis. European Journal of Oral Sciences. 1996;104(4):346-52.
92.
Nikitkova AE, Haase EM, Scannapieco FA. Taking the starch out of oral biofilm
formation: molecular basis and functional significance of salivary -amylase binding to oral
streptococci. Applied and Environmental Microbiology. 2013;79(2):416-23.
101
93.
Lee YH, Zimmerman JN, Custodio W, Xiao Y, Basiri T, Hatibovic-Kofman S, et al.
Proteomic evaluation of acquired enamel pellicle during in vivo formation. Plos One.
2013;8(7):e67919.
94.
Douglas C, Pease A, Whiley R. Amylase-binding as a discriminition among oral
streptococci. FEMS Microbiology Letters. 1990;66(1-3):193-7.
95.
Kilian M, Nyvad B. Ability to bind salivary alpha-amylase discriminates certain
viridans group streptococcal species. Journal of Clinical Microbiology. 1990;28(11):2576-7.
96.
Scannapieco F, Solomon L, Wadenya R. Emergence in human dental plaque and host
distribution of amylase-binding streptococci. Journal of Dental Research. 1994;73(10):162735.
97.
Nyvad B, Kilian M. Comparison of the initial streptococcal microflora on dental
enamel in caries-active and in caries-inactive individuals. Caries Research. 1990;24(4):26772.
98.
Scannapieco FA, Torres G, Levine MJ. Salivary -amylase: role in dental plaque and
caries formation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 1993;4(3):301-7.
99.
Sethi A, Mohanty B, Ramasubbu N, Gooley PR. Structure of amylasebinding protein
A of Streptococcus gordonii: A potential receptor for human salivary amylase enzyme.
Protein Science. 2015.
100. Nikitkova A, Haase E, Scannapieco F. Effect of starch and amylase on the expression
of amylasebinding protein A in Streptococcus gordonii. Molecular Oral Microbiology.
2012;27(4):284-94.
101. Craigen B, Dashiff A, Kadouri DE. The use of commercially available alpha-amylase
compounds to inhibit and remove Staphylococcus aureus biofilms. The Open Microbiology
Journal. 2011;5:21.
102. Okahashi N, Nakata M, Terao Y, Isoda R, Sakurai A, Sumitomo T, et al. Pili of oral
Streptococcus sanguinis bind to salivary amylase and promote the biofilm formation.
Microbial Pathogenesis. 2011;50(3):148-54.
103. Nater U, Rohleder N. Salivary alpha-amylase as a non-invasive biomarker for the
sympathetic nervous system: current state of research. Psychoneuroendocrinology.
2009;34(4):486-96.
102
104. Laible N, Germaine G. Bactericidal activity of human lysozyme, muramidase-inactive

lysozyme, and cationic polypeptides against Streptococcus sanguis and Streptococcus
faecalis: inhibition by chitin oligosaccharides. Infection and Immunity. 1985;48(3):720-8.
105. Ibrahim HR, Thomas U, Pellegrini A. A helix-loop-helix peptide at the upper lip of the
active site cleft of lysozyme confers potent antimicrobial activity with membrane
permeabilization action. Journal of Biological Chemistry. 2001;276(47):43767-74.
106. Marquis G, Garzon S, Strykowski H, Auger P. Cell walls of normal and lysozymedamaged blastoconidia of Candida albicans: localization of surface factor 4 antigen and
vicinal-glycol staining. Infection and Immunity. 1991;59(4):1312-8.
107. Brandenburg K, Koch MH, Seydel U. Biophysical characterisation of lysozyme
binding to LPS Re and lipid A. European Journal of Biochemistry. 1998;258(2):686-95.
108. Erridge C, Bennett-Guerrero E, Poxton IR. Structure and function of
lipopolysaccharides. Microbes and infection. 2002;4(8):837-51.
109. Li J, Helmerhorst E, Yao Y, Nunn M, Troxler R, Oppenheim F. Statherin is an in vivo
pellicle constituent: identification and immuno-quantification. Archives of Oral Biology.
2004;49(5):379-85.
110. Siqueira W, Custodio W, McDonald E. New insights into the composition and
functions of the acquired enamel pellicle. Journal of Dental Research.
2012:0022034512462578.
111. Lindh L, Glantz P, Strmberg N, Arnebrant T. On the adsorption of human acidic
proline-rich proteins (PRP-1 and PRP-3) and statherin at solid/liquid interfaces. Biofouling.
2002;18(2):87-94.
112. Shimotoyodome A, Kobayashi H, Tokimitsu I, Matsukubo T, Takaesu Y. Statherin
and histatin 1 reduce parotid saliva-promoted Streptococcus mutans strain MT8148 adhesion
to hydroxyapatite surfaces. Caries Research. 2005;40(5):403-11.
113. Gibbons R, Hay D. Adsorbed salivary acidic proline-rich proteins contribute to the
adhesion of Streptococcus mutans JBP to apatitic surfaces. Journal of Dental Research.
1989;68(9):1303-7.
114. Gibbons R, Hay D, Cisar J, Clark W. Adsorbed salivary proline-rich protein 1 and
statherin: receptors for type 1 fimbriae of Actinomyces viscosus T14V-J1 on apatitic surfaces.
Infection and Immunity. 1988;56(11):2990.
103
115. Sekine S, Kataoka K, Tanaka M, Nagata H, Kawakami T, Akaji K, et al. Active

domains of salivary statherin on apatitic surfaces for binding to Fusobacterium nucleatum
cells. Microbiology. 2004;150(7):2373-9.
116. Nakagaki H, Sekine S, Terao Y, Toe M, Tanaka M, Ito H-O, et al. Fusobacterium
nucleatum envelope protein FomA is immunogenic and binds to the salivary statherin-derived
peptide. Infection and Immunity. 2010;78(3):1185-92.
117. Leito JT, Ligtenberg AJ, Nazmi K, Veerman EC. Identification of salivary
components that induce transition of hyphae to yeast in Candida albicans. FEMS Yeast
Research. 2009;9(7):1102-10.
118. Murakami Y, Nagata H, Amano A, Takagaki M, Shizukuishi S, Tsunemitsu A, et al.
Inhibitory effects of human salivary histatins and lysozyme on coaggregation between
Porphyromonas gingivalis and Streptococcus mitis. Infection and Immunity.
1991;59(9):3284-6.
119. Murakami Y, Xu T, Helmerhorst E, Ori G, Troxler R, Lally E, et al. Inhibitory effect
of synthetic histatin 5 on leukotoxin from Actinobacillus actinomycetemcomitans. Oral
Microbiology and Immunology. 2002;17(3):143-9.
120. Gusman H, Travis J, Helmerhorst EJ, Potempa J, Troxler RF, Oppenheim FG.
Salivary histatin 5 is an inhibitor of both host and bacterial enzymes implicated in periodontal
disease. Infection and Immunity. 2001;69(3):1402-8.
121. Pusateri CR, Monaco EA, Edgerton M. Sensitivity of Candida albicans biofilm cells
grown on denture acrylic to antifungal proteins and chlorhexidine. Archives of Oral Biology.
2009;54(6):588-94.
122. Konopka K, Dorocka-Bobkowska B, Gebremedhin S, Dzgne N. Susceptibility of
Candida biofilms to histatin 5 and fluconazole. Antonie Van Leeuwenhoek. 2010;97(4):4137.
123. Siqueira W, Margolis H, Helmerhorst E, Mendes F, Oppenheim F. Evidence of intact
histatins in the in vivo acquired enamel pellicle. Journal of Dental Research. 2010;89(6):62630.
124. Oudhoff MJ, Bolscher JG, Nazmi K, Kalay H, van't Hof W, Amerongen AVN, et al.
Histatins are the major wound-closure stimulating factors in human saliva as identified in a
cell culture assay. The FASEB Journal. 2008;22(11):3805-12.
125. Oudhoff MJ, Kroeze KL, Nazmi K, van den Keijbus PA, van't Hof W, FernandezBorja M, et al. Structure-activity analysis of histatin, a potent wound healing peptide from
104
human saliva: cyclization of histatin potentiates molar activity 1000-fold. The FASEB
Journal. 2009;23(11):3928-35.
126. Oppenheim F, Xu T, McMillian F, Levitz S, Diamond R, Offner G, et al. Histatins, a
novel family of histidine-rich proteins in human parotid secretion. Isolation, characterization,
primary structure, and fungistatic effects on Candida albicans. Journal of Biological
Chemistry. 1988;263(16):7472-7.
127. Sabatini L, Azen E. Histatins, a family of salivary histidine-rich proteins, are encoded
by at least two loci (HIS1 and HIS2). Biochemical and Biophysical Research
Communications. 1989;160(2):495-502.
128. Oppenheim FG, Salih E, Siqueira WL, Zhang W, Helmerhorst EJ. Salivary proteome
and its genetic polymorphisms. Annals of the New York Academy of Sciences.
2007;1098(1):22-50.
129. McDonald E, Goldberg H, Tabbara N, Mendes F, Siqueira W. Histatin 1 resists
proteolytic degradation when adsorbed to hydroxyapatite. Journal of Dental Research.
2011;90(2):268-72.
130. Komatsu T, Salih E, Helmerhorst EJ, Offner GD, Oppenheim FG. Influence of histatin
5 on Candida albicans mitochondrial protein expression assessed by quantitative mass
spectrometry. Journal of Proteome Research. 2010;10(2):646-55.
131. Tsai H, Bobek LA. Human salivary histatin-5 exerts potent fungicidal activity against
Cryptococcus neoformans. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects.
1997;1336(3):367-9.
132. Xu T, Levitz S, Diamond R, Oppenheim F. Anticandidal activity of major human
salivary histatins. Infection and immunity. 1991;59(8):2549-54.
133. Helmerhorst EJ, Reijnders IM, vant Hof W, Simoons-Smit I, Veerman EC,
Amerongen AVN. Amphotericin B-and Fluconazole-ResistantCandida spp., Aspergillus
fumigatus, and other newly emerging pathogenic fungi are susceptible to basic antifungal
peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1999;43(3):702-4.
134. Vukosavljevic D, Custodio W, Del Bel Cury A, Siqueira W. The effect of histatin 5,
adsorbed on PMMA and hydroxyapatite, on Candida albicans colonization. Yeast.
2012;29(11):459-66.
135. Wei G-X, Bobek LA. In vitro synergic antifungal effect of MUC7 12-mer with
histatin-5 12-mer or miconazole. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2004;53(5):750-8.
105
136. van't Hof W, Reijnders IM, Helmerhorst EJ, Walgreen-Weterings E, Simoons-Smit

IM, Veerman EC, et al. Synergistic effects of low doses of histatin 5 and its analogues on
amphotericin B anti-mycotic activity. Antonie Van Leeuwenhoek. 2000;78(2):163-9.
137. Li XS, Reddy MS, Baev D, Edgerton M. Candida albicans Ssa1/2p is the cell envelope
binding protein for human salivary histatin 5. Journal of Biological Chemistry.
2003;278(31):28553-61.
138. Jang WS, Bajwa JS, Sun JN, Edgerton M. Salivary histatin 5 internalization by
translocation, but not endocytosis, is required for fungicidal activity in Candida albicans.
Molecular Microbiology. 2010;77(2):354-70.
139. Gorr SU. Antimicrobial peptides of the oral cavity. Periodontology 2000.
2009;51(1):152-80.
140. Amerongen A, Veerman E. Salivathe defender of the oral cavity. Oral Diseases.
2002;8(1):12-22.
141. Blankenvoorde M, Van't Hof W, Walgreen-Weterings E, Van Steenbergen T, Brand
H, Veerman E, et al. Cystatin and cystatin-derived peptides have antibacterial activity against
the pathogen Porphyromonas gingivalis. Biological Chemistry. 1998;379(11):1371-5.
142. Ganeshnarayan K, Velliyagounder K, Furgang D, Fine D. Human salivary cystatin SA
exhibits antimicrobial effect against Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Journal of
Periodontal Research. 2012;47(5):661-73.
143. Henskens Y, Veerman E, Mantel M, Van Der Velden U, Amerongen AN. Cystatins S
and C in human whole saliva and in glandular salivas in periodontal health and disease.
Journal of Dental Research. 1994;73(10):1606-14.
144. Henskens Y, Velden U, Veerman EC, Amerongen AV. Cystatin C levels of whole
saliva are increased in periodontal patients. Annals of the New York Academy of Sciences.
1993;694(1):280-2.
145. Henskens YM, Veerman EC, Nieuw Amerongen A. Cystatins in health and disease.
Biological Chemistry-Hoppe Seyler. 1996;377(2):71-86.
146. Shah A, Bano B. Cystatins in health and diseases. International Journal of Peptide
Research and Therapeutics. 2009;15(1):43-8.
147. Takehara S, Yanagishita M, Podyma-Inoue KA, Kawaguchi Y. Degradation of MUC7
and MUC5B in Human Saliva. Plos One. 2013;8(7):e69059.
106
148. Derrien M, van Passel MW, van de Bovenkamp JH, Schipper R, de Vos W, Dekker J.
Mucin-bacterial interactions in the human oral cavity and digestive tract. Gut Microbes.
2010;1(4):254-68.
149. Liu B, Lague JR, Nunes DP, Toselli P, Oppenheim FG, Soares RV, et al. Expression
of membrane-associated mucins MUC1 and MUC4 in major human salivary glands. Journal
of Histochemistry & Cytochemistry. 2002;50(6):811-20.
150. Barrera M-J, Aguilera S, Veerman E, Quest AF, Daz-Jimnez D, Urza U, et al.
Salivary mucins induce a Toll-like receptor 4-mediated pro-inflammatory response in human
submandibular salivary cells: are mucins involved in Sjgrens syndrome? Rheumatology.
2015:kev026.
151. Wickstrom C, Davies J, Eriksen G, Veerman E, Carlstedt I. MUC5B is a major gelforming, oligomeric mucin from human salivary gland, respiratory tract and endocervix:
identification of glycoforms and C-terminal cleavage. Biochemical Journal. 1998;334:685-93.
152. Adler KB, Tuvim MJ, Dickey BF. Regulated mucin secretion from airway epithelial
cells. Frontiers in Endocrinology. 2013;4.
153. Perez-Vilar J. Mucin granule intraluminal organization. American Journal of
Respiratory Cell and Molecular Biology. 2007;36(2):183-90.
154. Levitov AB, Dallas AP, Slonim AD. Bioqumica Ilustrada de Harper. 29ed. Porto
Alege: AMGH. 2013. 826 p.
155. Tabak LA. Structure and function of human salivary mucins. Critical Reviews in Oral
Biology & Medicine. 1990;1(4):229-34.
156. Iontcheva I, Oppenheim F, Troxler R. Human salivary mucin MG1 selectively forms
heterotypic complexes with amylase, proline-rich proteins, statherin, and histatins. Journal of
Dental Research. 1997;76(3):734-43.
157. Wickstrm C, Svenster G. Salivary gelforming mucin MUC5Ba nutrient for dental
plaque bacteria. Oral Microbiology and Immunology. 2008;23(3):177-82.
158. Wickstrm C, Herzberg MC, Beighton D, Svenster G. Proteolytic degradation of
human salivary MUC5B by dental biofilms. Microbiology. 2009;155(9):2866-72.
159. Murray P, Prakobphol A, Lee T, Hoover C, Fisher S. Adherence of oral streptococci to
salivary glycoproteins. Infection and Immunity. 1992;60(1):31-8.
107
160. Reddy MS, Levine MJ, Paranchych W. Low-molecular-mass human salivary mucin,
MG2: structure and binding of Pseudomonas aeruginosa. Critical Reviews in Oral Biology &
Medicine. 1993;4(3):315-23.
161. Groenink J, Ligtenberg A, Veerman E, Bolscher J, Amerongen AN. Interaction of the
salivary low-molecular-weight mucin (MG2) with Actinobacillus actinomycetemcomitans.
Antonie Van Leeuwenhoek. 1996;70(1):79-87.
162. Moshier A, Reddy MS, Scannapieco FA. Role of type 1 fimbriae in the adhesion of
Escherichia coli to salivary mucin and secretory immunoglobulin A. Current Microbiology.
1996;33(3):200-8.
163. Liu B, Rayment S, Oppenheim FG, Troxler RF. Isolation of human salivary mucin
MG2 by a novel method and characterization of its interactions with oral bacteria. Archives of
Biochemistry and Biophysics. 1999;364(2):286-93.
164. Liu B, Rayment S, GYURKO C, OPPENHEIM F, OFFNER G, Troxler R. The
recombinant N-terminal region of human salivary mucin MG2 (MUC7) contains a binding
domain for oral Streptococci and exhibits candidacidal activity. Biochemical Journal.
2000;345:557-64.
165. Wei G-X, Campagna AN, Bobek LA. Effect of MUC7 peptides on the growth of
bacteria and on Streptococcus mutans biofilm. Journal of Antimicrobial Chemotherapy.
2006;57(6):1100-9.
166. Groenink J, WalgreenWeterings E, Nazmi K, Bolscher J, Veerman E, Van
Winkelhoff A, et al. Salivary lactoferrin and lowMr mucin MG2 in Actinobacillus
actinomycetemcomitansassociated periodontitis. Journal of Clinical Periodontology.
1999;26(5):269-75.
167. Sengupta A, Valdramidou D, Huntley S, Hicks SJ, Carrington SD, Corfield AP.
Distribution of MUC1 in the normal human oral cavity is localized to the ducts of minor
salivary glands. Archives of Oral Biology. 2001;46(6):529-38.
168. Li X, Wang L, Nunes D, Troxler R, Offner G. Pro-inflammatory cytokines up-regulate
MUC1 gene expression in oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 2003;82(11):8837.
169. Gendler SJ. MUC1, the renaissance molecule. Journal of Mammary Gland Biology
and Neoplasia. 2001;6(3):339-53.
108
170. McAuley JL, Linden SK, Png CW, King RM, Pennington HL, Gendler SJ, et al.
MUC1 cell surface mucin is a critical element of the mucosal barrier to infection. Journal of
Clinical Investigation. 2007;117(8):2313.
171. Silness J, Le H. Periodontal disease in pregnancy II. Correlation between oral
hygiene and periodontal condition. Acta Odontologica. 1964;22(1):121-35.
172. OMS. Levantamentos bsicos em sade bucal: Formulrio de avaliao. So Paulo:
Editora Santos. 1999.
173. Rohleder N, Nater UM. Determinants of salivary -amylase in humans and
methodological considerations. Psychoneuroendocrinology. 2009;34(4):469-85.
174. Atkinson J, Dawes C, Ericson T, Fox P, Gandara B, Mandel I. Guidelines for saliva
nomenclature and collection. Annals of the New York Academy of Sciences, 694
1993;694:pp. xixii.
175. Siqueira WL, Lee YH, Xiao Y, Held K, Wong W. Identification and characterization
of histatin 1 salivary complexes by using mass spectrometry. Proteomics. 2012;12(22):342635.
176. Navazesh M, Kumar SK. Measuring salivary flow: challenges and opportunities. The
Journal of the American Dental Association. 2008;139:35S-40S.
177. Siqueira WL, Bermejo PR, Mustacchi Z, Nicolau J. Buffer capacity, pH, and flow rate
in saliva of children aged 260 months with Down syndrome. Clinical Oral Investigations.
2005;9(1):26-9.
178. Tanaka MH. Anlise microbiolgica e imunologica do fluido gengival e proteoma
salivar de individuos com Sindrome de Down com doena periodontal. [tese]. Araraquara:
Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontolofia; 2014.
179. Bussab W, Morettin P. Estatstica Bsica. So Paulo: Editora Saraiva, 2002, 7
tiragem. 2006.
180. Ferrari S, Cribari-Neto F. Beta regression for modelling rates and proportions. Journal
of Applied Statistics. 2004;31(7):799-815.
181.
Cribari-Neto F, Zeileis A. Beta regression in R. Journal of Statistical Software. 2009.
109
182. Siqueira W, Salih E, Wan D, Helmerhorst E, Oppenheim F. Proteome of human minor

salivary gland secretion. Journal of Dental Research. 2008;87(5):445-50.
183. Helmerhorst E, Alagl A, Siqueira W, Oppenheim F. Oral fluid proteolytic effects on
histatin 5 structure and function. Archives of Oral Biology. 2006;51(12):1061-70.
184. McManus L, Dawes P, Stringer M. Clinical anatomy of the chorda tympani: a
systematic review. The Journal of Laryngology & Otology. 2011;125(11):1101-8.
185. Knox S, Lombaert I, Reed X, Vitale-Cross L, Gutkind J, Hoffman M. Parasympathetic
innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science.
2010;329(5999):1645-7.
186. Knox SM, Lombaert IM, Haddox CL, Abrams SR, Cotrim A, Wilson AJ, et al.
Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature Communications.
2013;4:1494.
187. Leone CW, Oppenheim FG. Physical and chemical aspects of saliva as indicators of
risk for dental caries in humans. Journal of Dental Education. 2001;65(10):1054-62.
188. Prabhakar A, Dodawad R. Evaluation of Flow Rate, pH, Buffering Capacity, Calcium,
Total Protein and Total Antioxidant Levels of Saliva in Caries Free and Caries Active
ChildrenAn In Vivo Study. International Journal of Clinical Pediatric Dentistry.
2009;2(1):9.
189. Preethi B, Reshma D, Anand P. Evaluation of flow rate, pH, buffering capacity,
calcium, total proteins and total antioxidant capacity levels of saliva in caries free and caries
active children: an in vivo study. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 2010;25(4):425-8.
190. Kho H-S, Lee S-W, Chung S-C, Kim Y-K. Oral manifestations and salivary flow rate,
pH, and buffer capacity in patients with end-stage renal disease undergoing hemodialysis.
Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontology.
1999;88(3):316-9.
191. Gudkina J, Brinkmane A. Caries experience in relation to oral hygiene, salivary
cariogenic microflora, buffer capacity and secretion rate in 6-year olds and 12 year olds in
Riga. Stomatologija. 2008;10(2):76-80.
192. Animireddy D, Bekkem VTR, Vallala P, Kotha SB, Ankireddy S, Mohammad N.
Evaluation of pH, buffering capacity, viscosity and flow rate levels of saliva in caries-free,
minimal caries and nursing caries children: an in vivo study. Contemporary Clinical
Dentistry. 2014;5(3):324.
110
193. Shaila M, Pai GP, Shetty P. Salivary protein concentration, flow rate, buffer capacity
and pH estimation: A comparative study among young and elderly subjects, both normal and
with gingivitis and periodontitis. Journal of Indian Society of Periodontology. 2013;17(1):42.
194. Kitasako Y, Ikeda M, Burrow MF, Tagami J. Oral health status in relation to
stimulated saliva buffering capacity among Japanese adults above or below 35 years of age.
Journal of Medical and Dental Sciences. 2006;53(4):175.
195. Fiyaz M, Ramesh A, Ramalingam K, Thomas B, Shetty S, Prakash P. Association of
salivary calcium, phosphate, pH and flow rate on oral health: A study on 90 subjects. Journal
of Indian Society of Periodontology. 2013;17(4):454.
196. Syrjl AM, Raatikainen L, Komulainen K, Knuuttila M, Ruoppi P, Hartikainen S, et
al. Salivary flow rate and periodontal infectiona study among subjects aged 75 years or
older. Oral Diseases. 2011;17(4):387-92.
197. Vitorino R, de Morais Guedes S, Ferreira R, Lobo MJC, Duarte J, FerrerCorreia AJ,
et al. Twodimensional electrophoresis study of in vitro pellicle formation and dental caries
susceptibility. European Journal of oOral Sciences. 2006;114(2):147-53.
198. Vitorino R, Lobo MJC, Duarte JR, FerrerCorreia AJ, Domingues PM, Amado FM.
The role of salivary peptides in dental caries. Biomedical Chromatography. 2005;19(3):21422.
199. Klein M, Duarte S, Xiao J, Mitra S, Foster T, Koo H. Structural and molecular basis of
the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development. Applied and
Environmental Microbiology. 2009;75(3):837-41.
200. Klein MI, DeBaz L, Agidi S, Lee H, Xie G, Lin AH-M, et al. Dynamics of
Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm
development. Plos One. 2010;5(10):e13478.
201. Rucker JC, Webb BD, Frempong T, Gaspar H, Naidich TP, Jabs EW. Characterization
of ocular motor deficits in congenital facial weakness: Moebius and related syndromes. Brain.
2014;137(4):1068-79.
202. Diamant H, Wiberg A. Does the chorda tympani in man contain secretory fibers for
the parotid gland? Acta Oto-Laryngologica. 1965;60(1-6):255-64.
203. Reichert FL, Poth EJ. Pathways for the secretory fibers of the salivary glands in man.
Experimental Biology and Medicine. 1933;30(7):973-7.
111
204. Keur I, Abraham-Inpjin L, Amerongen AN. Salivary flow rate and acutephase
proteins in Bell's palsy. Clinical Otolaryngology & Allied Sciences. 1994;19(5):415-21.
205. Zandian A, Osiro S, Hudson R, Ali IM, Matusz P, Tubbs SR, et al. The neurologists
dilemma: A comprehensive clinical review of Bells palsy, with emphasis on current
management trends. International Medical Journal of Experimental and Clinical Research.
2014;20:83.
206. Garrett JR, Ekstrm J, Anderson LC. Neural mechanisms of salivary gland secretion:
Karger Medical and Scientific Publishers; 1999.
207. Turner RJ, Sugiya H. Understanding salivary fluid and protein secretion. Oral
Diseases. 2002;8(1):3-11.
208. Johnson DA. Effect of a liquid diet on the protein composition of rat parotid saliva.
The Journal of Nutrition. 1982;112(1):175-81.
209. Wu KP, Ke J-Y, Chung C-Y, Chen C-L, Hwang T-L, Chou M-Y, et al. Relationship
between unstimulated salivary flow rate and saliva composition of healthy children in Taiwan.
Chang Gung Medical Journal. 2008;31(3):281-6.
210. Baron A, DeCarlo A, Featherstone J. Functional aspects of the human salivary
cystatins in the oral environment. Oral Diseases. 1999;5(3):234-40.
211. Laitala-Leinonen T, Rinne R, Saukko P, Vnnen HK, Rinne A. Cystatin B as an
intracellular modulator of bone resorption. Matrix Biology. 2006;25(3):149-57.
212. Bartold PM, Cantley MD, Haynes DR. Mechanisms and control of pathologic bone
loss in periodontitis. Periodontology 2000. 2010;53(1):55-69.
213. Hong SW, Seo DG, Baik JE, Cho K, Yun CH, Han SH. Differential profiles of
salivary proteins with affinity to Streptococcus mutans lipoteichoic acid in cariesfree and
cariespositive human subjects. Molecular Oral Microbiology. 2014;29(5):208-18.
214. Shaw PA, Yu W-hA. Autonomic regulation of cystatin S gene expression in rat
submandibular glands. Autonomic Neuroscience. 2000;83(1):49-57.
215. Chaparro O, Yu W-hA, Shaw PA. Isoproterenol-induced expression of the cystatin S
gene in submandibular glands of parasympathectomized rats. Molecular brain research.
1998;61(1):136-46.
112
216. Sun X, Salih E, Oppenheim FG, Helmerhorst EJ. Kinetics of histatin proteolysis in
whole saliva and the effect on bioactive domains with metal-binding, antifungal, and woundhealing properties. The FASEB Journal. 2009;23(8):2691-701.
217. Shi Q, Jackowski G. One-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Gel
electrophoresis of proteins: A practical approach. 3a ed. Oxford: University Press. 1998:1-52.
218. Diwu Z, Haugland RP, Patton WF. Background-free, high sensitivity staining of
proteins in one-and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a
luminescent ruthenium complex. Electrophoresis. 2000;21:2509-21.
219. Hames BD. Gel electrophoresis of proteins: a practical approach: a practical approach.
Oxford: University Press. 1998.
220. Wilkins MR. Proteome research: new frontiers in functional genomics. Berlim:
Springer Science & Business Media; 1997. 243 p.
221. Siqueira WL, Dawes C. The salivary proteome: challenges and perspectives.
Proteomics-Clinical Applications. 2011;5(1112):575-9.
222. Hu S, Loo JA, Wong DT. Human saliva proteome analysis. Annals of the New York
Academy of Sciences. 2007;1098(1):323-9.
223. Washburn MP, Wolters D, Yates JR, 3rd. Large-scale analysis of the yeast proteome
by multidimensional protein identification technology. Nature Biotechnology.
2001;19(3):242-7.
224. Lin D, Tabb DL, Yates JR. Large-scale protein identification using mass spectrometry.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 2003;1646(1):1-10.
225. Hu S, Xie Y, Ramachandran P, Ogorzalek Loo RR, Li Y, Loo JA, et al. Largescale
identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass
spectrometry and twodimensional gel electrophoresismass spectrometry. Proteomics.
2005;5(6):1714-28.
113
ANEXO A- Aprovao do Comit de tica - FOUSP
114
ANEXO B- Termo de consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Dados de identificao
Ttulo do Projeto: Caractersticas da saliva produzida pela partida e a relao com
ndice de crie e doena periodontal em indivduos com sndrome de Moebius
Pesquisadores: Maria Carolina Martins Mussi (CROSP 95380) e Gabrielle Oliveira
Pesquisador Responsvel: Marina Helena Cury Gallottini (CROSP 34881)
Instituio a que pertence o Pesquisador Responsvel: Universidade de So Paulo (FOUSP)
O estudo ser realizado no Centro de Atendimento a Pacientes Especiais da Faculdade de Odontologia da
Universidade de So Paulo.
Telefones para contato: (11) 8766-6140 - (11) 3091-7894
Nome do voluntrio:_____________________________________________________
Idade: _____________ anos
R.G. ________________________
Responsvel legal (se necessrio): _________________________________________

R.G. Responsvel legal: _________________________
O Sr. () est sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa Caractersticas da saliva produzida
pela partida e a relao com ndice de crie e doena periodontal em indivduos com sndrome de Moebius,
desenvolvido pelas alunas Maria Carolina Martins Mussi e Gabrielle Oliveira, sob orientao da Profa. Dra. Marina
Helena Cury Gallottini.
O presente trabalho visa avaliar algumas caractersticas da saliva que podem estar associadas ao
aparecimento de leses de crie em pacientes com Sndrome de Mbius e compar-las as caractersticas
encontradas na saliva de pacientes que no apresentam a sndrome. Esse trabalho visa melhor entendimento
acerca da composio salivar desses pacientes, visando, no futuro, um melhor direcionamento do tratamento
odontolgico.
Assim, benefcios ao paciente e futuros benefcios a ele e a populao em geral podem advir da melhora
dos servios odontolgicos a serem prestados, baseados nas suas condies e necessidades especiais. Os riscos
ou desconfortos sero mnimos, j que o questionrio e o exame bucal so parte dos cuidados a serem tomados
com estes pacientes. A coleta e avaliao dos pacientes sero realizadas em uma nica sesso com tempo mdio
de uma hora. As amostras salivares obtidas sero armazenadas para pesquisas futuras
Os pacientes que concordarem em participar da pesquisa sero avaliados em relao ao acometimento
pela sndrome de Mbius, mediante a alguns exerccios mmicos e sensitivos. Sero tambm coletados, sob leve
suco, 2 ml de saliva total sem estmulo e a saliva estimulada de origem na glndula partida, durante um perodo
de 5 minutos. A identificao do paciente ser preservada de forma que seu nome e dados pessoais no
aparecero nas publicaes subseqentes pesquisa nem sero citados em cursos, palestras ou aulas
expositivas. O paciente no receber e no efetuar nenhum pagamento pela sua participao na pesquisa ou
pelo atendimento prestado.
Voc poder ter todas as informaes que quiser sobre a pesquisa. Fica claro que o paciente ter o direito
de no aceitar participar da pesquisa ou de retirar o consentimento cedido a qualquer momento, sem prejuzo de
qualquer beneficio que esteja recebendo.
115
Em relao ao armazenamento das amostras de saliva obtidas, devido escassez de trabalhos com
saliva de pacientes com Mbius e a baixa incidncia dessa sndrome na populao, temos a inteno de realizar
novos estudos com essas amostras, de maneira que possam contribuir para melhor conhecimento das
caractersticas bucais especficas deste grupo de pacientes. Os tipos de informao que podero ser obtidos nas
pesquisas futuras, a partir da utilizao da amostra de saliva armazenada, envolvem alteraes na saliva
associadas ao alto ndice de crie descrito na literatura nos indivduos com sndrome de Mbius, ou qualquer outra
alterao salivar que possa ser relacionada sade bucal e geral desses indivduos.
Os pesquisadores declaram que toda nova pesquisa a ser realizada com o material armazenado ser
submetida para aprovao do Comit de tica em Pesquisa (CEP) institucional e, quando for o caso, da Comisso
Nacional de tica em Pesquisa (CONEP).
O consentimento livre e esclarecido referente coleta, depsito, armazenamento e utilizao da saliva
em Biorrepositrio formalizada atravs deste termo de consentimento, onde o paciente deve manifestar sua
opinio com relao sua vontade de permitir que o material seja armazenado para uso futuro ou no, assinalando
com um x apenas uma das alternativas:
( ) necessidade de novo consentimento a cada pesquisa;

( ) dispensa de novo consentimento a cada pesquisa;
( ) no permito o armazenamento da saliva em Biobanco
O paciente envolvido na pesquisa ou seu responsvel legal tem acesso ao conhecimento de todos os
resultados, bem com as suas respectivas implicaes, obtidos a partir da utilizao de sua amostra de saliva.
Todos os dados fornecidos, coletados e obtidos a partir desta pesquisa podero ser utilizados para pesquisas
futuras.
O descarte das amostras de saliva armazenadas no Biorrepositrio, ou sua transferncia, ser
comunicada ao sujeito da pesquisa. O descarte da amostra de saliva pode ocorre devido retirada do
consentimento do sujeito, inadequao da amostra por critrios de qualidade, iniciativa da instituio e pela
dissoluo do Biorrepositrio. Se voc preferir, podemos informar caso seja necessrio o descarte da(s) amostra(s)
referente ao seu material
As amostras de saliva sero armazenadas com inibidor de protease, em tubos de 1,5ml, em freezer 80C e so do paciente, permanecendo armazenadas no Departamento de Patologia Bucal (FOUSP) sob a
responsabilidade da Profa.Dra. Marina Helena Cury Gallottini. O paciente, ou seu representante legal, a qualquer
momento e sem qualquer prejuzo, pode retirar o consentimento de guarda e utilizao das amostras de saliva
armazenadas. A retirada do consentimento ser formalizada por manifestao por escrito e assinada pelo sujeito
da pesquisa ou seu representante legal.
Em qualquer momento durante o andamento do estudo as pesquisadoras alunas Maria Carolina Martins
Mussi e Gabrielle Oliveira estaro disponveis para dvidas ou esclarecimentos pelos telefones 3091-7859 ou
3091-7838.
Se houver dvidas sobre a tica da pesquisa entre em contato com o Comit de tica em Pesquisa da
Faculdade de Odontologia (Av. Lineu Prestes 2227, 05508-000 So Paulo ou pelo e-mail cepfo@usp.br).
Eu, __________________________________________, RG n _________________, aps ter sido informado e

ter minhas dvidas suficientemente esclarecidas pelo pesquisador concordo em participar de forma voluntria
desta pesquisa descrita acima.
116
ou
Eu, __________________________________________, RG n _________________, responsvel legal por
_________________________________, RG n ____________ aps ter sido informado e ter minhas dvidas
suficientemente esclarecidas pelo pesquisador concordo em participar de forma voluntria desta pesquisa descrita
acima.
So Paulo, _____ de ____________ de 201___
_____________________________________
Nome e assinatura do paciente ou seu responsvel legal
________________________________________________
Nome, assinatura e CRO ou documento relacionado do pesquisador
________________________________________________
Nome, assinatura e CRO ou documento relacionado do orientador responsvel pelo estudo
________________________________________________
Nome e assinatura de testemunha
Este documento feito em duas vias: uma via fica com o investigador e a outra fica com o participante.
117
ANEXO C - Folha de testes para avaliao da capacidade motora e sensitiva de indivduos com
sndrome de Moebius
118
ANEXO D - Disperso dois a dois e coeficiente de correlao de Pearson entre os Cortes do ICDAS
ANEXO E - Tabela graduando o acometimento facial de acordo com o nervo envolvido (nervos VII, VI, IV, III, II, XII, V, XI) e lado mais acometido
SIGLA
VII
VI
IV
III
II
XII
XI
Soma
Lado total mais acometido
M1
0,25
0,2
3,5
M2
0,88
1,5
0,6
10,0
M3
2,25
1,25
0,0
12,5
DE
M4
2,63
0,4
13,0
DE
M5
0,50
0,25
0,4
4,2
M6
3,25
1,5
0,8
11,6
M7
3,13
1,5
0,2
11,8
M8
1,88
0*
0,4
8,3
M9
2,38
0,25
0,0
5,6
M10
0,5
0,0
7,5
M11
3,63
1,5
0,4
11,5
M12
3,13
0,0
11,1
M13
2,75
1,25
0,0
12,0
M14
3,25
1,2
11,5
M15
0,38
0,75
0,2
4,3
*paciente com cirurgia para correo de estrabismo
120
ANEXO F - Protenas com razo de abundncia (>1,25 ou < 0,75) para o cruzamento entre os grupos
Razo
entre os
grupos
G1/G2
Nmero de
acesso da
protena
Q9UF83
Nmero
de
peptdeos
41
Valor da
razo
pValor
Uncharacterized protein DKFZp434B061
0,48
0,017
Mucin 5B
17
0,59
0,005
P12273
Prolactin inducible protein
0,60
0,001
G3CIG0
P01833
P07737
MUC19 variant 12
Polymeric immunoglobulin receptor
Profilin 1
58
10
3
0,62
0,64
0,68
0,001
0,007
0,003
C3PTT6
P04080
Pancreatic adenocarcinoma upregulated factor

Cystatin B
4
3
0,69
0,70
0,044
0,001
Componente
celular
Lubrificao e
antimicrobiano
Interao
protena/protena
Lubrificao
Transporte
Interao
protena/protena
Angiognse
Metabolismo
H7BYZ0
Q8NDH2
HUMAN Coiled coil domain containing protein

168
HUMAN Tetratricopeptide repeat protein 28
HUMAN BAH and coiled coil domain containing
protein 1
HUMAN FRAS1 related extracellular matrix
protein 2
HUMAN Filaggrin
1,29
0,001
Desconhecida
8
7
1,31
1,31
0,001
0,007
1,45
0,001
Diviso celular
Ligao
cromatina
Metabolismo
18
1,47
0,001
1,56
0,001
1,62
0,001
Nome da protena
Principal
funo*
G3/G4
Q96AY4
F8WBW8
Q5SZK8
P20930
E9PAV3
P49792
HUMAN Nascent polypeptide associated

complex subunit alpha
HUMAN E3 SUMO protein ligase RanBP2
Agregao de
queratina
Regulao da
transcrio
Transporte
121
continua
continuao
P12273
HUMAN Prolactin inducible protein
1,65
0,001
Interao
protena/protena
Antimicrobiana
Q96DR5
HUMAN BPI fold containing family A member 2
1,71
0,001
A8K739
HUMAN cDNA FLJ77339
1,70
0,001
P12273
1,81
0,001
P04080
HUMAN Cystatin B
1,60
0,020
Metabolismo
P01034
B5ME49
HUMAN Cystatin C
HUMAN Mucin 16
3
95
0,10
0,50
0,001
0,001
A8K5R2
0,53
0,001
28
3
6
0,55
0,56
0,57
0,001
0,002
0,001
Estrutural
Antimicrobiana
Angiognse
P04080
P01037
P12273
HUMAN cDNA FLJ77293 highly similar to

Homo sapiens vasohibin 1 (VASH1) mRNA
HUMAN NHS like protein 1
HUMAN Pancreatic adenocarcinoma upregulated
factor
HUMAN Cystatin B
HUMAN Cystatin SN
Antimicrobiano
Lubrificao e
proteo
Angiognese
4
2
7
0,59
0,60
0,63
0,001
0,001
0,001
H7BYZ0
HUMAN Mucin 5B
11
0,64
0,001
A1L447
P01833
HUMAN Ubiquitin carboxyl terminal hydrolase

HUMAN Polymeric immunoglobulin receptor
6
7
0,67
1,29
0,001
0,001
Metabolismo
Metabolismo
Interao
protena/protena
Lubrificao e
antimicrobiana
Metabolismo
Transporte
G5/G6
Interao com
lipdeos
Interao
protena/protena
G7/G8
G12/G11
Q5SYE7
Q96DR5
C3PTT6
G13/G14
continua
122
continuao
B4DYX1
Q5T1R4
Q8NDH2
P01833
Q8NFC6
B7Z421
Q6AWC2
Q5JV73
B7ZLX3
Q8IVF2
Q9NR48
C9J908
A6NKC6
E9PAV3
B4DR76
Q5CZC0
Q12830

Homo sapiens MORC family CW type zinc finger
1 (MORC1) mRNA
HUMAN Transcription factor HIVEP3
0,23
0,006
Diferenciao
celular
0,24
0,001
HUMAN Coiled coil domain containing protein

168
HUMAN Biorientation of chromosomes in cell
division protein 1 like
Homo sapiens KIN antigenic determinant of recA
protein homolog mRNA
HUMAN Protein WWC2
HUMAN FERM and PDZ domain containing
protein 3
HUMAN CLASP1 protein
HUMAN Protein AHNAK2
0,38
0,017
Diferenciao
celular
Desconhecida
9
16
0,46
0,47
0,001
0,001
Transporte
Diviso celular
24
0,56
0,001
Desconhecida
6
8
0,57
0,64
0,001
0,001
18
8
0,64
0,65
0,001
0,001
0,67
0,001
4
13
0,67
0,68
0,003
0,001
0,71
0,019
0,72
0,003
Metabolismo
Componente
celular
Diviso celular
Interao
protena/protena
Sinalizao
celular
Desconhecida
Sinalizao
celular
Regulao da
transcrio
Metabolismo
7
13
0,73
0,75
0,001
0,001
HUMAN Histone lysine N methyltransferase

ASH1L
HUMAN Uncharacterized protein
HUMAN Retinitis pigmentosa 1 like 1 protein
HUMAN Eukaryotic translation initiation factor
4E transporter
HUMAN Fibrous sheath interacting protein 2
HUMAN Nucleosome remodeling factor subunit
BPTF
Desconhecida
Regulao de
transcrio
continua
123
continuao
Q8N9E0
HUMAN Protein FAM133A
11
0,75
0,001
Interao
protena/protena
E9PAV3
1,36
0,001
B2R7Z6

HUMAN cDNA FLJ93674
14
1,48
0,001
P98088
MUC5A HUMAN Mucin 5AC (Fragments)
35
1,58
0,001
P01833
Q9NR48

ASH1L
HUMAN Fibrous sheath interacting protein 2
HUMAN Golgin subfamily A member 3
HUMAN Ankyrin 3
HUMAN Cystatin B
6
3
1,59
1,66
0,001
0,001
13
12
3
16
3
6
1,78
1,85
1,87
1,94
1,94
2,22
0,001
0,001
0,001
0,001
0,001
0,001
HUMAN Cystatin S
factor
HUMAN Cystatin SN
5
5
2,62
2,62
0,001
0,001
Regulao da
transcrio
Interao com
lipdeos
Lubrificao e
proteo
Transporte
Sinalizao
celular
Desconhecida
Transporte
Antimicrobiana
Metabolismo
Metabolismo
Interao
protena/protena
Metabolismo
Angiognse
2,99
0,001
Metabolismo
HUMAN Uncharacterized protein KIAA1522

HUMAN Cystatin SN
factor
HUMAN Cystatin S
16
2
6
0,35
0,37
0,43
0,001
0,001
0,001
Deconhecida
Metabolismo
Angiognse
0,47
0,001
Metabolismo
G9/G1
Q5CZC0
Q08378
Q96DR5
Q12955
P04080
P12273
P01036
C3PTT6
P01037
G2/G10
Q9P206
P01037
C3PTT6
P01036
continua
124
continuao
B3KWI5
0,53
0,025
Desconhecida
Q96JH7
P12273
HUMAN cDNA FLJ43124 fis clone

CTONG3004072 highly similar to Protein
EMSY
HUMAN Deubiquitinating protein VCIP135
3
4
0,57
0,57
0,004
0,001
P01833
P32926

HUMAN Desmoglein 3
10
3
0,73
0,74
0,001
0,010
Metabolismo
Interao
protena/protena
Transporte
Adeso celular
C3PTT6

factor
HUMAN Filaggrin 2
0,55
0,001
Angiognse
19
0,63
0,001

Bactericidal/permeability increasingprotein like 1
HUMAN Mucin 5B
1,30
0,001
7
9
1,31
1,33
0,001
0,001

HUMAN N sulphoglucosamine sulphohydrolase
HUMAN Filaggrin
18
1,34
0,001
5
4
1,39
1,41
0,001
0,001
Estrutural
molecular
Interao com
lipdeos
Transporte
Lubrificao e
antimicrobiana
Regulao da
transcrio
Metabolismo
Angiognese
13
1,43
0,001
HUMAN MUC19 variant 12

HUMAN cDNA FLJ52075 moderately similar to
Mus musculus SPT2 Suppressor of Ty domain
containing 1 mRNA
44
3
3
1,45
1,48
1,79
0,001
0,001
0,001
G3/G11
Q5D862
B4E209
P01833
H7BYZ0
E9PAV3
B7Z9A6
A8K5R2
P20930
G3CIG0
Q96DR5
B4E223
Agregao de
queratina
Lubrificao
Antimicrobiana
Desconhecida
G5/G13
continua
125
continuao
G6/G14
Q9UF83

DKFZp434B061
17
0,26
0,001
Componente
celular
Q9NV58
HUMAN E3 ubiquitin protein ligase RNF19A
10
0,10
0,001
B4E392

Pinin
ASH1L
HUMAN Filaggrin
25
0,14
0,001
Componente
celular
Desconhecida
0,18
0,001
0,27
0,001
0,29
0,001
G3CIG0
P01833
P12273

108
9
3
0,30
0,55
0,59
0,001
0,001
0,001
B2RU27
G3CIG0
P01833
P02812
HUMAN Testis expressed 15

HUMAN Basic salivary proline rich protein 2
9
29
7
2
0,16
0,17
0,49
1,26
0,001
0,001
0,001
0,001
P12273
1,39
Q9NR48
P20930
A8K5R2
Sinalizao
celular
Agregao de
queratina
Angiognese
Lubrificao
Transporte
Interao
protena/protena
G7/G15
E9PH94
H0Y4T4
HUMAN Uncharacterized protein C5orf42

HUMAN Centrosomal protein of 170 kDa
(Fragment)
1,52
1,55
14
8
0,60
1,34
Homeostase
Lubrificao
Transporte
Resposta imune
Interao
0,001
protena/protena
0,001
Desconhecida
Componente
0,001
celular
G8/G16
Q9UF83
Q96Q06

DKFZp434B061
HUMAN Perilipin 4
0,001
0,045
Componente
celular
Metabolismo
126
continua
concluso
Componente
celular e regula
Q5T4S7
HUMAN E3 ubiquitin protein ligase UBR4
18
1,45
0,002
sinalizao
*Os dados referentes s principais funes das protenas foram retirados dos bancos de dados: Uniprot e Protein Information Resource (PIR)
127
127
APNDICE A- Solues utilizadas para o ensaio da atividade de amilase
Preparo das solues

Cfinal
MW
*KH2PO4
20mM
136.09 g/mol
*NaCl
0.7mM
58.44 g/mol
Maltose
1mg/mL
360.31 g/mol
Starch
1%
162.15 g/mol
DNS
1%
228.12 g/mol
Receita do tampo:
-
0.272 g of KH2PO4
0.0041 g of NaCl
DD water (Volume final = 50 mL)
Adicionar a soluo cido soluo bsica at atingir pH 7.0.
Receita da soluo de Maltose

-
10 mg of Maltose
DD water (Final volume = 10 mL)
Receita da soluo de amido (1%)

-
0.5 g of Starch
gua destilada (Volume final = 50 mL)
Receita da soluo de DNS

-
DNS 1%
49.5 mL of water
NaOH 0.4M
Potassium Sodium Tartrate 30%
APNDICE B - Valores descritos, por paciente com SM, das anlises realizadas.
SIGLA
VII
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
M9
M10
M11
M12
M13
M14
M15
1
0,875
2,25
2,625
0,5
3,25
3,125
1,875
2,375
1
3,625
3,125
2,75
3,25
0,375
Lado com
Lado
ndice
NE
SE
PD
PE
VII mais VI IV III II XII V XI Soma total mais PSR
de
(ml/min) (ml/min) (ml/min) (ml/min)
acometido
acometido
placa
E 1 0 0,25 0
1 0,2 0
3,45
E
0
0,79
0,305
0,9
0,2
0,25
E 1 4 1,5 0
1 0,6 1 9,975
E
1
1,58
0,4
0,5
0,56
0,3
DE 4 4 1,25 0
1 0 0
12,5
DE
2
2
0,21
0,4
0,68
0,19
D 3 4
1 0
2 0,4 0 13,025
DE
1
1,75
0,13
0,38
0,09
0
D 2 1 0,25 0
0 0,4 0
4,15
D
1
0,54
0,125
0,31
0
0,32
DE 1 2 1,5 0
1 0,8 2 11,55
D
1
0,66
0,036
0,19
D 2 4 1,5 0
1 0,2 0 11,825
D
2
1,41
0
0,75
0
0
E 0 3
1 1
1 0,4 0 8,275
E
1
0,875
0,06
0,24
0,1
0,5
E 1 1 0,25 0
1 0 0 5,625
E
3
0,16
0,38
0,052
0
0
DE 3 2 0,5 0
1 0 0
7,5
E
3
0,33
0,25
0,175
0
0,07
D 1 4 1,5 0
0 0,4 1 11,525
D
3
1,5
0,014
0,6
0
0
D 2 4
1 0
1 0 0 11,125
D
1
0,66
0,12
1
0,16
0,15
E 1 3 1,25 0
4 0 0
12
E
0
1,41
0,05
0,21
E 1 3
1 0
2 1,2 0 11,45
E
0
0,375
0,15
0,55
0,15
0
E 1 2 0,75 0
0 0,2 0 4,325
E
0
0,79
0,3
0,53
0
0
PSR (Periodontal Screening And Recording), NE (saliva no estimulada), SE (saliva estimulada), PD e PE (saliva parotdea direita e esquerda)
129
129
APNDICE C - Grficos preditos auxiliares relativos aos cortes 3,4 e 5 de ICDAS
Valores preditos para o Corte 3 do ICDAS segundo NE (ml/min) e Grupo, fixando PE em 0,3
ml/min
ml/min
ml/min
130
APNDICE D - Modelos para o corte do ICDAS segundo Grupo, saliva no estimulada e parotdea
esquerda
Resposta
Coeficientes
Intercepto
Grupo (Moebius)
NE (cl/min)
Corte 1 ICDAS
PE (cl/min)
(prop.)
Grupo (Moebius) : NE (cl/min)
Grupo (Moebius) : PE (cl/min)
(parmetro de disperso)
Intercepto
Grupo (Moebius)
NE (cl/min)
Corte 2 ICDAS
PE (cl/min)
(prop.)
Grupo (Moebius) : NE (cl/min)
Grupo (Moebius) : PE (cl/min)
Intercepto
Grupo (Moebius)
NE (cl/min)
Corte 3 ICDAS
PE (cl/min)
(prop.)
Grupo (Moebius): NE (cl/min)
Grupo (Moebius): PE (cl/min)
Intercepto
Grupo (Moebius)
NE (cl/min)
Corte 4 ICDAS
PE (cl/min)
(prop.)
Intercepto
Grupo (Moebius)
NE (cl/min)
Corte 5 ICDAS
PE (cl/min)
(prop.)
Estimativa
0,325
0,48
-0,116
-0,077
-0,701
0,383
1,233
-0,632
2,43
0,044
-0,261
-0,978
0,291
1,648
-1,305
-0,073
-0,033
-0,417
-0,479
0,302
9,278
-4,177
2,486
-0,005
-0,071
-0,454
-0,438
18,903
-4,159
1,933
-0,023
-0,084
-0,753
-0,169
19,734
Erro padro
0,911
1,149
0,098
0,193
0,292
0,293
0,31
0,863
1,118
0,093
0,181
0,294
0,28
0,447
0,677
0,811
0,077
0,152
0,221
0,222
3,105
0,799
0,868
0,081
0,159
0,21
0,235
7,539
0,81
0,886
0,081
0,159
0,23
0,236
8,579
valor p
0,721
0,676
0,238
0,691
0,016
0,192
<0,001
0,464
0,03
0,636
0,15
0,001
0,299
<0,001
0,054
0,928
0,663
0,006
0,03
0,174
0,003
<0,001
0,004
0,946
0,655
0,031
0,062
0,012
<0,001
0,029
0,78
0,599
0,001
0,473
0,021

Versão Final - Tese - Biblioteca Impressão

Enviado por

Dados do documento

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Versão Final - Tese - Biblioteca Impressão

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

MARIA CAROLINA MARTINS MUSSI

Parmetros salivares, proteoma e sade bucal na sndrome de Moebius

MARIA CAROLINA MARTINS MUSSI

Parmetros salivares, proteoma e sade bucal na sndrome de Moebius

Tese apresentada Faculdade de Odontologia

Orientador: Profa. Dra Marina Helena Cury

Palavras-chave: Sndrome de Moebius. Paralisia Facial. Saliva. Protenas e Peptdeos Salivares.

Keywords: Mobius Syndrome. Saliva. Salivary Proteins and Peptides. Proteome.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

homeobox protein Hox-B1

Centro de Atendimento a Pacientes Especiais

Facudade de Odontologia da Universidade de So Paulo

Periodontal Screening and Recording

International Caries Detection and Assessment System

SDS-PAGE dodecil-sulfato de sdio (SDS) de poliacrilamida (PAGE)

mililitro por minuto

MALDI-MS Ionizao e dessoro a laser assistida por matriz associadas ao espectrmetro

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

Figura 2.1 - Aspectos faciais de indivduos com SM ............................................................. 25

Diagrama de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em

Diagrama de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em

Diagrama de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em

Figura 7.4 - Diagrama de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em

Figura 7.5 - Diagramas de Venn mostrando a relao do nmero de protenas identificadas em

Figura 7.11 - Quantificao de histatina 1, 3 e 5 (em g) provenientes em 25 g de saliva

Figura 7.12 - - Quantificao de histatina 1, 3 e 5 (em g) provenientes em 25 g de saliva

Tabela 5.1 - Dados demogrficos dos participantes do estudo ............................................ 60

REVISO DE LITERATURA .................................................................................. 22

Histrico da Sndrome de Moebius .......................................................................... 22

Critrios de diagnstico e diagnsticos diferenciais da SM .................................... 23

Achados orofaciais descritos na SM .......................................................................... 25

2.5.1 Secreo salivar ............................................................................................................ 28

MATERIAL E MTODOS ....................................................................................... 44

Avaliao clnica ......................................................................................................... 44

4.1.1 Higiene bucal ................................................................................................................ 45

Anlise quantitativa e qualitativa da saliva.............................................................. 47

4.2.1 A coleta da saliva total no estimulada......................................................................... 48

4.2.7.2 Anlise prote6omica da saliva por eletroforese em gel de

Captulo 1: RESULTADOS ....................................................................................... 57

Avaliao da sade periodontal, ndice de crie e ndice de placa ......................... 58

Avaliao do comprometimento motor .................................................................... 61

Fluxo salivar, pH e capacidade tampo .................................................................... 61

Atividade da amilase salivar ...................................................................................... 64

Captulo 1: DISCUSSO ........................................................................................... 66

Captulo 2: RESULTADOS ....................................................................................... 71

Cromatografia lquida tandem espectrometria de massas ..................................... 72

7.1.1 Identificao das protenas ........................................................................................... 72

Eeletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato

Teste imunoenzimtico (Elisa) .................................................................................. 86

Captulo 2: DISCUSSO ........................................................................................... 87

A Sndrome de Moebius (SM) uma desordem neuromuscular congnita incomum,

A SM uma condio clnica caracterizada pela paralisia uni ou bilateral, completa ou

2.1 Histrico da Sndrome de Moebius

Dados no oficiais estimavam que aproximadamente 2000 pessoas em todo o mundo

2.2 Critrios de diagnstico e diagnsticos diferenciais da SM

Clinicamente a SM caracteriza-se por paralisia facial congnita e incapacidade da

se esses indivduos previamente diagnosticados com SM apresentavam os critrios mnimos

2.3 Achados orofaciais descritos na SM

As alteraes craniofaciais so as que causam maior impacto na qualidade de vida das

Na dependncia da teoria que suporta a etiopatogenia da alterao, alguns autores optam

Baseado nos achados neuropatolgicos encontrados nas autpsias desses 15

A saliva um fluido seromucoso, ligeiramente acdico, proveniente da secreo das

2.5.1 Secreo salivar

secreo salivar, a submandibular com 65%, a sublingual com 7 a 8% e as glndulas menores