UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA E

ENGENHARIA DE ALIMENTOS

ENZIMAS E SUAS APLICAES

CINTICA ENZIMTICA

DISCIPLINA : ENGENHARIA BIOQUMICA

PROF: AGENOR FURIGO JUNIOR
COLABORAO: ERNANDES B. PEREIRA

FLORIANPOLIS
JUNHO 2001

1.INTRODUO
Enzimas so catalisadores biolgicos, formados por longas cadeias de
molculas pequenas, chamadas de aminocidos. So portanto, um tipo de protena com
atividade cataltica, sendo encontradas na natureza em todos os seres vivos. Sua funo
viabilizar a atividade das clulas, quebrando molculas ou juntando-as para formar
novos compostos. A singularidade desses compostos decorre do elevado grau de
especificidade ao substrato em condies moderadas, sob as quais atuam. Algumas
enzimas so especficas para determinado tipo de ligao qumica, como, por exemplo,
a capacidade da -amilase de romper unicamente as ligaes -1,4 das molculas de
amido. Outras so especficas para um tipo particular de ismero ptico, como, por
exemplo, a

oxidao da

-D-glicose pela glicose oxidase.

So os catalisadores

potentes.
Toda enzima uma PROTENA, mas nem toda protena uma ENZIMA.

1.1. Consideraes iniciais

Protenas
So as molculas mais abundantes nas clulas, cerca de 30-70%. Contm
resduos de aminocidos unidos por ligaes peptdicas.

Constituintes bsicos:
Carbono

50%

Oxignio

23%

Nitrognio

16%

Hidrognio

7%

Enxofre

3%

A massa molecular das protenas: 6000 a 1.106 Da.

A classificao das protenas dividem-se em duas classes principais:
Protenas fibrosas e protenas globulares.
As estruturas das protenas so descritas em nveis: primria, secundria, terciria e
quaternria.
As enzimas pertencem a classe das protenas globulares, tendo como estrutura a
terciria.
2

As protenas tem vrias funes biolgicas, tais como:

. Enzimas
. Protenas transportadoras
. Protenas de armazenamento
. Protenas contrteis
. Protenas estruturais
. Protenas de defesa
. Protenas de regulagem

Aminocidos
So compostos qumicos que apresentam em sua frmula qumica grupo
carboxlico (-COOH) e grupo amino (-NH2).

Representao esquemtica de aminocidos:

H
R C* COOH

NH2
Os aminocidos so diferenciados de acordo com o grupo R ligado ao carbono
assimtrico.
Na natureza so encontrados 20 aminocidos encontrados. Alguns exemplos:
Grupo R aliftico no polar
Glicina Gly-G
Alanina Ala A
Valina Val V

Grupo R aromtico:
Fenilalanina Phe F
Tirosina Tyr - Y
Triptofano Trp - W
3

Quimicamente, enzimas so protenas com estrutura especial contendo

um centro ativo denominado apoenzima e, s vezes, um grupo prosttico (cofator) que
pode ser orgnico (coenzima) ou um on metlico ativo.
A habilidade com que a enzima se liga ao substrato se denomina
atividade biolgica e depende:
a) estrutura da protena;
b) nmero de cadeias peptdicas;
c) arranjo dessas cadeias na molcula;
d) natureza do substrato;
e) natureza do grupo prosttico (se houver).
Cada organismo vivo produz uma

grande variedade de enzimas, a

maioria delas em pequenas quantidades. Algumas so produzidas em grandes

quantidades por certos microrganismos, que as excretam para o meio externo. As
enzimas extracelulares so capazes de digerir materiais nutritivos insolveis, como
celulose, protenas e amido.
Algumas destas enzimas so usadas em alimentos, bebidas, laticnios, nas
industrias farmacuticas, txtil e de detergentes. Sua utilizao feita em processos
biotecnolgicos industriais, ajudando a reduzir a poluio, muitas vezes substituindo
processos qumicos nefastos ao meio ambiente.
So produzidas comercialmente em grande escala, por sntese microbiana,
atravs de fungos ou de bactrias. O processo de produo normalmente anaerbico e
o meio de cultura similar aos usados para a fermentao de sntese de antibiticos.
As enzimas so especialmente importantes porque agem em grupos funcionais
especficos, catalisando reaes de forma estereoespecfica, formando somente um ou
dois enantimeros possveis.
Algumas caractersticas importantes das enzimas podem ser citadas, tais como:
So produtos naturais biolgicos.
Apresentam um alto grau de especificidade.
Reaes baratas e seguras.
Possuem mecanismo de turnover, desempenhando a mesma funo
consecutivamente, sem serem consumidas no processo.
4

 So altamente eficientes, acelerando a velocidade das reaes catalisadas.

So econmicas, reduzindo a energia de ativao necessria para a reao
catalisada.
So biodegradveis, sendo o lodo residual reciclado como biofertilizante.
No so txicas.
Altamente eficientes: aumentando a velocidade de reao de 108 a 1011
vezes mais rpida.
Condies brandas.

Comparao das Enzimas com os Catalisadores Qumicos

Caracterstica

Enzimas

Catalisadores Qumicos

Especificidade ao substrato

alta

baixa

Natureza da estrutura

complexa

simples

Sensibilidade T e pH

alta

baixa

Condies de reao (T, P e suaves

drstica (geralmente)

pH)
Custo de obteno (isolamento alto

moderado

e purificao)
Natureza do processo

batelada

contnuo

Consumo de energia

baixo

alto

Formao de subprodutos

baixa

alta

Separao

catalisador/ difcil/cara

simples

produtos
Atividade

Cataltica alta

baixa

(temperatura ambiente
Presena de cofatores

sim

no

Estabilidade do preparado

baixa

alta

Energia de Ativao

baixa

alta

Velocidade de reao

alta

baixa

Classificao e Nomenclatura das Enzimas

Esto disponveis comercialmente mais de 300 enzimas, de acordo com a

Comisso de Enzimas (EC) da Unio Internacional de Bioqumica (IUB)
responsvel pela nomenclatura e classificao
So divididas em seis classes: baseiam-se na reao que catalisam. O
primeiro nmero designa a qual das 6 classes a enzima pertence. O segundo
nmero indica o tipo de ligao que a enzima atua. O terceiro nmero uma
subclassificao do tipo de ligao e o quarto nmero apenas um nmero de
srie.

Principais Classes de Enzimas

Primeiro

EC Classe da enzima

Tipo de reao catalisada

nmero
1.

Oxirredutases

Catalisam reaes de oxirreduo.

Transferncia de H, O ou eltrons.

2.

Transferases

Catalisam transferncias de grupos

entre molculas

3.

Hidrolases

Catalisam reaes de hidrlise

4.

Liases

Catalisam a adio de grupos a

ligaes duplas e vice-versa

5.

Isomerases

Catalisam reaes de isomerizao

Catalisam a unio de duas molculas,

6.

Ligases

associadas

ruptura

da

ligao

tirofosfato do ATP

Mercado Global de Enzimas

Setor

Enzimas

Produo de amido

-amilase,

Milhes de Dlares (US$)

glucoamilase, 500

glucose isomerase
Detergentes

Protease, lipase, amilase

450

Txteis

Amilases

150

Tratamento de couro

Enzimas diversas

25

Papel e celulose

Celulases

25

Laticnios

Lactase

150

Papana

25

Pectinesterases

30

Total

1.355 bilhes

Dados de 1998

2-GENERALIDADES

2.1- ENERGIA DE ATIVAO

Termodinamicamente falando, as enzimas so catalisadores biolgicos
que abaixam seletivamente as energias de ativao das reaes qumicas vitais. Energia
de ativao, a energia mnima necessria para que uma molcula de reagente ou de

substrato S alcance o estado de transio SP

e da se tornar uma molcula de

produto P.
A velocidade da reao SP depende do nmero de molculas de S que
alcanam o estado de transio por unidade de tempo. Na presena de uma enzima
apropriada, a temperatura ambiente fornece uma quantidade suficiente de molculas
reagentes com a necessria energia de ativao. Uma reao catalisada por enzima pode
processar a 25oC, 108 a 1011 vezes mais rapidamente que a mesma reao no catalisada.
As enzimas no afetam o G (energia livre de Gibbs) ou a Keq
(constante de equilbrio) de uma reao. Elas simplesmente aceleram a velocidade com
a qual a reao alcana o equilbrio. No equilbrio, as reaes em ambos os sentidos so
iguais.

Portanto:

k1

k-1

vf = k1[S] = vd = k 1 [P]

Keq =

k1
[ P]
=
[S] k 1

onde,

vf = velocidade de formao do produto P.

vd = velocidade de dissociao do produto P.
[S] = concentrao de substrato S.
[P] = concentrao de produto P.
Na presena de uma enzima apropriada, k1 e o k-1 crescem na mesma
ordem. Se k1 aumenta de 106 vezes, o k -1 deve tambm aumentar de 106 vezes. O G e
o Keq permanecem invariveis (figura 1).

(SP)

Nvel de
energia

Nvel de
energia
Ea

(SP)
S

Ea

S
G

(a)

(b)

FIGURA 1- G e Ea de (a) uma reao no enzimtica; (b) uma reao enzimtica.

2.2- O STIO ATIVO

Sua funo de ligao e cataltica.

A seqncia total de uma reao enzimtica pode ser descrita como:
S + E ES EP E + P

Embora a enzima participe da seqncia da reao, ela no sofre

nenhuma transformao. Sendo assim, apenas poucas molculas de E so capazes de
catalisar a converso de milhares de molculas de S a P por exemplo.
A existncia de um complexo enzima-substrato, ES, foi deduzida:
a) do alto grau de especificidade apresentado pelas enzimas;
b) da forma da curva de velocidade contra concentrao de substrato;
c) do fato de que substratos freqentemente protegem as enzimas de
inativao.
O alto grau de especificidade das enzimas originou a hiptese do modelo
templete ou da analogia chave-fechadura (Emil Fischer,1894). Esse modelo
considera que a enzima possui uma regio chamada stio ativo, a qual complementar
em tamanho, forma e natureza qumica molcula de substrato (figura 2).
A hiptese de Koshland, mais moderna, da enzima flexvel ou do
encaixe induzido considera que o stio ativo no precisa preexistir sob uma forma
geomtrica rgida, devendo contudo existir um arranjo espacial preciso e especfico dos
grupamentos R (cadeia lateral) dos aminocidos, arranjo esse que induzido pelo
contato com o substrato (figura 3). O stio ativo de uma enzima ocupa apenas uma
pequena parte da molcula de enzima.

ES

FIGURA 2- Hiptese da chave fechadura (templete) de especificidade das enzimas.

S
B

A
A

C
E

(a)

(b)

FIGURA 3- Hiptese do encaixe induzido de Koshland. (a) O substrato se aproxima do stio

ativo. (b) A ligao do substrato induz o alinhamento apropriado dos grupos catalticos A e B.

3- CINTICA ENZIMTICA
9

Entende-se por cintica enzimtica a anlise quantitativa do efeito de cada um dos

fatores que influencia a atividade enzimtica avaliada atravs do aumento ou reduo da
velocidade da reao catalisada.
A atividade da enzima, e, portanto a cintica enzimtica determinada pela
concentrao da enzima, concentrao de cofatores, concentrao e tipo de inibidores
(quando presentes) e ainda pH, T e fora inica.
3.1. CATLISE
Caracterstica do catalisador

Modificar a velocidade da reao, sem ser nela consumido ou aparecer entre os

produtos.
No apresenta efeito termodinmico global: energia livre liberada ou absorvida
na reao independente da presena ou ausncia do catalisador.
Atua pela reduo da Energia de Ativao.
Catalisador mais reagente: estados de transio mais estvelreduo da
energia de ativao.
Influncia da Concentrao de Enzima

Sob determinadas condies, a velocidade de transferncia do substrato em

produto proporcional quantidade de enzima. Desvios da linearidade podem ocorrer
devido a: presena de inibidores na prpria soluo de enzima; presena de substncias
txicas; presena de um ativador que dissocia a enzima; e limitaes impostas pelo
mtodo de anlise. A fim de se evitar o efeito causado por estes fatores recomenda-se
utilizar nos ensaios cinticos, sempre que possvel: enzimas com alto grau de pureza;
substratos puros; e mtodo de anlise confivel.
Influncia do pH

Geralmente as enzimas so ativas numa faixa restrita de pH e na maioria dos

casos h um pH timo definido.

10

O efeito do pH sobre a afinidade pode ser eliminado utilizando-se altas

concentraes de substrato de modo a se saturar a enzima em todos os valores de pH; e
o efeito do pH

sobre a enzima deve-se s variaes no estado de ionizao dos

componentes do sistema medida que o pH varia. Como as enzimas so protenas

contm muitos grupos ionizveis, elas existem em diferentes estados de ionizao, por
isso, a atividade cataltica restrita a uma pequena faixa de pH (HARTMEIER).
A atividade da enzima deve ser ento medida no pH timo. A estabilidade de
uma enzima ao pH depende de muitos fatores como: temperatura, fora inica, natureza
qumica do tampo, concentrao de vrios preservativos (por exemplo, glicerol,
compostos sulfdricos), concentrao de ons metlicos contaminantes, concentrao de
substratos ou cofatores da enzima e concentrao da enzima.

Efeito da Temperatura

A atividade cataltica das enzimas altamente dependente da temperatura, como

no caso dos catalisadores convencionais, porm, medida que se eleva a temperatura
dois efeitos ocorrem simultaneamente: (a) a taxa de reao aumenta, como se observa
na maioria das reaes qumicas; e (b) a estabilidade da protena decresce devido a
desativao trmica.
A influncia da temperatura sobre a atividade da enzima geralmente,
representada em termos de atividade ou velocidade de reao em funo da temperatura,
ou seja, a maioria das reaes qumicas se processa a uma velocidade maior medida
que a temperatura aumenta..
O efeito da temperatura de uma enzima depende de um nmero de fatores
inculem o pH e a fora inica do meio e a presena ou ausncia de ligantes. Os
substratos freqentemente protegem a enzima da desnaturao pelo calor.
No processo de desnaturao trmica ocorre a perda da atividade biolgica da
enzima.
Toda enzima tem uma temperatura tima para que atinja sua atividade mxima,
ou seja, a temperatura mxima na qual a enzima possui uma atividade constante por
um perodo de tempo.

11

3.2- Sistema Unirreacional Simples Tratamento Em Equilbrio Rpido

(Henri, Michaelis e Menten)

A reao enzimtica mais simples envolve um nico substrato se transformando

em um nico produto. Admite-se que, inicialmente, a enzima e o substrato reagem
reversivelmente, formando um composto intermedirio denominado complexo enzimasubstrato que, por sua vez, ou se decompe ou reage com outra substncia,
regenerando a enzima e formando os produtos da reao. Considerando o caso mais

simples possvel, caracterizado pelos seguintes pontos:

a) a formao do complexo enzima-substrato se d na proporo de 1
mol de enzima para 1 mol de substrato;
b) o complexo formado se decompe, sem reagir com outras substncias
existentes no sistema.
A seqncia da reao :
k1

E+S

kp

ES

E+P

k-

A equao de velocidade pode ser obtida considerando condies de

equilbrio rpido:
a) E, S e ES alcanam o equilbrio muito rapidamente em comparao
com a velocidade com a qual ES se transforma em E + P (etapa lenta);
b) a velocidade instantnea em qualquer tempo depende da concentrao
de ES:
v = kp[ES], onde kp = constante de velocidade cataltica.

A enzima total est distribuda entre E e ES [E]t = [E] + [ES].

Dividindo a equao de velocidade por [E]t, onde [E] + [ES] usado no
termo da direita, obtemos:

v
kp
[E S ]
=
[E ] t [E ] + [E S ]
No equilbrio a [ES] pode ser expresso em termos de [S], [E] e Ks, onde
Ks a constante de dissociao do complexo ES:

Ks =

[ E ][ S ] k 1
[ S ][ E ]
=
[ ES] =
[ ES]
k1
Ks
12

Substituindo-se para [ES]:

k p[S][E]
v
Ks
=
[E] t [E] + [S][E]
Ks
Rearranjando-se, tem-se:

[S ]
v
= Ks
k p [E ] t 1 + [S ]
Ks
Se v = kp[ES], ento kp[E]t = Vmx a velocidade mxima que ser
observada quando toda a enzima estiver presente sob a forma de ES, ento:

[S]
v
= Ks
V max 1 + [S]
Ks

(1)

Ou
v
[S]
=
V m ax K s + [S]

(2)

Equao de Henri-Michaelis-Menten

A equao (2) nos d a velocidade instantnea ou inicial relativa a

Vmx para uma dada concentrao de substrato.
A equao s vlida se v medida num tempo pequeno o suficiente
para que [S] permanea praticamente constante. Pra isto no mais do que 5% do
substrato devem ser utilizados durante o tempo de ensaio.

3.3. TRATAMENTO DO ESTADO ESTACIONRIO (BRIGGS E

HALDANE)

Se a enzima estiver presente em quantidades catalticas (isto , [S] >>

[E]t), ento a velocidade de aparecimento de ES ser praticamente igual velocidade de
desaparecimento de ES caracterizando-se um estado estacionrio no qual a
concentrao de ES permanece praticamente constante num certo perodo de tempo.
13

A equao de velocidade pode ser derivada de maneira muito similar

equao anteriormente descrita. Neste caso, ES ser obtido da equao do estado
estacionrio ao invs de expresses de equilbrio:
k1
E+S

kp
ES

E+P

k-1
v = kp[ES]

v
kp
[E S ] (2a)
=
[E ] t [E ] + [E S ]

Analisando a seqncia de reao, verifica-se que:

Velocidade de formao de ES = k1[E][S]
Velocidade de decomposio de ES = k-1[ES] + kp[ES] = (k-1 + kp)[ES]
No estado estacionrio, d[ES]/dt = 0 (no h acmulo) ou,
k1[E][S] = (k-1+kp)[ES]

Resolvendo para [ES]:

[ES] =
Onde,

k1[E][S]
(k 1 + kp)

+ kp
= K m = constante de Michaelis - Menten
k1

Assim:

[ES] =

[E][S]
, que substituindo na equao da velocidade:
Km

[ S ][ E ]
v
Km
=
k p [E ] t [ E ] + [ S ][ E ]
Km

[S]
v
= Km
Vmax 1 + [S]
Km

ou

v
[S]
=
Vmax Km + [S]

(3)

Km diferente de Ks:

Km =

[ E ][ S ] k 1 + k p
=
[ ES ]
k1
14

Ks =

[ E ][ S ] k 1
=
[ ES]
k1

A constante de Michaelis, Km, uma constante dinmica. ou de

pseudoequilbrio, que expressa a relao entre as concentraes reais no estado

estacionrio ao invs de concentraes no equilbrio.

Se kp muito pequeno quando comparado com k-1, Km se reduz a Ks.
A equao de Henri-Michaelis-Menten indica que Km equivalente
concentrao de substrato no qual uma enzima produz metade de sua velocidade
mxima.

v=

[S]
Vmax
Km + [S]

v=

Km
Vmax
Vmax =
Km + Km
2

quando[S] = Km,

O valor de Km indica a afinidade de uma enzima pelo seu substrato. O

substrato com valor mais baixo de Km tem uma afinidade aparente maior para a enzima.
Observao: Vmx no uma constante. Vmx depende do kp, que uma
constante, e da concentrao da enzima na experincia. Vmx

proporcional

concentrao de enzima (figura 4).

Lembre-se que a etapa lenta da reao [ES] P + E e portanto a
velocidade de formao de produto praticamente a velocidade da reao:
v = kp[ES] e quando v = Vmx, temos Vmx = kp[E]t.

Vmx

[2E]

Vmx

[E]

[S]
FIGURA 4 - Grfico de v vs. [S] com Vmx variando de acordo com a [E].

3.4.

CURVAS

DE

VELOCIDADE

VS.

CONCENTRAO

DE

SUBSTRATO

A equao de Henri-Michaelis-Menten descreve a curva obtida quando a

velocidade inicial lanada em grfico contra [S] (figura 5).
15

A curva de v vs. [S] uma hiprbole retangular perfeita cujos limites so

Vmx e -Km. A curvatura fixa independentemente dos valores de Km e Vmx. Em
conseqncia, a razo das concentraes do substrato para quaisquer duas fraes de
Vmx constante para todas as enzimas que obedecem cintica de Henri-MichaelisMenten.

Vmx
Velocidade inicial v
0.5Vmx

Km
Concentrao de substrato S

FIGURA 5 - Grfico de v vs. [S]

4- ORDEM DE REAO

A curva de v vs. [S] apresenta 3 regies distintas onde a velocidade

apresenta uma resposta caracterstica medida que [S] aumenta (figura 6a). Em
concentraes muito baixas de substrato (por exemplo, [S] < 0.01Km ), a curva de
v vs. [S] praticamente linear (figura 6b). Esta a regio de cintica de primeira ordem.
Em concentraes de substrato muito altas ([S] > 100Km), a velocidade
praticamente independente da concentrao de substrato. Esta a regio de cintica de
ordem zero (figura 6c). Para as concentraes intermedirias de substrato, a relao
entre v e [S] no segue nem uma cintica de primeira ordem nem uma de ordem zero.

ordem zero

Velocidade inicial v

v
16

Concentrao de substrato S

Concentrao de substrato S
(c)

(a)

1aordem

Concentrao de substrato S
(b)

FIGURA 6- (a) Grfico de v vs. [S] numa grande faixa de [S]. (b) Grfico de v vs.[S]
onde [S]<<Km. (c) Grfico de v vs. [S] onde [S]>Km.

4.1- CINTICA DE PRIMEIRA ORDEM

A relao linear entre v e [S], quando [S] << Km pode ser deduzida a
partir da equao de Henri-Michaelis-Menten.
v=

V m ax [S]
K m + [S]

Quando [S] << Km v = V m ax [S] ou v = k[S] (4)

Km
k = constante de velocidade de primeira ordem para a equao total.
k = Vmx/Km = moles x litro-1 x min-1/ moles x litro-1 = min-1
A equao indica que quando [S] muito pequena, a velocidade absoluta
diminui a cada momento, medida que [S] decresce (figura 7a). Porm, em certo
momento, uma frao constante de substrato presente se transforma em produto:
d[S ]
-d[S ] / [S ]
= v = k [S ] k =
dt
dt
d [S ]
= v = q u a n tid a d e d e [S ] u tiliz a d a p o r u m p e q u e n o p e rio d o
dt
17

k = frao constante de substrato presente em qualquer momento.

Como v diminui com o tempo na regio de primeira ordem, grficos de
[S] e [P] contra o tempo so curvos (figura 7b). Pode-se determinar a quantidade de
substrato utilizada ou de produto formado durante qualquer intervalo de tempo
utilizando a equao integrada de velocidade de primeira ordem.

[S]0
[P]
[S] ou [P]
v
[S]0/2

[S]
(a)

Tempo

t1/2

Tempo

(b)

FIGURA 7- Regio de primeira ordem da curva de velocidade. (a) v diminui

continuamente com o tempo. (b) O aparecimento de P e o desaparecimento de S no so
lineares com o tempo.

v=
[S ]

[S ]0

-d[S]
-d[S]
= k[S] ou
= kdt
dt
[S]
d [S ]
= k
dt

[S]0
[S]0
= k ( t t 0) ou 2.3log
= k ( t t 0)
d t ln
[S]
[S]
to

Se [S]0 = concentrao inicial de substrato e t0 = tempo zero, a equao

fica assim:
2.3 log

[S]0
= kt (5)
[S]

Onde, t = tempo decorrido

[S] = concentrao de substrato no tempo t
Na forma exponencial:
[S] = [S]0e-kt (6)
A equao 5 pode ser transformada em:

log[S ] =

k
t + log[S ]0
2 .3
18

Ento, um grfico de [S] vs. t linear, com uma inclinao de -k/2.3 e

uma interseo de log[S]0 no eixo de log[S] (figura 8).
Quando [S] = [S]0, t = meia-vida, t1/2.
t1/2 = tempo necessrio para converter em produto metade do substrato
originalmente presente.
O t1/2 constante para reaes de 1a ordem e est relacionado ao k:

2 .3 log

2.3 log 2
= t1 / 2
k

1
= kt 1 / 2
0.5

0.693
= t1 /
k

(8)

Inclinao = -k/2.3
log[S]0
log[S]

lo g

[ S ]0
2

t1/2

Tempo

FIGURA 8- Grfico semilog da forma integrada da equao da velocidade de primeira

ordem.

4.2- CINTICA DE ORDEM ZERO

Quando [S] >> Km, o Km no denominador da equao de HenriMichaelis-Menten pode ser ignorado e a equao simplificada:

v=

V max[ S ]
V max [S]
S ] >> Km
[

[S ]
K m + [S]

v = Vmx (9)

19

5- MTODOS PARA CONSTRUO DE GRFICOS DOS DADOS E

CINTICA ENZIMTICA

Para facilitar a determinao das constantes cinticas, os dados so

geralmente lanados em grficos lineares.

5.1- GRFICOS DOS RECPROCOS DE LINEWEAVER-BURK:

1/v

VS. 1/[S]

baseado no rearranjo da equao de Henri-Michaelis-Menten numa

forma linear (y = mx + b):
v
[S ]
V m ax K m + [S ]
=
=
Invertend o :
v
V m ax K m + [ S ]
[S]

1 K m + [S]
=
v
V m ax [S ]

Separando os termos:
1
Km
1
[S]
=
+

v
V m ax [ S ] V m ax [S]
ou 1 = K m 1 + 1
v
V m ax [ S ] V m ax

(10)

1/v

1/Vmx
20

-1/Km

1/[S]

FIGURA 9- Grfico duplo recproco (1/v vs.1/[S]) de Lineweaver-Burk

Existem outros tipos de grficos:

Grfico De Hanes-Woolf: [S]/V Vs. [S]
Grfico De Woolf-Augustinsson-Hofstee: V VS. V/[S]
Grfico De Eadie-Scatchard: V/[S] Vs. V

5.2- FORMA INTEGRADA DA EQUAO DE HENRI-MICHAELISMENTEN

Em determinadas condies pode ser difcil medir-se velocidades

iniciais, embora seja ainda possvel determinar-se a concentrao de substrato ou
produto durante o curso de uma reao.
Se Keq muito alto e o produto tem pouca afinidade pela enzima, ento a
velocidade decrescente com o tempo resulta somente da saturao decrescente da
enzima. Km e Vmx podem ser determinados pelo uso da forma integrada da equao de
velocidade.
v=

d [S ]
V m ax[ S ]
=
dt
K m + [S ]

V m ax dt =

K m + [S ]
d [S ]
[S ]

Integrando:
t

V m ax t dt =
0

V m ax t dt =
0

+ [S ]
d[S ]
[S ]

[S ]t K m

[ S ]

[S]t K m

[ S ]

V max t = K m ln

[S ]

d [S ]

[S]t

[ S ] d [S ]
0

[S ]
([ S ] [ S ]0 )
[ S ]0

ou

21

V max t = 2 .3 K m log

[ S ]0
+ ([S ]0 [S ])
[S ]

onde [S] = concentrao de substrato em qualquer tempo t = [S]0 - [P]

([S]0 - [S]) = concentrao de substrato utilizado no tempo t = [P], a
concentrao de produto formado no tempo t.
A equao 14 pode ser dividida por t e sofrer um rearranjo, resultando
em:
2 .3
[ S ]0
1 ([ S ] 0 [ S ]) V m ax
log
=
+
t
[S ]
Km
t
Km

(15)

Vmx/Km

2.3
t

log

[S]0
[S]

ou

2.3
t

log

Inclinao = -1/Km

[S]0
[S]0 [P]

Vmx

([S]0-[S])/t ou [P]/t

FIGURA 10- Grfico de equao integrada de Henri-Michaelis-Menten.

6- INIBIO ENZIMTICA

Um inibidor qualquer substncia que reduza a velocidade de uma

reao enzimtica.
Os inibidores podem ser classificados em:

Reversveis

competitivos
no competitivos

Inibidores
Irreversveis

6.1- INIBIO REVERSVEL

22

Neste tipo de inibio, a atividade enzimtica recuperada com a

remoo do inibidor.
caracterizada por um equilbrio entre o inibidor e a enzima definido
por uma constante de equilbrio, ki.
6.1.1-INIBIO COMPETITIVA

Um inibidor competitivo uma substncia que se combina com uma

enzima livre de uma forma tal que impede a ligao do substrato. Isto , o
inibidor e o substrato so mutuamente exclusveis, em geral porque h uma
verdadeira competio pelo mesmo stio. Um inibidor competitivo poderia ser
um anlogo no metabolizvel ou um derivado de um substrato verdadeiro, ou
um substrato substituto da enzima, ou um produto da reao.
A combinao do inibidor com a enzima provoca uma mudana na
conformao (estrutura terciria ou quaternria) da enzima que deforma o stio
do substrato e, portanto, impede o substrato de se ligar.
As figuras abaixo ilustram os modelos de inibio competitiva:

23

O esquema de reao que descreve a inibio competitiva :

A velocidade inicial da reao proporcional concentrao no

estacionrio do complexo enzima-substrato, ES. Todas as reaes so
reversveis. Desse modo, podemos prever que em qualquer concentrao subsaturante fixa de inibidor: a) v, (a velocidade da reao em ausncia de inibidor)
pode ser igualada a v (a velocidade da reao em ausncia de inibidor), porm,
nesse caso, uma concentrao mais alta de substrato ser necessria (para obter a
24

mesma concentrao de ES), e b) na presena de uma concentrao de substrato

muito alta (saturante), toda enzima pode ser levada forma de complexo ES.
Como conseqncia, a velocidade inicial mxima, na presena de um inibidor
competitivo, igual a V mx (velocidade inicial mxima em ausncia de inibidor).
A Km aparente (medico como [S] para V

mx)

aumentar na presena de um

inibidor competitivo porque, qualquer que seja a concentrao deste ltimo,

existir uma frao de enzima sob forma de EI, a qual no possui afinidade pelo
S.
A equao de velocidade pode ser facilmente deduzida a partir de
condies de equilbrio rpido:

A figura abaixo ilustra o efeito de um inibidor competitivo no grfico de

v vs. [S].

A equao da velocidade para a inibio competitiva na forma recproca

:

25

grfico

recproco

(V-1

[S]-1)

dado

pela

figura

abaixo:
A inclinao do grfico recproco na presena do inibidor competitivo
dada por:

A Kmap dada como:

6.1.2- INIBIO NO COMPETITIVA

26

Um inibidor no competitivo clssico no tem efeito na ligao do

substrato, e vice-versa. S e I se ligam reversvel, aleatria e independentemente
em stios diferentes. Isto , I se liga a E e a ES: S se liga a E e a EI. Entretanto, o
complexo ESI resultante cataliticamente inativo. I pode impedir o
posicionamento adequado do centro cataltico. As reaes de equilbrio so:

Podemos observar pelas reaes de equilbrio que, em qualquer

concentrao de inibidor, uma concentrao infinitamente alta de substrato no
consegue levar toda enzima sob forma de ES que a forma produtiva. Em
qualquer [I] uma parte da enzima permanecer sob a forma de complexo no
produtivo ESI, donde podemos prever que Vmx em presena de um inibidor no
competitivo (Vmx ) ser menor que a Vmx observada na ausncia de inibidor. O
valor Km (medido a uma [S] quando a v, igual a 0,5 Vmx ) permanece o mesmo
na presena do inibidor no competitivo porque, qualquer que seja a
concentrao de inibidor, as formas da enzima que podem combinar com S (E e
EI) apresentam a mesma afinidade para com o S. O efeito final de um inibidor
no competitivo fazer com que parea que haja menor quantidade de enzima
presente.
A equao da velocidade dada por:

Como previsto, observamos que o nico efeito de um inibidor no

competitivo diminuir a Vmx. A figura abaixo ilustra o comportamento do
grfico V vs [S].
27

A equao do recproco :

A figura apresenta o grfico recproco V-1 vs [S]- 1:

28

A inclinao da reta no grfico recproco em presena de um inibidor

puramente no competitivo um funo linear de [I], como j mostrado para a
inibio puramente competitiva.
6.2. INIBIO IRREVERSVEL

Um substrato que se combina irreversivelmente com uma enzima pode

assemelhar-se a um inibidor no competitivo porque Vmx diminui, ao passo que
Km permanece a mesma. As reaes so:

A Vmx diminui porque parte da enzima completamente removida do

sistema. Pela construo de um grfico de Vmx vs. a quantidade total de enzima

29

adicionada ao meio de reao em presena de I, pode-se distinguir um inibidor

irreversvel de um inibidor, no competitivo clssico:

7. EFEITO DO pH NA ESTABILIDADE E ATIVIDADE DAS ENZIMAS

Os efeitos do pH na estabilidade de uma enzima devem ser levados em

conta em qualquer estudo do efeito do pH na ligao do substrato e na catlise.
Os stios ativos nas enzimas so freqentemente compostos por grupos
ionizveis que devem se encontrar numa forma inica adequada para que
mantenham a conformao do stio ativo, liguem-se aos substratos, ou catalisem
a reao. Alm disso, os prprios substratos podem conter grupos ionizveis e
somente uma forma inica deste substrato pode se ligar enzima ou sofrer
catlise.
A figura ilustra uma curva experimental de v vs. PH para uma enzima
(curva A). E o efeito do pH na estabilidade da enzima (curva B).

30

Observamos que a pr-incubao da enzima em pH 5 ou pH 8 no

produz nenhum efeito na atividade medida em pH 6,8. Ento, o declnio na
atividade entre pH 6,8 e 8 e entre pH 6,8 e 5 deve resultar da constituio de
uma forma inica no adequada da enzima e/ou do substrato. Quando a enzima
pr-incubada em pH > 8 ou pH > 5, a atividade total no obtida em pH 6,8.
Ento, parte do declnio na atividade acima de pH 8 e abaixo de pH 5 resulta de
uma inativao irreversvel da enzima. Um estudo do efeito do pH na
estabilidade de uma enzima, tal como ilustrado pela curva B, constitui parte
essencial na caracterizao de qualquer enzima.
A curva B de estabilidade pode ser obtida pela pr-incubao da enzima
nos pH indicados por um tempo que seja, pelo menos, to longo quanto o tempo
que se gasta para fazer as determinaes usuais. A atividade da enzima deve ser
ento medida no pH timo. A estabilidade de uma enzima ao pH depende de
muitos fatores como (a) temperatura, (b) fora inica, (c) natureza qumica do
31

tampo, (d) concentrao de vrios preservativos (por exemplo, glicerol,

compostos sulfidrlicos), (e) concentrao de ons metlicos contaminantes, (f)
concentrao de substratos ou cofatores da enzima, e (g) concentrao da
enzima.
8. EFEITO DA TEMPERATURA NA ESTABILIDADE E ATIVIDADE
DAS ENZIMAS

A maioria das reaes qumicas se processa a uma velocidade maior

medida que a temperatura aumenta. Um aumento na T (temperatura) imprime
maior energia cintica s molculas de reagente, ocasionando um maior nmero
de colises produtivas por unidade de tempo. As reaes catalisadas por enzimas
se comportam de modo at certo ponto semelhante. As enzimas so molculas
proticas complexas. Sua atividade cataltica provm de uma estrutura terciria
precisa, altamente ordenada que justape os grupamentos R especficos dos
aminocidos de tal modo a formar stios estereo-especficos de ligao com o
substrato e o centro cataltico. A estrutura terciria de uma enzima mantida
principalmente por um grande nmero de ligaes no covalentes fracas. Em
termos prticos, uma molcula de enzima uma estrutura muito delicada e
frgil. Se a molcula absorve energia demais, a estrutura terciria romper-se- e
a enzima ficar desnaturada, isto , perder a atividade cataltica. Logo, a
medida que a temperatura cresce, o esperado aumento em v, resultante do
aumento das colises entre E + S, compensado pelo aumento da velocidade de
desnaturao. Consequentemente, um grfico de v vs. T em geral apresenta um
pico algumas vezes chamado de temperatura tima. A temperatura tima
depende do tempo escolhido para a realizao das medidas. A verdadeira
temperatura tima para uma determinao a temperatura mxima na qual a
enzima possui uma atividade constante por um perodo de tempo pelo menos to
longo quanto o tempo da determinao.
O efeito da temperatura de uma enzima depende de um nmero de
fatores que incluem o pH e a fora inica do meio e a presena ou ausncia de
ligantes. Os substratos freqentemente protegem a enzima da desnaturao pelo
calor. Enzimas de baixo peso molecular compostas de uma nica cadeia
32

polipeptidica e possuindo pontos dissulfetos so geralmente mais estveis ao

calor do que enzimas oligomricas, de alto peso molecular. Em geral, uma
enzima ser mais estvel ao calor em preparaes brutas livres de clulas que
contenham uma concentrao alta e de outras protenas (desde que na ausncia
de proteases).
A EQUAO DE ARRHENIUS - ENERGIA DE ATIVAO

A relao entre a constante de velocidade de uma reao, K, e a energia

de ativao, Ea, dada pela equao de Arrhenius.

A a constante para cada reao em particular. A forma integrada da

equao de Arrhenius :

onde K2 e K1 so as constantes de velocidade especficas em duas temperaturas

diferentes, T2 e T1, respectivamente.
Num sistema de equilbrio rpido e simples, Vmx [E]t = Kp uma
constante de velocidade de primeira ordem. Assim, um grfico de log Vmx [E]t
vs. 1/T fornece Ea para a etapa cataltica. Na prtica pode-se colocar no grfico
apenas log Vmx, uma vez que Vmx, de uma determinada preparao
proporcional a Kp, desde que Km varia com T, no podemos admitir que uma
determinada concentrao de substrato seja saturante em todas as temperaturas.
O ideal seria determinar a Vmx a partir de um grfico recproco a cada
temperatura. Para a maior parte das reaes enzimticas, o Vmx depende de
vrias constantes de velocidade, cada qual podendo ser afetada de maneira
diferente pela variao de temperatura. Isto quer dizer que a Ea calculada atravs
33

do grfico de Arrhenius ser um valor aparente ou uma mdia. O prprio

grfico de Arrhenius pode no ser linear se diferentes etapas se tornam
limitantes da velocidade em temperaturas diferentes. Em alguns casos, o grfico
pode apresentar uma variao brusca na inclinao da reta a determinadas
temperaturas (temperatura de transio) em que a dependncia de Vmx varia
de uma etapa limitante para outra (curva B). Uma queda brusca no grfico de
Arrhenius em 1/T baixa (T alta) indica uma desnaturao da protena (curva C).

O efeito da temperatura na velocidade das reaes em geral expresso

em termos de coeficiente de temperatura (Q10) - fator pelo qual a velocidade
aumenta quando a temperatura aumenta de 10oC.

34

9. DETERMINAO DAS ENZIMAS

9.1. UNIDADES DE ENZIMAS E ATIVIDADES ESPECFICAS - QUANTIFICAO
DE [E]t

Na maior parte das preparaes e concentrao real da enzima

desconhecida. Consequentemente, a quantidade de enzima presente s pode ser
expressa em termos de sua atividade. A determinao da atividade da enzima
envolve a medida da velocidade de reao, portanto, a Comisso de Enzima da
Unio Internacional de Bioqumica, recomenda a seguintes definio (DIXON e
WEBB, 1979):
Uma unidade (U) de atividade a quantidade de enzima que catalisa a
transformao de 1 micromol de substrato, ou a formao de 1 micromol de
produto por minuto, nas condies de ensaio (temperatura, pH, concentrao de
substrato, etc).
U= micromoles produto/minuto
A concentrao da enzima de uma preparao impura expressa em termos de
unidades/ml. A atividade especfica expressa em termos de atividade por
miligrama de protena (U/mg).

AE = Unidades/ml
mg protena/ml

= Unid/mg protena

9.2. EXTRAO DE ENZIMAS

Extrao um processo em que a protena de interesse transferida a

partir da fase aquosa existente para outra fase, tanto aquosa ou orgnica. Neste
processo, a atividade biolgica preservada.
Sempre quando inicia-se a extrao, definem-se as condies, tais como:
concentrao, tipo de extrato, bem como o tempo e a temperatura em que
ocorrer o processo, alm do nvel de agitao.
Alguns reagentes mais utilizados na extrao: NaCl, soluo tampo, solventes
apropriados, entre outros.
35

9.3. PURIFICAO DE ENZIMAS

A purificao consiste numa srie de processos que removem

contaminantes at a obteno de um produto de elevado grau de pureza. Estes
processos devem ocorrer em condies que mantenham a estabilidade da
molcula a ser purificada ou seja, deve-se evitar a degradao da protena.
As enzimas so purificadas pelo emprego sucessivo de mtodos do
fracionamento qumicos ou fsicos. O objetivo de cada etapa reter o mximo
possvel da enzima que se quer purificar e eliminar, tambm o mximo possvel,
outras protenas, cidos nuclicos e outras substncias. A eficincia de cada
etapa dada por um rendimento ou recuperao (a porcentagem retida da
atividade total da enzima originalmente presente) e a purificao ou fator de
purificao (o fator pelo qual a atividade especfica da preparao aumentou).
O objetivo otimizar ambos os fatores. Algumas vezes, um bom rendimento
sacrificado em funo de uma etapa excelente de purificao; algumas vezes
uma boa etapa de purificao no utilizada porque o rendimento muito baixo.
A recuperao e a purificao so representadas por:

Recuperao =

unidades totais na frao purificada

unidades totais no extrato bruto

x 100%

atividade especfica na frao purificada

Purificao =

atividade especfica do extrato bruto

x 100%

No h regras gerais com relao ordem das etapas de purificao,

embora sejam normalmente utilizados em primeiro lugar nas etapas de
purificao o tratamento por calor (onde possvel) e as precipitaes por sulfato
de amnio. A filtrao em gel seguir-se precipitao por sulfato de amnio,
servindo para dessalificar a preparao assim como para fracionar as protenas
de acordo com o tamanho. Se a cromatografia de troca inica usada
posteriormente precipitao por sulfato de amnio, recomendvel dialisar a
preparao rpida em gel (por exemplo, Sephadex G-25). A eliminao do
sulfato de amnia facilitar a ligao das protenas resina de troca inica.
Outras etapas podem ser altamente eficientes para certas enzimas incluem
36

centrifugao diferencial, precipitao por sulfato de protamina ou sulfato de

estreptomicina, cromatografia de afinidade, e eletroforese preparativa em gel.

9.4. Precipitao de Protenas

Uma das etapas iniciais de purificao a precipitao de protenas de

uma soluo aquosa concentrada (extrato). Vrios agentes precipitantes so
disponveis, incluindo sais, calor, pH e solventes orgnicos.
A solubilidade da protena devido, em grande parte, distribuio de
resduos hidroflicos e hidrofbicos na superfcie da molcula e, desta maneira,
protenas diferentes componentes de uma mistura, ao responderem de modo
distinto a agentes precipitantes, podem ser separadas.
O fracionamento de acordo com a solubilidade em solues de sulfato de
amnio muito utilizado em protocolos de isolamento de protenas e, em geral,
fornece preparaes com menor grau de contaminao e mais enriquecidas da
protena de interesse. Adicionalmente, preparaes homogneas podem ser
obtidas pela precipitao dos contaminantes permanecendo a protena de
interesse solvel.

9.5. Quantificao de Protenas

A determinao quantitativa de protenas indispensvel durante o

procedimento de isolamento e caracterizao destas biomolculas. Entre os
vrios mtodos para quantificar protenas, o de Lowry e colaboradores e a
medida da absoro de luz ultravioleta (280 nm) so freqentemente utilizados.

9.6. Processos cromatogrficos

Cromatografia um procedimento fsico-qumico que se desenvolve em

um meio slido, de origem orgnica (Sephadex, Celulose) ou inorgnica
(poliacrilamida, slica). Neste processo ocorre a separao dos componentes
constituintes de uma mistura, devido a migrao destes em diferentes
velocidades, atravs de uma coluna.
Em cromatografia vrios so os fatores que determinam a qualidade da
separao (resoluo), sendo exemplos: temperatura e velocidade de fluxo,
37

volume e concentrao da amostra e propriedades da matriz, como: forma e

tamanho da partcula e nmero de stios de adsoro disponveis.
Cromatografias

mais

utilizadas:

cromatografia

de

troca

inica,

cromatografia de afinidade, cromatografia de fase reversa, cromatografia de

excluso (filtrao em gel).
10. UTILIZAO DE ENZIMAS
10.1. HISTRICO

1876 Willain Krihne, props o nome ENZIMA

EN = EM
ZIMA = LEVEDO
Enzimas de plantas e animais de importncia industrial
Nome

Fonte

Aplicao

Papana

mamo

Digestiva, mdica, bebidas, carne

Bromelina

abacaxi

Digestiva, mdica, bebidas, carne

Diastase

malte

Xarope, panificao, digestivo

Pepsina

estmago

Amaciamento de carne

10.2. Usos de Enzimas na Indstria

Industria de Cerveja
Indstria de Amido E Aucares
Indstria de lcool
Detergentes
Txtil
Papel E Celulose
Curtumes
Panificao

11. BIBLIOGRAFIA
BROCK, T. (1997), Biology of Microorganisms. Prentice-Hall Inc. Chapter 12.
Industrial Microbiology.
38

GLAZER, A. N. & NIKAIDO, H. (1994) Microbial Biotecnology, fundamentals of

applied Biotecnology. University of California, Berkeley. W. H. Freeman &
Company, N.Y.
NOVONORDISK. (1995) Apostila sobre uso de enzimas.
SHREVER, R. N. & BRINK JR, J. A. (1980) Indstrias de Processos Qumicos.
Ed. Guanabara Dois S.A. R.J.
SEGEL, I.H. (1979) Bioqumica. Teoria e Problemas. Ed. Livros tcnicos e
cientficos. RJ.
BAILEY, J. E. e OLLIS,.D. F. Biochemical Engineering Fundamentals 2 nd
edition.
LEHNINGER, A . L. - Bioqumica - volume 1 - Componentes Moleculares das
Clulas

39