Material

Agitador magntico

Pipeta volumtrica de 25

Balo volumtrico de 50
mL

mL;

Pipeta Pasteur;

Barra magntica

Esptula

Bureta de 25 mL;

Suporte universal;

Medidor de pH

Conta-gotas;

Balana Analtica

Pompete;

(0,0001g);

Funil;

Proveta de 10 mL

Polarmetro;

Copo de 100mL para

Vidro de relgio;

titulado;

Vareta

Reagentes

Glicnia;

Soluo aquosa de NaOH 0.1066 mol/dm3;

HCl concentrado.

Procedimentos
Determinao da curva de titulao da glicina:
1- Preparar 50 mL de uma soluo aquosa de glicina 0,1 mol/dm 3;

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- BIOQUMICA

2- Calibrar o aparelho medidor de pH com as solues

que foram fornecidas;
3- Num copo de 100mL, colocar 25,00 mL da soluo de
aminocido e adicionar, gota a gota, HCl concentrado
(no nicho), at o pH ser aproximadamente 1,5;
4- Encher uma bureta com soluo aquosa de NaOH
0,1066 mol/dm3;
5- Adicionar pequenos volumes desta soluo ao copo
que

contm

soluo

do

aminocido,

agitar

convenientemente e fazer um registo de variao do

pH com o volume de base adicionado;
6- Lavar e arrumar cuidadosamente o elctrodo do aparelho medidor de
pH.

Distino entre a glicina e a L-prolina:

1- Preparar 50.00 mL de duas solues aquosas a 2% de cada um dos
aminocidos;
Actividade ptica:
2- Com a ajuda do docente, ler cuidadosamente as instrues de
3-

funcionamento do polarmetro;
Ajustar o zero do aparelho com gua destilada numa clula de 2

dm de comprimento;
4- Encher a mesma clula, sucessivamente com cada uma das duas
solues de aminocidos e determinar as respectivas rotaes
pticas.

Instrues dos medidores de pH Anatron 300 e WPA CD 720

Antes de proceder calibrao so necessrias 2 solues tampo,

dependendo da zona de pH pretendida. Geralmente utiliza-se as de pH4 e
pH7.
necessrio verificar-se a temperatura das solues, uma vez que o
pH varia em funo da temperatura.

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- BIOQUMICA

Calibrao:
1. Introduzir o elctrodo depois de devidamente lavado e seco na
soluo tampo pH7.
2. Ajustar a leitura do aparelho a 7.00, com o auxilio do boto Call ou
Buffer off Set.
3. Retirar o elctrodo da soluo pH 7, lava-lo com gua e seca-lo.
4. Introduzir o elctrodo da soluo tampai de pH 4.
5. Ajustar a leitura do aparelho a 4.00, com o auxilio do boto SLOPE.
Depois da calibrao, o elctrodo deve ser lavado e seco e pode ser
introduzido na soluo que se pretende medir.

Nota: Nunca deixar secar o elctrodo. Quando no est a ser usado

usado deve ser mergulhado numa soluo KCI 3M.

Resultados

DETERMINAO DA CURVA DE TITULAO DA GLICINA:

mglicina= ?
GLICINA

H3N+

CH2

CO2-

M (glicina) = 1,0 x 5 + 14 + 12 x 2 + 16 x 2 = 75g/mol

M=

m
, n=?
n

C = 0.1 mol/dm3
v = 50 mL = 0.005 dm3

n
C= , n=C v , n=0,1 0,05=0,005 mol
v

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M=

- BIOQUMICA

m
, m=M n , m=75 0,005=0.375 g de glicina
n

NOTA: soluo de 25mL glicina adicionaram-se gotas de HCl at atingir um pH de cerca de

1,5.
Adicionaram-se

6 gotas e pH = 3.53
+ 3 gotas, pH = 2.85
+ 3 gotas, pH = 1.46

Procedeu-se, ento, titulao, sendo o titulado a soluo cida de

glicina

HCl

titulante

soluo

de

NaHO

de

concentrao

0,1066mol/dm3, como objectivo de atingir um pH de cerca de 11,5 , 12 .

Os valores apresentam-se na tabela de seguida apresentada:

ESSUA 1Ano de Enfermagem

Volume
Varia
adicion
o do pH
ado
1
2
3
3,5
4
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
9,5
10
10,5
11
11,5
12
12,5
13
13,5
14
14,5
15
15,5
16
16,5
17
17,5
18
18,5
19
19,5
20

1,51
1,56
1,62
1,64
1,67
1,7
1,72
1,75
1,78
1,8
1,83
1,86
1,88
1,91
1,94
1,97
1,99
2,02
2,04
2,07
2,1
2,12
2,15
2,18
2,2
2,23
2,26
2,28
2,34
2,34
2,37
2,41
2,42
2,45
2,48
2,51
2,53

- BIOQUMICA

Volume
adicion
ado
21
21,5
22
22,5
23
23,5
24
24,5
25
25,5
26
26,5
27
27,5
28
28,5
29
29,5
30
30,5
31
31,2
31,4
31,5
31,6
31,7
31,8
31,9
32
32,1
32,2
32,3
32,4
32,5
32,6
32,7
32,8

Varia
o do
pH
2,6
2,64
2,67
2,7
2,74
2,81
2,81
2,85
2,9
2,93
2,94
3,04
3,1
3,16
3,22
3,31
3,36
3,45
3,62
3,8
4,04
4,33
4,61
4,99
5,62
6,34
6,95
7,28
7,69
7,86
7,96
8,11
8,15
8,24
8,33
8,36
8,41

Volume Varia
adicion
o do
ado
pH
A
33
33,5
34
34,5
35
35,5
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67

8,47
8,67
8,78
8,9
8,98
9,07
9,12
9,23
9,33
9,41
9,5
9,57
9,64
9,7
9,74
9,83
9,89
9,93
10,07
10,13
10,2
10,3
10,35
10,46
10,56
10,59
10,68
10,79
10,93
11,1
11,26
11,42
11,57
11,7
11,8
11,89
11,94
12,01

tabela apresenta os valores de variao do pH consoante o volume

adicionado ao titulado. A verde esbado apresentam-se as alteraes na
adio do volume, de 1mL para 0.5mL e para 0.2mL entre cada poro de

ESSUA 1Ano de Enfermagem

- BIOQUMICA

volume adicionado. A amarelo salientam-se as variaes de pH mais

importantes, sendo a primeira a mudana de cido para base e a segunda a
chegada aos valores pretendidos de pH, 11,5 ou 12.

Em baixo apresenta-se o grfico da variao do pH com o volume

adicionado, apresentando (questo 1):
- os pontos correspondentes aos valores de pKa 1 e pKa2
da glicina (assinalados, aproximadamente, a azul)

- o ponto isoelctrico da glicina (a vermelho)

PI = (pka1 + pka2) / 2
= (2.35 + 9.78) / 2 = 6.065
V

NaHO

= 31.7 mL (aproximadamente)

- as regies nas quais se pode considerar que a soluo

se comporta como tampo (a laranja) O soluo
comporta-se como tampo em dois pontos da curva, em que o
aumento de pH mais lento.

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- BIOQUMICA

Curva de titulao da glicina

14
12
10
pKa2,

pH=9.78 e Vadicionado = 44mL

(aproximadamente)

8
6
Valores de pH

Variao do pH

Pto.
isoelctrico

4
2
0pKa1,

pH = 2.35 e Vadicionado =16.5mL

(aproximadamente)

Volume de NaOH
adicionado

DISTINO ENTRE A GLICINA E A L-PROLINA:

Para uma soluo de prolina a 5%,
mprolina = ?
5g

100 mL

xg

50 mL
x = 2,5 g prolina

Caracterstica para as molculas terem rotao ptica - ter um

carbono assimtrico (esta ligado a 4 grupos diferentes o carbono,
quiralidade).

Actividade optica da glicina

No deve existir variao do

campo.

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Est de acordo com o que

pretendamos observar. Como a
glicina no tem centro de
quiralidade no consegue rodar,
dai no vermos diferena quando
observamos no polarmetro.

Actividade ptica da L-prolina

H variao, a parte esquerda
ficou mais escura em relao
parte direita.

- BIOQUMICA

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Aminocidos

Rotao ptica

Glicina
L-prolina

0
- 8.15

Rotao especfica da glicina = 0

Clculo da rotao especfica da L-prolina:
Atravs da lei de Biot:

Em que:
- ngulo de desvio ()
l - comprimento do tubo polarimtrico (dm)
c - concentrao da substncia em anlise (g cm-3 )
- rotao especfica da substncia ( cm3 g-1 dm-1)

,l=2 dm , C=?
lC
m 2.5 g
C prolina= =
=0.05 g/mL=0.05 g/cm3
v 50 mL

8.15
2 0.05

81.5

Concluso
.Questes:
1. (em cima)
2. Escreva as estruturas das formas de glicina que predominam nas
seguintes regies:
a. a pKa1

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NH3+ CH2 COOH- - forma protonada (cida, no

ionizada)

b. entre pKa1 e o ponto isoelctrico

NH3+ CH2 COOH- e NH3+ CH2 COOforma protonada e anfotrica

c. no ponto isoelctrico

NH3+ CH2 COO-

- forma anfotrica

d. a pKa2

NH2+ CH2 COO-

- forma no protonada (bsica,

ionizada)

3. Sabendo que para a valina os pKa1 e pKa2 so, respectivamente,

2.32 e 9.62, calcule o seu ponto isoelctrico.
Sendo PI = (pka1 + pka2) / 2
PI = (2.32 + 9.62) / 2
PI = 5.97

4. Diga como poderia distinguir, por electroforese, usando um

tampo a pH=6, os aminocidos seguintes [NH 2-CHR-CO2H]:
alanina, arginina e cido asprtico. Descreva o que se observa
experimentalmente.
Ponto isoelctrico da alanina =6.0
Ponto isoelctrico da arginina = 10.8
Ponto isoelctrico do cido asprtico = 2.8

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- BIOQUMICA

A electroforese, na bioqumica, serve para a separao de

compostos

que

possuem

carga,

como

aminocidos,

pptidos,

protenas e cidos nucleicos, sendo que esta carga varia de acordo

com o valor de pH do meio em que as substncias se encontram. As
cargas positivas e negativas sero separadas e dirigir-se-o para
direces opostas.
Experimentalmente, o papel de filtro a utilizar ser absorvido
com a soluo tampo de pH=6, colocando-se depois as amostras de
aminocidos no mesmo, assentando-o entre os elctrodos.
Observar-se-ia que a alanina ficaria situada no centro, pois o
seu ponto isoelctrico igual ao pH tampo. A arginina afastar-se-ia
para o lado do elctrodo negativo, uma vez que na soluo tampo
de pH=6 esta se encontra com cargas positivas. J o cido asprtico
afastar-se-ia para o lado negativo, pois com ponto isoelctrico = 2.8,
numa soluo tampo de pH=6 est carregado negativamente.
As amostras dirigem-se para o centro ou para qualquer uma
das extremidades do papel de filtro dependendo das substncias a
separar bem como do valor do pH tampo.
Concluindo:
- os objectivos propostos inicialmente foram atingidos:
. a curva de titulao da glicina foi efectuada com
sucesso uma vez que os valores registados durante a
titulao foram precisos e com pequenas variaes de
volume de NaHO na soluo de glicina e HCl.

. os valores pKa1 e pKa2 foram identificados no grfico

segundo a tabela apresentada, sendo que para pKa 1 o
volume adicionado = 16.5mL e para pKa 2 o volume
adicionado = 44mL.

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- BIOQUMICA

. foi possvel determinar a rotao especfica dos

aminocidos prolina e glicina. Para o primeiro a rotao
especfica tem um valor de 81.5, obtido atravs da
rotao

ptica

de

8.15,

da

concentrao

do

comprimento do tubo polarimtrico, calculado atravs da

lei de Biot.
- importante salientar que na medio da massa de glicina
necessria a balana se encontrava apenas com uma casa
decimal, pelo que o valor 0.375g calculado previamente no
foi o utilizado na realidade, mas sim 0.3g.