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MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO

SECRETARIA DE DEFESA AGROPECURIA


INSTRUO NORMATIVA N 12, DE 29 DE JANEIRO DE 2004
O SECRETRIO DE DEFESA AGROPECURIA SUBSTITUTO, DO MINISTRIO DA
AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO, no uso da atribuio que lhe confere o art. 15,
inciso II, do Anexo I do Decreto n 4.629, de 21 de maro de 2003, o art 4, da Portaria Ministerial n 516,
de 9 de dezembro de 1997, tendo em vista o disposto na Instruo Normativa SDA n 51, de 27 de junho
de 2003, e o que consta do Processo n 21000.000039/2004-39, resolve:
Art. 1 Estabelecer os REQUISITOS DE QUALIDADE PARA O CREDENCIAMENTO E
MONITORAMENTO DE LABORATRIOS PARA DIAGNSTICO SOROLGICO DO MORMO
por meio da tcnica de Fixao do Complemento, com seus respectivos procedimentos e anexos.
Art. 2 O credenciamento a que se refere o art. 1 ser concedido a Laboratrios Pblicos para inquritos
sorolgicos oficiais, trnsito e vigilncia em casos de foco e a Laboratrios Privados apenas para o
trnsito de animais. Alm dessas aplicaes, o Departamento de Defesa Animal - DDA poder estabelecer
outras que se fizerem necessrias.
Art. 3 Esta Instruo Normativa entra em vigor na data de sua publicao.
RUI EDUARDO SALDANHA VARGAS
ANEXO
REQUISITOS DE QUALIDADE PARA CREDENCIAMENTO E MONITORAMENTO DE
LABORATRIOS PARA O DIAGNSTICO SOROLGICO DO MORMO
1. OBJETIVO: Estabelecer os requisitos de qualidade para que o laboratrio seja credenciado pela
Coordenao de Laboratrio Animal - CLA, do Departamento de Defesa Animal - DDA.
2. APLICAO: Aplicam-se aos laboratrios pblicos e privados, limitados s necessidades do DDA no
que se refere a nmero e localizao geogrfica e que atendam aos requisitos estabelecidos por esta
Instruo Normativa.
3. MATERIAL:
3.1. Antgeno:
3.1.1. S podero ser utilizados antgenos (Ag) e soros controles registrados no MAPA ou importados
mediante a autorizao do MAPA, observado o prazo de validade.
3.2. Insumos de Referncia:
- Complemento
- Hemolisina
- Hemcia de Carneiro a 2%
- Antgeno de Mormo
- Soro Controle Positivo Alto

- Soro Controle Positivo Baixo


- Soro Controle Negativo
- Kit reagente e padro cianometahemoglobina
O suprimento destes insumos est a cargo de cada laboratrio credenciado.
3.3. Amostra a ser analisada: soro sanguneo de eqdeos.
4. RECEBIMENTO DAS AMOSTRAS:
4.1. As amostras devero estar devidamente identificadas e acondicionadas sob refrigerao;
4.2. As amostras devero estar acompanhadas de formulrio de requisio e resultado de exame conforme
modelo (Anexo III).
4.2.1. Os laboratrios credenciados pblicos recebero amostras acompanhadas tambm dos formulrios
indicados pelo DDA, para os casos de vigilncia epidemiolgica da enfermidade.
4.3. As amostras sero registradas em livro prprio, diariamente, conforme modelo estabelecido pela CLA
(Anexo IV).
4.4. As amostras sero obrigatoriamente divididas em duas alquotas de volumes iguais, suficientes para a
realizao dos exames de prova e contraprova.
4.5. A tarjeta de identificao da contraprova (Anexo V) ser preenchida e lacrada juntamente com as
amostras para contraprova; o lacre ser plstico, numerado e inviolvel.
5. CONSERVAO E ESTOCAGEM:
5.1. A amostra a ser analisada dever ser conservada, no mximo 7 (sete) dias, sob refrigerao e
congelada aps este perodo.
5.2. As amostras devero ser estocadas em congelador a - 20 C, por 30 (trinta) dias para anlise de
contraprova.
6. SEGURANA BIOLGICA
6.1. Recomenda-se a utilizao de equipamentos de proteo individual (EPI) durante a realizao das
atividades laboratoriais.
6.2. Por serem as amostras classificadas no grupo A de resduos slidos (Resoluo do Conselho Nacional
de Meio Ambiente n 5, de 5 de agosto de 1993, publicada no Dirio Oficial da Unio n 166, de 31 de
agosto de 1993), as mesmas devero ser autoclavadas a 120C (cento e vinte graus Celsius) por 30 (trinta)
minutos com 1 (uma) libra de presso antes do descarte. Devero ser respeitadas as normas vigentes de
biossegurana.
7. RESULTADOS E RELATRIO:
7.1. Os resultados dos exames devero ser emitidos em formulrios prprios, segundo item 4.2 da
presente Instruo Normativa (IN) e de acordo com o fluxograma determinado.
7.1.1. Resultado POSITIVO: Imediata e exclusivamente comunicado ao Servio/Seo/Setor de Sanidade
Animal (SSA) da Delegacia Federal de Agricultura (DFA) da Unidade Federativa onde se encontra o
animal reagente, que dever comunicar, oficialmente, ao interessado. A DFA local poder determinar que
a comunicao seja feita diretamente ao rgo executor.

7.1.2. Resultado NEGATIVO: Ser comunicado ao mdico veterinrio que assinou o pedido de exame
e/ou ao interessado.
7.2. Todo laboratrio credenciado dever encaminhar, at o quinto dia til do ms subseqente, relatrio
das atividades mensais ao SSA da DFA onde se localiza o laboratrio e CLA, conforme Anexo IV,
independente de terem sido ou no realizadas as anlises.
7.3. Somente poder assinar o formulrio de resultado do exame e o Relatrio Mensal o responsvel
tcnico ou seu substituto.
8. DO LABORATRIO:
8.1. O laboratrio dever possuir instalaes, equipamentos, vidrarias, utenslios e solues adequadas
para a realizao da prova de Fixao do Complemento.
8.2. As instalaes devero obedecer a um fluxo operacional adequado ao desenvolvimento das atividades
propostas.
9. INSTALAES:
9.1. Protocolo: Sala destinada ao recebimento das amostras, registro, expedio dos resultados e arquivo
dos mesmos.
9.2. Sala de exame: Neste local, as amostras sero processadas, devendo estar provido de bancada
impermevel e resistente desinfeco, fontes de eletricidade suficientes e adequadas ao perfeito
funcionamento dos equipamentos e paredes com superfcie lavvel.
9.3. Sala de lavagem e esterilizao: Dever estar provida de fontes de eletricidade, tanques ou pias que
permitam a lavagem e esterilizao do material utilizado na realizao da prova de diagnstico.
As paredes devem estar revestidas com superfcie lavvel.
10. DO RESPONSVEL TCNICO E SUBSTITUTO
10.1. O(s) responsvel(is) tcnico(s) dever(o) estar habilitado(s) para a realizao da prova pelo
protocolo estabelecido pela CLA nesta IN.
10.2. Para efeito de credenciamento e monitoramento do laboratrio, o(s) responsvel(is) tcnico(s)
ser(o) submetido(s) a auditorias tcnicas com acompanhamento do ensaio no prprio laboratrio,
realizadas por auditores pertencentes rede da CLA.
10.2.1. Como alternativa, sero realizadas provas de habilitao nas unidades da rede de laboratrios da
CLA/MAPA, com critrios e cronograma, por ela definidos.
11. REALIZAO DOS EXAMES DE CONTRAPROVA
11.1. A realizao de contraprova somente ser efetuada no laboratrio realizador do exame.
11.2. A solicitao dever ser feita (Anexo VI), pelo interessado, no prazo mximo de 8 (oito) dias a
contar da data do recebimento do resultado.
11.3. A contraprova ser solicitada diretamente ao SSA/DFA da UF onde se encontra o animal reagente.
O SSA da DFA comunicar ao laboratrio responsvel pelo exame, agendando data e horrio da
realizao do exame da contraprova, podendo o tcnico deste servio assistir, fiscalizar e observar o
resultado.

11.4. A ausncia do representante do SSA/DFA no constitui bice para a realizao do mesmo, desde
que tenha sido observado o disposto no item anterior.
11.5. As amostras destinadas a contraprova devero ser mantidas por um perodo mnimo de 30 (trinta)
dias aps a emisso do resultado para eventual solicitao do MAPA.
11.6. Cabe ao interessado ou ao mdico veterinrio requisitante do exame de contraprova apenas assistir e
observar a exatido do resultado do(s) exame(s).
11.7. O resultado da contraprova ser emitido em novo formulrio de requisio e resultado de exame de
MORMO e encaminhado de acordo com o fluxograma estabelecido no item 7.1.
11.7.1. Identificar como exame de contraprova, no campo observaes do formulrio, o nmero de lacre e
nmero do registro do exame anterior.
11.8. A desistncia do mdico veterinrio requisitante do exame ou seu representante, mediante
declarao escrita ou sua ausncia na realizao do exame de contraprova, implicar na prevalncia do
resultado obtido no exame anterior.
12. DOCUMENTOS NECESSRIOS PARA CREDENCIAMENTO:
12.1. Solicitao de credenciamento emitida pelo representante legal da firma;
12.2. Formulrio de Cadastro de Laboratrio preenchido;
12.3. Currculum vitae resumido do responsvel tcnico e/ou do substituto (atividades relacionadas ao
credenciamento);
12.4. Declarao do CRMV da jurisdio de que est inscrito regularmente, est em dia com suas
obrigaes e no responde a processo tico, do responsvel tcnico e/ou do substituto;
12.5. Cpia da carteira de registro profissional no CRMV do responsvel tcnico e/ou do substituto.
12.6. Documentos relativos habilitao dos responsveis tcnicos (titular e substituto): certificado de
habilitao expedido pelo MAPA e relatrio da auditoria realizada pela CLA.
12.7. Cadastro Nacional de Pessoa Jurdica, atualizado;
12.8. Planta baixa ou croqui do laboratrio com a localizao dos equipamentos necessrios ao
credenciamento;
12.9. Cpia da licena de funcionamento, atualizada, expedida pela Autoridade Sanitria competente
local, explicitando as atividades para as quais o laboratrio est habilitado.
12.10. Autorizao de funcionamento, emitida por autoridade maior, no caso de Instituio de ensino e/ou
pesquisa;
12.11. Manuais da Qualidade e Manuais de Procedimentos Tcnicos;
12.12. Declarao do responsvel tcnico e substituto(s), formalizando ter conhecimento da legislao em
vigor, para o credenciamento e monitoramento de laboratrios para o diagnstico do Mormo;
12.13. Relao dos funcionrios envolvidos nas anlises objeto do credenciamento, vnculo e carga
horria.
Obs:

1) No caso de responsvel tcnico e/ou substituto em laboratrio de terceiros, os documentos de


solicitao devero ser expedidos pelo proprietrio, dirigente e/ou responsvel tcnico.
2) No caso em que a prova de habilitao for realizada no momento da vistoria, toda a documentao
acima solicitada dever ser entregue ao auditor responsvel pela vistoria, que a encaminhar unidade
responsvel pelo credenciamento.
I - PROCEDIMENTOS
1. INTRODUO
Fixao do Complemento consiste em um mtodo de diagnstico sorolgico de eleio para o mormo, por
se tratar de um teste com alta sensibilidade e especificidade, segundo a OIE.
Esta tcnica detecta quase que exclusivamente anticorpos IgG1, que so especficos da infeco. Um
anti-soro teste titulado em diluio seriada e uma quantidade fixa de antgeno adicionada a cada poo.
Se o anticorpo estiver presente no anti-soro, formam-se complexos imunes. O complemento ento
adicionado soluo.
Nesta etapa, antgeno, soro teste e complemento esto reagindo juntos.
Se os complexos estiverem presentes, o complemento ativado, sendo fixado e consumido. Na etapa final
da reao, as clulas indicadoras (eritrcitos), juntamente com uma quantidade subaglutinante de
anticorpo (anticorpo antieritrcito) so adicionados mistura.
Se houver qualquer complemento remanescente, estas clulas sero lisadas; se o complemento tiver sido
consumido na etapa dois pelos complexos imunes, as clulas no sero lisadas devido a quantidade
insuficiente de complemento presente na soluo. A quantidade de complemento utilizada apenas
suficiente para lisar as clulas indicadoras se absolutamente nada do complemento for consumido.
Os controles adequados so de fundamental importncia neste mtodo porque algumas preparaes de
anticorpos consomem complemento sem adio de antgeno, por exemplo, soros que j contm
complexos imunes. Alguns antgenos tambm podem apresentar atividade anticomplementar. Portanto, os
controles devem incluir somente anticorpo e somente antgeno para verificar que nenhum destes esteja,
por si s, fixando complemento. O resultado do teste de Fixao do Complemento baseado no
percentual de hemlise dos eritrcitos sensibilizados.
2. EQUIPAMENTOS
Agitador de microplacas
Autoclave
Balana
Banho-maria: 58 C
Banho-maria: 62 C
Banho-maria: 37 C
Centrfuga (900 x g) para tubos de 15 mL
Centrfuga (900 x g) para tubos de 50 mL
Centrfuga Refrigerada (900 x g)*

Destilador
Espectrofotmetro digital (alcance 540 nm)
Espelho leitor *
Estufa bacteriolgica: 37 C
Freezer: -70 C *
Refrigerador
Potencimetro
Relgio marcador de tempo - at 60 minutos
Vortex
(*) equipamentos opcionais
3. VIDRARIA E UTENSLIOS
Cuba para banho de gelo, com aproximadamente 44x30x08cm
Cubetas para reagentes
Estante para tubos de ensaio
Gaze
Microplaca em fundo U, com 96 poos
Papel de filtro retangular
Papel contato ou alumnio
Papel milimetrado di-Log
Pipeta monocanal de 100 a 1000 l
Pipeta multicanal de 10 a 200 l
Pipetas de vidro de 1 mL
Pipetas de vidro de 10 mL
Pipetas de vidro de 2 mL (escala 1:10)
Pipetas de vidro de 2 mL (escala 1:100)
Pipetas de vidro de 5 mL
Pipetador automtico ou pra
Ponteiras para pipetas automticas, descartveis.
Provetas de 100 mL

Tubos cnicos milimetrado de 15 mL (para centrfuga)


Tubos cnicos de 50 mL (para centrfuga)
Tubos de ensaio 13 x 150 mm
Tubos de ensaio 18 x 180 mm
Tubos de ensaio 10 x 70 mm
Tubos de ensaio 10 x 50 mm
Balo fundo chato 250 e 1000 mL
Erlenmeyer 50 mL, 250 mL e 1000 mL
4. SOLUES
Soluo Concentrada de Trietanolamina ou Veronal
Soluo de Trabalho de Trietanolamina ou Veronal
gua Destilada
II - RECEPO E PREPARO DE AMOSTRAS
O teste de Fixao de Complemento detecta anticorpos apenas no soro. Plasma no aceitvel para este
teste. O soro deve ser de boa qualidade e livre de contaminao bacteriana e excesso de hemlise. As
amostras devem estar devidamente identificadas nos tubos com o nome ou nmero do animal. Estas
amostras devem ser remetidas, refrigeradas ou congeladas, quando centrifugadas, e acondicionadas em
caixa de isopor com gelo.
As amostras testes e o soro controle (positivo alto, baixo e negativo) sero diludos na proporo de 1:5
em soluo de trabalho (125 l soro + 500l).
Amostras de eqinos e os controles devem ser inativados em banho-maria a 58 C por 35 minutos.
Amostras de muares, asininos e guas prenhes sero inativados a 62,5 C por 35 minutos. Remover as
amostras aps o perodo de inativao, deixar em temperatura ambiente, se for imediatamente testados ou
guardar em temperatura de 4 C, por um perodo mximo de 24 horas.
Preparao e Lavagem das Clulas Sangneas Vermelhas (RBCs)
Determinar o volume de hemcia requerido para a suspenso de 2%:
Para preparao do padro de cor, so necessrios 12,0 mL de RBCs 2%;
Determinar se a titulao de hemolisina necessria. Se for, aumentar o volume requerido para 36,0 mL
de RBCs 2%;
Para a titulao do complemento, aumentar o volume para 12,0 mL;
Para o teste diagnstico, adicionar 2,0 mL para titulao do soro e 1,2 mL para cada soro no teste de
screening;
Calcular o volume total de RBCs 2%, requerido de acordo com a etapa seguinte:

1 - Desprezar o sobrenadante (Alserver). Lavar a hemcia com diluente 3 (trs) vezes.


2 - Filtrar o sangue preservado em gaze estril dentro de um tubo de centrfuga de 50 mL, adicionar
soluo de trabalho e centrifugar a 900 x g por 10 minutos.
3 - Remover o sobrenadante por suco. Adicionar soluo trabalho ao tubo, mixar gentilmente por
inverso, ressuspendendo a hemcia e recentrifugar a 900 x g por 10 minutos.
4 - Cuidadosamente, remover o sobrenadante e leuccitos por suco. Adicionar soluo de trabalho para
ressuspender a hemcia e transferir para um tubo de centrfuga volumtrico de 15 mL.
Mixar gentilmente e recentrifugar como no passo anterior.
5 - Inspecionar a colorao do sobrenadante. Se colorido, descartar a hemcia e repetir o procedimento
inicial com nova hemcia.
6 - Cuidadosamente remover o sobrenadante por suco sem destruir as clulas. Observar o volume final
de hemcia.
7 - Calcular a quantidade de diluente para ressuspenso da hemcia.
Para cada 1 mL de hemcia compactada, adicionar 34 mL de diluente.
8 - Padronizao da Hemcia a 2%:
Ligar o espectrofotmetro antecipadamente, conforme instrues do fabricante. Cuidadosamente, pipetar
1,0 mL da suspenso de hemcia dentro de um frasco volumtrico contendo 25 mL de soluo de
Drabkin. Mixar bem invertendo 10 vezes para lisar as clulas. Calibrar o aparelho com o padro de
cianometahemoglobina, com comprimento de onda de 540 nm. Calcular o volume final da suspenso de
clula usando a seguinte frmula:
Diluir a suspenso com o diluente na quantidade encontrada.
Reagente e Padro de Cianometahemoglobina
a) Soluo de Drabkin (DS):
Preparar uma diluio 1:100 da soluo estoque de Drabkin em gua destilada. Esta soluo estvel por
no mnimo 6 (seis) meses em frasco escuro. Descartar se apresentar turvao ou precipitados.
b) Padro de Hemoglobina (HS):
Preparar uma soluo de HS, colocando 0,1 mL do HS em 12,5 mL da soluo de Drabkin. Mixar bem.
c) Preparao do Padro de CMH:
Rotular 5 tubos (12x100 mm) para as concentraes padres de 80, 60, 40, 20, e 0 mg%.
Adicionar DS e HS nos tubos de acordo com o seguinte:
Concentrao CMH (mg%)
80
HS (mL) 4,0
DS (mL) 0,0

60
3,0
1,0

40
2,0
2,0

20
1,0
3,0

0
0,0
4,0

Zerar o espectrofotmetro com o tubo 0,0 mg% CMH.


Fazer 3 Trs leituras da densidade ptica de cada tubo. Zerar o aparelho para cada tempo e calcular a
mdia das leituras.
d) Clculo da DO alvo:
Cada DO alvo da suspenso de clula de carneiro o padro
CMH % dividido pelo fator de instrumento. O padro CMH mg% um valor mdio para um pool de
hemcias de carneiro.
Suspenso de clula de carneiro (%) Padro CMH mg%
2,0
2,8
3,0

25,03
35,04
37,54

Exemplo: DO alvo para suspenso a 2%:


Padro de Cor 1 - Preparao da Soluo de Hemoglobina (Hg):
Adicionar 18,0 mL de gua destilada em erlenmeyer
Adicionar 6,0 mL da suspenso de hemcia a 2%.
Mixar em vortex at toda clula lisar.
Adicionar 6,0 mL da soluo me.
Mixar a soluo de hemoglobina e aguardar uso.
2 - Preparao de Soluo de Hemcia a 0,4%:
Adicionar 24,0 mL da soluo de trabalho em erlenmeyer.
Adicionar 6,0 mL da suspenso de hemcia a 2% para fazer uma suspenso de 0,4% de hemcia.
Mixar gentilmente por inverso.
3 - Padro de Cor:
Rotular 13 tubos sorolgicos (10 x 50) com as porcentagens de hemlise como mostrado na tabela 1.
Rotule o padro 0% com os dados e hora da preparao.
Tabela 1:
0%

10% 20% 25% 30% 40% 50% 60% 70% 75% 80% 90% 100%

Hg 0 0,4 0,8 1,0 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,0 3,2 3,6 4,0
Cel4,0
3,6 3,2 3,0 2,8 2,4 2,0 1,6 1,2 1,0 0,8 0,4 0
Mixar os tubos em vortex e centrifugar 900 x g durante 10 minutos e fazer leitura da D.O. Estocar em
temperatura 4 C at momento do uso.

I.V. Preparao das Clulas Sangneas Sensibilizadas (RBCs)


Adicionar 12,0 mL da hemcia a 2% em um frasco de 50 mL.
Preparar uma diluio de hemolisina a partir da hemolisina estoque 1:10
Adicionar 12,0 mL da soluo da diluio acima soluo da hemcia.
Mixar rapidamente.
Incubar por 10 minutos em banho-maria a 37 C.
Titulao do Complemento (C')
Para todo trabalho com o complemento, necessrio banho de gelo.
Adicionar 9,0 mL da soluo de trabalho em tubo 13 x 150 mm.
Tomar uma alquota do C' do freezer -70 C ou -20 C.
Retirar 1,0 mL do C' e adicionar na soluo de trabalho e mixar gentilmente, obtendo a diluio 1:10 de
complemento. Deixar a soluo estabilizar por 20 minutos.
Preparar as diluies do C' de 1:500, 1:600 e 1:700. As diluies indicadas aqui so apenas exemplos e
podem variar de acordo com a titulao do lote do complemento. Adicionar soluo de trabalho e C' de
acordo com a tabela 2.
Tabela 2:
TTULO
200
250
300
400
500
600
700

C 1/10
0,4
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3

DILUENTE
7,6
7,2
8,7
11,7
14,7
17,7
20,7

Mixar gentilmente por inverso.


Estabilizar o C' diludo por 20 (vinte) minutos.
Rotular trs sries de tubos 10 x 50 mm; uma srie para cada diluio do C'.
Adicionar soluo de trabalho nos tubos na quantidade indicada na tabela 3.
Adicionar o C' diludo nos tubos na quantidade indicada na tabela 3.
Adicionar 1,6 mL das clulas sensibilizadas em cada tubo.
Mixar os tubos no vortex e colocar em banho-maria a 37 C por 15 minutos.
Remover os tubos e mixar em vortex.
Recolocar os tubos no banho-maria a 37 C por mais 15 minutos.

Tabela 3.
REAGENTE
DILUENTE
COMPLEMENTO
SISTEMA
HEMOLTICO

TUBO 1 TUBO
TUBO 3
2
1,0
0,6
0,2
1,0
1,4
1,8
1,4

1,4

1,4

TUBO 4
0,0
2,2
1,4

Remover os tubos do banho-maria e centrifugar 900 x g por 10 minutos.


Ler a densidade ptica dos tubos com comprimento de onda de 540 nm.
Comparar cada tubo das sries com o padro de cor.
Determinar o percentual de hemlise para cada tubo.
Construir o Grfico Logartmico:
1 - Para cada srie de 4 tubos da titulao, plotar num papel logartmico volume de C' em mL (eixo Y)
versus o percentual de hemlise correspondente (eixo X). Os tubos 1, 2 , 3 e 4 correspondem aos nmeros
logartmicos 3, 4, 5 e 6 do eixo Y. Alm disso, os nmeros logartmicos do eixo Y, 3, 4 , 5 e 6
correspondem a 0,3, 0,4, 0,5 e 0,6 mL do C' (Figura 1).
2 - Um grfico vlido quando 2 pontos esto esquerda e 2 pontos esto direita da linha vertical 50.
Um grfico tambm vlido se um ponto mdio passa sobre a linha 50. Se todos grficos so invlidos,
repetir a titulao do C' com diferentes diluies de C'.
3 - No grfico vlido, plotar os pontos dos tubos 1 e 2 e marcar o ponto mdio. Repetir com os pontos 3 e
4 - Passar uma reta entre os pontos mdios.
4 - Determinar a inclinao da linha.
Em qualquer ponto da reta, medir uma reta de 10 cm para a direita;
Medir a distncia vertical em mm do final da reta horizontal com a reta inclinada dos pontos mdios.
Para obter a inclinao, medir os dois pontos mdios e marcar o centro. Deste ponto, traar uma reta at o
eixo y . Se a inclinao for 0,44 20%, continue como descrito abaixo. Se a inclinao no estiver dentro
deste parmetro, repetir a titulao do C' com novo lote de hemcia preservada.
Determinando a diluio do C' requerido para o teste diagnstico:
Do ponto mdio dos pontos mdios, traar uma reta horizontal para o eixo Y;
Ler o volume em mL para o grfico. Este volume contm uma unidade de 50% de hemlise de C'
(C'H50);
Determinar o volume contendo 5,0 C'H50, multiplicando o volume contendo uma unidade de C'H50 por 5
(5,0 C'H50 em 0,2 mL a quantidade requerida para o teste diagnstico);
Do grfico vlido, calcular a diluio de C' necessria para obter 5,0 C'H50 em 2,0 mL pela seguinte
equao:
Exemplo: O volume de C' na titulao na diluio 1:500 2,15 mL (5,0 x 0,43 mL). A quantidade de C'
no teste 0,2 (0,025 mL/poo x 8 poos). A diluio de C' para o teste calculado como segue:

Execuo do Teste 1- Preparao do C' diludo Determinar o volume de C' diludo requerido para o teste,
multiplicando o nmero de poos no teste por 0,025 mL.
Calcular o volume de soluo de trabalho e do C' 1:10 contendo 5,0 C'H50 , como determinado na
titulao do C'.
Adicionar o volume calculado de soluo em um frasco pequeno ou tubo de ensaio, dependendo da
quantidade.
Adicionar o volume de C' 1:10 dentro do frasco com soluo trabalho e mixar gentilmente.
Manter esta diluio em temperatura de 4 C. Deixar estabilizar por 20 minutos.
2 - Rotulagem das Microplacas
Placa para Titulao de Soro:
A 1:5 1 2 3
B 1:10
C 1:20
D 1:40
E 1:80
F 1:160
G 1:320

4 5

CH CL CN 0%
25%
50%
75%
100%

AC

1
2
3
4
5
6
7

3 - Preparao do Antgeno:
Determinar o volume de antgeno requerido multiplicando o nmero de poos que recebem antgeno por
0,025 mL. Diluir o antgeno na diluio 1:125.
Preparar o volume requerido em soluo trabalho e mixar.
Estocar a soluo de antgeno a 4 C at o momento do uso.
4 - Adio dos Reagentes e Amostras nas Placas:
4.1. Titulao do Soro:
Adicionar 25 l da soluo de trabalho nos poos de titulao 1:10 a 1:320 e na linha de AC.
Adicionar 25 l do soro teste nos poos de diluio 1:5, 1:10 e AC.
Adicionar 25l dos soros controles (positivo alto e baixo e negativo) nos poos de diluio 1:5, 1:10 e AC
nas respectivas colunas, conforme figura I.
Com um microdiluidor de 25 l, mixar os soros controles e soros testes nos poos de titulao 1:10 por
quatro segundos. Transferir e mixar soro nas sucessivas diluies para cada poo. Na ltima diluio
(1:320), desprezar 25 l.
Adicionar 25 l do antgeno diludo nos poos da diluio 1:5 a 1: 320.
Adicionar 25 l do C' diludo nos poos da diluio 1:5 a 1:320 e linha AC.
Controle dos Reagentes (ver tabela 4).

Mixar as placas por 1 minuto. Cobrir as placas para minimizar a evaporao e incubar em estufa a 37C
por 1 (uma) hora.
4.2. Adio de Clulas Sensibilizadas e No-Sensibilizadas Determine o volume de clulas sensibilizadas
necessrio para o teste multiplicando o total de poos no teste por 0,05 mL.
Remover a Hemcia a 2% estocada em 4 C e agitar gentilmente at ressuspenso.
Adicionar, em um frasco, volume de hemcia igual ao volume de soluo de trabalho com hemolisina
diluda.
Incubar em banho-maria a 37 C por 10 minutos.
Remover o sistema hemoltico do banho-maria.
Adicionar 50 l das clulas sensibilizadas nos poos das diluies de 1:5 a 1:320 e AC das placas de
titulao e colunas M e CC do teste screening.
Adicionar 25 l da hemcia a 2% nos poos 7, 8 e 9 do controle dos reagentes.
4.3. Adio de Outros Reagentes e Incubao:
Adicionar 125 l de cada padro de cor, individualmente, nos poos rotulados de 0 a 4+.
Cobrir as placas e mixar por 1 minuto.
Incubar as placas em estufa a 37 C por 20 minutos.
Remover as placas e mixar para ressuspender as clulas no lisadas. Incubar novamente por 25 minutos.
Centrifugar as placas por 5 minutos a 300 x g ou deixar por pelo menos duas horas em geladeira.
Tabela 4 - Controle dos Reagentes
POO
1
2
3
4
5
6
7
8
9

l DIL
25
50
50
50
25
75
100
75
75

l Ag
25
25

25

l C'
25
25
25:1/2
25:1/2

l SH
50
50
50
50
50
50

25
25

l H2% Resultados
0
4+
0
Traos a 3+
Traos a 3+
4+
25
4+
25
4+
25
4+

1 - Controle anticomplementar do antgeno


2 - Se houver hemlise, as hemcias esto com problema
3 - C' livre, hemlise total
4 - Verificar a fora do C', 1+ o ideal
5 - Controle anticomplementar do antgeno, se houver muito C'.

6 - Controle de hemolisina
7 - Controle das clulas
8 - Controle das clulas
9 - Clulas na presena do antgeno
Interpretao dos Resultados
Ler os resultados dos controles dos reagentes comparando o percentual de hemlise com o padro de cor.
Interpretar os resultados baseados na tabela 5.
Compare os controles dos reagentes para determinar se esto dentro dos padres estabelecidos na tabela 4.
Caso contrrio, repita todo o procedimento.
Fazer a leitura do percentual de hemlise de cada poo testado. Este percentual baseado no tamanho, cor
do sobrenadante e espessura do boto, em respectiva ordem de importncia.
As clulas sensibilizadas devem estar completamente hemolisadas no controle AC. Caso contrrio, o soro
tido como anticomplementar, devendo-se solicitar nova amostra.
O ttulo registrado a diluio seguinte da ltima da fixao do complemento.
Se restarem poucas clulas no poo, o soro tido como inconclusivo. Solicitar nova amostra.
Tabela 5: Equivalncia da leitura do percentual de hemlise e valores numricos
Percentual de
Hemlise
0
25
50
75
100

Interpretao

Diagnstico

4+
3+
2+
1+
Negativo

Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo

Restando poucas clulas a amostra ser considerada inconclusiva.


OBS: O preenchimento do laudo dever ser conclusivo contendo as seguintes informaes:
. NEGATIVO
. POSITIVO: Indicar o ttulo encontrado.
. INCONCLUSIVO: Requer nova coleta.
. ANTICOMPLEMENTAR: Requer nova coleta.
ANEXO I
Titulao da Hemolisina:
Lavar as hemcias: Calcular o volume que ser necessrio de hemcia 2%. Fazer 3 (trs) lavagens a 900 x
g por 10 minutos.
Da Hemolisina (HL) pura, fazer a diluio 1/10 em soluo salina 0,85%.

Da HL 1/10 fazer HL 1/100 = 1 mL HL 1/10 + 9,0 mL diluente.


Diluir HL 1:1000 = 18 mL dil. +2,0 1:100.
Rotular tubos 15x180 ou 18x180 de 1:1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 8000 e 16000. Diluir a hemolisina
conforme o quadro 1.
Quadro 1: Diluies da Hemolisina
DIL. FINAL HL
1:1500
1:2000
1:2500
1:3000
1:4000
1:8000
1:16000

DIL (mL)

HL 1:1000 mL

1,0
2,0
3,0
2,0
3,0
7,0
15,0

2,0
2,0
2,0
1,0
1,0
1,0
1,0

Sistema Hemoltico:
Em tubos 12x100 mm ou 13x100 mm, rotular de 1:1000 at 1:16000 e colocar em cada tubo 2,0 mL de
H2% e 2,0 mL da diluio de HL do quadro acima.
Agitar cada tubo em vortex e colocar em banho-maria a 37 C por 10 minutos.
Preparar o Complemento (C') 1:200, 1:250 e 1:300:
Rotular 3 sries de tubos para leitura em espectrofotmetro das diluies do C'

1/1000 - 1/1500 - 1/2000 at 1/16000 - C'


1/200

0,8 mL dil
0,4 mL C'1/200
0,8 mL SH
0,8 mL dil

1/1000 - 1/1500 - 1/2000 at 1/16000 - C'


1/250

0,4 mL C'1/250
0,8 mL SH
0,8 mL dil

1/1000 - 1/1500 - 1/2000 at 1/16000 - C'

0,4 mL C'1/300
1/300
0,8 mL SH

Misturar para agitao e levar a banho-maria 37 C por 30 minutos (agitar com 15 minutos).
Preparao do Padro de Cor:
Preparar padro de cor (PC) igual a prova de mormo. Registrar o valor das D.O.

Centrifugar todos os tubos 900 x g por 10 minutos. Fazer leitura em espectrofotmetro e registrar os
valores inclusive do PC.
Fazer o grfico:
Em papel milimetrado, tomar uma reta na horizontal de 20 cm (ou 30 cm) e, deste, marcar a diluio
1:1000. Para calcular as demais fraes, dividir 20000 por cada diluio.
Ex.:
A partir do ponto 0 (zero), marcar 13,3 cm. Calcular at diluio 1:16000.
Na reta vertical, marcar os percentuais de hemlise de 10 a 100%, com espao de dois em dois quadrantes
(2,0 em 2,0 cm).
Marcao dos Pontos: Fazer a leitura das D.O das trs diluies do C' para todos os valores 1/1000 at
1/16000. Associar o valor da D.O ao percentual de hemlise do PC. Marcar os pontos e fazer o grfico. O
ponto timo ser aquele que mostrar uma estabilidade (Figura 2).
Referncias Bibliogrficas
United States Department of Agriculture/National Veterinary Services Laboratories - Testing Protocol.
Complement Fixation Test for Detection of Antibodies to Burkholderia mallei: Microtitration test. Ames,
IA - April 30, 1997.
ROITT, I, BROSTOFF, J, MALE, D Imunologia. Editora Manole, 5 ed., 1999, 421p.
ANEXO II
SOLUES E REAGENTES
Tampo de Trietanolamina (TEA) - Soluo me
Colocar em um frasco com graduao para um litro:
28 mL de trietanolamina (Merck 108379)
180 mL de cido Clordrico 1N (Merck PA 15893)
75 g Cloreto de sdio (Merck 6404)
1 g Cloreto de magnsio hidratado (Merck 5833)
0,2 g Cloreto de clcio (Merck 2382)
Colocar o volume com gua destilada para (um) litro
Soluo Diluda de Trietanolamina - Soluo de trabalho
Adicionar em um frasco graduado para um litro:
100 mL da soluo me
0,5 g de gelatina em gua fervente (Merck 4070)
Medir o pH que deve estar entre 7,3 e 7,4. O pH pode corrigir com cido ctrico.

Dissolver o Cloreto de Sdio em aproximadamente 600 mL de gua destilada em um Balo Volumtrico


de 1L. Acrescentar os demais reagentes na ordem relacionada. A Trietanolamina um lquido muito
viscoso e deve medir-se cuidadosamente, por exemplo:
transferindo para um cilindro graduado com um Basto de Vidro ou uma Pipeta, de modo que a
Trietanolamina no toque as paredes do cilindro, at o volume de 28 mL; tambm pode-se pesar a
Trietanolamina em recipiente de precipitados (28 mL equivalem a 31,45 g). Como a densidade dos
diferentes lotes pode variar ligeiramente, deve-se reajustar o peso requerido. Qualquer que seja o mtodo
adotado, o recipiente no qual se mediu a Trietanolamina deve enxaguarse perfeitamente com a soluo do
Balo Volumtrico para ter-se a segurana de que toda a Trietanolamina se incorporou ao diluente. As
solues me de Cloreto de Magnsio e Cloreto de Clcio, preparamse segundo a explicao dada para o
1 diluente citado, mas com um grau de concentrao 10 vezes maior, quer dizer: 10g de MgCl26H2O
resultam em 11,8 mL de soluo me 4,16 mol/L e 10 g de Ca-Cl22H2O resultam em 54,4 mL de soluo
me 1,25 mol/L.
O pH da soluo diluda estar entre 7,3 - 7,4 a 20 C; cada novo lote de diluente na concentrao de
razo 10 dever ser aferido antes de seu uso.
Tampo Veronal (Soluo me)
Adicionar 100 mL de gua destilada em erlenmeyer de 250 mL.
Adicionar 20,3g de Mg.Cl26H2O.
Adicionar 4,4g de CaCl22H2O.
Misturar gentilmente.
Estocar em refrigerao.
Alsever
Glicose - 18,66g
Cloreto de Sdio - 4,18g
Citrato de Sdio - 8,0g
cido Ctrico - 0,55g
gua destilada q.s.p - 1000 mL
A soluo deve ser esterilizada em autoclave, aps ser filtrada em filtro de Seitz. O sangue de carneiro
pode ser conservado assepticamente em refrigerador em frascos com tampa de rosca. No deve ser
utilizado antes de 5 dias, pelo menos, aps a sangria, e pode ser utilizado at 6 (seis) semanas aps, desde
que no esteja contaminado.
Hemcias de Carneiro
Deve ser escolhido um ou mais carneiros que produzam hemcias em um grau de sensibilidade
satisfatrio e constante, sangrando
se sempre os mesmos carneiros. O sangue dever ser colhido assepticamente em um recipiente que
contenha um volume de Soluo de Alsever na mesma quantidade que o volume de sangue.
Deve-se agitar cuidadosamente. Aliquotar, em tubos de ensaio 18x180 e refrigerar. Usar aps 5 dias.

Hemolisina (Amboceptor)
Trata-se de um soro que contm um alto ttulo de anticorpos contra as hemcias de carneiro. Quando se
combina este anticorpo com hemcias em suspenso, diz-se que estas esto sensibilizadas, isto , em
presena de complemento livre sofrem lise.
A Hemolisina deve ser preparada somente em coelhos. A maioria dos trabalhos de tcnicas sorolgicas
(i.e. Campbell e cols., 1963 ou Cruickshank, 1965) apresentam detalhes sobre o mtodo de preparao da
Hemolisina. A Hemolisina encontrada no comrcio, geralmente na forma lquida, conservada em um
volume igual de glicerina.
Complemento
Sangrar pelo menos 4 cobaias, separar o mais breve possvel o soro do cogulo e misturar para preparar o
Complemento. Os cobaias adultos e bem nutridos com verduras frescas produzem um complemento de
boa qualidade. Os animais devero estar em jejum de 12 horas. No se utilizaro fmeas prenhas nem
recm-paridas. O Complemento deve permanecer congelado a -40C ou temperaturas mais baixas, desde
que com meios adequados. O armazenamento em nitrognio lquido um procedimento eficaz e prtico.
O Complemento pode ser adquirido liofilizado e/ou desidratado; ainda que neste caso deva ser
armazenado em refrigerador ou congelador.
ANEXO III

Instrues:
1. Do campo observaes, dever constar informaes referente a: histrico do animal, eventuais
sintomas, contatos, deslocamentos.
2. Resenha
- Procure fazer a resenha o mais fielmente possvel.
- Utilizar caneta azul ou preta.
- Indique o remoinho sempre com um simples x no local, puxando um trao que dever - terminar com
um R.
- Indique a espiga com um trao ondulado.
- Indique somente os contorno das marchas, estrelas ou calados dos animais.
- Nunca pinte ou preencha os contornos fazendo um sombreado mais escuro nas reas de mancha.
- Dois traos paralelos sobre um membro indicam que este membro no tem mancha branca, isto , no
calado.
- Cicatrizes devem ser desenhadas.
- Casco: de cor preta - no escrever, nem indicar nada

- de cor branca - indicar com a letra Br


- rajados - indicar com a letra Rj
- Mancha Branca deve ser indicada por MB.
- LADRE a mancha de colorao rsea, presente no lbio superior, entre as narinas. Deve ser indicada,
escrevendo-se a palavra LADRE por extenso.
- BETA a mancha de colorao rsea presente no lbio inferior.
- Quando houver REA NO DESPIGMENTADA (rea da cor da pele do animal na parte interna do
LADRE ou BETA), deve ser indicada por AND.
- Para animais pampas, indique apenas o contorno das manchas escrevendo nas reas a inicial da cor
existente (branco, B - castanho, C - ou alazo A).
ANEXO IV
LIVRO DE REGISTROS
Nome
Data
N de
ou n
Idade
de
Referncia Remetente Municpio/UF Proprietrio Propriedade
Espcie
Registro
do
/sexo/gestao
entrada
Animal

ANEXO V

ANEXO VI
ANEXO VII

D.O.U., 05/02/2004