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7.1.2. Resultado NEGATIVO: Ser comunicado ao mdico veterinrio que assinou o pedido de exame
e/ou ao interessado.
7.2. Todo laboratrio credenciado dever encaminhar, at o quinto dia til do ms subseqente, relatrio
das atividades mensais ao SSA da DFA onde se localiza o laboratrio e CLA, conforme Anexo IV,
independente de terem sido ou no realizadas as anlises.
7.3. Somente poder assinar o formulrio de resultado do exame e o Relatrio Mensal o responsvel
tcnico ou seu substituto.
8. DO LABORATRIO:
8.1. O laboratrio dever possuir instalaes, equipamentos, vidrarias, utenslios e solues adequadas
para a realizao da prova de Fixao do Complemento.
8.2. As instalaes devero obedecer a um fluxo operacional adequado ao desenvolvimento das atividades
propostas.
9. INSTALAES:
9.1. Protocolo: Sala destinada ao recebimento das amostras, registro, expedio dos resultados e arquivo
dos mesmos.
9.2. Sala de exame: Neste local, as amostras sero processadas, devendo estar provido de bancada
impermevel e resistente desinfeco, fontes de eletricidade suficientes e adequadas ao perfeito
funcionamento dos equipamentos e paredes com superfcie lavvel.
9.3. Sala de lavagem e esterilizao: Dever estar provida de fontes de eletricidade, tanques ou pias que
permitam a lavagem e esterilizao do material utilizado na realizao da prova de diagnstico.
As paredes devem estar revestidas com superfcie lavvel.
10. DO RESPONSVEL TCNICO E SUBSTITUTO
10.1. O(s) responsvel(is) tcnico(s) dever(o) estar habilitado(s) para a realizao da prova pelo
protocolo estabelecido pela CLA nesta IN.
10.2. Para efeito de credenciamento e monitoramento do laboratrio, o(s) responsvel(is) tcnico(s)
ser(o) submetido(s) a auditorias tcnicas com acompanhamento do ensaio no prprio laboratrio,
realizadas por auditores pertencentes rede da CLA.
10.2.1. Como alternativa, sero realizadas provas de habilitao nas unidades da rede de laboratrios da
CLA/MAPA, com critrios e cronograma, por ela definidos.
11. REALIZAO DOS EXAMES DE CONTRAPROVA
11.1. A realizao de contraprova somente ser efetuada no laboratrio realizador do exame.
11.2. A solicitao dever ser feita (Anexo VI), pelo interessado, no prazo mximo de 8 (oito) dias a
contar da data do recebimento do resultado.
11.3. A contraprova ser solicitada diretamente ao SSA/DFA da UF onde se encontra o animal reagente.
O SSA da DFA comunicar ao laboratrio responsvel pelo exame, agendando data e horrio da
realizao do exame da contraprova, podendo o tcnico deste servio assistir, fiscalizar e observar o
resultado.
11.4. A ausncia do representante do SSA/DFA no constitui bice para a realizao do mesmo, desde
que tenha sido observado o disposto no item anterior.
11.5. As amostras destinadas a contraprova devero ser mantidas por um perodo mnimo de 30 (trinta)
dias aps a emisso do resultado para eventual solicitao do MAPA.
11.6. Cabe ao interessado ou ao mdico veterinrio requisitante do exame de contraprova apenas assistir e
observar a exatido do resultado do(s) exame(s).
11.7. O resultado da contraprova ser emitido em novo formulrio de requisio e resultado de exame de
MORMO e encaminhado de acordo com o fluxograma estabelecido no item 7.1.
11.7.1. Identificar como exame de contraprova, no campo observaes do formulrio, o nmero de lacre e
nmero do registro do exame anterior.
11.8. A desistncia do mdico veterinrio requisitante do exame ou seu representante, mediante
declarao escrita ou sua ausncia na realizao do exame de contraprova, implicar na prevalncia do
resultado obtido no exame anterior.
12. DOCUMENTOS NECESSRIOS PARA CREDENCIAMENTO:
12.1. Solicitao de credenciamento emitida pelo representante legal da firma;
12.2. Formulrio de Cadastro de Laboratrio preenchido;
12.3. Currculum vitae resumido do responsvel tcnico e/ou do substituto (atividades relacionadas ao
credenciamento);
12.4. Declarao do CRMV da jurisdio de que est inscrito regularmente, est em dia com suas
obrigaes e no responde a processo tico, do responsvel tcnico e/ou do substituto;
12.5. Cpia da carteira de registro profissional no CRMV do responsvel tcnico e/ou do substituto.
12.6. Documentos relativos habilitao dos responsveis tcnicos (titular e substituto): certificado de
habilitao expedido pelo MAPA e relatrio da auditoria realizada pela CLA.
12.7. Cadastro Nacional de Pessoa Jurdica, atualizado;
12.8. Planta baixa ou croqui do laboratrio com a localizao dos equipamentos necessrios ao
credenciamento;
12.9. Cpia da licena de funcionamento, atualizada, expedida pela Autoridade Sanitria competente
local, explicitando as atividades para as quais o laboratrio est habilitado.
12.10. Autorizao de funcionamento, emitida por autoridade maior, no caso de Instituio de ensino e/ou
pesquisa;
12.11. Manuais da Qualidade e Manuais de Procedimentos Tcnicos;
12.12. Declarao do responsvel tcnico e substituto(s), formalizando ter conhecimento da legislao em
vigor, para o credenciamento e monitoramento de laboratrios para o diagnstico do Mormo;
12.13. Relao dos funcionrios envolvidos nas anlises objeto do credenciamento, vnculo e carga
horria.
Obs:
Destilador
Espectrofotmetro digital (alcance 540 nm)
Espelho leitor *
Estufa bacteriolgica: 37 C
Freezer: -70 C *
Refrigerador
Potencimetro
Relgio marcador de tempo - at 60 minutos
Vortex
(*) equipamentos opcionais
3. VIDRARIA E UTENSLIOS
Cuba para banho de gelo, com aproximadamente 44x30x08cm
Cubetas para reagentes
Estante para tubos de ensaio
Gaze
Microplaca em fundo U, com 96 poos
Papel de filtro retangular
Papel contato ou alumnio
Papel milimetrado di-Log
Pipeta monocanal de 100 a 1000 l
Pipeta multicanal de 10 a 200 l
Pipetas de vidro de 1 mL
Pipetas de vidro de 10 mL
Pipetas de vidro de 2 mL (escala 1:10)
Pipetas de vidro de 2 mL (escala 1:100)
Pipetas de vidro de 5 mL
Pipetador automtico ou pra
Ponteiras para pipetas automticas, descartveis.
Provetas de 100 mL
60
3,0
1,0
40
2,0
2,0
20
1,0
3,0
0
0,0
4,0
25,03
35,04
37,54
10% 20% 25% 30% 40% 50% 60% 70% 75% 80% 90% 100%
Hg 0 0,4 0,8 1,0 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 3,0 3,2 3,6 4,0
Cel4,0
3,6 3,2 3,0 2,8 2,4 2,0 1,6 1,2 1,0 0,8 0,4 0
Mixar os tubos em vortex e centrifugar 900 x g durante 10 minutos e fazer leitura da D.O. Estocar em
temperatura 4 C at momento do uso.
C 1/10
0,4
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
DILUENTE
7,6
7,2
8,7
11,7
14,7
17,7
20,7
Tabela 3.
REAGENTE
DILUENTE
COMPLEMENTO
SISTEMA
HEMOLTICO
TUBO 1 TUBO
TUBO 3
2
1,0
0,6
0,2
1,0
1,4
1,8
1,4
1,4
1,4
TUBO 4
0,0
2,2
1,4
Execuo do Teste 1- Preparao do C' diludo Determinar o volume de C' diludo requerido para o teste,
multiplicando o nmero de poos no teste por 0,025 mL.
Calcular o volume de soluo de trabalho e do C' 1:10 contendo 5,0 C'H50 , como determinado na
titulao do C'.
Adicionar o volume calculado de soluo em um frasco pequeno ou tubo de ensaio, dependendo da
quantidade.
Adicionar o volume de C' 1:10 dentro do frasco com soluo trabalho e mixar gentilmente.
Manter esta diluio em temperatura de 4 C. Deixar estabilizar por 20 minutos.
2 - Rotulagem das Microplacas
Placa para Titulao de Soro:
A 1:5 1 2 3
B 1:10
C 1:20
D 1:40
E 1:80
F 1:160
G 1:320
4 5
CH CL CN 0%
25%
50%
75%
100%
AC
1
2
3
4
5
6
7
3 - Preparao do Antgeno:
Determinar o volume de antgeno requerido multiplicando o nmero de poos que recebem antgeno por
0,025 mL. Diluir o antgeno na diluio 1:125.
Preparar o volume requerido em soluo trabalho e mixar.
Estocar a soluo de antgeno a 4 C at o momento do uso.
4 - Adio dos Reagentes e Amostras nas Placas:
4.1. Titulao do Soro:
Adicionar 25 l da soluo de trabalho nos poos de titulao 1:10 a 1:320 e na linha de AC.
Adicionar 25 l do soro teste nos poos de diluio 1:5, 1:10 e AC.
Adicionar 25l dos soros controles (positivo alto e baixo e negativo) nos poos de diluio 1:5, 1:10 e AC
nas respectivas colunas, conforme figura I.
Com um microdiluidor de 25 l, mixar os soros controles e soros testes nos poos de titulao 1:10 por
quatro segundos. Transferir e mixar soro nas sucessivas diluies para cada poo. Na ltima diluio
(1:320), desprezar 25 l.
Adicionar 25 l do antgeno diludo nos poos da diluio 1:5 a 1: 320.
Adicionar 25 l do C' diludo nos poos da diluio 1:5 a 1:320 e linha AC.
Controle dos Reagentes (ver tabela 4).
Mixar as placas por 1 minuto. Cobrir as placas para minimizar a evaporao e incubar em estufa a 37C
por 1 (uma) hora.
4.2. Adio de Clulas Sensibilizadas e No-Sensibilizadas Determine o volume de clulas sensibilizadas
necessrio para o teste multiplicando o total de poos no teste por 0,05 mL.
Remover a Hemcia a 2% estocada em 4 C e agitar gentilmente at ressuspenso.
Adicionar, em um frasco, volume de hemcia igual ao volume de soluo de trabalho com hemolisina
diluda.
Incubar em banho-maria a 37 C por 10 minutos.
Remover o sistema hemoltico do banho-maria.
Adicionar 50 l das clulas sensibilizadas nos poos das diluies de 1:5 a 1:320 e AC das placas de
titulao e colunas M e CC do teste screening.
Adicionar 25 l da hemcia a 2% nos poos 7, 8 e 9 do controle dos reagentes.
4.3. Adio de Outros Reagentes e Incubao:
Adicionar 125 l de cada padro de cor, individualmente, nos poos rotulados de 0 a 4+.
Cobrir as placas e mixar por 1 minuto.
Incubar as placas em estufa a 37 C por 20 minutos.
Remover as placas e mixar para ressuspender as clulas no lisadas. Incubar novamente por 25 minutos.
Centrifugar as placas por 5 minutos a 300 x g ou deixar por pelo menos duas horas em geladeira.
Tabela 4 - Controle dos Reagentes
POO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
l DIL
25
50
50
50
25
75
100
75
75
l Ag
25
25
25
l C'
25
25
25:1/2
25:1/2
l SH
50
50
50
50
50
50
25
25
l H2% Resultados
0
4+
0
Traos a 3+
Traos a 3+
4+
25
4+
25
4+
25
4+
6 - Controle de hemolisina
7 - Controle das clulas
8 - Controle das clulas
9 - Clulas na presena do antgeno
Interpretao dos Resultados
Ler os resultados dos controles dos reagentes comparando o percentual de hemlise com o padro de cor.
Interpretar os resultados baseados na tabela 5.
Compare os controles dos reagentes para determinar se esto dentro dos padres estabelecidos na tabela 4.
Caso contrrio, repita todo o procedimento.
Fazer a leitura do percentual de hemlise de cada poo testado. Este percentual baseado no tamanho, cor
do sobrenadante e espessura do boto, em respectiva ordem de importncia.
As clulas sensibilizadas devem estar completamente hemolisadas no controle AC. Caso contrrio, o soro
tido como anticomplementar, devendo-se solicitar nova amostra.
O ttulo registrado a diluio seguinte da ltima da fixao do complemento.
Se restarem poucas clulas no poo, o soro tido como inconclusivo. Solicitar nova amostra.
Tabela 5: Equivalncia da leitura do percentual de hemlise e valores numricos
Percentual de
Hemlise
0
25
50
75
100
Interpretao
Diagnstico
4+
3+
2+
1+
Negativo
Positivo
Positivo
Positivo
Positivo
Negativo
DIL (mL)
HL 1:1000 mL
1,0
2,0
3,0
2,0
3,0
7,0
15,0
2,0
2,0
2,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Sistema Hemoltico:
Em tubos 12x100 mm ou 13x100 mm, rotular de 1:1000 at 1:16000 e colocar em cada tubo 2,0 mL de
H2% e 2,0 mL da diluio de HL do quadro acima.
Agitar cada tubo em vortex e colocar em banho-maria a 37 C por 10 minutos.
Preparar o Complemento (C') 1:200, 1:250 e 1:300:
Rotular 3 sries de tubos para leitura em espectrofotmetro das diluies do C'
0,8 mL dil
0,4 mL C'1/200
0,8 mL SH
0,8 mL dil
0,4 mL C'1/250
0,8 mL SH
0,8 mL dil
0,4 mL C'1/300
1/300
0,8 mL SH
Misturar para agitao e levar a banho-maria 37 C por 30 minutos (agitar com 15 minutos).
Preparao do Padro de Cor:
Preparar padro de cor (PC) igual a prova de mormo. Registrar o valor das D.O.
Centrifugar todos os tubos 900 x g por 10 minutos. Fazer leitura em espectrofotmetro e registrar os
valores inclusive do PC.
Fazer o grfico:
Em papel milimetrado, tomar uma reta na horizontal de 20 cm (ou 30 cm) e, deste, marcar a diluio
1:1000. Para calcular as demais fraes, dividir 20000 por cada diluio.
Ex.:
A partir do ponto 0 (zero), marcar 13,3 cm. Calcular at diluio 1:16000.
Na reta vertical, marcar os percentuais de hemlise de 10 a 100%, com espao de dois em dois quadrantes
(2,0 em 2,0 cm).
Marcao dos Pontos: Fazer a leitura das D.O das trs diluies do C' para todos os valores 1/1000 at
1/16000. Associar o valor da D.O ao percentual de hemlise do PC. Marcar os pontos e fazer o grfico. O
ponto timo ser aquele que mostrar uma estabilidade (Figura 2).
Referncias Bibliogrficas
United States Department of Agriculture/National Veterinary Services Laboratories - Testing Protocol.
Complement Fixation Test for Detection of Antibodies to Burkholderia mallei: Microtitration test. Ames,
IA - April 30, 1997.
ROITT, I, BROSTOFF, J, MALE, D Imunologia. Editora Manole, 5 ed., 1999, 421p.
ANEXO II
SOLUES E REAGENTES
Tampo de Trietanolamina (TEA) - Soluo me
Colocar em um frasco com graduao para um litro:
28 mL de trietanolamina (Merck 108379)
180 mL de cido Clordrico 1N (Merck PA 15893)
75 g Cloreto de sdio (Merck 6404)
1 g Cloreto de magnsio hidratado (Merck 5833)
0,2 g Cloreto de clcio (Merck 2382)
Colocar o volume com gua destilada para (um) litro
Soluo Diluda de Trietanolamina - Soluo de trabalho
Adicionar em um frasco graduado para um litro:
100 mL da soluo me
0,5 g de gelatina em gua fervente (Merck 4070)
Medir o pH que deve estar entre 7,3 e 7,4. O pH pode corrigir com cido ctrico.
Hemolisina (Amboceptor)
Trata-se de um soro que contm um alto ttulo de anticorpos contra as hemcias de carneiro. Quando se
combina este anticorpo com hemcias em suspenso, diz-se que estas esto sensibilizadas, isto , em
presena de complemento livre sofrem lise.
A Hemolisina deve ser preparada somente em coelhos. A maioria dos trabalhos de tcnicas sorolgicas
(i.e. Campbell e cols., 1963 ou Cruickshank, 1965) apresentam detalhes sobre o mtodo de preparao da
Hemolisina. A Hemolisina encontrada no comrcio, geralmente na forma lquida, conservada em um
volume igual de glicerina.
Complemento
Sangrar pelo menos 4 cobaias, separar o mais breve possvel o soro do cogulo e misturar para preparar o
Complemento. Os cobaias adultos e bem nutridos com verduras frescas produzem um complemento de
boa qualidade. Os animais devero estar em jejum de 12 horas. No se utilizaro fmeas prenhas nem
recm-paridas. O Complemento deve permanecer congelado a -40C ou temperaturas mais baixas, desde
que com meios adequados. O armazenamento em nitrognio lquido um procedimento eficaz e prtico.
O Complemento pode ser adquirido liofilizado e/ou desidratado; ainda que neste caso deva ser
armazenado em refrigerador ou congelador.
ANEXO III
Instrues:
1. Do campo observaes, dever constar informaes referente a: histrico do animal, eventuais
sintomas, contatos, deslocamentos.
2. Resenha
- Procure fazer a resenha o mais fielmente possvel.
- Utilizar caneta azul ou preta.
- Indique o remoinho sempre com um simples x no local, puxando um trao que dever - terminar com
um R.
- Indique a espiga com um trao ondulado.
- Indique somente os contorno das marchas, estrelas ou calados dos animais.
- Nunca pinte ou preencha os contornos fazendo um sombreado mais escuro nas reas de mancha.
- Dois traos paralelos sobre um membro indicam que este membro no tem mancha branca, isto , no
calado.
- Cicatrizes devem ser desenhadas.
- Casco: de cor preta - no escrever, nem indicar nada
ANEXO V
ANEXO VI
ANEXO VII
D.O.U., 05/02/2004