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INSTITUTO DE BIOLOGIA
Niteri
2007
ii
Orientadoras
Professora Jussara Lagrota Cndido
Professora Thereza Quirico dos Santos
iii
Banca examinadora:
iv
FICHA CATALOGRFICA
muscular
induzida
por
bupivacana
em
linhagens
de
1. leso muscular
4. citocinas
2. inflamao
3. Msculo Esqueltico
vi
vii
AGRADECIMENTOS
A Dra. Joseli Lannes Vieira por sua ajuda nos momentos mais crticos,
por acreditar no futuro deste projeto e contribuir para o meu crescimento
profissional e por ser tambm um exemplo a ser seguido. Sua
participao foi fundamental para a realizao deste trabalho.
viii
todos
os
colegas
professores
da
ps-graduao
em
ix
EPGRAFE
Rui Barbosa.
SUMRIO
Pgina
FICHA CATALOGRFICA...................................................................................v
DEDICATRIA.................................................................................................... vi
AGRADECIMENTOS..........................................................................................vii
EPGRAFE.......................................................................................................... ix
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... xii
LISTA DE TABELAS..........................................................................................xiv
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................xv
RESUMO...........................................................................................................xvii
ABSTRACT.......................................................................................................xviii
1.0 - INTRODUO.......................................................................................... 1
1.1 - Tecido Muscular Esqueltico.....................................................................1
1.2 - Formao do Tecido Muscular.................................................................. 5
1.3 - Reparo do Tecido Muscular...................................................................... 6
1.4 - Progenitores Miognicos........................................................................... 9
1.4.1 - Clulas Satlites........................................................................................ 9
1.4.2 - Contribuio de Outras Clulas Miognicas no Reparo do Tecido
Muscular...................................................................................................13
1.5 - Participao da Inflamao no Reparo Tecidual .....................................16
1.6 - Metaloproteinases na Regenerao e Reparo de Tecido Muscular .......23
1.7 - Modelos Animais de Injuria Muscular.......................................................25
2.0 - OBJETIVOS.............................................................................................28
2.1 - Objetivo Geral..........................................................................................28
2.2 - Objetivos Especficos..............................................................................28
3.0 - MATERIAL E MTODOS.........................................................................29
3.1 - Animais.....................................................................................................29
3.2 - Induo da Leso.....................................................................................29
3.3 - Processamento Histolgico......................................................................30
3.4 - Imuno-histoqumica..................................................................................30
3.5 - Histomorfometria......................................................................................32
3.6 - Citometria de Fluxo..................................................................................32
3.7 - RT-PCR....................................................................................................33
xi
3.7.1 - Extrao de RNA Total ........................................................................... 33
3.7.2 - Eletroforese de RNA .............................................................................. 34
3.7.3 - Transcrio Reversa de RNA e PCR...................................................... 35
3.8 - Zimografia............................................................................................... 36
3.8.1 - Preparo do Extrato Tecidual.................................................................. 36
3.8.2 - Gel para Zimografia............................................................................... 36
3.9 - Anlise Estatstica................................................................................... 37
4.0 - RESULTADOS........................................................................................ 38
4.1 - Anlise Histolgica da Leso Muscular ................................................. 38
4.2 - Alteraes no Microambiente da Leso Muscular ...................................42
4.2.1- Colorao de Picrocrius .......................................... ..............................42
4.2.2 - Atividade das Metaloproteases no Msculo Lesionado ..........................47
4.3 - Fenotipagem do Infiltrado Inflamatrio..... ...............................................51
4.4 - Fenotipagem do Linfonodo de Drenagem.......................... .....................53
4.5 - Expresso de RNAm para TGF- no msculo esqueltico.....................62
5. -
DISCUSSO........................................................................................... 64
6. -
CONCLUSES....................................................................................... 72
7. -
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................ 73
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP
Adenosina tri-fosfato
ATPASE
Adenosina tri-fosfatase
B10
C57BL/10
B6
C57BL/6
BHLH
Basic-helix-loop-helix
Ca+
Clcio
CTX
Cardiotoxina
DMD
DPI
ECM
Matriz extracelular
FGF
GAPDH
Gliceraldeido-3-fosfatase dehidrogenase
HGF
HMGB1
IGF
IL
Interleucina
LAP
LPS
Lipopolissacardeo
MDSC
MHC
MMP
Metaloprotease de matriz
MRF
mRNA
RNA mensageiro
NK
NO
xido Ntrico
NTX
Notexina
PCNA
PCR
PGE2
Prostaglandina E
PPARy
xiii
RNAse
Ribonuclease
Runx2
SCA-1
SDF
SDS
SP
Side Population
TGF
TGF-
TIMP
TLR
TNF
Zn2+
Zinco
xiv
LISTA DE TABELAS
Pgina
1.
2.
3.
Lista de oligonucleotdeos.......................................................................35
xv
LISTA DE FIGURAS
Pgina
1.
2.
3.
4.
5.
11
6.
13
7.
8.
9.
15
17
23
40
41
44
46
49
50
52
54
49
55
57
58
xvi
21. Anlise por citometria de fluxo de expresso dos antgenos
CD62L, CD44, CD25 nas clulas CD4+............................................
59
60
61
63
xvii
RESUMO
BALB/c.
Os
linfonodos
regionais
apresentaram
aumento
xviii
ABSTRACT
Muscular lesion is a frequent matter in sportive medicine and myodegenerative
diseases. Necrosis of the damaged tissue and activation of inflammatory
response characterize the initial phase of muscle repair. This work aimed to
analyze the tissue repair after induction of lesion in skeletal muscle from mouse
lineages with distinct cytokine secretion patterns. It was included at least 3 mice
per group with distinct cytokine pattern: Th1 (C57BL/10, C57BL/6) and Th2
(BALB/c). Muscular injury was performed by injection of bupivacaine (Bp) in the
(T. brachii) skeletal muscle. Mice were sacrificed at 1, 4, 8 and 12 days postinjection (dpi). Both Th1-dominant strains presented more areas with
regenerating myofibers and macrophages at 4 dpi. Regional lymph nodes
showed significant increase of cellularity and relative numbers of CD3+CD4+ in
bupivacaine-inoculated BALB/c mice compared to non-inoculated matched mice
at 4 dpi. BALB/c mice showed increased collagen expression and decrease of
MMP-9 activity associated with more mRNA for TGF-b1. This study shows that
the immune background of the mouse may affect the remodelling processes in
skeletal muscles that occur in response to bupivacaine injection promoting
muscle regeneration (Th1 cytokines) or myonecrosis and collagen deposition
(Th2 cytokines).
1. INTRODUO
todo
comprimento
do
msculo
esqueltico,
so
ento
perimsio
osso
sanguneo
Fibra muscular
tendo
epimsio
endomsio
fascculo
ncleo
Banda I
Banda A
Disco Z
Mitocndria
Retculo
sarcoplasmtico
Triad
Cisterna terminal
Tbulo transversal
Sarcolema
Sarcoplasma
Miofibra
muscular
(MCK)
(Charge
&
Rudnicki,
2004).
Durante
1.3
Rudnicki, 2004). Esse processo seguido por uma fase de reparo onde ocorre
a fagocitose do tecido lesionado, regenerao das miofibras, formao do
tecido cicatricial e revascularizao. Durante a fase seguinte, a fase de
remodelagem, ocorre contrao e reorganizao do tecido cicatricial e a
recuperao da capacidade funcional do msculo (Peng & Huard, 2004).
Na fase inicial da leso muscular geralmente ocorre ativao de clulas
mononucleares, principalmente clulas inflamatrias e clulas miognicas. No
perodo ps-leso as principais alteraes histolgicas no stio de leso so:
necrose da miofibra e aumento do nmero de clulas mononucleares de
origem no muscular (Charge & Rudnicki, 2004). Estudos recentes sugerem
que fatores liberados por msculos lesionados ativam as clulas inflamatrias
residentes que em troca produzem sinais quimiotticos para as clulas
inflamatrias
circulantes
(Warren
et
al.,
2004).
Maturao
Diferenciao
Proliferao
Ativao
1.4
PROGENITORES MIOGNICOS
10
em
camundongos
30%
dos
ncleos
musculares
sublaminares (Cardasis & Cooper, 1975; Chen & Goldhamer, 2003). Contudo,
aps o nascimento, essa proporo diminui para menos de 5% no camundongo
adulto e continua a cair lentamente aps a puberdade (Chen & Goldhamer,
2003; Charge & Rudnicki, 2004).
No msculo normal clulas satlites so normalmente quiescentes e
expressam marcadores como Pax-7+, CD34 e M-caderina (revisado em
Zammit et al., 2006). Inicialmente, achava-se que Pax-7 era essencial para
especificao de clulas satlites, porque camundongos mutantes nocaute
para Pax-7 pareciam no possuir clulas satlites porm possuam
comprometimento da regenerao muscular. Contudo clulas satlites podem
ser detectadas na ausncia de Pax-7, porm sua manuteno e proliferao
parece ser defeituosa, sugerindo que Pax-7 possua um importante papel antiapopttico (Relaix et al., 2006).
Clulas satlites quiescentes no expressam nveis detectveis de
nenhum dos MRFs. Aps a injria e/ou ativao, a expresso de MyoD
induzida em 12 horas, antes mesmo da expresso de PCNA (antgeno nuclear
de proliferao celular), um marcador para proliferao celular. A expresso de
miogenina ocorre tardiamente durante a fuso e diferenciao (Figura 5).
Anlise da expresso gnica de clulas satlites individuais ativadas, mostrou
inicialmente a expresso de Myf-5 ou MyoD, seguida da coexpresso desses
marcadores durante a fase proliferativa e de miogenina e MRF-4 na fase de
diferenciao terminal (Cornelison & Wold, 1997; Charge & Rudnicki, 2004).
Clulas satlites que mantm a expresso de Pax e diminuem expresso de
11
Mioncleo
Fibra
muscular
Lmina
basal
Clula satlite
12
13
Resposta imune
LIF
IL-6
PDGF
Citocinas
IGF-I
IGF-II
FGF
TGF-
HGF
Macrfagos
Neutrfilos
Linfcitos T
Plaquetas
Outros fatores
Neurnio motor
Testosterona
NO
Neurotransmissores
Fatores neurotrficos
Clula
satlite
EGF
PDGF
IGF-I
IGF-II
EGF
HGF
Vasculatura
IGF-I
IGF-II
TGF-
HGF
FGF
Fatores autcrinos
Figura 6- Influncia do microambiente na ativao das clulas satlites (Hawke & Garry,
2001)
EGF - Fator de crescimento para endotlio, FGF - Fator de crescimento para fibroblasto, HGF
Fator de crescimento de hepatcito, IGF-I - Fator de crescimento tipo insulina 1, IGF-II - Fator
de crescimento tipo insulina 2, IL-6 - Interleucina-6, LIF - Fator de inibio da migrao
macrfago, NO - xido Ntrico, PDGF - Fator de crescimento derivado de plaqueta, TGF- Fator de crescimento de transformao-.
14
tecido muscular (Ferrari et al., 1998). Apesar das clulas derivadas da medula
ssea contribuir bem menos que as clulas satlites, este experimento criou
enorme interesse no potencial de diferenciao plstico e na possibilidade de
novas estratgias teraputicas. Essas populaes residem no msculo
esqueltico ou podem ser recrutadas de compartimentos no musculares em
resposta injria e regenerao (figura 7).
As SP (side population), caracterizadas pela expresso de Sca-1high e
CD45low ,constituem uma populao de clulas progenitoras residentes nos
tecidos adultos (medula ssea; msculo esqueltico). Estas clulas aumentam
em nmero aps a injria e participam na regenerao (Meeson et al., 2004).
MDSC (muscle-derived stem cells) so outra populao de clulas tronco com
potencial miognico isoladas do msculo esqueltico adulto expressando os
marcadores Sca-1 e CD34 (revisado em Shi & Garry, 2006).
15
Clula satlite
Miofibra
Clulas
intersticiais
Progenitores
vasculares
Mioncleo
Miofibra
Cls de m. ssea
16
stio preferencial das clulas satlites. Tanto as clulas endoteliais como 60%
das MDSCs so CD34+Sca1+ sugerindo serem subpopulaes de clulas
endoteliais. Essas clulas se diferenciariam em clulas do endotlio vascular e
fibras do msculo esqueltico aps serem implantadas no msculo (Peng &
Huard, 2004).
As clulas precursoras miognicas no somente contribuem para
regenerar miofibras no msculo lesionado, mas tambm so capazes de
reconstituir o compartimento de clulas satlites. Contudo, a freqncia muito
baixa (mesmo na injria) comparando-se com o nmero de mioblastos
derivados de clulas satlites. O aumento do recrutamento dessas clulas para
a leso atravs do aumento da expresso local de IGF-1 ou SDF-1 no
aumentou o nmero de mioncleos originados do doador (Askari et al., 2003;
Musaro et al., 2004). Por isto, importante investigar os mecanismos e sinais
envolvidos na fuso ou transdiferenciao a fim de propor novas estratgias
para aumentar a eficincia da converso de outras clulas precursoras (Long et
al., 2005).
1.5
17
Coagulao
Inflamao
Migrao/proliferao
Neutrfilos
Plaquetas
Macrfagos
Nmero de
clulas
Fibroblastos
Remodelagem
Linfcitos
Figura 8 - Cintica da migrao celular nas fases da leso tecidual (Witte & Barbul, 1997)
18
19
20
21
22
23
Injria e inflamao
Tipo I
Tipo II
Resoluo
normal
Fibrose
Destruio da citoarquitetura
Alterao de funo
remodelagem
da
ECM.
Esse
processo
coordenado
24
cinco
famlias
demetaloproteases:
as
gelatinases,
as
25
1.7
26
27
28
2. OBJETIVOS
29
3.1 Animais
Nos experimentos foram utilizados camundongos machos isognicos na
idade de 5 a 6 semanas das linhagens C57BL10, C57BL6, BALB/c. Os animais
foram mantidos em ambiente refrigerado (20 C) e aclimatado com ciclo de
iluminao 12:12 horas, no Biotrio da Fundao Oswaldo Cruz e no Biotrio
de Patologia Celular do Instituto de Biologia da UFF. Os animais foram
mantidos em gaiolas de prolipropileno forradas com maravalha peneirada e
autoclavada recebendo rao Nuvital (Curitiba, Brasil), suplementao
alimentar (farelo de trigo e semente de girassol) e vitamnica (Vitagold), gua
filtrada ad libitum.
para
realizao
das
tcnicas
de
histologia,
imuno-
30
3.4 Imuno-histoqumica
O msculo T. brachii foi cuidadosamente removido, congelado em
nitrognio lquido e includo em OCT (Sakura, EUA). Cortes de 5 m de
espessura foram colocados em lminas desengorduradas e previamente
filmadas com poli-L-lisina (Sigma Chem. Co, Mo, EUA). Aps a fixao por 10
31
rato
Caltag
1/80
Anti-CD8.biotina
rato
Caltag
1/80
Anti-F4-80
rato
Serotec
1/40
Anti-Mac-1.biotina
rato
Pharmingen
1/30
Anticorpos monoclonais
Origem
Fonte
Diluio
32
3.5 Histomorfometria
Nas lminas com colorao para Picrosrius foi realizada a quantificao do
percentual de rea de depsito de colgeno por rea de leso com o programa
Analisys (Soft Image System, Alemanha). Foram escolhidos 3 campos
aleatrios em cada anlise.
33
Fluorocromo
Fonte
Diluio
Anti-CD3
Fitc
Pharmingen
1/300
Anti-B220
Fitc
Pharmingen
1/400
Anti-CD4
Pe
Pharmingen
1/300
Anti-CD8
Spectral red
Southern
1/600
Anti-CD25
Fitc
Sigma
1/5
Anti-CD62L
Fitc
Pharmingen
1/100
Anti-CD44
Fitc
Pharmingen
1/50
3.7 RT-PCR
3.7.1 Extrao de RNA total
O RNA total foi isolado pelo mtodo de TRIzol Reagent (Invitrogen,
CA, EUA). Os msculos foram homogeneizados na proporo de 50mg de
tecido para 1000l de Trizol e centrifugados a 12.000 xg por 10 minutos a 4C
para remover o fragmento de tecido no dissolvido. Os sobrenadantes foram
congelados a -20C at o momento de uso. Aps serem descongelados, foi
adicionado 200l de uma soluo de clorofrmio/ lcool isoamlico na
proporo 24:1 (v:v) seguindo-se nova homogeneizao. Aps 10 minutos no
gelo, a mistura foi centrifugada a 12.000 xg por 15 minutos a 4C. A fase
aquosa foi coletada e transferida para outro tubo contendo o mesmo volume de
isopropanol
(Merck
do
Brasil).
As
solues
foram
agitadas
at
34
35
Antisense
TGF-
CAAGGAGACGGAATACAGGGCT
CGCACACAGCAGTTCTTCTCTGT
GAPDH
GGTGAAGGTCGGTGTGAACGGA
TGTTAGTGGGGTCTCGCTCCTG
36
3.8 Zimografia
3.8.1 Preparo do extrato tecidual
Os msculos inoculados e controles foram coletados e imediatamente
congelados e preservados em nitrognio lquido (-165oC). Os msculos foram
pesados e homogeneizados (1/10, p/v) em tampo de extrao (100 mM TrisHCl, pH 7,6, 200mM NaCl, 100mM CaCl2 e 1% Triton X-100) 4oC. Aps a
centrifugao (15.000 xg), o sobrenadante foi dividido em alquotas de 100 l, e
a concentrao protica determinada utilizando-se uma curva padro de
albumina pelo mtodo de Lowry (Lowry et al., 1951). A mesma quantidade de
protena total foi usada para zimografia (60 g/poo).
37
38
4. RESULTADOS
Inclusive, pode-se
39
40
Balb/c
B6
4 dpi
A
0,05mm
0,05mm
8 dpi
0,1mm
0,1mm
12 dpi
0,1mm
0,1mm
41
B6
BALB/c
*
*
4 dpi
*
0,05mm
0,05mm
8 dpi
0,1mm
0,1mm
12 dpi
0,1mm
0,1mm
42
43
44
B6
BALB/c
1 dpi
0,1mm
0,1mm
F
4 dpi
0,1mm
0,1mm
8 dpi
0,1mm
0,1mm
12 dpi
0,1mm
0,1mm
45
46
% rea
12
10
8
6
4
2
0
12
C57BL/06
BALB/C
10
0
C57BL/06
BALB/C
47
48
49
A
B6c
B6i
B10i
B10i
B10i
BAi
BAi
BAc
mdx
Vaso
MMP-9
100 kDa
66 kDa
60 kDa
BAi
MMP 2 PP
MMP 2 Pr
MMP 2 ativa
BAi
BAi
BAi
B10i
B10i
B10i
B10i
B6i
B6i
100 kDa
MMP 2 PP
MMP 2 Pr
66 kDa
60 kDa
C
B6i
B6i
B6i
B6 i
B10i
B10i
B10i
BAi
BAi
100 kDa
66 kDa
60 kDa
MMP 2 PP
MMP 2 Pr
MMP-2 PP
MMP-2 Pro
50
UA 40000
40000
MMP-9
30000
MMP-2 pro
30000
20000
20000
10000
10000
MMP2pro
MMP9
UA 40000
MMP-2 pro
*
30000
20000
10000
0
B6
UA
B10
BALB/c
40000
MMP-2 pro
30000
20000
10000
0
B6
B10
Ba
51
de
msculos
congelados
emblocados
em
substncia
criopreservante OCT.
Em 4 dias ps-inoculao no encontramos diferenas quanto aos tipos
celulares presentes no infiltrado inflamatrio entre as linhagens estudadas
(Figura 16). A grande maioria das clulas presentes no infiltrado inflamatrio
expressou intensa marcao para Mac-1, um timo marcador de inflamao,
expresso em nveis variados em vrios tipos celulares como: macrfagos,
neutrfilos e clulas dendrticas (Flotte et al, 1983, Springer et al, 1979). A
marcao foi muito similar quando utilizamos o anticorpo F4-80 que
especfico para macrfagos. Isto indica que macrfagos representam a maioria
das clulas do infiltrado inflamatrio nestes animais. Camundongos BALB/c
apresentaram infiltrado inflamatrio com menor quantidade de macrfagos que
os camundongos C57BL6 (figura 16). Em contrapartida no observamos uma
marcao expressiva para linfcitos T, tanto CD4+ quanto CD8+. Um dado j
esperado porque esta uma fase inicial e possivelmente essas clulas ainda
no foram ativadas.
52
Mac-1
F4-80
0,05mm
CD4
0,05mm
CD8
0,1mm
Mac-1
0,1mm
F4-80
0,05mm
CD4
0,05mm
CD8
0,1mm
0,1mm
Figura 16: Fenotipagem das clulas do infiltrado inflamatrio da leso muscular induzida
por bupivacana.
Imuno-histoqumica para os antgenos Mac-1, F4-80, CD4 e CD8 na leso muscular nos
camundongos C57BL6 (A) e BALB/c (B). As setas evidenciam as clulas com imunomarcao
positiva.
53
que
os
camundongos
C57BL10
BALB/c
(p<0,001
0,05
entre
os
camundongos
controle,
sham
inoculados.
Os
54
50
n de clulas x 10
*
40
**
30
20
10
0
BALB/c
Controle
B6
Sham
B10
Bupivacana
55
B220
100
B220
30
25
n cls x 106
percentual
75
50
20
15
10
25
5
0
0
BALB/c
B6
B10
BALB/c
B6
B10
C
CD3
CD3
100
30
25
percentual
75
20
50
15
10
25
BALB/c
B6
B10
Controle
BALB/c
Sham
B6
B10
Bupivacana
Figura 18: Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos presentes nos
linfonodos de drenagem em 4 dpi.
Em A mostramos um histograma com perfil representativo da marcao para B220 e CD3 num
camundongo C57BL6 inoculado com bupivacana.
Os grficos dos nmeros relativos e absolutos da marcao de B220 e CD3 so mostrados
nos painis B e C respectivamente. As barras representam a mdia e seu respectivo desvio
padro. Foram includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de
Student sendo * p < 0,05.
56
57
20
100
n de cls x 10 6
percentual
80
60
40
20
15
10
5
0
0
BALB
B6
BALB
B10
B6
B10
CD8
CD8
100
20
80
15
n cls x 10 6
percentual
CD4
CD4
60
40
10
5
20
0
0
BALB
B6
B10
BALB
B6
B10
Figura 19: Anlise por citometria de fluxo dos subtipos de linfcitos T presentes nos
linfonodos de drenagem em 4 dpi.
A- mostra um perfil representativo da marcao para CD4 e CD8 dentro da populao total no
camundongo BALB/c inoculado (i) e controle no inoculado (c)
Em B e C mostramos os grficos dos nmeros relativos e absolutos da marcao de CD4 e CD8
respectivamente. As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3
animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05. As
colunas azuis representam os animais controles, vinho os animais sham inoculados e em amarelo os
animais inoculados com bupivacana.
58
Figura 20: Perfis representativos da expresso de CD44 (A), CD25 (B) e CD62L (C)
nas clulas T CD4+ de camundongos BALB/c.
C= controle no inoculado I = inoculado
59
CD62
100
40
75
30
cels x 10 6
percentual
CD62
50
25
20
10
0
Balb
B6
B10
Balb
CD44
B6
B10
CD44
100
40
30
n cls x 10 6
percentual
75
50
25
20
10
0
Balb
B6
B10
Balb
B6
B10
CD25
CD25
10
100
n cls x 10 6
percentual
8
75
50
*
25
6
4
2
0
0
Balb
B6
B10
Balb
B6
B10
Figura 21: Anlise por citometria de fluxo da expresso dos antgenos CD62L,
CD44 e CD25 nas clulas CD4+.
So mostrados os nmeros relativos e absolutos da expresso de CD62L (A), CD44
(B) e CD25 (C) As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram
includos 3 animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de
Student sendo * p < 0,05. As colunas azuis representam os animais controles, vinho
os animais sham inoculados e as amarelas os animais inoculados com bupivacana.
ND = no determinado.
60
61
CD62
100
40
75
30
n cls x 10 6
perce ntual
CD62
50
25
20
10
0
Balb
B6
B10
Balb
B6
B10
CD44
100
40
75
30
n cls x 10 6
percentual
CD44
50
25
20
10
0
Balb
B6
B10
Balb
B10
CD25
100
40
75
30
n cls x 10-6
percentual
CD25
B6
50
25
20
10
0
Balb
B6
B10
Balb
B6
B10
Figura 23: Anlise por citometria de fluxo da expresso dos antgenos CD62L, CD44 e
CD25 nas clulas CD8+.
So mostrados os nmeros relativos e absolutos da expresso de CD62L (A), CD44 (B) e
CD25 (C) As barras representam a mdia e seu respectivo desvio padro. Foram includos 3
animais por linhagem. A anlise estatstica foi baseada no teste t de Student sendo * p < 0,05.
As colunas azuis representam os animais controles, vinho os animais sham inoculados e as
amarelas os animais inoculados com bupivacana. ND = no determinado.
62
inoculao
com
bupivacana
os
msculos
Triceps
brachii
de
camundongos das linhagens C57BL6 e BALB/c. Cada grupo foi formado por no
mnimo trs animais. A expresso do RNAm para TGF- foi detectada por RTPCR e sua expresso foi calculada em relao expresso de protena
constitutiva GAPDH.
Nossos resultados mostraram que em 1 dpi os camundongos C57BL10
e C57BL6 apresentaram expresso de RNAm para TGF- similar aos
camundongos controles (figura 24). Com a quantificao (Figura 24C)
observamos que os camundongos BALB/c, de perfil Th2 apresentavam uma
expresso muito maior (2 vezes em relao ao controle pareado) aps a
inoculao de bupivacana. Em 4 dpi, no encontramos a presena de RNAm
para TGF- (Figura 24B).
63
A
B6
B10
BALB/c
200bp
B6
200bp
BALB/c
200bp
G
TGF-b
Razao TGF/GAPDH
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
B6
B10
controle
BALB/c
inoculado
64
5. DISCUSSO
O reparo tecidual orquestrado por uma seqncia de eventos bioqumicos e
celulares organizados de forma a restaurar a integridade tecidual aps a leso.
A participao do sistema imune no reparo de feridas tem sido questionada
pela seqncia de migrao de neutrfilos, macrfagos e linfcitos (Park &
Barbul, 2004). O estudo em camundongos imunodeficientes tem mostrado que
a participao dos componentes do sistema imune vai alm da proteo dos
tecidos lesionados contra possveis infeces, reforando sua participao na
manuteno e reparo pela secreo de citocinas e fatores de crescimento
(Park & Barbul, 2004; Gawronska-Kozak et al., 2006). Este trabalho teve como
objetivo estudar a leso muscular induzida pela bupivacana em camundongos
apresentando padro divergente (Th1, Th2) de produo de citocinas. O
modelo de leso muscular induzida pela bupivacana muito utilizado para se
estudar as diferentes fases do reparo muscular, porque a leso autolimitada e
permite a regenerao do tecido muscular (Sandri, 2001; Charge & Rudnicki,
2004).
A imunidade inata no especfica um mecanismo imediato importante
caracterizado
pela
participao
de
leuccitos
(tais
como
neutrfilos,
65
as
duas
linhagens,
sobretudo
no
quarto
dia
ps-inoculao.
66
anlise
das
alteraes
no
microambiente
mostrou
que
os
67
68
69
70
1997;
Morrison
et
al.,
2000).
Alm
disso,
camundongos
nude,
71
72
6. CONCLUSES
A compreenso dos processos regulatrios que medeiam a remodelagem
muscular pode contribuir para o surgimento de estratgias adequadas nas
leses musculares. Em conjunto este trabalho mostra que:
de
miofibras
regenerando
macrfagos
enquanto
73
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Askari, A. T., Unzek, S., Popovic, Z. B., Goldman, C. K., Forudi, F., Kiedrowski,
M., Rovner, A., Ellis, S. G., Thomas, J. D., DiCorleto, P. E., Topol, E. J. &
Penn, M. S. (2003). "Effect of stromal-cell-derived factor 1 on stem-cell
homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy." Lancet
362(9385): 697-703.
Azouz, A., Razzaque, M. S., El-Hallak, M. &
Taguchi, T. (2004).
74
Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S.,
Montarras, D., Rocancourt, D. & Relaix, F. (2003). "The formation of
skeletal muscle: from somite to limb." J Anat 202(1): 59-68.
Cardasis, C. A. & Cooper, G. W. (1975). "An analysis of nuclear numbers in
individual muscle fibers during differentiation and growth: a satellite cellmuscle fiber growth unit." J Exp Zool 191(3): 347-58.
Carmeli, E., Moas, M., Reznick, A. Z. &
75
Ferguson, M. W. (1998).
76
Goldman, S., Weiss, A., Eyali, V. & Shalev, E. (2003). "Differential activity of
the gelatinases (matrix metalloproteinases 2 and 9) in the fetal
membranes and decidua, associated with labour." Mol Hum Reprod 9(6):
367-73.
Granstein, R. D., Murphy, G. F., Margolis, R. J., Byrne, M. H. & Amento, E. P.
(1987). "Gamma-interferon inhibits collagen synthesis in vivo in the
mouse." J Clin Invest 79(4): 1254-8.
Hawke, T. J. & Garry, D. J. (2001). "Myogenic satellite cells: physiology to
molecular biology." J Appl Physiol 91(2): 534-51.
Henry, G. & Garner, W. L. (2003). "Inflammatory mediators in wound healing."
Surg Clin North Am 83(3): 483-507.
Hesse, M., Modolell, M., La Flamme, A. C., Schito, M., Fuentes, J. M., Cheever,
A. W., Pearce, E. J. & Wynn, T. A. (2001). "Differential regulation of
nitric oxide synthase-2 and arginase-1 by type 1/type 2 cytokines in vivo:
granulomatous pathology is shaped by the pattern of L-arginine
metabolism." J Immunol 167(11): 6533-44.
Heussen, C. & Dowdle, E. B. (1980). "Electrophoretic analysis of plasminogen
activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and
copolymerized substrates." Anal Biochem 102(1): 196-202.
Hsieh, C. S., Macatonia, S. E., O'Garra, A. & Murphy, K. M. (1995). "T cell
genetic background determines default T helper phenotype development
in vitro." J Exp Med 181(2): 713-21.
77
Jarvinen, M.
78
progenitors and muscle repair." Semin Cell Dev Biol 16(4-5): 632-40.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. & Randall, R. J. (1951). "Protein
measurement with the Folin phenol reagent." J Biol Chem 193(1): 26575.
Maegaki, Y., Ogura, K., Maeoka, Y. & Takeshita, K. (1999). "Normalization of
creatine kinase level during arthritis in a patient with Becker muscular
dystrophy." Neurology 52(1): 172-174.
Mauro, A. (1961). "Satellite cell of skeletal muscle fibers." J Biophys Biochem
Cytol 9: 493-5.
79
Meeson, A. P., Hawke, T. J., Graham, S., Jiang, N., Elterman, J., Hutcheson,
K., Dimaio, J. M., Gallardo, T. D. & Garry, D. J. (2004). "Cellular and
molecular regulation of skeletal muscle side population cells." Stem Cells
22(7): 1305-20.
Mescher, A. L. &
80
Sugita, H. (1983).
81
82
83
Sime, P. J. & O'Reilly, K. M. (2001). "Fibrosis of the lung and other tissues:
new concepts in pathogenesis and treatment." Clin Immunol 99(3): 30819.
Szalay, K., Razga, Z. &
84
Wynn, T. A. (2004). "Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm." Nat Rev
Immunol 4(8): 583-94.
Yu, Q., Horak, K. &
hypertension-induced
cardiac
extracellular
matrix
remodeling."