UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA
DISCIPLINA BIOQUMICA 4 BQ 004

MANUAL DE AULAS PRTICAS

Prof. Levy Dos Santos Guedes

RECIFE
2007
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 2

APRESENTAO

O objetivo deste manual tornar o aluno consciente da importncia das aulas prticas
para a sua formao profissional, procurando envolv-lo de forma mais efetiva, atravs da
aplicao de questionrios sobre cada aula prtica executada.
As fichas de estudo trazem informaes que ajudam o aluno a entender a relao
existente entre a prtica realizada e o tema terico correspondente. Alm das aulas prticas, o
manual contem um texto sobre o tema de aula terica: Integrao e regulao do
metabolismo. Este tema abrangente e ser apresentado ao aluno na forma de painel
dirigido. O manual ainda contem textos com exemplos clnicos e temas sobre algumas
doenas relacionadas com o metabolismo celular, que sero apresentados pelos alunos na
forma de seminrios.
Considerando que o Curso Farmacutico um curso essencialmente prtico e que a
Bioqumica uma disciplina bastante rida em seu contedo, esperamos que os alunos
possam, com este manual, compreender melhor os assuntos das aulas tericas atravs da
execuo das prticas e da apresentao dos seminrios sobre temas relacionados. Isso torna-
se imperioso, uma vez que a Bioqumica uma disciplina fundamental na formao do
Farmacutico.
Nesta edio estamos introduzindo algumas modificaes na metodologia das prticas
e algumas correes no texto.

Recife, 11 de maio de 2007

Prof. Levy dos Santos Guedes

3 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

NDICE

APRESENTAO .......................................................................................... 2

1. Cintica de Reaes Catalisadas por Enzimas ............................................. 4

2. Inibio de Reaes Catalisadas por Enzimas ............................................. 8

3. Consumo de Glicose por Clulas de Sacharomyces cerevisiae ................... 10

4. Dosagem de Perxidos de Lipdeos ............................................................. 13

5. Efeito da Glicose sobre a Peroxidao de Lipdeos ..................................... 17

6. Hidrlise de Protenas ................................................................................... 18

7. Dosagem de Uria no Plasma Sangneo ..................................................... 20

ESTUDOS DIRIGIDOS ................................................................................... 22

PAINEL DIRIGIDO

1. Integrao e Regulao Metablica .............................................................. 24

2. Questes Sobre o Tema Integrao e Regulao Metablica ....................... 33

BIBLIOGRAFIA ................................................................................................ 34
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 4

CINTICA DE REAES CATALISADAS POR ENZIMAS

OBJETIVOS

A realizao desta prtica permite ao aluno:

1- Uma introduo ao estudo da cintica de reaes catalisadas por enzimas
2- Medir a velocidade de uma reao enzimtica.
3- Calcular a constante de Michaelis-Menten (KM) e a velocidade mxima (Vmx) e
destacar a importncia destes parmetros na caracterizao das enzimas.
4- Conferir a importncia da equao de Lineweaver-Burk no clculo de KM e Vmx.

INTRODUO

Cintica de reaes enzimticas

As enzimas desempenham um papel de destaque no organismo vivo, uma vez que

catalisam reaes bioqumicas imprescindveis ao desenvolvimento e manuteno das clulas.
A concentrao de uma enzima em tecido ou fluido biolgico pode ser determinada
medindo-se a velocidade da reao catalisada pela enzima. Para isso so utilizados mtodos
analticos que permitam medir a diminuio na concentrao do substrato ou o aumento na
concentrao do produto da reao.
Muitos fatores podem afetar a atividade enzimtica: concentrao do substrato,
temperatura, pH, concentrao de ativadores e inibidores, concentrao do produto. Todas
estas variveis podem e devem ser controladas, mas a presena de ativadores e inibidores em
sistemas biolgicos nem sempre detectada e por isso no pode ser controlada. Por isso a
medida da atividade enzimtica no corresponde necessariamente concentrao real da
enzima. Para medir com preciso a velocidade de uma reao enzimtica necessrio que esta
velocidade se mantenha constante durante o experimento.
Com auxlio da equao de Michaelis-Menten possvel determinar o percentual da
velocidade de uma reao enzimtica com uma dada concentrao de substrato, em relao
velocidade mxima da reao, ou seja, velocidade obtida com uma concentrao de
substrato capaz de saturar toda a enzima presente no meio da reao. Assim, se em uma
reao enzimtica for utilizada uma concentrao de substrato correspondente a 20 vezes o
valor do KM, a velocidade da reao corresponder a 95% da Vmx:

v = Vmx [S] (KM + [S]) v Vmx100 = 20 KM (KM + 20 KM)

Admitindo que no final da reao 10% do substrato tenha sido consumido, a

concentrao agora corresponder a 18 vezes o valor do K M e a velocidade da reao a 94,7%
da Vmx. A variao da velocidade muito pequena e pode ser ignorada.
Na prtica esse problema torna-se mais complexo uma vez que a solubilidade do
substrato limitada e muitas vezes as enzimas apresentam um K M alto. Nestes casos
aconselhvel desenvolver a reao enzimtica em um espao de tempo curto e repetir o
5 experimento com o material que contem a enzima,
Manualdiludo, todas Prof.
de Aulas Prticas as vezes
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Guedes
10% do substrato for consumido na reao.

Aplicaes de enzimas nas anlises clnicas

Os conhecimentos da enzimologia vm sendo aplicados no laboratrio clnico para

medir a atividade de enzimas e a concentrao de substratos em tecidos ou fluidos de
pacientes. Enzimas como trombina e plasmina, associadas ao processo de coagulao
sangnea, bem como lipoprotena lipase, envolvida com o processamento dos quilomcrons;
so exemplos de enzimas especficas do plasma e por isso so encontradas em concentraes
mais elevadas. Nas doenas de tecidos e rgos pode haver alteraes na permeabilidade da
membrana, ou morte celular e com isso, enzimas dos tecidos difundem-se para o plasma.
Essas enzimas, normalmente esto presentes em baixas concentraes e no tm nenhum
papel funcional no plasma.
No diagnstico do envolvimento de um rgo especfico numa doena, seria ideal se
as enzimas particulares para cada rgo pudessem ser identificadas. Isso improvvel porque
os processos metablicos de vrios rgos so muito semelhantes. Embora existam poucas
enzimas especficas para um determinado rgo ou tecido, como a lcool desidrogenase do
fgado e a fosfatase cida da prstata, o estudo da cintica do aparecimento e
desaparecimento de enzimas particulares no plasma, permite que o diagnstico do
envolvimento de um rgo especfico seja feito.
Estudos da cintica de liberao de enzimas cardacas no soro, aps um enfarte do
miocrdio, permitem estabelecer quando o ataque ocorreu e se o tratamento efetivo. A
concentrao plasmtica de creatina fosfocinase (CPK), aumenta cerca de seis vezes, entre o
primeiro e o segundo dia aps o enfarte; enquanto a lactato desidrogenase (LDH) e a
-hidroxibutrico desidrogenase (HBDH), aumentam cerca de duas vezes, de forma mais
lenta, mas permanecem elevadas por mais tempo.
Entre as enzimas utilizadas com freqncia no diagnstico de doenas podemos
relacionar, alm daquelas citadas acima, fosfatase alcalina, amilase, lipase, aspartato e
alanina amino transferases, estas duas ltimas, tambm conhecidas como transaminase
glutmico oxaloactica (TGO) e transaminase glutmico pirvica (TGP), respectivamente.
O reconhecimento dos metablitos que se acumulam em fluidos biolgicos, tem um
papel importante na identificao de possveis defeitos na produo ou na atividade de
enzimas. Como exemplo temos a acidria ortica hereditria, devida deficincia de duas
enzimas envolvidas com a via de biossntese de pirimidinas (orotato fosforibosil transferase e
orotidina), gerando um acmulo de cido ortico. A hiperuricemia um outro exemplo de
aumento de metablito, devido a deficincia na produo da enzima hipoxantina-guanina-
fosforribosiltransferase.
Enzimas so utilizadas como reagentes qumicos em analisadores clnicos portteis.
Dosagem de colesterol, triacilgliceris, glicose, podem ser realizados em poucos minutos,
usando 10L de plasma. A qumica clnica moderna tem se beneficiado da unio entre a
qumica e a imunologia. Anticorpos especficos contra um antgeno protico so acoplados a
uma enzima indicadora, como peroxidase de raiz forte (horseradish), gerando um ensaio
muito especfico e sensvel. Esse ensaio conhecido como ELISA (enzyme-linked
immunoadsorbent assay). Um exemplo de sua utilizao demonstrado por um ensaio para
identificao dos antgenos proticos da capa do vrus da imunodeficincia humana (HIV),
que gera a sndrome da imunodeficincia adquirida (AIDS).
A identificao de isoenzimas enzimas que catalisam a mesma reao, mas migram
diferentemente em um campo eletrofortico tambm tem sido usada para diagnstico
clnico. Exemplos de isoenzimas que tm ampla aplicao clnica:
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 6

1) Creatina fosfocinase um dmero com dois tipos de subunidades, M (muscular) e

B (cerebral). No msculo esqueltico as duas subunidades so do tipo M. No crebro as duas
unidades so do tipo B. Somente no miocrdio se encontra a isoenzima contendo as duas
subunidade M e B. Nos outros tecidos so encontradas quantidades variveis de isoenzimas
MM e BB. De acordo com a mobilidade para o nodo, na eletroforese, essas isoenzimas so
denominadas CPK1 (BB), CPK2 (MB) e CPK3 (MM).
2) Lactato desidrogenase, uma enzima tetramrica contendo apenas duas
subunidades diferentes: H, para o corao e M, para o msculo esqueltico. So identificadas
cinco formas dessas isoenzimas: LDH1 (HHHH) e LDH2 (HHHM), encontradas no miocrdio
e nos eritrcitos; LDH3 (HHMM), no crebro e rim; LDH 4 (HMMM) e por fim LDH5
(MMMM), encontradas no fgado e msculo esqueltico.
Estreptocinase, uma mistura de enzimas obtida de um streptococcus, utilizada para
a remoo de cogulos sangneos, atravs da ativao do plasminognio, a forma inativa da
plasmina, no plasma. Uma outra aplicao de enzimas como agentes teraputicos a
utilizao da asparaginase. Algumas clulas leucmicas parecem perder a capacidade de
sintetizar asparagina. Dessa forma, a asparaginase inibe o crescimento de clulas tumorais,
reduzindo os nveis plasmticos de asparagina do hospedeiro.
Na indstria farmacutica, enzimas ligadas a matrizes insolveis (enzimas
imobilizadas) so utilizadas como reatores qumicos altamente especficos. Por exemplo, -
galactosidase utilizada para reduzir o contedo de lactose no leite.

FUNDAMENTO DA PRTICA

Nesta prtica utilizaremos a enzima urease (uria amidohidrolase, EC 3.5.1.5). Esta

enzima apresenta uma alta especificidade para o substrato uria (NH 2CO-NH2),
transformando-o em amonaco (NH4+) e carbonato (HCO3-), em meio cido:
UREASE
NH2CO-NH2 + 2H2O + H =========> 2NH4+ + HCO3-
+

A medida da atividade enzimtica pode ser determinada medindo-se a diminuio na

concentrao de uria ou o aumento de amonaco ou carbonato formado.
Neste experimento utilizaremos a reao proposta por Berthelot para determinar os
nveis de amonaco formado. Em meio alcalino, amonaco transformado em amnia (NH3) e
reage com um derivado fenlico (salicilato) na presena de hipoclorito de sdio produzindo
um composto de cor azul, o indofenol, cuja intensidade proporcional concentrao de
amnia. Nitroprussiato de sdio utilizado como catalisador desta reao.
7 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

PROCESSO

Identificar sete tubos de ensaio: Branco (B) e mais seis tubos enumerados de 1 a 6 e
seguir a orientao abaixo:

TUBOS GUA DEIONIZADA SUBSTRATO (URIA) ENZIMA (UREASE)

8,56% 85,6mg% (268 U/ml)
B 0,4 mL - - 1,0 mL
1 0,3 mL 0,1 mL - 1,0 mL
2 0,2 mL 0,2 mL - 1,0 mL
3 - 0,4 mL - 1,0 mL
4 0,3 mL - 0,1 mL 1,0 mL
5 0,2 mL - 0,2 mL 1,0 mL
6 - - 0,4 mL 1,0 mL

1- Incubar todos os tubos em banho-maria (BM) a 37C por 5 minutos (esta a reao
enzimtica).
2- Adicionar a cada tubo 1,0 mL da soluo oxidante (hidrxido de sdio 2,8 mM e
hipoclorito de sdio 121 mM), misturar e levar ao BM a 37C por 5 minutos..
3- Ler as absores pticas em 600 nm, utilizando o branco para ajustar o zero do
espectrofotmetro.

CLCULO DA ATIVIDADE ENZIMTICA

Construir um grfico contendo no eixo das abcissas as concentraes do substrato [S]

(0,1; 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 e 4,0 mM)* e no eixo das ordenadas a leitura das absores (v).
Construir um novo grfico contendo nos eixo das abscissas, 1/[S] e nas ordenadas, 1/v.
Calcular KM e Vmx.

OBSERVAO

A urease (268 U/ml) est dissolvida com tampo fosfato 10 mM, pH 6,9; salicilato de
sdio 31,2 mM e nitroprussiato de sdio 1,68 mM.

* -Considerando que 0,1ml da soluo de uria, a 8,56%, contem 8,56 g de uria.

-Considerando, ainda, que essa massa do substrato est dissolvida em um volume final
(volume dos reagentes) de 1,4ml.
-Em 1000ml da preparao teremos 6,11mg de uria, cuja massa molecular 60,06 daltons.
-6,11 mg/60,06mg por litro corresponde, aproximadamente, a uma concentrao 0,1mM.
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 8

INIBIO DE REAES CATALISADAS POR ENZIMAS

OBJETIVOS

A realizao desta prtica permite ao aluno:

1- Identificar o efeito de inibidores sobre a velocidade de uma reao enzimtica.
2- Conferir a importncia do grfico duplo recproco, proposto por Lineweaver-Burk,
na identificao do tipo de inibidor de uma reao enzimtica.

INTRODUO

Molculas diferentes do substrato podem interagir com a enzima levando a uma

reduo de sua atividade. O estudo da inibio enzimtica de interesse, porque revela
informaes acerca do mecanismo de ao da enzima. Muitas substncias txicas, incluindo
drogas, expressam sua ao no organismo atravs da inibio de enzimas.
A inibio reversvel descrita pelo equilbrio da interao enzima inibidor. Os
processos de inibio enzimtica podem ser classificados como competitivo e no
competitivo, dependendo da forma como o inibidor age sobre a enzima. O inibidor
competitivo, geralmente tem uma estrutura semelhante do substrato e pode ligar-se ao stio
ativo da enzima, mas no pode ser transformado. Um inibidor no competitivo no se liga no
stio ativo da enzima, mas liga-se em outra regio da molcula enzimtica e impede que a
enzima reconhea o substrato.
Para distinguir cineticamente, os dois processos de inibio enzimtica, aplica-se o
grfico proposto por Lineweaver-Burk aos resultados obtidos experimentalmente. A enzima,
numa concentrao constante, reage com concentraes crescentes do substrato na ausncia
do inibidor e em um segundo experimento a enzima reage com o substrato em concentraes
crescentes na presena do inibidor.

FUNDAMENTO DA PRTICA

A realizao desta prtica muito semelhante anterior. Utilizaremos a enzima urease

(uria amidohidrolase, EC 3.5.1.5), em presena do substrato uria mas utilizaremos
cloreto de mercrio (HgCl2) como inibidor da enzima.

PROCESSO

Identificar sete tubos de ensaio: Branco (B) e mais seis tubos enumerados de 1 a 6 e
seguir a orientao abaixo:

TUBOS GUA INIBIDOR SUBSTRATO (URIA) ENZIMA

DEIONIZADA (HgCl2 0,05%) 8,56mg% 85,6mg% (UREASE)
(268 U/ml)
B 0,4 mL 0,1mL - - 1,0 mL
1 0,3 mL 0,1mL 0,1 mL - 1,0 mL
2 0,2 mL 0,1mL 0,2 mL - 1,0 mL
3 - 0,1mL 0,4 mL - 1,0 mL
4 0,3 mL 0,1mL - 0,1 mL 1,0 mL
5 0,2 mL 0,1mL - 0,2 mL 1,0 mL
6 - 0,1mL - 0,4 mL 1,0 mL
9 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

1- Incubar todos os tubos em banho-maria (BM) a 37C por 5 minutos (esta a reao
enzimtica).
2- Adicionar a cada tubo 1,0 mL da soluo oxidante (hidrxido de sdio 2,8 mM e
hipoclorito de sdio 121 mM), misturar e levar ao BM a 37C por 5 minutos..
3- Ler as absores pticas em 600 nm, utilizando o branco para ajustar o zero do
espectrofotmetro.

CLCULO DA ATIVIDADE ENZIMTICA

Construir um grfico contendo no eixo das abcissas as concentraes do substrato [S]

(0,1; 0,2; 0,4; 1,0; 2,0 e 4,0 mM) e no eixo das ordenadas a leitura das absores (v), deste
experimento e dos valores da prtica anterior.
Construir um novo grfico contendo nos eixo das abcissas 1/[S] e nas ordenadas 1/v.
Calcular KM e Vmx, com os valores obtidos nesta prtica e na prtica anterior.
Com os resultados, definir o tipo de inibio do cloreto de mercrio sobre a urease.
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CONSUMO DE GLICOSE POR CLULAS DE Sacharomyces cerevisiae

OBJETIVOS

1- Demonstrar o consumo de glicose pelas clulas.

2- Determinar os nveis de glicose utilizando uma tcnica espectrofotomtrica.

INTRODUO

S. cerevisiae so organismos unicelulares, pertencentes classe dos ascomicetes

(asco= rgo produtor de esporos) e gnero Sacaromicete, utilizados em larga escala na
produo de lcool e bebidas fermentadas e tambm na panificao. Essas leveduras esto
entre os mais importantes fungos domesticados e metabolizam a glicose gerando etanol e
dixido de carbono. O po assado adquire uma textura suave, devido a formao de bolhas de
dixido de carbono na massa.
Para este experimento poderamos utilizar as hemcias. Nos mamferos, a hemcia
madura no contem ncleo, nem mitocndrias, nem ribossomos e por isso no capaz de
desempenhar as mesmas atividades metablicas das clulas nucleadas. No entanto, o ganho de
energia na hemcia faz-se, fundamentalmente, pela gliclise. Essa energia utilizada na
manuteno das condies osmticas, da forma discide e do ferro no estado ferroso. A
glicose desaparece rapidamente no sangue, quando deixado fora dos vasos sangneos e
nessas condies h um aumento nos nveis de cido lctico.
Na prtica do laboratrio clnico, o sangue colhido para a dosagem de glicose deve ter
o plasma separado imediatamente das hemcias, ou ao sangue total acrescenta-se fluoreto que
um inibidor da enolase, enzima que catalisa a seguinte reao na via glicoltica:

2-fosfoglicerato fosfoenolpiruvato + H2O

Este experimento nos permite avaliar o consumo de glicose, in vitro, medindo a

reduo nos nveis de glicose com o tempo de incubao.

SUSPENSO DE CLULAS DE Sacharomyces cerevisiae

Dissolver 15g de clulas em 100 mL de soluo fisiolgica tamponada, pH 7,4 (PBS).

PROCESSO

Preparar trs tubos de ensaio, identificados com os nmeros 0, 5 e 10, respectivamente e

proceder conforme esquema:
1- Adicionar a cada tubo 0,5mL da suspenso de clulas + 0,2mL da soluo de glicose a
10% + 1,0mL de PBS.
2- Incubar os tubos 5 e 10 em banho-maria a 37o C, por 5 e 10 min, respectivamente.

OBS. Para utilizar o MTODO DE DOSAGEM QUMICA seguir o item 3. Para dosagem
pelo MTODO DE DOSAGEM ENZIMTICA seguir a metodologia, adiante.

3- Transferir alquotas de 0,2 mL (em duplicata) dos tubos 0, 5 e 10 para tubos de centrfuga,
previamente identificados (0a e 0b, 5a e5b, 10a e 10b), contendo 1,8 mL de cido
tricloroactico (TCA), a 10%. Deixar os tubos em repouso por 10 min, agitando-os
11 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

esporadicamente e centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos. Transferir, por decantao, o

sobrenadante para tubos limpos, previamente identificados (0a e 0b, etc), que ser
utilizado na dosagem dos nveis de glicose, pelo mtodo de dosagem qumica.

MTODO PARA DOSAGEM DE GLICOSE

1 Mtodo de dosagem qumica

Fundamento - O grupamento amino da orto-toluidina reage com o grupamento aldedo da

glicose, em soluo de cido actico glacial a quente e d origem a um composto de cor
verde, estvel. A intensidade de cor proporcional concentrao de glicose na amostra e sua
estabilidade depende do equilbrio entre uma glicosilamina (-NH-CHOH-) e a base de Schiff
(-N=CH-) correspondente.

Soluo padro de glicose - 100mg de glicose em 100 mL de soluo. Para a dosagem diluir
a soluo padro 1:10 com gua destilada.

Dosagem de glicose - Identificar nove tubos (B, P1, P2, 0a, 0b, 5a, 5b, 10a e 10b) - Branco,
Padres e Testes.
Transferir 1 mL de cada sobrenadante lmpido para os respectivos tubos de ensaio
previamente identificados.
Adicionar a cada tubo:
TUBO SOLUO TESTES GUA REAGENTE DA
PADRO DILUDA (0a, 0b, 5a, 5b, DESTILADA ORTO-TOLUIDINA
10a e 10b)
Padres 1 mL - - 3,5 mL
Testes - 1 mL - 3,5 mL
Branco - - 1 mL 3,5 mL

Aquecer os tubos em banho-maria fervente por 10 minutos e resfri-los em gua

corrente.
Ler as densidades pticas (DO) da soluo em cada tubo, no espectrofotmetro em
630 nm. Ajustar o zero do aparelho com o Branco.
Calcular a concentrao de glicose em cada amostra e expressar os valores em mg%.
Construir um grfico das DO em funo do tempo de incubao.

CONCLUSES:

2- Mtodo de dosagem enzimtica

Fundamento - Duas enzimas esto envolvidas neste processo: glicose oxidase, que age sobre
a glicose e gera cido glicnico e perxido de hidrognio. E peroxidase, que utiliza o
perxido de hidrognio como agente oxidante para transformar 4-aminoantipirina e fenol em
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 12

antipirilquinonimina e gua. Antipirilquinonimina um composto colorido que absorve em

505 nm. A intensidade de cor proporcional quantidade de perxido de hidrognio gerado
na primeira reao.

Dosagem de glicose - Identificar nove tubos (B, P1, P2, 0a, 0b, 5a, 5b, 10a e 10b) - Branco,
Padres e Testes.
Transferir alquotas de 0,05 mL para os respectivos tubos de ensaio previamente identificados:

TUBO SOLUO TESTES GUA REAGENTE

PADRO (100mg (0a, 0b, 5a, 5b, DESTILADA
%) 10a e 10b)
Padres 0,05 mL - - 2,5 mL
Testes - 0,05 mL - 2,5 mL
Branco - - 0,05 mL 2,5 mL
Misturar e incubar em banho-maria a 37C durante 15 minutos.
O nvel de gua do banho deve ser superior ao nvel da mistura em cada tubo de
ensaio.
Ler as densidades pticas (DO) da soluo em cada tubo, no espectrofotmetro em
505 nm. Ajustar o zero do aparelho com o Branco.
Calcular a concentrao de glicose em cada amostra e expressar os valores em mg%.
Construir um grfico das concentraes de glicose em funo do tempo de incubao.

CONCLUSES:
13 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

DOSAGEM DE PERXIDOS DE LIPDEOS

OBJETIVOS

A realizao desta prtica permite ao aluno determinar os nveis de substncias que

reagem com o cido tiobarbitrico em clulas de Sacharomyces cerevisiae e avaliar o grau da
peroxidao dos lipdeos.

INTRODUO

A peroxidao de lipdeos um processo complexo onde cidos graxos insaturados e

outros lipdeos so oxidados por ao dos radicais livres. Para entender a reatividade destas
espcies qumicas, devemos lembrar que os eltrons, nas molculas, geralmente se renem em
pares. Na molcula de gua, por exemplo, o oxignio se apresenta rodeado por quatro pares
de eltrons; dois pares se ligam fracamente em unies OH e dois pares no esto ligados:

Para descrever completamente um eltron em um tomo devemos considerar, alm dos

seus nmeros qunticos n (principal), l (secundrio) e ml, um quarto nmero quntico ms,
chamado nmero quntico de spin; que est associado com a rotao do eltron em torno do
seu prprio eixo e pode ter um dos dois valores possveis: + ou - , dependendo da direo
da rotao do eltron. Dois eltrons em um mesmo orbital com valores de ms + ou - so
ditos emparelhados. Um par eletrnico mais estvel do que os eltrons isolados, uma
vez que, aparentemente, dois eltrons com spins opostos tm seus campos magnticos
recprocos anulados.
Radicais livres podem ser definidos como tomos, molculas ou fragmento molecular
com, pelo menos, um eltron desemparelhado. A presena do eltron desemparelhado, em
geral, confere ao radical livre alta reatividade qumica e, ainda, certas propriedades como
caractersticas paramagnticas. Para restaurar sua estabilidade estas espcies qumicas tendem
a retirar um eltron de outra substncia ou doar o seu eltron desemparelhado. Com isso
podem gerar novos radicais livres, numa reao em cadeia.
No organismo vivo a produo de radicais livres permanente, mas esta produo est
associada ao metabolismo celular do oxignio e s reaes de xido-reduo. Entre as fontes
geradoras de radicais livres destacam-se:

A cadeia respiratria mitocondrial - A mitocndria considerada a casa de fora da

clula, a se encontra um complexo sistema de transferncia de eltrons, conhecido como
Cadeia Transportadora de Eltrons (CTE). A funo deste sistema reduzir o oxignio ao
mesmo tempo em que gera energia, que armazenada sob a forma de ATP. Embora os
eltrons sejam transferidos aos pares, os citocromos integrantes da CTE s transferem um
eltron de cada vez. Quando uma molcula de oxignio recebe um eltron transformada no
nion superxido (O2-.) - um radical livre. Cerca de 5% do nion superxido, gerado no
processo de reduo do oxignio, pode ser liberado da CTE e, por dismutao, gera perxido
de hidrognio (H2O2).
Os radicais livres derivados da reduo do oxignio so os produtos fisiolgicos
potencialmente mais perigosos, gerados a partir da respirao celular.
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 14

A fagocitose - Em estado de repouso os neutrfilos consomem pouco oxignio. Em

contato com partculas a serem fagocitadas, eles produzem uma invaginao de sua
membrana, encerrando assim o material a destruir (fagossoma), isolando-o do citoplasma.
Essa estimulao dos neutrfilos acompanhada de uma acelerao no consumo de oxignio
(choque respiratrio), com ativao de uma enzima de membrana - a NADPH-oxidase - que
catalisa a reduo do oxignio, gerando o nion superxido, que por dismutao gera
perxido de hidrognio.
Estes dois agentes oxidantes (O2-. e H2O2) participam da produo de espcies
qumicas ativas, como o radical hidroxil (OH.) e na liberao de hipoclorito e de cloraminas,
sob a influncia de uma enzima leucocitria, a mieloperoxidase. Este conjunto de reagentes
agressivos (nion superxido, perxido de hidrognio, hipoclorito e cloraminas) liberados nos
fagossomas so responsveis pela destruio do material fagocitado. Na ausncia de NADPH-
oxidase, a atividade fagocitria torna-se diminuda ou mesmo abolida.

As reaes de desintoxicao - Os peroxissomos so organelas celulares que

desempenham um papel importante na desintoxicao de numerosas molculas. Uma
variedade de substncias txicas so absorvidas com freqncia atravs do trato
gastrointestinal, ou so produzidas a partir do metabolismo celular. Estas substncias podem
sofrer modificaes em sua estrutura qumica (o processo de desintoxicao) e em seguida
devem ser excretadas, sobre tudo, pela urina.
Os mecanismos de desintoxicao utilizados no fgado so diversificados, envolvendo
oxidao, reduo, hidrlise, conjugao, ou uma combinao destes mecanismos. Em geral,
a oxidao o primeiro dos mecanismos utilizados, seguido s vezes de reao de
conjugao.
A desintoxicao por oxidao, implica na hidroxilao, que catalisada por um
sistema oxidase de funo mista presente nos peroxissomos. Este sistema constitudo de
uma hidroxilase, citocromos P450, NADPH, ferredoxina e FAD. Neste sistema o citocromo P 450
transfere um eltron, de cada vez, para o oxignio molecular, o que favorece a produo de
nions superxido e perxido de hidrognio. Este ltimo desdobrado a gua e oxignio pela
catalase, presente nessas organelas.

A sntese de prostaglandinas - As prostaglandinas, como a prostaciclina e o tromboxano

A2, tm sua origem no cido araqidnico, liberado dos fosfolipdeos integrantes de
membrana, por ao da fosfolipase A2.
Os radicais hidroxil so gerados no processo de sntese das prostaglandinas, na fase de
transformao do cido araqidnico a endoperxidos, por ao da ciclooxigenase.
Estes radicais livres intervm secundariamente sobre a cascata do cido araqidnico,
inibindo a ciclooxigenase e promovendo a via metablica pr-agregante do tromboxano A2
sobre a via anti-agregante e vasodilatadora da prostaciclina.

As radiaes - Raios gama e raios-X so exemplos de radiaes ionizantes. Quando uma

molcula colide com essas radiaes absorve energia e pode emitir eltrons com alto nvel
energtico.
O material celular est fundamentalmente distribudo em uma fase aquosa. A
transferncia da energia para a molcula de gua excita os eltrons constituintes e gera uma
molcula de gua excitada (com um excedente de energia, comparada com sua energia
normal). A conseqncia mais provvel deste evento uma ionizao, como segue:
(1) H2O H2O+ + e-
(2) H2O+ + H2O H2O+ + OH.
15 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

ambas as espcies (H2O+ e OH.) tm um eltron desemparelhado, so radicais livres e por isso
so espcies extremamente reativas. Outras espcies reativas podem ser geradas.
O eltron da reao (1) - eltron hidratado - pode reagir com oxignio presente na
clula e gerar nion superxido. Admite-se que cerca de 10 -5 segundo o tempo decorrido
entre a ao inicial dos radicais sobre os constituintes em uma soluo e a formao de
produtos. Vale ressaltar, no entanto, que essas espcies reativas tm um tempo de ao muito
curto. Eltrons produzidos na reao (1) perdem sua energia para as espcies qumicas do
meio, em uma escala de tempo da ordem de 10-13 a 10-11 segundo.
Quando uma molcula absorve um fton de luz ultravioleta, cuja energia inferior
sua energia de ionizao, ela dever se excitar. Se a energia armazenada for suficiente, pode
haver ruptura de ligaes e produo de radicais livres por diversos mecanismos.
Os tecidos mais suscetveis ao efeito dessas radiaes so a pele e sobretudo os olhos,
devido sua exposio direta e intensidade de seu metabolismo. De forma geral, os radicais
livres exercem vrios efeitos citotxicos, envolvendo, virtualmente todos os componentes
celulares. So capazes de promover eventual destruio de estruturas e tecidos, causando
doenas genticas, gentico ambientais e ambientais, a exemplo da arteriosclerose,
hipertenso, cncer, osteoartrite, entre outras, alm da liberao de uma variedade de produtos
de degradao como cetonas, lcoois, aldedos e steres, propagando-se pela circulao. As
membranas biolgicas de um modo geral, oferecem um rico meio para o ataque peroxidativo
que interfere na integridade das clulas.
Malondialdedo (MDA), formado a partir da quebra de cidos graxos poliinsaturados,
identificado como o principal produto da peroxidao de lipdeos e serve como ndice
determinante da extenso da reao peroxidativa. O MDA reage com o cido tiobarbitrico
(TBA) produzindo um pigmento de cor avermelhada que absorve em comprimento de onda de
535 nm. O pigmento formado resultado da condensao de 2 moles de TBA com 1 mol de
MDA. Esta reao no especfica para quantificar MDA, uma vez que existem outras
substncias que reagem com o TBA (TBARS), mas vem sendo amplamente utilizada para
avaliar o grau de peroxidao de lipdeos.

DOSAGEM DE TBARS

Mtodo de Buege JA & Aust SD (Methods in Enzymology 52:302-310, 1978)

REAGENTE: Soluo de TBA 0,375% em cido tricloroactico (TCA) a 15%

PROCESSO:

Identificar quatro tubos de ensaio: 0, 5, 10 e 20.

A cada tubo adicionar 1,0 mL de suspenso de clulas de S. cerevisiae.
Incubar os tubos respectivos por 5, 10 e 20 minutos a 37o C e em seguida transferir o
contedo de cada tubo para tubo de centrfuga contendo 1,0 mL de TCA a 30%.
A suspenso do tubo 0 no ser incubada a 37 C, mas deve ser transferida para tubo de
centrfuga contendo 1,0 mL de TCA a 30%.
Depois de transferir as amostras para tubos de centrfuga contendo TCA a 30% Deixa-las em
repouso por um tempo mnimo de10 min, misturando esporadicamente.
Centrifugar todos os tubos a 3000 rpm por 5 min e transferir o sobrenadante lmpido para
tubos previamente identificados: 0, 5, 10 e 20.
Preparar mais dois tubos (Branco e Padro). Ao Branco adicionar 1,0 mL de gua destilada e
ao Padro, 0,1 mL da soluo padro de MDA (32,12nmol/mL) + 0,9 de gua destilada.
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 16

Adicionar a todos os tubos 2,0 mL da soluo reagente, agitar e levar ao banho fervente por
15 min.
Esfriar os tubos em gua corrente e fazer a leitura da absoro ptica em 535nm.
Calcular a concentrao (M) de TBARS em cada experimento, considerando que:

Massa do padro (3,212nmol) DOpadro

Massa da amostra ( x nmol ) DOamostra
0,9 ml de suspenso de S. cereviseae x nmol de TBARS

Lanar os resultados em um grfico (concentrao vs tempo) e comparar com os resultados

obtidos no prximo experimento.
OBS.: DO Densidade ptica
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EFEITO DA GLICOSE SOBRE A PEROXIDAO DE LIPDEOS

OBJETIVOS

1- Reconhecer o malondialdedo como produto da peroxidao dos lipdeos.

2- Identificar o efeito da glicose sobre a peroxidao dos lipdeos.

INTRODUO

Malondialdedo (MDA) um produto da peroxidao dos lipdeos nos diversos

tecidos e est presente no plasma sangneo. Pesquisas tm mostrado que os nveis de MDA
plasmtico aumentam com a idade. Esse composto muito reativo e tem grande afinidade por
grupamentos amino, o que pode favorecer sua ligao com as protenas da membrana das
clulas, comprometendo sua perfeita funo. Na prtica anterior pudemos acompanhar a
produo de perxidos de lipdeos medindo os nveis de TBARS em clulas de S. cerevisiae
submetidas ao estresse oxidativo. Nesta prtica vamos avaliar os nveis de TBARS em clulas
de S. cerevisiae com suprimento de glicose, como fonte de energia.

PROCESSO

Identificar quatro tubos de ensaio: 0, 5, 10 e 20.

A cada tubo adicionar 0,9 mL de suspenso de clulas de S. cerevisiae + 0,1 mL da soluo de
glicose a 10%.
Incubar os tubos respectivos por 5, 10 e 20 minutos a 37o C e em seguida transferir o
contedo de cada tubo para tubo de centrfuga contendo 1,0 mL de TCA a 30%.
A suspenso do tubo 0 no ser incubada a 37 C, mas deve ser transferida para tubo de
centrfuga contendo 1,0 mL de TCA a 10%.
Depois de transferir as amostras para tubos de centrfuga contendo TCA a 10% Deixa-las em
repouso por um tempo mnimo de10 min, misturando esporadicamente.
Centrifugar todos os tubos a 3000 rpm por 5 min e transferir o sobrenadante lmpido para
tubos previamente identificados: 0, 5, 10 e 20.
Preparar mais dois tubos (Branco e Padro). Ao Branco adicionar 1,0 mL de gua destilada e
ao Padro, 0,1 mL da soluo padro de MDA + 0,9 de gua destilada.
Adicionar a todos os tubos 2,0 mL da soluo reagente, agitar e levar ao banho fervente por
15 min.
Esfriar os tubos em gua corrente e fazer a leitura da absoro ptica em 535nm.
Calcular a concentrao (M) de TBARS em cada experimento, considerando que:

Massa do padro (3,212nmol) DOpadro

Massa da amostra ( x nmol ) DOamostra
0,9 ml de suspenso de S. cereviseae x nmol de TBARS

Lanar os resultados em um grfico (concentrao vs tempo) e comparar com os resultados

obtidos no experimento anterior.

CONCLUSES:
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 18

HIDRLISE DE PROTENAS

OBJETIVOS
1- Identificar os aminocidos como unidade fundamental das protenas
2- Acompanhar a hidrlise de protenas por aquecimento em meio cido.

INTRODUO

Todas as protenas na natureza tm como unidade fundamental vinte -aminocidos e

so construdas atravs de ligaes amida entre estes aminocidos. Quando isolados das
protenas os aminocidos apresentam caractersticas estruturais comuns, qual seja um grupo
carboxila e um grupo amino ligados ao carbono . O que distingue estes compostos quanto s
suas caractersticas fsicas, qumicas e biolgicas o grupo R, lateral, que nico para cada
aminocido. fundamental que se estabelea mtodos prticos usados na separao e
identificao destes compostos, uma vez que a estrutura e funes biolgicas de uma protena
depende do seu contedo em aminocidos.
Quando protenas so aquecidas em um meio aquoso, cido ou bsico, as ligaes
amida sofrem hidrlise liberando os aminocidos constituintes, cuja identificao implica no
conhecimento de suas propriedades fsico-qumicas. importante relembrar que estas
substncias so anfotricas, ou seja, podem agir como cido de Brnsted (doadoras de
prtons) ou como base de Brnsted (aceptoras de prtons) - reaes 1 e 2.

H3N+CH(R)COOH <===> H3N+CH(R)COO- (Reao 1)

I II

H3N+CH(R)COO- <===> H2NCH(R)COO- (Reao 2)

II III

A forma zwiterinica (II) produzida pela dissociao do prton em I (Reao 1) e essa

forma pode tambm sofrer dissociao de um prton e gerar o nion III.
Cada reao inica definida por uma constante de ionizao, Ka e um pKa (-log Ka).
Todos os grupos -carboxlicos dos 20 aminocidos tm valores de pKa prximos, mas
diferentes (pKa 2 a 3), o mesmo se observa para os grupos -amino (pKa 9 a 10). O valor
do pKa de um aminocido representa o pH no qual as duas formas inicas esto presentes em
concentraes iguais. Alguns aminocidos apresentam grupos ionizveis na cadeia R lateral.
Os grupos cidos ou bsicos extras, lgico, aumentam a complexidade das reaes cido-
base dos aminocidos, o que garante maior resoluo na anlise destes compostos em uma
mistura.
O primeiro passo na caracterizao de uma protena isolada e purificada a
determinao da composio de seus aminocidos. Ela hidrolisada e a mistura de
aminocidos livres submetida anlise qualitativa e quantitativa. A hidrlise de uma
protena em meio cido ou bsico no leva a resultados ideais, uma vez que ambos os
mtodos tendem a destruir alguns aminocidos. A hidrlise cida destri triptofano, causa
alguma perda de serina e treonina e converte asparagina e glutamina em cido asprtico e
19 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

glutmico, respectivamente. A hidrlise em meio bsico leva destruio de serina, treonina e

racemizao de aminocidos livres. A hidrlise cida mais utilizada, por ser um mtodo que
apresenta menor ndice de destruio.
O processo de hidrlise consiste em dissolver a amostra de protena em uma soluo
aquosa cida (normalmente HCl 6N) e aquecer a soluo a 110C por 12 a 15 h, ou mant-la
temperatura ambiente por uma semana. O intervalo de tempo necessrio para a hidrlise
depende da natureza dos resduos de aminocidos. Para separao e identificao dos
aminocidos, as tcnicas mais versteis, econmicas e convenientes so baseadas em mtodos
cromatogrficos. A anlise qualitativa dos aminocidos pode ser feita por cromatografia em
papel, em camada fina de slica gel ou celulose, no entanto muitas tcnicas mais sensveis so
utilizadas atualmente. Os aminocidos livres so detectados na placa ou papel, em que foi
desenvolvido o cromatograma, atravs da reao com ninhidrina. O aminocido prolina
desenvolve uma cor amarela, enquanto os demais aminocidos desenvolvem uma cor violeta.

FUNDAMENTO DA PRTICA

Em nosso experimento iremos acompanhar o processo de hidrlise protica, medindo

os nveis de aminocidos liberados atravs da reao com hidrxido de sdio. As protenas
sero precipitadas com cido tricloroactico (TCA) enquanto os aminocidos livres, no
sobrenadante, reagem com NaOH, formando um composto de colorao castanha, que
absorve em 440 nm (Leigton et al. Journal Molecular Biology, 76:103-122, 1973).

PROCESSO
A- Preparao da soluo de ovoalbumina (soluo A):

Dissolver 3 ml de clara de ovo com 17 ml de gua destilada, em um Erlenmeyer e

adicionar 5,0 ml de HCl concentrado. Misturar.

B- Hidrlise cida com aquecimento:

1- Transferir alquotas de 3 ml da soluo de ovoalbumina para cinco tubos de

ensaio. Levar os tubos ao banho-maria fervente e aps 20, 30, 40 e 50 min, transferir o
contedo dos tubos de ensaio (um a cada perodo de tempo) para tubos de centrfuga,
previamente identificados (20, 30, 40 e 50), contendo 0,5 ml de TCA a 30%. Agitar e deixar
em repouso por um mnimo de10 minutos.
2- Centrifugar o contedo de cada tubo, transferir 1,5 ml do sobrenadante para tubos
de ensaio, previamente identificados, e ao tubo branco adicionar 1,5 ml de gua destilada.
3- No final adicionar ao contedo de cada tubo de ensaio, 3 ml da soluo de
hidrxido de sdio 1 M.
4- Ler a densidade ptica (DO) em 440 nm, nos diversos tubos. Ajustando o zero do
espectrofotmetro com o branco.
5- Construir um grfico da DO em funo do tempo.
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 20

DOSAGEM DE URIA

OBJETIVOS

1- Identificar a uria como o principal produto de excreo de amnia.

2- Reconhecer a enzima urease como um reagente para anlises bioqumicas.
3- Descrever os mtodos mais comumente utilizados para a determinao de uria.
4- Descrever o fundamento do mtodo utilizado neste experimento.
5- Determinar os nveis de uria no soro sangneo.
6- Identificar as causas que geram o aumento nos nveis plasmticos de uria.

INTRODUO

A uria formada no fgado a partir de amnia produzida em todos os tecidos, como

produto final do catabolismo protico. A uria representa a maior frao de substncias
orgnicas presentes na urina e cerca de 80% do nitrognio no protico excretado na urina,
em condies normais.
Existem vrios mtodos utilizados na determinao de uria. Entre eles destacamos:
a) A utilizao de xantidrol em mtodos gravimtricos, colorimtricos, oxidimtricos.
b) A determinao de nitrognio pelo mtodo de Kjeldahl.
c) Determinao colorimtrica utilizando reagentes como diacetil-monoxima, dimetil-
glioxima ou p-dimetil-amino-benzaldedo.
d) Determinao enzimtica utilizando urease (uria amidohidrolase, EC 3.5.1.5). A
hidrlise enzimtica da uria gera amnia (NH 3) e bixido de carbono (CO 2). Este pode ser
dosado por gasometria, enquanto a amnia pode ser quantificada: i) por titulometria, com o
reagente de Nessler; ii) enzimaticamente, com glutamato desidrogenase; iii) atravs da reao
de Berthelot.

FUNDAMENTO DA PRTICA
Utilizaremos a reao de Berthelot para quantificar a amnia formada por ao da
urease sobre a uria, presente no soro sangneo. Cada molcula de amnia reage com duas
molculas do derivado fenlico (salicilato) na presena de hipoclorito de sdio, em meio
alcalino, para formar indofenol, composto de cor azul. A intensidade de cor da reao
proporcional concentrao de amnia.

PROCESSO
Em um tubo de ensaio diluir 0,1 mL de soro com 0,9 mL de soluo salina.
Marcar cinco tubos de ensaio: Branco, Padro(2) e Teste(2) e adicionar a cada um:

TUBOS URIA (70mg%) SORO ENZIMA (UREASE)

(268 U/ml)
Branco - - 1,0 mL
Padro (2) 0,05 mL - 1,0 mL
Teste (2) - 0,05 mL 1,0 mL

1- Incubar todos os tubos em banho-maria (BM) a 37C por 5 minutos (esta a reao
enzimtica).
2- Adicionar a cada tubo 1,0 mL da soluo oxidante (hidrxido de sdio 2,8 mM e
hipoclorito de sdio 121 mM), misturar e levar ao BM a 37C por 5 minutos..
21 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

3- Ler as absores pticas em 600 nm, utilizando o branco para ajustar o zero do
espectrofotmetro.

CLCULO

Podemos calcular a concentrao de uria no soro - expressa em mg% - atravs da

frmula:

Concentrao de uria (mg%) = LT / LP x 70

LT - Leitura do Teste
LP - Leitura do Padro

CONSIDERAES SOBRE O MTODO

1- O mtodo enzimtico para dosagem de uria apresenta um alto ndice de confiana,

uma vez que a urease reage especificamente com a uria.
2- A reao de Berthelot um mtodo de dosagem de amnia sensvel e acurado.
3- A amostra de soro ou plasma deve ser utilizada to logo tenha sido coletada. Para
obteno do plasma no devem ser utilizados anticoagulantes contendo sais de amnia, por
motivos bvios e fluoretos, porque inibem a urease.

IMPORTNCIA CLNICA

Os nveis plasmticos de uria so utilizados em conjunto com os nveis de creatinina

como auxiliar no diagnstico diferencial de hiperuremia pr-renal e ps-renal.
Entre as causas pr-renais responsveis pelo aumento de uria no plasma esto a
descompensao cardaca, desidratao, aumento no catabolismo de protenas. Entre as causas
renais destacam-se nefrite crnica, necrose tubular, glomerulonefrite aguda ou crnica. As
causas ps-renais so qualquer tipo de obstruo do trato urinrio (clculos, dilatao da
glndula prosttica, tumores).
Os nveis de uria se encontram reduzidos na insuficincia heptica aguda, com leses
muito extensas. No ltimo trimestre da gravidez tambm se observa uma diminuio nos
nveis de uria.

Valores normais: 10 a 50 mg de uria por 100 mL de plasma.

Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 22

ESTUDOS DIRIGIDOS

Cintica de Reaes Catalisadas por Enzimas

01- Qual a importncia das enzimas nos organismos vivos?

02- Como possvel avaliar a concentrao de uma enzima em tecido ou fluido biolgico?
03- Explique porque a medida da atividade enzimtica no corresponde necessariamente
concentrao real da enzima.
04- Qual a importncia dos parmetros Vmx e KM, na caracterizao de uma enzima?
05- D exemplos da aplicao clnica das enzimas.
06- Explique como foi possvel acompanhar a velocidade da reao enzimtica, na prtica.
07- Com os dados obtidos na prtica sobre enzimas, demonstre como cresce a velocidade de
uma reao enzimtica com o aumento da concentrao do substrato e calcule K M e Vmx
da enzima.

Inibio de Reaes Catalisadas por Enzimas

1- Qual a importncia de analisarmos o efeito de inibidores sobre reaes enzimticas?

2- O que distingue o efeito de um inibidor competitivo daquele no competitivo?
3- Como possvel distinguir, experimentalmente, um inibidor competitivo de um no
competitivo?
4- Com os dados obtidos na prtica, demonstre o tipo de inibio em que se enquadra o
cloreto de mercrio, em relao urease.

Consumo De Glicose por clulas de Sacharomyces cerevisiae

5- Explique porque a via glicoltica importante para as hemcias.

02- Porque importante separar o plasma dos elementos figurados do sangue, o mais rpido
possvel, quando se pretende dosar os nveis plasmticos de glicose?
03- Qual a opo, quando no h condies de separar o plasma dos elementos figurados de
imediato?
6- Explique como foi possvel acompanhar o consumo de glicose pelas clulas de
Sacharomyces cerevisiae.
7- Com os resultados obtidos na prtica calcule a concentrao de glicose, em mg%,
construa um grfico das concentraes em funo do tempo de incubao e explique
porque os resultados foram diferentes.

Dosagem de Perxidos de Lipdeos

01- O que so radicais livres e qual a ao dessas espcies qumicas no organismo vivo?
02- Fale sobre trs fontes geradoras de radicais livres no organismo vivo.
23 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

03- Como explicar a ao danosa da luz ultravioleta sobre a pele?

04- Explique como foi possvel determinar os nveis de perxidos de lipdeos no plasma.
05- Com os resultados obtidos na prtica calcule a concentrao de perxidos de lipdeos
plasmticos, referidos como nveis de TBARS em M e construa um grfico da
concentrao em funo do tempo de incubao das clulas de S. cerevisiae.

Efeito da Glicose Sobre a Peroxidao de Lipdeos

1- Como gerado, no organismo vivo, o malondialdedo (MDA)?

2- Por que um aumento de MDA no plasma pode comprometer a atividade biolgica das
protenas?
3- Qual o efeito prtico na determinao do efeito da glicose sobre a peroxidao de
lipdeos?
4- Com os resultados obtidos nesta prtica e aqueles obtidos na prtica anterior demonstre,
graficamente, o efeito da glicose sobre os nveis de TBARS medidos nas clulas.

Hidrlise de Protenas

01- Porque importante conhecermos a seqncia dos aminocidos constituintes de uma

protena?
02- O que acontece com as protenas quando so aquecidas em um meio aquoso, cido ou
bsico?
03- Conceitue pKa e fale sobre a importncia desta constante na anlise dos aminocidos em
uma mistura.
04- Explique como foi possvel acompanhar o processo de hidrlise protica.
05- Com os resultados obtidos na prtica demonstre, atravs de um grfico, o aumento na
concentrao dos aminocidos livres com o tempo.

Dosagem de Uria no Soro Sangneo

01- Fale sobre a origem da uria no organismo e sobre sua importncia.

02- Relacione trs mtodos utilizados na dosagem de uria, destacando o mais preciso entre
eles.
03- Qual o fundamento da reao de Berthelot e qual a sua aplicao?
04- Com os dados obtidos na prtica calcule a concentrao de uria e comente o resultado.
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 24
05- Fale sobre a importncia clnica da dosagem plasmtica de uria.

PAINEL DIRIGIDO
INTEGRAO E REGULAO METABLICA

Metabolismo o conjunto total das transformaes das molculas dos nutrientes

orgnicos nas clulas vivas. Atravs dessas transformaes, catalisadas por enzimas,
extrada a energia qumica das molculas dos nutrientes, que utilizada na realizao do
trabalho celular.
Os organismos vivos podem ser divididos em dois grandes grupos: Os seres
autotrficos (que se alimentam por si mesmos) podem utilizar o dixido de carbono da
atmosfera como nica fonte de carbono e produzir todas as biomolculas essenciais vida. Os
seres hetertrofos (que se alimentam s custas de outros) necessitam obter os tomos de
carbono do meio ambiente na forma de molculas orgnicas relativamente complexas.
Alm das fontes de carbono, oxignio e energia, todos os organismos vivos necessitam
de uma fonte de nitrognio, necessrio para a sntese dos compostos nitrogenados, como os
aminocidos, as bases pricas e pirimdicas, etc.
O metabolismo pode ser entendido, ainda, como o conjunto das diversas vias
metablicas, resultado da ao de seqncias multienzimticas que, individualmente,
catalisam os passos sucessivos dessas vias. As seqncias especficas de intermedirios
envolvidos nas vias do metabolismo celular designado freqentemente como metabolismo
intermedirio. A transformao dos nutrientes, como carboidratos, protenas e lipdeos; em
estruturas mais simples, como CO2 e H2O chamada de catabolismo. Este um processo de
degradao dos nutrientes, acompanhado pela liberao da energia livre inerente estrutura
complexa das molculas orgnicas. As vias catablicas geram energia e convergem para
poucos produtos finais.
O processo de sntese de macromolculas, como protenas e cidos nucleicos, a partir
de pequenas molculas precursoras (as unidades fundamentais) conhecido como
anabolismo ou biossntese. As vias anablicas envolvem consumo de energia e divergem para
a formao de muitos produtos diferentes.

Figura 1 Produo de energia no catabolismo e sua

utilizao no anabolismo celular
25 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

A Figura 1 mostra que h, na clula, um ciclo energtico em que o ATP serve como elo
de transporte de energia qumica, favorecendo uma unio entre o catabolismo e o anabolismo.
Um outro elo importante entre estes dois processos metablicos o NADPH, que transporta
energia na forma de fora redutora. Com isso possvel entender que a estratgia do
metabolismo formar ATP, poder redutor e unidades fundamentais para os processos de
biossntese.
No metabolismo celular existe um intrincado sistema de regulao, de tal forma que a
liberao de energia nos processos catablicos controlada pelas necessidades celulares de
energia na forma de ATP e de NADPH, e no pela simples disponibilidade dos nutrientes.
A regulao do metabolismo ocorre de vrias formas:

1 Compartimentao A clula est dividida em compartimentos, separados uns dos

outros por membranas. Alguns processos metablicos como a gliclise, a via pentose fosfato,
a sntese dos cidos graxos ocorrem no citossol. Outros processos ocorrem na mitocndria,
como acontece com oxidao dos cidos graxos, as reaes do ciclo do cido ctrico e a
fosforilao oxidativa. Existem ainda aqueles processos que dependem da interao de
reaes que ocorrem em ambos os compartimentos, como a gliconeognese, a sntese de
uria. Com isso a utilizao de um determinado nutriente pela clula vai depender do
compartimento em que essa molcula se encontra. A separao entre as vias de sntese e as
vias de degradao de fundamental importncia para a regulao do metabolismo.
2 Disponibilidade de substrato Com freqncia, a concentrao do substrato
comanda direta ou indiretamente a velocidade de determinados processos. Embora muitas
vezes seja ignorada a importncia do suprimento de substrato como um fator de regulao do
metabolismo, a concentrao de cidos graxos do sangue que entra no fgado um fator
determinante da velocidade da cetognese. Gordura sintetizada em excesso quando ocorre o
consumo excessivo de substratos que contribuem para a lipognese. Por outro lado, a ingesto
deficiente de substratos glicognicos (principalmente alanina) podem gerar hipoglicemia na
gravidez ou no jejum prolongado.
3 Efetores alostricos A primeira reao essencialmente irreversvel em uma via
metablica quase sempre fortemente regulada. As enzimas que catalisam estas reaes so
reguladas alostericamente. A quantidade e a atividade dessas enzimas vo determinar o fluxo
de molculas na maioria das vias metablicas. Na via glicoltica, frutose 2,6-bisfostato
estimula a fosfofrutocinase e inibe a frutose 1,6-bisfosfatase, dessa forma estimula a gliclise
ao mesmo tempo em que inibe a gliconeognese. Nveis elevados de ADP estimulam a
atividade da isocitrato desidrogenase, no ciclo do cido ctrico. O citrato ativa a acetil CoA
carboxilase, estimulando a sntese de malonil CoA, na via de sntese de cidos graxos. O
aumento nos nveis de malonil CoA inibe a carnitina aciltransferase I, interrompendo a
oxidao de cidos graxos.
4 Modificao covalente Algumas enzimas quando so fosforiladas mudam sua
conformao e sua atividade. A glicognio fosforilase, por exemplo, quando fosforilada tem a
sua atividade cataltica aumentada, enquanto a glicognio sintase fosforilada tem a sua
atividade diminuda. Essas modificaes covalentes so catalisadas por enzimas especficas.
Entre as enzimas que sofrem regulao pela fosforilao reversvel, podemos citar ainda:
piruvato cinase, lipase sensvel a hormnio, fenilalanina hidroxilase, frutose 2,6-bisfosfatase.
5 Nveis de enzimas A mudana nos nveis enzimticos um mecanismo de
regulao que envolve mudanas da velocidade de sntese ou de degradao de enzimas
chaves. Entre essas enzimas est a glicocinase, fosfrutocinase, piruvato cinase, glicose 6-
fosfatase, frutose 1,6-bisfosfatase.
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6 Especializao metablica dos rgos A existncia de rgos com diferentes

caractersticas, afeta consideravelmente a regulao do metabolismo. Nem todas as principais
vias metablicas operam em todos os tecidos em um determinado momento.

Estas formas de regulao do metabolismo evidenciam o papel preponderante das

enzimas. Mas vale ressaltar a relevncia dos hormnios, como moduladores da velocidade de
uma grande variedade de reaes bioqumicas e vias metablicas.
A Figura 2 apresenta um esquema relacionando s principais vias metablicas e o local
onde elas ocorrem na clula. Os fatores que dirigem o fluxo das molculas no metabolismo
podem ser melhor compreendidos pelo exame de trs importantes junes metablicas:
glicose-6-fosfato, piruvato e acetil CoA. Cada uma dessas molculas tm diversos destinos
mas esto interrelacionadas:
A Glicose-6-fosfato pode ser armazenada como glicognio, degradada a
piruvato, gerando ATP, ou transformada em ribose 5-fosfato, para sntese de nucleotdeos,
com a produo concomitante de NADPH. Por outro lado, glicose 6-fosfato pode ser formada
pela mobilizao do glicognio ou pode ser sintetizada a partir de piruvato e aminocidos
glicognicos pela via da gliconeognese.

Figura 2 Uma viso esquemtica da compartimentao das

principais vias metablicas

O Piruvato primariamente derivado da glicose 6-fosfato, alanina e lactato. A

fcil reduo do piruvato, catalisada pela lactato desidrogenase, serve para regenerar NAD +,
permitindo que a gliclise prossiga temporariamente em condies anaerbicas. O lactato
acumulado nos msculos transferido para o fgado e sofre oxidao. Uma outra reao
reversvel no citossol a reao de transaminao do piruvato gerando alanina, o que garante
um elo de ligao entre o metabolismo de aminocidos e de carboidratos. Alm da alanina,
outros aminocidos podem ser convertidos em piruvato. Oxaloacetato, produto da
carboxilao do piruvato, pode ser transformado em fosfoenolpiruvato e, por isso, permite que
a glicose seja sintetizada a partir de piruvato.
Acetil CoA produzido em maior quantidade pela descarboxilao oxidativa do
piruvato e pela -oxidao dos cidos graxos. Esse composto pode ser totalmente oxidado a
CO2 e H2O, atravs das reaes do ciclo do cido ctrico e cadeia transportadora de eltrons,
27 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

ou pode gerar 3-hidroxi-3-metil glutaril CoA, precursor para a via de sntese do colesterol
como tambm dos corpos cetnicos. Um outro destino do acetil CoA a sua utilizao para a
sntese de cidos graxos. O acetil CoA serve como elo de integrao entre o metabolismo dos
carboidratos, dos lipdeos e das protenas e a integrao destas vias metablicas com o ciclo
do cido ctrico.

Integrao Metablica entre os Diversos Tecidos

A integrao das diversas funes dos rgos um processo muito complexo, uma vez
que os padres metablicos de crebro, msculo, tecido adiposo, trato digestivo e fgado so
muito diferentes. Para um perfeito entendimento destas inter-relaes h necessidade, alm da
abordagem bioqumica, de uma abordagem fisiolgica. Neste texto abordaremos somente
alguns aspectos bioqumicos significativos.

Tabela 1 Reserva energtica em um homem adulto (~70kg)

Energia disponvel (kcal)
RGO Glicognio Triacilgliceris Protenas
ou glicose Mobilizveis*
Sangue 60 45 0
Fgado 400 450 400
Crebro 8 0 0
Msculo 1.200 450 24.000
Tecido adiposo 80 135.000 40
*Embora protena no constitua material de reserva, na inanio podem ser consumidos 50%
do seu total.

A distribuio das reservas energticas nos diversos tecidos (Tabela 1) mostra como
esses tecidos diferem no uso dos alimentos para satisfazer as suas necessidades energticas:
Crebro No tem reservas energticas e, por isso, necessita de um suprimento
contnuo de glicose. Ele consome cerca de 120 g diariamente, o que representa cerca de 60%
do consumo de glicose pelo organismo inteiro em repouso. Durante a inanio, o crebro
utiliza os corpos cetnicos (acetoacetato e -hidroxibutirato), gerados pelo fgado, como fonte
de energia, substituindo parcialmente a glicose. Essa mudana no uso de combustvel de
glicose para corpos cetnicos tem por objetivo minimizar a degradao de protenas durante a
inanio. Os cidos graxos no servem como alimento para o crebro, por no atravessarem a
barreira hematoenceflica, mas os corpos cetnicos, derivados dos cidos graxos, podem ser
utilizados como fonte de energia pelo crebro.
Msculo Difere do crebro por ter grande reserva de glicognio e alm de
glicose utiliza cidos graxos e corpos cetnicos como fontes de energia. O msculo, como o
crebro, no tem a enzima glicose-6-fosfatase, por isso no pode exportar glicose, que seu
alimento preferido para surtos de atividade. A velocidade da gliclise no msculo esqueltico
em contrao ativa, excede aquela do ciclo do cido ctrico. Muito do piruvato formado nesse
processo reduzido a lactato, que flui para o fgado onde transformado em glicose. A
alanina, como o lactato, podem ser transformada em glicose pelo fgado. No msculo em
repouso os cidos graxos so a principal fonte de energia, enquanto os corpos cetnicos
podem tambm servir de alimento para o msculo cardaco.
Tecido adiposo Tem como funo armazenar triacilgliceris produto da
esterificao dos cido graxos, sintetizados no fgado, com glicerol. O glicerol 3-fosfato,
intermedirio nessa reao de esterificao, um produto da degradao da glicose na via
glicoltica. Como os adipcitos no podem fosforilar o glicerol, necessitam de glicose para a
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 28

sntese de triacilgliceris. As lipases do tecido adiposo so enzimas envolvidas com a

liberao da maior parte de energia armazenada. A lipase que remove o primeiro cido graxo
de um triacilglicerol sensvel a vrios hormnios circulantes (Figura 3). O controle da
hidrlise de triacilgliceris deve ser balanceado com o processo de sntese destes compostos,
para assegurar um armazenamento de energia adequado e evitar a obesidade. Os nveis de
glicerol 3-fostato, produzidos a partir de glicose, nos adipcitos desempenham um papel
importante sobre destino dos cido graxos. Nveis elevados de glicerol 3-fostato estimulam a
esterificao, enquanto baixos nveis deste composto nos adipcitos favorecem a liberao
dos cidos graxos para a corrente sangnea.
Fgado - Suas atividades metablicas so essenciais para o provimento de
material energtico para o crebro, msculo e outros rgos perifricos. A maioria dos
compostos absorvidos pelos intestinos passa atravs do fgado, o que permite que ele regule o
nvel de muitos destes compostos no sangue. O fgado pode captar grandes quantidades de
glicose e convert-las em glicognio, como pode liberar glicose para o sangue a partir das
reservas de glicognio ou atravs da gliconeognese. Lactato e alanina, a partir dos msculos
e glicerol, do tecido adiposo, bem como os aminocidos glicognicos, so os principais
precursores de glicose na gliconeognese. Assim como o fgado regula o metabolismo dos
carboidratos, tambm desempenha papel central na regulao do metabolismo dos lipdeos.
As lipoprotenas de muito baixa densidade (VLDL) so sintetizadas no fgado e transportam
os cidos graxos para o tecido adiposo para a sntese de triacilgliceris. E o fgado que, no
jejum, transforma os cidos graxos em corpos cetnicos. Malonil-CoA, precursor para a
sntese de cidos graxos, inibe a enzima carnitina aciltransferase I, envolvida com o transporte
de cidos graxos para a mitocndria. Dessa forma, quando os nveis de malonil CoA esto
altos a sntese de cidos graxos favorecida e a -oxidao, inibida. Quando os alimentos so
escassos, os nveis de malonil CoA baixam e os cidos graxos liberados do tecido adiposo so
transformados em corpos cetnicos.

Figura 3 Mobilizao de cidos graxos dos adipcitos induzida

por hormnio. PKA Protena cinase, MAG,
DAG, TAG Mono, di e triacilglicerol
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Entre os hormnios envolvidos com a integrao metablica, insulina, glucagon

epinefrina e norepinefrina so de particular importncia no armazenamento e na mobilizao
de alimentos:
Insulina secretada pelas clulas do pncreas estimulada pela presena de
glicose e pelo sistema nervoso parassimptico. Esse hormnio atua nas cascatas de protenas
cinase. Estimula a sntese de glicognio no msculo e no fgado. Estimula a gliclise heptica,
favorecendo a sntese de cidos graxos. Como j foi discutido, o aumento de cidos graxos e
glicose no tecido adiposo estimula a sntese e armazenamento de triacilglicerol. A insulina
tambm promove a captao de aminocidos ramificados (valina, leucina e isoleucina) pelo
msculo e apresenta um efeito estimulador geral sobre a sntese proteica e inibe a degradao
intracelular de protenas.
Glucagon secretado pelas clulas do pncreas em resposta aos baixos
nveis de glicose no sangue. O glucagon inibe a sntese de glicognio e estimula a
glicogenlise, porque dispara a cascata de cAMP. Alm disso estimula a gliconeognese e
inibe a gliclise por reduzir os nveis de frutose 2,6-bisfosfato. O aumento de cAMP nos
adipcitos ativa a lipase que mobiliza os triacilgliceris.

Figura 4 Integrao do metabolismo entre os principais tecidos no

estado bem alimentado

Epinefrina e norepinefrina So secretadas pela medula adrenal e terminaes

nervosas simpticas em resposta ao baixo nvel de glicose circulante. Tm efeito semelhante
quele do glucagon por disparar a cascata de cAMP. Esses hormnios diferem do glucagon
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 30

porque seu efeito glicogenoltico mais acentuado no msculo do que no fgado. Na presena
desses hormnios a captao de glicose pelos msculos inibida e os cidos graxos, liberados
do tecido adiposo, so utilizados como fonte de energia. A epinefrina tambm estimula a
secreo de glucagon e inibe a secreo de insulina. Assim, as catecolaminas aumentam a
liberao de glicose heptica no sangue e diminuem a utilizao de glicose pelo msculo.
A Figura 4 mostra um panorama da integrao metablica entre diversos tecidos. O
transporte dos diversos compostos entre os rgos geralmente assumida pelo sangue. Os
lipdeos, a princpio constituintes dos quilomcrons, so removidos do intestino pelo sistema
linftico, enquanto glicose passa das clulas epteliais intestinais para o fgado atravs da veia
porta. Ainda no intestino ocorre o metabolismo parcial dos aminocidos, antes de serem
liberados no sistema porta.

Adaptaes Metablicas no Jejum Prolongado

A energia necessria para um perodo de 24 horas varia de aproximadamente 1.600

kcal no estado basal a 6.000 kcal, dependendo do grau de atividade. Considerando os dados
da Tabela 1, as reservas energticas em um indivduo com peso em torno de 70 kg so
suficientes para satisfazer as necessidades calricas na inanio por cerca de trs meses. Mas
as reservas de glicose se esgotam em apenas um dia. Mesmo assim, o nvel de glicose
circulante mantido acima de 40 mg/dl. O crebro no suporta nveis mais baixos, mesmo por
perodos curtos. Alm disso existem tecidos que s utilizam glicose como fonte de energia
(Tabela 2). No entanto, os precursores de glicose no se encontram em grande quantidade. A
maior parte da energia est armazenada nos cidos graxos dos triacilgliceris, mas esses
compostos no podem ser convertidos em glicose, porque o acetil CoA no pode ser
convertido em piruvato. O glicerol, que pode ser utilizado como precursor da glicose,
liberado em pequenas quantidades dos triacilgliceris. Resta uma nica fonte de precursores
da glicose, os aminocidos derivados da degradao proteica. Mas como o msculo a maior
fonte de protenas e tem papel fundamental na estrutura do organismo, precisa ser
preservado. Como preciso prover os nveis de glicose acima de 40 mg/dl e preservar as
protenas do msculo, os cido graxos e corpos cetnicos passam a serem utilizados como
combustvel.

Tabela 2 Combustveis Usados pelos Diversos Tecidos

TECIDOS GLICOSE A. GRAXOS C. CETNICOS
Eritrcitos + - -
Leuccitos + - -
Medula renal + - -
Crtex renal + + +
Crebro + - +
Msculo esqueltico +(exerccio intenso) +(repouso) +
Msculo cardaco + + +
Retina + - -
Fgado + + -
Mucosa intestinal + - -

As alteraes metablicas durante o primeiro dia de jejum so como aquelas aps o

jejum de uma noite. Com a reduo nos nveis de carboidratos, aumenta a secreo de
glucagon, estimulando a mobilizao de triacilgliceris do tecido adiposo e a gliconeognese
pelo fgado. A captao de glicose pelo msculo reduzida com os baixos nveis de insulina
circulante, enquanto os cidos graxos entram livremente e a -oxidao destes compostos no
31 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

msculo geram aumento na concentrao de acetil CoA e de citrato, inibindo a via glicoltica
e impedindo a converso de piruvato em acetil CoA.. Aps vrias semanas de inanio, os
corpos cetnicos tornam-se o principal combustvel para o crebro, reduzindo a utilizao de
glicose e garantindo a preservao das protenas do msculo (Tabela 3).

Tabela 3 Regulao do Metabolismo no Jejum Prolongado

QUANTIDADE GERADA OU CONSUMIDA EM 24
FONTES DE ENERGIA HORAS (GRAMAS)
o
3 DIA 40o DIA
Consumo pelo crebro
Glicose 100 40
Corpos cetnicos 50 100
Utilizao de glicose por 50 40
outros tecidos
Liberao pelo fgado
Glicose 150 80
Corpos cetnicos 150 150
Liplise no tecido adiposo 180 180
Degradao da protena 75 20
muscular

Adaptaes Metablicas no Exerccio

A converso da energia qumica em trabalho mecnico pelo msculo implica na

necessidade instantnea do consumo de glicose. No exerccio anaerbico (como corrida de
velocidade ou levantamento de peso) o msculo depende de suas reservas de glicognio e
creatina fosfato, para a produo de ATP. A creatina fosfato serve como fonte de fosfato de
alta energia para sntese de ATP, at que a glicogenlise e a gliclise sejam estimuladas. A via
glicoltica torna-se a fonte primria de ATP para o msculo, devido a falta de oxignio.
Durante uma corrida de velocidade (100 m em ~10 s) o nvel de ATP do msculo cai de 5,2
mM para 3,7 mM, enquanto o nvel de creatina fosfato cai de 9,1 mM para 2,6 mM. Com a
gliclise anaerbica aumenta o nvel sangneo de lactato de 1,6 mM para 8,3 mM,
favorecendo o abaixamento do pH sangneo de 7,42 para 7,24. Por isso essa marcha no
pode ser mantida em uma corrida de 1000 m em ~132 s, porque as reservas de creatina fosfato
seriam consumidas em poucos segundos e a gliclise seria interrompida por falta de NAD +;
sem falar na quantidade de cido formado. Parte do ATP consumido ser gerado pela
fosforilao oxidativa.
A corrida de uma maratona (42.200 m em ~2 h) implica na utilizao de cidos graxos
para a produo de ATP, uma vez que os depsitos de glicognio so insuficientes para prover
os 150 mol de ATP necessrios para essa competio. No entanto, se a oxidao dos cidos
graxos fossem a nica fonte de ATP a maratona deveria durar 6 h, uma vez que essa via
metablica muito mais lenta do que a oxidao do glicognio. Os melhores corredores
consomem quantidades aproximadamente iguais de glicognio e cidos graxos, de tal forma
que a glicose seja poupada para o final da maratona.
A taxa de oxidao dos cidos graxos de cadeia longa aumenta de cinco a oito vezes,
quando humanos so submetidos a um esforo fsico que exige menos de 85% do consumo de
oxignio. Dois fatores determinam a utilizao de cidos graxos: A durao e a intensidade do
exerccio. Dessa forma, exerccio intenso por 5 a 10 min, implica na utilizao de ATP gerado
a partir da oxidao de carboidratos. Em um esforo com menor intensidade por um perodo
de 30 min ou mais, gera um aumento na taxa de oxidao de cidos graxos. Essa taxa
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 32

mxima, quando o esforo fsico requer cerca de 60% do consumo mximo de oxignio.
Indivduos bem treinados utilizam um percentual maior de cidos graxos como fonte de
energia, do que indivduos sedentrios, no treinados.

Transtornos do Metabolismo no Diabetes

No diabetes mellitus h uma superproduo de glicose pelo fgado que subutilizada

pelos outros rgos. Em um indivduo no tratado, o nvel sangneo de insulina muito
baixo e o de glucagon muito alto em relao s necessidades do paciente. A alta relao
glucagon/insulina no diabetes estimula a glicogenlise e gliconeognese e inibe a gliclise,
contribuindo para o aumento dos nveis de glicose circulante. A glicose excretada na urina
junto com a gua, o que leva o diabtico na fase aguda da doena sentir fome e sede.
A utilizao reduzida de carboidratos no diabtico leva a um estmulo na quebra de
lipdeos e protenas. A oxidao de cidos graxos promove a sntese de glicose atravs do
aumento da concentrao de Acetil-CoA, um efetor alostrico positivo da piruvato
carboxilase. O aumento nos nveis de Acetil-CoA estimula a produo de corpos cetnicos,
que podem suplantar a capacidade dos rins de manter o equilbrio cido-base e levar o
diabtico no tratado a entrar em coma, por causa do abaixamento do pH sangneo e da
desidratao.
So conhecidas duas formas do diabetes mellitus: O tipo I, ou insulino-dependente,
que em geral comea antes dos 20 anos de idade. Devido produo defeituosa de insulina
pelas clulas do pncreas, os nveis sangneos de insulina no aumentam em resposta aos
nveis elevados de glicose no sangue. No tipo II, ou no insulino-dependente, a insulina no
est ausente. Nveis elevados de insulina podem ser observados nesse tipo de diabetes, mas h
resistncia dos tecidos ao do hormnio. O pncreas do paciente diabtico no insulino-
dependente no produz insulina suficiente para superar a resistncia insulina, induzida por
sua obesidade. Embora no esteja bem entendido o fenmeno da resistncia insulina, a
maioria dos indivduos com diabetes do tipo II so obesos.

Metabolismo do Etanol e a Relao NAD+/NADH

Etanol uma substncia hidrossolvel e de baixo peso molecular. Por isso

rapidamente absorvido, especialmente quando o estmago se encontra vazio. A concentrao
alcolica no sangue pode atingir, em mdia, cerca de 0,1% uma hora aps a ingesto de um
copo de lcool a 50%, quatro copos de vinho, ou quatro garrafas de cerveja. O etanol chega
ao fgado e transformado em acetato, evolvendo duas etapas:

CH3CH2OH + NAD+ CH3CHO + NADH + H+ (1)

Etanol Acetaldedo

CH3CHO + NAD+ CH3COO- + NADH + H+ (2)

Acetaldedo Acetato

A etapa (1) etapa lenta catalisada pela enzima lcool desidrogenase, no citossol
enquanto a etapa (2) ocorre na matriz mitocondrial e catalisada pela enzima aldedo
desidrogenase. Em ambas as etapas ocorre a produo de NADH. Por esta razo, as vias
metablicas da gliconeognese e da -oxidao dos cidos graxos, que tm enzimas cuja
atividade sensvel presena de NADH, sofrem inibio durante o metabolismo do etanol.
No jejum, esta situao favorece hipoglicemia e ao acmulo de triacilgliceris no fgado
33 Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes

(fgado gordo). Pode, tambm, haver um acmulo de cido lctico, gerando acidose
metablica.
O consumo de lcool por uma pessoa subnutrida ou aps exerccio extenuante pode
causar hipoglicemia. Os equivalentes de NADH em excesso bloqueiam a converso de lactato
em glicose e promovem a converso de alanina em lactato, que acumula na corrente
sangnea. Com a reduo da glicemia ocorre queda no desempenho motor e intelectual. Altas
doses de etanol apresenta um efeito depressor, que pode levar a estupor e anestesia.
O etanol apresenta um alto contedo energtico, produzindo cerca de 7,1 kcal/g,
quando oxidado. O acetato derivado do metabolismo do etanol pode ser transformado em
acetil-CoA, que oxidado a CO 2 e H2O, atravs das reaes do ciclo do cido ctrico e da
cadeia transportadora de eltrons. No fgado as mitocndrias tm uma capacidade limitada
para oxidar o acetato, porque a ativao do acetato a acetil-CoA requer GTP. Com o aumento
nos nveis de NADH, as reaes do ciclo sofrem inibio. Isto leva a uma reduo nos nveis
de GTP, gerado na transformao de sucnil-CoA a succinato, e oxidao do acetil-CoA
tambm fica comprometida. Grande parte do acetato exportado do fgado para o sangue e
pode ser oxidado, na forma de acetil-CoA, em outros tecidos.
Como acetato, acetaldedo pode ser exportado do fgado para a circulao sangnea.
Este ltimo composto reage, rapidamente, com grupos funcionais importantes, como as
protenas das clulas sangneas e dos demais tecidos, comprometendo a sua atividade
biolgica.

Questes Sobre o Tema Integrao e Regulao Metablica

1- Conceitue metabolismo, e explique o que so seres autotrficos e seres hetertrofos e

como esses seres sobrevivem.
2- Fale sobre a importncia das enzimas no metabolismo e conceitue anabolismo e
catabolismo.
3- Qual a importncia do ATP e NADPH na regulao do metabolismo celular?
4- Relacione as formas pelas quais ocorre a regulao do metabolismo e explique como elas
funcionam.
5- Relacione as principais vias metablicas e fale sobre a importncia das junes
metablicas: glicose-6-fosfato, piruvato e acetil CoA.
6- Como possvel explicar a integrao entre os diversos rgos, quando existe diferentes
padres metablicos entre crebro, msculo, tecido adiposo, trato digestivo e fgado? Fale
sobre essas diferenas
7- Fale sobre os hormnios envolvidos com a regulao do armazenamento e da mobilizao
dos alimento e sobre seu papel na integrao do metabolismo.
8- Explique como o organismo vivo se adapta a uma situao de jejum prolongado.
9- As fontes de energia so as mesmas em qualquer atividade muscular? Explique.
10- Quais os transtornos do metabolismo causados pelo diabetes mellitus e o que entende por
diabticos insulino-dependentes e no insulino-dependentes?
11- Independente dos efeitos prejudiciais, sociais e econmicos do alcoolismo, explique
porque o etanol no deve ser consumido como fonte de energia, apesar do seu alto teor
calrico.
Manual de Aulas Prticas Prof. Levy dos Santos Guedes 34

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