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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS - UFMG

ESCOLA DE VETERINRIA
Colegiado dos Cursos de Ps-Graduao

CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS E MICROBIOLGICAS E


ACEITAO SENSORIAL DE LEITES FERMENTADOS POR
BACTRIAS PRODUTORAS DE CIDO LCTICO ISOLADAS DE
QUEIJO COALHO DE PERNAMBUCO

DEBORA PINHEIRO GUIMARES MENDES

BELO HORIZONTE
2011
Debora Pinheiro Guimares Mendes

CARACTERSTICAS FSICO-QUMICAS E MICROBIOLGICAS E


ACEITAO SENSORIAL DE LEITES FERMENTADOS POR
BACTRIAS PRODUTORAS DE CIDO LCTICO ISOLADAS DE
QUEIJO COALHO DE PERNAMBUCO

Dissertao apresentada Escola de


Veterinria da Universidade Federal de
Minas Gerais - UFMG, como requisito
parcial para obteno do grau de Mestre em
Cincia Animal.
rea de concentrao: Tecnologia e
Inspeo de Produtos de Origem Animal.
Orientador: Marcelo Resende de Souza

BELO HORIZONTE
Escola de Veterinria UFMG
2011
Mendes, Debora Pinheiro Guimares, 1985-
M538c Caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas e aceitao sensorial de leites
fermentados por bactrias produtoras de cido lctico isoladas de queijo coalho de
Pernambuco / Debora Pinheiro Guimares Mendes. 2011.
63 p. : il.
Orientador: Marcelo Resende de Souza
Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinria
Inclui bibliografia

1. Leite fermentado Anlise Teses. 2. Bactrias produtoras de cido lctico Teses.


3. Avaliao sensorial Teses. 4. Lactobacilo Teses. I. Souza, Marcelo Resende de.
II. Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinria. III. Ttulo.

CDD 637.3

2
ASSINATURAS

3
4
AGRADECIMENTOS

Agradeo primeiramente a Deus, que sempre esteve e estar comigo.

Ao meu esposo, Ricardo, pelo apoio, carinho, amor e compreenso. Pela oportunidade
que me deu de fazer esse mestrado, e pelas inmeras vezes que ficou em casa sozinho
enquanto eu estava na UFMG.

minha me, aos meus avs e aos meus tios Alexandre, Aparecida e Ceclia e suas
respectivas famlias e ao meu tio Gasto, que sempre apoiaram e entenderam que as
ausncias eram necessrias para que hoje eu chegasse at aqui.

Ao professor Marcelo Resende pela orientao, dedicao, amizade e confiana.

Aos meus amigos e companheiros de mestrado, em especial Fernanda Magalhes, Alice


Ferreira, Camila Couto, Maria Carolina Paes, Guilherme Marcondes, Leonardo Acurcio
pelo companheirismo, amizade, carinho.

Aos professores do DTIPOA, em especial Mnica Leite e Claudia Penna, pela


colaborao neste projeto, sempre com boas sugestes.

Aos funcionrios do DTIPOA, em especial Maura, Taynara, Marco Antnio, pelo


suporte nas anlises e nos momentos de dvida, ao Milton, por sempre estar disposto a
nos atender na secretaria com um sorriso no rosto.

Aos alunos de iniciao cientfica, Marcos Galletti e Dalila Lapinha, que sempre
estavam dispostos quando solicitados, pela ajuda em todos os momentos e pelo
companheirismo.

Ao Danilo, pelo brilhante suporte na estatstica e durante todo o processo de discusso


dos resultados.

Aos professores e ex-professores do Centro Universitrio de Belo Horizonte, em


especial professora Lcia Peret, Viviane Birchal e Clia Ornellas, que sempre me
apoiaram.

Aos colegas da UNIPAC VALE DO AO, em especial aos coordenadores William


Saliba e Arilton Barcelar. Aos meus alunos, em especial turma de formandos do 2
semestre de 2010 do Curso de Farmcia, pelo apoio, carinho e amizade.

Aos amigos, especialmente Vivianne Rosental, William Silva, Isismlian Hastenreiter,


Silvana Anglica, que sempre apoiaram para a realizao deste sonho.

5
A todos que de alguma forma contriburam para a realizao deste projeto, por
confiarem e acreditarem em mim e no meu potencial.

No conheo ningum que conseguiu realizar seu sonho sem sacrificar sbados e
domingos pelo menos uma centena de vezes. Se quiser atingir uma meta em especial,
ter de estudar no horrio em que os outros esto tomando chopp e comendo batata frita.
Ter de planejar, enquanto os outros permanecem na frente da televiso. Ter de
trabalhar enquanto os outros tomam sol beira da piscina. A realizao de um sonho
depende da dedicao.
Roberto Shinyashiki

6
SUMRIO

1. INTRODUO .......................................................................................................... 16
2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 18
3. HIPTESES ............................................................................................................... 18
4. REVISO DE LITERATURA .................................................................................. 19
4.1. Leites fermentados .................................................................................................. 19
4.1.1. Histrico ............................................................................................................... 19
4.1.2. Legislao brasileira ............................................................................................. 19
4.2. Probiticos ............................................................................................................... 21
4.2.1. Histrico ............................................................................................................... 21
4.2.2. Definies ............................................................................................................. 22
4.2.3. Leites fermentados probiticos............................................................................. 22
4.2.4. Efeitos benficos................................................................................................... 23
4.3. O gnero Lactobacillus............................................................................................ 24
4.3.1. Lactobacillus rhamnosus ...................................................................................... 26
4.3.2. Lactobacillus fermentum ...................................................................................... 27
5. MATERIAL E MTODOS ........................................................................................ 28
5.1. Delineamento experimental ..................................................................................... 28
5.2. Controle de qualidade do leite em p desnatado ..................................................... 29
5.3 Controle de qualidade do leite em p desnatado reconstitudo e tratado
termicamente .................................................................................................................. 29
5.4. Microrganismos ....................................................................................................... 29
5.5. Curvas de fermentao/ crescimento ....................................................................... 30
5.6. Preparo dos leites fermentados ................................................................................ 30
5.7. Anlises laboratoriais dos leites fermentados .......................................................... 31
5.7.1 Avaliao fsico-qumica dos leites fermentados .................................................. 31
5.7.2. Avaliao microbiolgica dos leites fermentados ................................................ 31
5.7.2.1. Enumerao dos microrganismos produtores de cido lctico .......................... 31
5.7.2.2. Pesquisa de coliformes totais e termotolerantes ................................................ 31

7
5.7.2.3. Pesquisa de bolores e leveduras......................................................................... 32

5.8. Avaliao sensorial dos leites fermentados ............................................................. 32


5.9. Anlise Estatstica ................................................................................................... 33
6. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................... 33
6.1. Controle de qualidade do leite em p desnatado ..................................................... 33
6.2 Controle de qualidade do leite em p desnatado reconstitudo ................................ 35
6.3.Curva de Fermentao / Crescimento ....................................................................... 35
6.3.1. pH ......................................................................................................................... 35
6.3.2. Acidez Titulvel ................................................................................................... 37
6.3.3. Enumerao das bactrias produtoras de cido lctico ........................................ 38
6.4. Avaliao fsico-qumica dos leites fermentados .................................................... 39
6.4.1. pH ......................................................................................................................... 39
6.4.2. Acidez Titulvel ................................................................................................... 40
6.4.3. Teor de protena .................................................................................................... 41
6.4.4. Teor de gordura .................................................................................................... 41
6.4.5. Teor de umidade e extrato seco total .................................................................... 42
6.5. Avaliao microbiolgica dos leites fermentados ................................................... 43
6.5.1. Enumerao dos microrganismos produtores de cido lctico ............................. 43
6.5.2. Pesquisa de coliformes totais e termotolerantes ................................................... 44
6.5.3. Pesquisa de bolores e leveduras............................................................................ 45
6.6. Avaliao sensorial dos leites fermentados ............................................................. 45
6.6.1. Teste de aceitao pela escala hednica de cinco pontos ..................................... 45
6.6.2. Teste de aceitao pela escala no estruturada ..................................................... 46
7. RESUMO DOS RESULTADOS................................................................................ 47
8. CONCLUSES .......................................................................................................... 48
9. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ....................................................................... 49
10. ANEXOS .................................................................................................................. 55

8
LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Teores percentuais mdios de acidez titulvel e componentes fsico-qumicos


dos trs lotes de leite em p desnatado ........................................................................... 34

Tabela 2: Resultados mdios percentuais de trs repeties pH de leites desnatados


esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus fermentum,
armazenados sob refrigerao entre 8 a 10 C, durante 45 dias de estocagem ............... 39

Tabela 3: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de acidez titulvel
de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10C, durante 45 dias
de estocagem................................................................................................................... 40

Tabela 4: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de protena de


leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10C, durante 45 dias
de estocagem................................................................................................................... 41

Tabela 5: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de umidade de


leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao a 8-10 C, durante 45 dias de
estocagem ....................................................................................................................... 42

Tabela 6: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de extrato seco
total de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10 C, durante 45 dias
de estocagem................................................................................................................... 43

Tabela 7: Contagens mdias (UFC/g) em gar MRS, de trs repeties de leites


desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus
fermentum, armazenados sob refrigerao a 8-10 C, durante 45 dias de estocagem .... 43

Tabela 8: Medianas dos resultados do teste de aceitao (escala hednica de cinco


pontos) de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 a 10 C, durante 60 dias
de estocagem................................................................................................................... 45

Tabela 9: Medianas dos resultados do teste de aceitao (escala no estruturada) dos


leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10 C, durante 60 dias
de estocagem................................................................................................................... 46

9
LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Requisitos fsico-qumicos oficiais para inspeo de leites fermentados no


Brasil ............................................................................................................................... 20

Quadro 2: Critrios microbiolgicos oficiais para inspeo de leites fermentados no


Brasil ............................................................................................................................... 20

Quadro 3: Contagem de microrganismos especficos para inspeo de leites fermentados


no Brasil .......................................................................................................................... 21

Quadro 4: Principais efeitos benficos do consumo de leites fermentados contendo


microrganismos probiticos e seus mecanismos ............................................................ 24

Quadro 5: Linhagens de Lactobacillus rhamnosus utilizadas na fermentao de


alimentos e seus respectivos benefcios sade humana ............................................... 27

Quadro 6: Linhagens de Lactobacillus fermentum utilizadas na fermentao de


alimentos e seus respectivos benefcios sade humana ............................................... 28

10
LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mdias de duas repeties de pH durante a fermentao de leites fermentados


esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e Lactobacillus fermentum
(LF) ................................................................................................................................. 36

Figura 2: Mdias de duas repeties de acidez titulvel (%) durante a fermentao de


leites fermentados esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e
Lactobacillus fermentum (LF) ........................................................................................ 37

Figura 3: Mdias de duas repeties das contagens (log UFC/g) durante a fermentao
de leites fermentados esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e
Lactobacillus fermentum (LF) ........................................................................................ 38

11
LISTA DE ABREVIATURAS

% porcentagem
l microlitro
a.C. antes de Cristo
B. Bifidobacterium
B. lactis Bifidobacterium lactis
CPS Concentrado Proteico de Soro
COEP Comit de tica em Pesquisa
DTIPOA Departamento de Tecnologia e Inspeo de Produtos de Origem
Animal
EC Escherichia coli
EV Escola de Veterinria
g gramas
IN Instruo Normativa
L. Lactobacillus
L. fermentum Lactobacillus fermentum
L. reuteri Lactobacillus reuteri
L. rhamnosus Lactobacillus rhamnosus
LF Leite fermentado por Lactobacillus fermentum
LR Leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus
mn. mnimo
ml mililitro
MRS de Man, Rogosa e Sharpe
NaCl Cloreto de sdio
NMP nmero mais provvel
C Graus Celsius
RTIQ Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade
TGI Trato gastrintestinal
UFC unidades formadoras de colnia
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais

12
ANEXOS

Anexo 1: Teste de Gram Lactobacillus rhamnosus (100x de aumento Microscpio


ptico) ............................................................................................................................. 55

Anexo 2: Teste de Gram Lactobacillus fermentum (100x de aumento Microscpio


ptico) ............................................................................................................................. 56

Anexo 3: Crescimento em caldo MRS do Lactobacillus fermentum aps 72 horas de


incubao ........................................................................................................................ 57

Anexo 4: Crescimento em Caldo MRS do Lactobacillus rhamnosus aps 72 horas de


incubao ........................................................................................................................ 58

Anexo 5: Fotografia do cogulo formado por Lactobacillus rhamnosus ....................... 59

Anexo 6: Fotografia do cogulo formado por Lactobacillus fermentum ....................... 60

Anexo 7: Modelo da Ficha de Anlise Sensorial utilizada nas anlises sensoriais dos
leites fermentados estocados por 15 e 60 dias sob refrigerao 8-10C...................... 61

Anexo 8: Modelo do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para a Anlise


Sensorial ......................................................................................................................... 62

Anexo 9: Mdia das duas repeties do tempo de fermentao dos leites desnatados
adoados esterilizados adicionados de Lactobacillus fermentum e Lactobacillus
rhamnosus....................................................................................................................... 63

13
RESUMO

No Brasil, assim como em todo o mundo, o consumidor vem buscando alimentos que
alm de prover necessidades nutricionais tragam benefcios a sua sade; e neste
contexto que se destacam os alimentos contendo microrganismos probiticos, tendo
como principais representantes os leite fermentados. A produo brasileira de leites
fermentados baseada na utilizao de microrganismos iniciadores importados,
comercializados por empresas estrangeiras. Verifica-se que h um grande potencial para
a utilizao de bactrias produtoras de cido lctico, potencialmente probiticas,
isoladas de produtos lcteos artesanais brasileiros, como o queijo coalho de
Pernambuco. O presente trabalho teve como objetivo elaborar leites fermentados a
partir de bactrias produtoras de cido lctico isoladas de queijo coalho produzido em
Pernambuco, Brasil; avaliar a habilidade de bactrias produtoras de cido lctico,
Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus fermentum fermentarem isoladamente o leite e
resultar em produtos finais com caractersticas sensoriais distintas; e avaliar a
viabilidade dessas bactrias, bem como as caractersticas fsico-qumicas,
microbiolgicas e sensoriais dos leites fermentados durante 45 dias de estocagem sob
refrigerao a 8-10C. As curvas de fermentao obtidas a partir de valores de pH,
acidez titulvel (%) e enumerao dos microrganismos produtores de cido lctico,
indicaram valores mais altos de acidez titulvel e consequentemente valores mais baixos
de pH para Lactobacillus rhamnosus. Em relao s contagens de microrganismos
produtores de cido lctico, os dois leites fermentados apresentaram quantidades
adequadas de microrganismos viveis, acima de 108 UFC/g. Em relao s anlises
sensoriais, os leites fermentados com 15 dias apresentaram melhor aceitabilidade entre
os provadores, em relao queles analisados aos 60 dias de estocagem sob refrigerao
8-10C.

Palavras chaves: leites fermentados, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus


fermentum, probiticos potenciais

14
ABSTRACT

In Brazil, as well as around the world, the consumer has been searching for foods that
meet nutritional features and bring benefits to health, and one alternative for fit those
requirements are the foods containing probiotics, mainly fermented milks. The Brazilian
production of fermented milks is based on the use of imported starter cultures, marketed
by foreign companies. However, there is great potential for the use of lactic acid
bacteria isolated from artisanal dairy products made in Brazil, as the coalho cheese
from Pernambuco. This study aimed to elaborate fermented milks from potentially
probiotic lactic acid bacteria isolated from that cheese; to evaluate the ability of
Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus fermentum, isolatedly, ferment milk and
result in final products with different sensory characteristics; to assess the viability of
those bacteria in the fermented milks, as well as analyze the physical-chemical,
microbiological, and sensory properties of them during storage for 45 or 60 days under
refrigeration at 8-10C. Fermentation profiles showed higher levels of acidity and lower
values of pH in milks fermented by Lactobacillus rhamnosus. Both two fermented
milks presented adequate quantities of viable micro-organisms, above 108CFU/g
throughout the analyzed period. Regarding the sensory analysis, fermented milk
analyzed at 15 days showed better acceptability of the panelists than at 60 days.

Key-words: fermented milks, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum,


potentially probiotics

15
1. INTRODUO probiticos era descrever compostos
produzidos por um protozorio que
Atualmente, o consumidor brasileiro estimulava o crescimento de outros
encontra sua disposio, nas organismos (Lilley & Stillwell, 1965
prateleiras dos supermercados, uma citados por Gomes & Malcata, 1999).
grande variedade de leites fermentados. Fuller (1989), aps revisar sobre o
Essa tendncia est associada com a assunto, definiu probiticos como
conscincia de que o consumo desses suplementos alimentares na forma de
alimentos traz benefcios sade. microrganismos vivos que tm um
Consequentemente, as indstrias, de um efeito benfico na sade dos
modo geral, tm investido na produo consumidores, por manter o equilbrio
desse derivado do leite. da microbiota intestinal. Com o passar
do tempo e a execuo de pesquisas,
Oliveira et al. (2009) citam que, vrias definies para probiticos foram
atualmente, os consumidores brasileiros idealizadas e, atualmente, a mais aceita
esto buscando alimentos com mais a que probiticos so microrganismos
sabor e aroma agradveis, de baixo vivos administrados em quantidades
valor calrico ou baixo contedo de suficientes para conferir efeito benfico
gordura, e com efeitos benficos para a sade do hospedeiro (JOINT
sade. FAO/WHO, 2002).

Esses benefcios associados com o Atualmente, tm-se diversos estudos


consumo de leites fermentados so mostrando os efeitos benficos de leites
relacionados capacidade probitica fermentados contendo microrganismos
que os mesmos contm. De um modo probiticos, dentre eles, a reduo da
geral, os leites fermentados contm diarreia infantil, reduo da
microrganismos considerados concentrao de colesterol no sangue e
probiticos, como Lactobacillus spp. As estimulo ao sistema imunolgico
principais espcies de Lactobacillus que (Komatsu et al., 2008). Alm desses
so utilizadas nos leites fermentados benefcios, podem-se destacar efeitos
brasileiros so Lactobacillus casei, benficos no intestino, como por
Lactobacillus paracasei, Lactobacillus exemplo, ao antibacteriana, com
bulgaricus e Lactobacillus acidophilus. possvel proteo contra gastrenterites,
Alm de Lactobacillus spp., contribuindo para o bom funcionamento
Streptococcus thermophilus, intestinal e uma potencial atividade
Lactococcus lactis e Bifidobacterium antitumoral (Gomes & Malcata, 1999).
spp. tambm so empregados (Botelho,
2005). Nas ltimas duas dcadas, o interesse na
manipulao da microbiota intestinal
A palavra probitico de origem grega vem crescendo, principalmente quando
e tem como significado em favor da se trata da preveno de enfermidades.
vida (pr favor; bio vida). Com isso, o uso de microrganismos
Originalmente, a proposta, que foi produtores de cido lctico, entre os
idealizada para microrganismos quais esto includas a grande maioria

16
das bactrias potencialmente novas tecnologias de produo de leites
probiticas, tem sido muito difundido, fermentados, podem ocasionar, para as
com diversas aplicaes nutricionais e indstrias, aumento de rendimento e
mdicas em todo o mundo (Lara- lanamento de novos produtos
Villoslada, 2009). fermentados produzidos a partir de
bactrias produtoras de cido lctico
O grupo Lactobacillus composto por isoladas de produtos lcteos artesanais
bactrias Gram-positivo, em forma de brasileiros, tendo em vista que a
bastonetes (bacilos), catalase-negativo. produo de leites fermentados no
Em alimentos, em geral, so Brasil baseia-se na fermentao a partir
microaerfilos, mas tambm inclui de microrganismos iniciadores
espcies anaerbicas, como no trato comercializados por empresas
gastrintestinal de humanos e animais estrangeiras. Desta forma, o
(Jay, 1996). desenvolvimento de leites fermentados
a partir dessas bactrias testadas quanto
Os leites fermentados contm bactrias s propriedades probiticas, e a
do gnero Lactobacillus spp., avaliao de suas caractersticas fsico-
principalmente do grupo Lactobacillus qumicas e microbiolgicas e seus perfis
casei, do qual faz parte o Lactobacillus sensoriais pode viabilizar registros de
rhamnosus. Buriti & Saad (2007) patentes, alm de estimular a elaborao
relataram que, desde aproximadamente de produtos lcteos (Guedes Neto,
1930, h leites fermentados contendo 2004).
Lactobacillus casei.
Neste trabalho, as espcies de
Lactobacillus fermentum a principal Lactobacillus utilizadas foram
espcie de Lactobacillus Lactobacillus rhamnosus e
obrigatoriamente heterofermentativo Lactobacillus fermentum, os quais,
presente no trato digestivo humano, e segundo Gardiner et al. (2002), so
tambm empregado na indstria de agentes probiticos capazes de auxiliar
laticnios como cultura iniciadora (Fons no tratamento de infeces urogenitais
et al., 1997 e Dickson et al., 2005). em mulheres, alm de outras funes.
Portanto, a utilizao de novas culturas
Leites fermentados contendo lcticas com potencial probiticas,
Lactobacillus rhamnosus e como Lactobacillus fermentum e
Lactobacillus fermentum no so Lactobacillus rhamnosus, aliada ao
comuns no Brasil, como j mencionado, desenvolvimento de novas tecnologias
mas na Europa h leites fermentados de produo dos leites fermentados
com essas bactrias produtoras de cido podem propiciar aumento de
lctico. rendimento para as indstrias e
lanamento de produtos fermentados
A utilizao de novas culturas lcticas brasileiros, com maior potencial
potencialmente probiticas, como funcional, sendo por isso justificada a
Lactobacillus fermentum e realizao deste trabalho.
Lactobacillus rhamnosus, em conjunto
com o desenvolvimento contnuo de

17
2. OBJETIVOS 3. HIPTESES

Os objetivos deste trabalho foram: Para a realizao deste trabalho foram


levantadas hipteses, as quais esto
Elaborar leites fermentados a descritas a seguir:
partir de bactrias produtoras de
cido lctico, isoladas de queijo Bactrias produtoras de cido
coalho produzido em lctico isoladas de queijo de
Pernambuco, Brasil. coalho poderiam ser utilizadas
isoladamente ou em associao
Avaliar a habilidade de bactrias na elaborao de leites
produtoras de cido lctico fermentados, resultando em
(Lactobacillus rhamnosus e produtos com diferentes
Lactobacillus fermentum) em caractersticas sensoriais.
fermentar o leite e resultar em
produtos finais com Os leites fermentados
caractersticas sensoriais produzidos a partir de
distintas. Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum
Avaliar a viabilidade de possuiriam caractersticas fsico-
bactrias produtoras de cido qumicas e microbiolgicas
lctico (Lactobacillus compatveis com os padres
rhamnosus e Lactobacillus brasileiros, incluindo a
fermentum), bem como as viabilidade de bactrias
caractersticas fsico-qumicas e probiticas, durante todo o
microbiolgicas durante 45 dias perodo de estocagem.
de estocagem sob refrigerao e
o perfil sensorial dos leites Leites fermentados por
fermentados durante 60 dias de Lactobacillus rhamnosus e
estocagem sob refrigerao. Lactobacillus fermentum
apresentariam caractersticas
sensoriais distintas entre si.

18
4. REVISO DE LITERATURA era de forma espontnea, ou seja, a
fermentao era realizada por
4.1. Leites fermentados microrganismos que j estavam
presentes no local. O uso de culturas
4.1.1. Histrico iniciadoras ficou mais conhecido e
difundido a partir da metade do sculo
Leites fermentados so produtos XX (Mongensen et al., 2003).
resultantes do crescimento seletivo de
bactrias especficas em leite. Estes Atualmente, os leites fermentados so
produtos esto presentes no mundo h produzidos em condies controladas
milhares de anos e acredita-se que os com culturas iniciadoras especficas. As
mesmos tenham surgido na rea que razes para fermentar leites so diversas
atualmente corresponde ao Oriente e a principal funo de aumentar a
Mdio. Isso foi em decorrncia, vida de prateleira, ou prazo de validade,
provavelmente, da necessidade de se alm das outras funes como: melhorar
conservar o leite por mais tempo na a textura do leite, reforar a
ausncia de refrigerao (Kosikowski, digestibilidade do produto e produo
1977). de outros produtos, como iogurte e
queijos (Robinson & Tamine, 2006).
Os leites fermentados no possuem uma
data de origem definida, pois h muito 4.1.2. Legislao brasileira
tempo so produzidos, mesmo que de
forma emprica. Na prpria Bblia, h Leites fermentados so definidos
indcios de que Abrao consumia este (Brasil, 2007) como os produtos
tipo de alimento, pois sua longevidade adicionados ou no de outras
era atribuda a um leite mgico, que substncias alimentcias, obtidas por
curava doenas (Robinson, 1991). coagulao e diminuio do pH do leite,
ou leite reconstitudo, adicionado ou
No comeo do sculo XX, a partir de no de produtos lcteos, por
estudos de Elia Metchnikoff (1845- fermentao lctica mediante ao de
1916), na Frana Instituto Pasteur, cultivos de microrganismos especficos.
houve uma associao da produo de Esses microrganismos devem ser
leites fermentados com o metabolismo viveis, ativos e abundantes no produto
de microrganismos lcteos. A partir final durante seu prazo de validade,
disso, ocorreu o isolamento e a segundo o Regulamento Tcnico de
caracterizao de vrias culturas Identidade e Qualidade de Leites
lcticas, assim como o processo Fermentados.
fermentativo comeou a ser controlado
e padronizado pelas indstrias O Regulamento Tcnico de Identidade e
(Robinson, 1991). Qualidade de Leites Fermentados inclui
na categoria de leites fermentados os
A tecnologia da produo de leites seguintes produtos: o iogurte, o leite
fermentados conhecida desde os fermentado ou cultivado, o leite
tempos mais remotos em vrias partes acidfilo ou acidofilado, o kefir, o
do mundo. Inicialmente, sua produo kumys e a coalhada (Brasil, 2007).

19
Os ingredientes obrigatrios para a mel, coco, cereais, vegetais, frutas
produo de leites fermentados so o secas, chocolate, especiarias, caf e
leite e/ou leite reconstitudo outras, ss ou combinadas.
padronizado em seu contedo de Adicionalmente, podem ser
gordura e o cultivo de bactrias lcticas incorporados acares e/ou glicdios
especficas ou no, dentre as quais (exceto polialcois e polissacardeos);
podem ser utilizadas: Lactobacillus cultivos de bactrias lcticas
acidophilus, Lactobacillus casei, subsidirias e amidos ou amidos
Streptococcus salivarius ssp. modificados em uma proporo mxima
thermophilus. Os ingredientes opcionais de 1% (m/m) do produto final. Os
so leite concentrado, creme, manteiga, ingredientes opcionais no lcteos, ss
gordura anidra de leite ou butter oil, ou combinados, devero estar presentes
leite em p, caseinatos alimentcios, em uma proporo mxima de 30%
protenas lcteas, outros slidos de (m/m) do produto final (Brasil, 2007).
origem lctea, soros lcteos,
concentrados de soros lcteos, frutas em Os requisitos fsico-qumicos e
forma de pedaos, polpa(s), suco(s) e microbiolgicos para o controle de
outros preparados base de frutas, qualidade de leites fermentados,
maltodextrinas, alm de outras segundo a legislao brasileira (Brasil,
substncias alimentcias, tais como: 2007), encontram-se no Quadro 1 e 2.

Quadro 1: Requisitos fsico-qumicos oficiais para inspeo de leites fermentados no


Brasil

Acidez (g de cido Protenas


Matria gorda lctea (g/100g)
ltico/100g) Norma lcteas
Norma FIL 116 A:1987
FIL 150:1991 (g/100g)
Com Parcialmente
Integral Desnatado
creme desnatado
Min. 6,0 3,0 a 5,9 0,6 a 2,9 0,6 a 2,0 Min. 2,9
Mx. 0,5
Fonte: Brasil (2007)

Quadro 2: Critrios microbiolgicos oficiais para inspeo de leites fermentados no


Brasil

Microrganismos Critrio de aceitao Norma


Coliformes/g (30C) n=5 c=2 m=10 M=100 FIL73A:1985
Coliformes/g (45C) n=5 c=2 m<3 M=10 APHA 1992c.24
Bolores e leveduras/g n=5 c=2 m=50 M=200 FIL94B:1990
Fonte: Brasil (2007)

20
As contagens mnimas de segundo a legislao brasileira, so
microrganismos especficos que devem apresentadas no Quadro 3.
estar presentes nos leites fermentados,

Quadro 3: Contagem de microrganismos especficos para inspeo de leites fermentados


no Brasil

Produto Contagem de bactrias Contagem de leveduras


lcticas totais (UFC/g) especficas (UFC/g)
Norma FIL 117A: 1988 Norma FIL 94 B: 1990
Iogurte mn. 107 (*) -
Leite fermentado ou mn.106(*) -
cultivado
Leite acidfilo ou mn. 107 -
acidofilado
Kefir mn. 107 mn. 104
Kumys mn. 107 mn. 104
Coalhada mn.106 -
(*) No caso em que se mencione o uso de bifidobactrias, a contagem ser no mnimo
106 bifidobactrias/g
Fonte: Brasil (2007)

4.2. Probiticos o uso de probiticos, recomendando a


crianas que estavam com diarreia o uso
4.2.1. Histrico de Bifidobacterium spp., alegando que
as mesmas iriam competir com os
A utilizao de microrganismos que microrganismos indesejveis presentes
trazem benefcios ao homem acontece no intestino, eliminando-os e
desde milhares de anos atrs, apesar de dominando a microbiota intestinal,
serem usados empiricamente. Leveduras acabando assim com a diarreia
e bactrias acidificantes faziam-se (Ballongue, 1993).
presentes nos primeiros alimentos
fermentados, os quais j eram Com o passar do tempo, a tecnologia de
mencionados no Antigo Testamento da processamento de leites fermentados foi
Bblia, em Gnesis 18:8, passagem na melhorada e, a partir de estudos de Elia
qual h meno sobre o consumo de Metchnikoff (1845-1916), em 1907,
queijos. Em 76 a.C. Plinius, historiador evidenciou-se, pela primeira vez, uma
romano recomendou o uso de produtos relao entre a fermentao do leite e o
lcteos fermentados para o tratamento papel das bactrias e leveduras
de gastrenterites (Kroeger et al., 1989 e acidificantes (Jay, 1996). Essa relao
Robinson, 1991). foi possvel com o estudo da
longevidade dos blgaros realizada por
Em 1906, Tissier, um cientista francs, Metchnikoff, a qual era relacionada com
forneceu importantes informaes sobre o consumo de leites fermentados por
esse povo. Metchnikoff, em 1908, foi o Em 1998 o Instituto Internacional de
primeiro pesquisador a defender Cincia da Vida (International Life
publicamente o consumo de leites Science Institute), incluiu no conceito
fermentados, principalmente o iogurte, de probiticos os termos sade e bem
como alimentos que ocasionam estar, servindo como base para o
benefcios sade (Robinson, 1991). conceito de Salminem (1999), o qual
definiu probiticos como preparados de
Estudos realizados na tribo Maasai microrganismos, ou seus constituintes,
(frica) mostraram que os nativos que tm efeito benfico sobre a sade e
ingeriam grandes quantidades de carnes o bem estar do hospedeiro.
vermelhas, mas que consumiam um
leite fermentado local, denominado kule Atualmente, o conceito de probiticos
naoto em altas quantidades e quase no mais utilizado o designado por uma
possuam problemas de cpula de pesquisadores da Organizao
hipercolesterolemia. O kule naoto um de Agricultura e Alimentos e da
leite fermentado por Lactobacillus Organizao Mundial de Sade o
plantarum e Lactobacillus rhamnosus. seguinte: probiticos so
Isso pode ser explicado pelo fato de que microrganismos vivos administrados em
essas bactrias possuem a capacidade de quantidades suficientes para conferir
desconjugar sais biliares no intestino, efeito benfico sade do hospedeiro
evitando sua absoro e utilizao para (JOINT FAO/WHO, 2002).
sntese de novo de colesterol (Jay,
1996). Fuller (1989) apontou que os
microrganismos probiticos so
4.2.2. Definies basicamente bactrias produtoras de
cido lctico, entre as quais se destacam
Data-se 1960, a utilizao pela primeira espcies de Lactobacillus,
vez do termo probitico, por Richard Bifidobacterium, Lactococcus e
Parker, tendo como significado a favor Streptococcus.
da vida, ressaltando que probitico
uma palavra de origem grega. 4.2.3. Leites fermentados probiticos

Logo aps essa definio, Lilley e Segundo Fuller (1989), os probiticos


Stiwell, em 1965, utilizaram esse presentes no mercado contm
mesmo termo para designar substncias microrganismos dos gneros
secretadas por microrganismos que Lactobacillus e Streptococcus,
estimulam o crescimento de outro. principalmente Streptococcus
Posteriormente, Fuller (1989) thermophilus, em sua maioria. Alguns
modificou tal conceito e introduziu uma contm bifidobactrias, mas so poucos,
nova definio, caracterizando pois como so bactrias anaerbicas,
probitico como suplemento alimentar deve-se criar uma condio total de
composto por microrganismos vivos anaerobiose para garantir o seu
capazes de beneficiar o hospedeiro pelo crescimento, uma vez que qualquer
equilbrio da microbiota intestinal. contato com o oxignio, estes no
sobrevivem. A justificativa do uso de

22
Lactobacillus devido ao fato de que os possua caractersticas importantes, entre
mesmos colonizam a microbiota do as quais se destacam: serem produzidos
organismo humano aps o nascimento, em larga escala, permanecerem estveis
em grande quantidade, e quando ocorre e viveis durante a estocagem; serem
o aumento da sua concentrao, ocorre capazes de resistir s condies
o decrscimo da concentrao de outros adversas do trato gastrintestinal e nele
microrganismos patognicos ou sobreviver; produzir efeito benfico ao
deteriorantes. hospedeiro; reduzir a adeso de
patgenos; modular a atividade
Kurmann e Rassic (1991), Gomes e imunolgica e a produo de toxinas e
Malcata (1999) e Lourens-Hatting e no ser patognico (JOINT FAO/WHO,
Viljoen (2001) enfatizaram que os 2002).
fabricantes de leites fermentados devem
observar se os produtos contm o Fuller (1989) relatou que o modo de
nmero satisfatrio de microrganismos ao de microrganismos probiticos
viveis para serem denominados ocorre de forma que o consumo de
probiticos. Esse nmero no mnimo alimentos contendo a concentrao
106 UFC/mL, devido dose teraputica adequada dos mesmos vai resultar na
ser de 108 a 109 clulas viveis em 100g produo de componentes
de produto. antimicrobianos e competio por
nutrientes, competio por stios de
A viabilidade dos microrganismos adeso; alm disso, eles alteram o
probiticos em leites fermentados pode metabolismo microbiolgico, ou
ser afetada durante as etapas de aumentando ou diminuindo a atividade
distribuio do produto (tanto da enzimtica (isso depende do que
indstria para o mercado quanto do melhor para o hospedeiro); e tambm
mercado para a casa do consumidor) estimulam a atividade imune.
devido exposio a diferentes fatores,
como aumento da acidez, Os benefcios ocasionados pelo
presena/ausncia de oxignio consumo de alimentos contendo
(dependendo do tipo de microrganismos probiticos so muitos,
microrganismo), presena de podendo ser citados reduo da diarreia
componentes antimicrobianos e infantil, preveno a diarreia do
temperatura de armazenamento. Alm viajante, reduo da concentrao de
disso, os microrganismos probiticos colesterol no sangue e estmulo ao
so muito susceptveis a condies no sistema imunolgico (Komatsu et al.,
ambiente em que esto crescendo, como 2008). Alm desses benefcios, podem-
acidez e altas temperaturas (Vasiljevic se destacar efeitos benficos no
& Shah, 2008). intestino, como por exemplo, ao
antibacteriana, com possvel proteo
4.2.4. Efeitos benficos contra gastrenterites e uma atividade
antitumor potencial (Gomes & Malcata,
Para que um microrganismo seja 1999). Outros benefcios que so
selecionado e utilizado em produtos destacados por Fuller (1989) so alivio
probiticos, necessrio que o mesmo

23
da intolerncia lactose e da Os fatores ambientais incluem
constipao. alimentao do hospedeiro e remdios
ingeridos pelo mesmo. Os fatores
OSullivan et al. (1992) citaram que a relacionados ao hospedeiro incluem a
colonizao do trato gastrintestinal produo de cidos (clordrico, lctico e
humano sofre a interferncia de trs cidos graxos), enzimas (gstricas,
tipos de fatores, a saber: fatores pancreticas e epiteliais) e sais biliares;
microbiolgicos, ambientais e peristaltismo e mecanismos de
relacionados aos hospedeiros. Os imunidade.
fatores microbiolgicos incluem
interaes bacterianas (antagonismo e Os principais benefcios do consumo de
simbiose) e exigncias do leites fermentados que veiculam
microrganismo (requisitos de microrganismos probiticos esto
crescimento, propriedades de adeso). resumidos no Quadro 4.

Quadro 4: Principais efeitos benficos do consumo de leites fermentados contendo


microrganismos probiticos e seus mecanismos

Efeito benfico Mecanismo


Transporta -galactosidase para o trato
Alvio na intolerncia da lactose
gastrintestinal humano.
Preveno e reduo dos sintomas da
Excluso competitiva;
diarreia causada por antibiticos e/ou
aumento da resposta imune.
vrus
Alterao da microbiota intestinal;
Reduo de risco associado a agentes
alterao do metabolismo ativo intestinal,
carcinognicos
aumentando a imunidade intestinal.
Efeito de hipercolesterolemia Desconjugao de sais bibliares.
Excluso competitiva;
Inibio da Helicobacter pylori e
efeito de barreira;
patgenos intestinais
produo de compostos antimicrobianos.
Regulao da atividade de fagocitose;
reconhecimento pelos receptores toll-like
Estmulo ao sistema imune
(TLR): regulao de citocinas pr-
inflamatrias e quimiocinas.
Fonte: Adaptado de Vasiljevic e Shah, 2008

4.3. O gnero Lactobacillus de vrios tipos de alimentos para


homens e animais desde os tempos mais
O gnero Lactobacillus engloba remotos (Bottazzi, 1998).
bactrias de muito interesse prtico e
cientfico. Bactrias produtoras de cido Lactobacillus ssp. inclui bactrias
lctico vm sendo usadas na preparao produtoras de cido lctico que esto

24
presentes em vrios hbitats, sendo nos organismos de humanos (Jay,
bastante difundidas no ambiente (no 1996).
solo e na gua), presentes em alimentos
e tambm no organismo de animais e Axelsson (2004) relatou que h mais de
humanos. Nestes, fazem parte da oitenta espcies identificadas e
microbiota indgena da cavidade oral, reconhecidas de Lactobacillus, j
do trato gastrintestinal e do trato genital desconsiderando as cinco espcies que
feminino (Lee & Salminem, 1995, foram reclassificadas como pertencentes
Gomes & Malcata, 1999 e Coudeyras et ao gnero Weissella. Essa classificao
al., 2008). s foi possvel devido ao avano das
tcnicas de biologia molecular.
Segundo Bergeys Manual of
Determinative Bacteriology (Sneath et De acordo com Hammes e Vogel
al., 1996), as clulas de Lactobacillus (1995), Jay (1996), Buriti e Saad (2007)
possuem formato de basto e possuem e Bernardeu et al. (2008), os
tamanho regular. Sua temperatura tima Lactobacillus so classificados em trs
de crescimento est em torno de 30 a grupos, baseado em suas caractersticas
40C. Esse gnero compreende um fermentativas:
grupo heterogneo de bastonetes Gram- - homofermentativos obrigatrios:
positivo, catalase-negativo, no convertem hexoses em cido lctico via
formadores de esporos, que so Embdem-Meyerhof Parnas, sendo
componentes da microbiota indgena incapazes de utilizar as pentoses, como
intestinal de homens e outros animais, por exemplo, Lactobacillus acidophilus
alm de serem importantes bactrias e Lactobacillus salivarius;
produtoras de cido lctico (Hammes & - heterofermentativos facultativos:
Vogel, 1995 e Rush et al., 1997). fermentam hexoses em cido lctico e,
no caso de algumas espcies e sob
Em geral, Lactobacillus no esto certas condies, em cidos lctico,
envolvidos em infeces gstricas e actico, frmico e etanol, sendo capazes
intestinais, no sendo organismos de fermentar pentoses em cidos lctico
patognicos; sendo consideradas as e cetico, por exemplo, o grupo grupo
bactrias produtoras de cido lctico Lactobacillus casei no qual est
mais importantes dentro do grupo includo o Lactobacillus rhamnosus,
GRAS (Geralmente Reconhecido como objeto deste estudo;
Seguro Generally Recognized as - heterofermentativos obrigatrios:
Safe), com grande importncia utilizam hexoses para obter cidos
industrial (Lee & Salminem, 1995; lctico e actico, etanol e dixido de
Gomes & Malcata, 1999 e Singh et al, carbono, e pentoses para obter cidos
2009). lctico e actico; como, o Lactobacillus
fermentum objeto deste estudo.
Em alimentos, a maioria dos
Lactobacillus tipicamente O grande nmero de espcies neste
microaerfila, mas h espcies gnero e suas similaridades fenotpicas
anaerbias facultativas, principalmente fizeram com que ocorressem algumas
vezes erros de identificao. Para evitar

25
esses problemas, vrias formas de contm ramnose, e uma das poucas
identificao foram propostas como, por espcies capazes de ferment-la (Klein
exemplo, baseadas em caractersticas et al., 1998).
bioqumicas e fisiolgicas, alm da
identificao molecular comparando a Collins et al. (1989) descreveram
sequncia 16S do rRNA (Hammes & Lactobacillus rhamnosus como
Vogel, 1995). microrganismos com clulas em forma
de bastonetes, que podem ocorrer em
4.3.1. Lactobacillus rhamnosus cadeias ou isolados,
heterofermentativos facultativos e
Lactobacillus rhamnosus faz parte do produtores de cido lctico, ou seja,
grupo Lactobacillus casei, o qual possuem capacidade de fermentar o
tambm compreende Lactobacillus leite.
casei e Lactobacillus paracasei. O
grupo Lactobacillus casei possui grande Amostras de Lactobacillus rhamnosus
relevncia na indstria farmacutica e possuem efeitos protetores
alimentcia, pelo fato de promoverem a comprovados contra infeces por
sade humana. So encontrados em Escherichia coli (Saito, Watanabe &
produtos alimentcios, mas tambm Tado, 1980). Alm disso, o
fazem parte da microbiota humana, Lactobacillus rhamnosus quando
presentes no trato gastrintestinal, boca e ingerido em concentraes adequadas,
vagina (Klein et al., 1998; Buriti & promove benefcios sade da mulher,
Saad, 2007). pois a vagina tem o mesmo em sua
microbiota atuando no combate aos
A diferenciao entre as espcies do microrganismos patognicos, como por
grupo Lactobacillus casei no pode ser exemplo Escherichia coli e Gadnerella
apenas por perfis fermentativos, pois as vaginalis. (Reid et al, 2003).
trs espcies apresentam perfis muito
similares; a mesma pode ser realizada No Quadro 5 esto apresentadas as
por Reao de Polimerase em Cadeia principais linhagens de Lactobacillus
(PCR) (Ward & Timmins, 1999). A rhamnosus utilizadas em alimentos,
identificao de Lactobacillus com benefcios comprovados
rhamnosus ocorreu por identificao cientificamente.
baseada no sistema DNA-DNA, e foi
uma identificao fcil, pois sua clula

26
Quadro 5: Linhagens de Lactobacillus rhamnosus utilizadas na fermentao de
alimentos e seus respectivos benefcios sade humana

Linhagem Produtor Origem Benefcios


L. rhamnosus Valio, Intestino Coloniza temporariamente o intestino,
GG (ATCC Finlndia reduz a diarreia por antibiticos em
3103) crianas, imunomodulao, reduo de
enzimas procarcinognicas
L. rhamnosus Urex Urogenital Restaura a microbiota urogenital,
GR-1 Biotech, reduzindo riscos na UTI e evitando
Canad/ infeces por bactrias e leveduras na
Chr vagina; adere s clulas uroepiteliais
Hansen, inibindo o crescimento e adeso de
Dinamarca uropatgenos.
L. rhamnosus Danisco, - Aumenta a imunidade de idosos
DR20/HN0001 Dinamarca
com B. lactis
DR10
L. rhamnosus Chr - Melhora a sade intestinal e a sade
GR-1 com L. Hansen, urogenital feminina
reuteri RC-14 Dinamarca
Fonte: adapatado de Saarela et al., 2000 e Yeung et al., 2002.

4.3.2. Lactobacillus fermentum Bao et al. (2010) verificaram o


potencial probitico in vitro de
A primeira descrio de Lactobacillus Lactobacillus fermentum isolados de
fermentum realizada por Beijerink em leites fermentados tradicionais, mas
1901, como uma espcie seriam necessrias pesquisas in vivo.
heterofermentativa de Lactobacillus que Estes testes in vitro compreendem
pode ser isolado de produtos lcteos, tolerncia a condies de baixo pH, ao
pes, material de fermentao de transito intestinal, bile; alm da
plantas, boca e fezes de humanos atividade de agregao, como por
(Hammes & Vogel, 1995; Dellaglio, exemplo, habilidade de combater
Torriani & Felis, 2004). agentes patognicos, de instalar na
microbiota transitria e atividade
Grande quantidade de Lactobacillus antibacteriana.
fermentum isolada de leites
fermentados tradicionais, como por Fons et al. (1997) descreveram que
exemplo, leites fermentados da China, Lactobacillus fermentum so as
do Tibete, da Monglia e do Sudo principais espcies de Lactobacillus
(Abdelgadir et al., 2001 e Bao et al., spp. heterofermentativos existentes no
2010). intestino humano.

27
Martn et al. (2005) descreveram que mais importantes bactrias produtoras
amostras de Lactobacillus fermentum de cido lctico presentes na microbiota
foram isoladas de leite humano e do intestino humano, trazendo
possuam propriedades probiticas, benefcios ao hospedeiro. Alm disso,
como sobrevivncia no trato um dos microrganismos predominantes
gastrintestinal, adeso s clulas no intestino humano e na vagina,
intestinais e atividade antimicrobiana. atuando tambm como regulador da
microbiota (Reid et al., 2003; Park et
Pereira et al. (2003) relataram que al., 2005).
espcies de Lactobacillus fermentum
so microrganismos normalmente No Quadro 6 esto apresentadas as
presentes na microbiota humana, com principais linhagens de Lactobacillus
habilidade de aderir clulas epiteliais. fermentum utilizadas em alimentos, com
Segundo Morita et al. (1997), benefcios comprovados
Lactobacillus fermentum uma das cientificamente.

Quadro 6: Linhagens de Lactobacillus fermentum utilizadas na fermentao de


alimentos e seus respectivos benefcios sade humana

Linhagem Produtor Origem Benefcios


L. fermentum Urex Biotech, Urogenital Restaura a microbiota urogenital
RC-14 Canad/ Chr
Hansen,
Dinamarca
L. fermentum Universidade de TGI Aumenta a imunidade contra
737/ 104R Gteborg, Sucia Animal colonizao de patgenos no TGI;
coloniza o intestino por diversas
semanas
Fonte: Adapatado de Saarela et al., 2000 e Yeung et al., 2002.

5. MATERIAL E MTODOS 5.1. Delineamento experimental

O experimento foi realizado nos Foram elaborados dois tipos de leites


Laboratrios do Departamento de fermentados, um contendo apenas a
Tecnologia e Inspeo de Produtos de cultura de Lactobacillus rhamnosus e
Origem Animal (DTIPOA) da Escola de um segundo contendo Lactobacillus
Veterinria (EV) da Universidade fermentum.
Federal de Minas Gerais (UFMG),
durante o perodo de julho a dezembro Aps a produo, os leites fermentados
de 2010. Os Laboratrios que foram foram estocados sob refrigerao entre
utilizados so: laboratrio de anlises 8 a 10C e submetidos s anlises
fsico-qumicas, laboratrio de anlises fsico-qumicas e microbiolgicas com
microbiolgicas e laboratrio de anlise 1, 15, 30 e 45 dias de estocagem. Dessa
sensorial. forma, a pesquisa teve um delineamento
fatorial 2x4 (dois tipos de leites

28
fermentados e quatro tempos de Anlises Microbiolgicas para Controle
anlise). Os produtos elaborados de Produtos de Origem Animal e gua
tambm foram submetidos anlise (Brasil, 2003). Para o controle fsico-
sensorial aos 15 e 60 dias de estocagem qumico, foram feitas as seguintes
entre 8 e 10C; neste caso, com um anlises: determinaes de pH, acidez
delineamento 2x2 (dois tipos de leites titulvel; e teores percentuais de
fermentados e dois momentos de gordura, protena, extrato seco total,
anlise). extrato seco desengordurado (Brasil,
2006).
5.2. Controle de qualidade do leite em
p desnatado 5.3 Controle de qualidade do leite em
p desnatado reconstitudo e tratado
A utilizao do leite em p desnatado termicamente
pode ser justificada pela associao da
imagem positiva da ingesto de leite A reconstituio do leite em p foi
desnatado com as caractersticas realizada a 10% em gua destilada,
probiticas das culturas utilizadas. adicionado de sacarose a 8%. Aps
reconstituio o leite foi submetido a
O objetivo da verificao da qualidade um tratamento trmico a 110C por 10
microbiolgica e fsico-qumica dos minutos. Em seguida, foi feito o
lotes de leite em p foi caracterizar o plaqueamento em meio MRS
leite utilizado e garantir, (Acumedia, Lansing, Michigan, United
consequentemente, o controle de States), em duplicata, da diluio 100
qualidade da produo dos leites deste leite em p desnatado
fermentados. Foram utilizados trs lotes reconstitudo a 10% e adicionado de 8%
de leite em p desnatado da marca de sacarose e tratado termicamente.
Molico (Nestl, Araatuba, So Paulo,
Brasil). Todas as anlises foram 5.4. Microrganismos
realizadas em duplicata.
Foram utilizadas duas amostras de
Para o controle microbiolgico foram bactrias produtoras de cido lctico:
realizadas as anlises de contagem Lactobacillus fermentum e
global de microrganismos mesfilos Lactobacillus rhamnosus, isoladas
aerbios (UFC/ml), contagem global de previamente de queijos de coalho
microrganismos termodricos artesanal e industrializado, produzido
(UFC/ml), pesquisas de coliformes em Pernambuco, Brasil, identificadas
totais e fecais (NMP/ml), por anlise de restrio enzimtica de
Staphylococcus spp. e Salmonella spp. DNA ribossomal e avaliadas quanto a
recomendadas pelo Regulamento propriedades probiticas (sensibilidade
Tcnico de Identidade e Qualidade a antimicrobianos e atividade
(RTIQ) de leite em p (Brasil, 1996), antagonista in vitro) (Guedes Neto,
alm da contagem de bolores e 2004).
leveduras. Todos os procedimentos
seguiram a metodologia descrita em Para garantir que as culturas avaliadas
Mtodos Analticos Oficiais para estariam puras, foi realizado o teste de

29
Gram para ambos, e os resultados Aps a ativao, 3% de cada cultura
podem ser vistos nos anexos 1 e 2, foram inoculados em recipientes
sendo o primeiro o Lactobacillus contendo leite desnatado reconstitudo a
rhamnosus e o segundo o Lactobacillus 10%, acrescido de sacarose a 8%,
fermentum. tratado termicamente a 110C por 10
minutos e resfriado a 37C. Esses
5.5. Curvas de fermentao/ recipientes contendo leite, sacarose e
crescimento adicionados de Lactobacillus fermentum
e Lactobacillus rhamnosus foram
A curva de fermentao foi obtida por incubados a 37C 2C pelo tempo
meio das determinaes do pH, da necessrio at a coagulao do leite
acidez titulvel e da enumerao de (Anexo 5 e Anexo 6).
bactrias produtoras de cido lctico
(UFC/ml) em meio gar MRS Esses dois produtos fermentados
(Acumedia, Lansing, Michigan, United constituram de inculo para a
States) nos intervalos de tempo de 2 elaborao dos respectivos leites
horas desde o tempo zero (adio do fermentados. Os inculos foram
inculo) at a coagulao dos leites adicionados em concentrao igual a
desnatados adicionados de 3% em recipientes de 200 ml e 500 ml
Lactobacillus fermentum (leite LF) e contendo o leite em p reconstitudo a
Lactobacillus rhamnosus (leite LR). 10%, adicionado de sacarose a 8%,
tratado termicamente a 110C por 10
O tempo de fermentao tambm foi minutos e resfriado a 37C. Os leites
determinado durante a curva de adicionados com os inculos foram
fermentao, sendo que o momento incubados a 37C 2C at a
inicial foi a adio do inculo ao leite e coagulao. Ao trmino da coagulao
como momento final a formao do os recipientes foram armazenados sob
cogulo. refrigerao entre 8 e 10C. Os
recipientes menores foram utilizados
5.6. Preparo dos leites fermentados para anlises microbiolgicas e fsico-
qumicas e os maiores para as anlises
Para a elaborao dos leites sensoriais, permitindo, assim, que
fermentados, 100 L das culturas contedos de cada frasco fossem
congeladas de Lactobacillus fermentum utilizados apenas em seu momento de
e Lactobacillus rhamnosus foram anlise.
transferidos para tubos de ensaio com
tampa contendo 5mL de Caldo MRS Esse processo foi feito para produzir
(Difco, Detroit, Michigan, United dois leites fermentados a partir das
States). Estes tubos contendo as culturas culturas de Lactobacillus fermentum e
de Lactobacillus fermentum (Anexo 3) e Lactobacillus rhamnosus.
Lactobacillus rhamnosus (Anexo 4)
foram incubados a 37C 2C por 24
horas, sendo esse procedimento repetido
trs vezes para garantir a ativao das
culturas.

30
5.7. Anlises laboratoriais dos leites 5.7.2.1. Enumerao dos microrganismos
fermentados produtores de cido lctico

5.7.1 Avaliao fsico-qumica dos leites As contagens dos microrganismos


fermentados foram realizadas a partir de diluies
decimais seriadas de 10-1 a 10-9 dos
As anlises foram realizadas nos dias 1, leites fermentados produzidos, em
15, 30 e 45 dias de estocagem dos leites salina peptonada (0,85% de NaCl -
fermentados sob refrigerao a 8-10C Labsynth, Diadema, So Paulo, Brasil -
em refrigerador (Ormifrio Ltda GCI004, e 0,1% de peptona bacteriolgica -
Sabar, Minas Gerais, Brasil). A HiMedia, Mumbai, India).
determinao da acidez titulvel, Posteriormente, alquotas de 0,1ml das
expressa em gramas de cido lctico por diluies selecionadas foram espalhadas
100 gramas de produto, foi realizada de sobre o gar MRS (Acumedia, Lasing,
acordo com a norma IDF (1991), de Michigan, United States) e incubadas
acordo com o RTIQ de leites sob aerobiose. A temperatura de
fermentados (Brasil, 2007). A medida incubao para Lactobacillus
de pH foi determinada por meio do fermentum e para Lactobacillus
pHmetro digital de bancada (mPA-210, rhamnosus foi 37C 2C por 48 horas.
Piracicaba, So Paulo, Brasil). O teor Em seguida, e esse perodo, a
percentual de gordura foi obtido pelo enumerao dos microrganismos foi
mtodo de Gerber (Brasil, 2005). Os feita por meio da contagem do nmero
teores percentuais de umidade e extrato de colnias formadas nas placas, sendo
seco total (EST) foram determinados na este nmero multiplicado por 10 e
estufa (Biomatic, Porto Alegre, Rio tambm pelo inverso da diluio
Grande do Sul, Brasil) e balana (adaptado de IDF, 1988).
(SHIMADZU AY220, So Paulo, SP,
37 Brasil) (Brasil, 2006). O teor 5.7.2.2. Pesquisa de coliformes totais e
percentual de protenas foi determinado termotolerantes
pelo mtodo Micro-Kjedahl, no
equipamento TECNAL (TE012, As pesquisas de coliformes totais e
Piracicaba, So Paulo, Brasil), segundo termotolerantes foram realizadas pelo
Brasil (2006). mtodo do Nmero Mais Provvel
(NMP) (Brasil, 2003). No teste
5.7.2. Avaliao microbiolgica dos leites presuntivo, as diluies 100, 10-1 e 10-2
fermentados foram inoculadas em triplicata em tubos
contendo caldo Verde Brilhante
As anlises foram realizadas nos dias (HiMedia, Mumbai, India) e tubos de
um, 15, 30 e 45 dias de estocagem dos Durhan invertidos. Estes tubos foram
leites fermentados sob refrigerao a 8 incubados a 36C por 48 horas. A
10C. identificao da presena de gs nos
tubos de Durhan indica resultado
positivo e por isso, requer a realizao
do teste confirmatrio em gar Levine
para coliformes totais (30C) (IDF,

31
1985) e caldo EC para coliformes fecais utilizada em cada momento de anlise
(45) (Brasil, 2003). sensorial foi de provadores no
treinados, composta por 30 estudantes,
5.7.2.3. Pesquisa de bolores e leveduras funcionrios e professores da Escola de
Veterinria da UFMG. Os provadores,
A pesquisa de bolores e leveduras foi para realizar a avaliao sensorial,
feita de acordo com a Instruo deveriam possuir o hbito de consumir
Normativa (IN) 62, Mtodos Analticos leites fermentados, sendo potenciais
Oficiais para Anlises Microbiolgicas consumidores e compradores dos
para Controle de Produtos de Origem produtos em teste.
Animal (Brasil, 2003).
A avaliao sensorial desta pesquisa foi
Em gar batata dextrose (Acumedia, realizada com o objetivo de verificar a
Lansing, Michigan, United States) aceitao dos consumidores em relao
acidificado a pH 3,5, foram inoculados ao produto desenvolvido, e se haveria
0,1 ml das diluies 100, 10-1 e 10-2 e algum que seria mais aceito.
espalhados com o auxilio de alas de
Drigalski. As amostras receberam codificaes
com sequencias aleatrias de trs
As placas foram incubadas, sem dgitos e servidas aos provadores em
inverter, a 25C 1C (temperatura cabines individuais, em pores de
ambiente), sem inverter por sete dias. 20ml em copos descartveis de plstico
branco, a uma temperatura igual a 8-
5.8. Avaliao sensorial dos leites 10C. E as duas amostras foram
fermentados oferecidas simultaneamente ao
provador.
A avaliao sensorial pode ser realizada
em diferentes situaes pelas empresas Os provadores receberam uma ficha
ou rgos de pesquisa, dentre as quais (Anexo 7) contendo uma escala no
destacam a preferncia do consumidor, estruturada formada por uma linha
classificao dos produtos, correlao inteira, ancorada nos extremos pelos
entre os resultados das anlises fsico- nmeros 0 e 10 sobre a qual marcaram
qumicas e microbiolgicas e da um X, expressando o grau de aceitao
avaliao sensorial e no do produto. A interpretao destes
desenvolvimento de novos produtos, o resultados foi realizada com uma rgua
qual a situao desta pesquisa de 10cm colocada sobre a linha para
(Chaves, 1998). quantificar o grau de aceitao
(Anzaldua-Morales, 1994). A ficha
A anlise sensorial foi realizada em dois tambm continha, alm disso, uma
momentos, 15 e 60 dias de estocagem escala hednica de cinco pontos, que
dos leites fermentados a 8- 10C. Em permitia que os provadores
cada momento, foram analisados qualificassem o quanto gostaram ou
sensorialmente dois produtos diferentes desgostaram, em relao avaliao
(leites fermentados produzidos com as global do produto. Foram atribudos
duas culturas diferentes). A equipe pontos para os graus de aceitao (1 =

32
Detestei, 2 = No gostei, 3 = No gostei representou um bloco, os dois
nem desgostei, 4 = Gostei, 5 = Adorei) tratamento (Lactobacillus rhamnosus e
para que os dados fossem tratados Lactobacillus fermentum) foram
estatisticamente. Alm da ficha considerados parcelas, sendo as
recebiam tambm duas cpias do Termo subparcelas os tempos (um, 15, 30 e 45
de Consentimento Livre e Esclarecido dias de estocagem sob refrigerao) em
(Anexo 8), na qual assinavam as cpias que foram realizadas as anlises fsico-
e ficavam com uma, para garantir que o qumicas e microbiologias e os dois
provador tomasse conhecimento da tempos das anlises sensoriais (15 e 60
pesquisa. dias de estocagem sob refrigerao).
Foram realizadas trs repeties do
O teste de escala hednica um teste experimento.
afetivo, no qual a pessoa indica sua
aceitao em relao ao produto e, em Para a comparao de mdias dos
geral, realizado com potenciais tratamentos, considerando a
consumidores (Chaves, 1998). enumerao de bactrias produtoras de
Anzaldua-Morales (1994) define a cido lctico (UFC/g) e anlises fsico-
escala hednica como uma forma de qumicas utilizou-se a anlise estatstica
mensurar o nvel de satisfao do paramtrica e foi aplicado o teste de
consumidor em relao ao produto Student-Newman-Keuls, em nvel de
avaliado, e a mesma pode ser de 3, 5 ou significncia de 5% (Sampaio, 2002).
9 pontos, sempre variando entre o
gostar e o no gostar, passando pelo no Os resultados da avaliao sensorial
gostei nem desgostei, em seu ponto foram submetidos s anlises
mdio. A escala hednica tambm pode estatsticas no paramtricas, pelos
ser representada por meios grficos, testes de Wilcoxon em nvel de
assim como nesta pesquisa. significncia de 5% (Sampaio, 2002).

A realizao das anlises sensoriais 6. RESULTADOS E DISCUSSO


deste trabalho foi aprovada no dia 02 de
junho de 2010 pelo Comit de tica em 6.1. Controle de qualidade do leite em
Pesquisa (COEP) da UFMG, parecer p desnatado
nmero ETIC 155-2010.
Os dados de acidez titulvel e da
5.9. Anlise Estatstica composio fsico-qumica dos trs
lotes de leite em p desnatados
A anlise estatstica do experimento foi utilizados durante as trs repeties do
o delineamento em blocos ao acaso com experimento esto apresentados na
arranjo em parcelas subdivididas, na Tabela 1.
qual cada lote de leite em p desnatado

33
Tabela 1: Teores percentuais mdios de acidez titulvel e componentes fsico-qumicos
dos trs lotes de leite em p desnatado

Parmetro (%) Lote 1 Lote 2 Lote 3


Gordura 0 0 0
Umidade 3,77 3,66 3,95
Protena 32,87 33,44 33,12
Extrato Seco Total 96,23 96,34 96,05
Acidez* 1,50 1,45 1,49
* g de cido lctico/100g

Os resultados encontrados para o teor que o leite em p utilizado para a


de gordura demonstram que todos os formulao dos leites fermentados
trs lotes de leite em p encontram-se estava de acordo com o RTIQ de leite
dentro dos padres estabelecidos no em p, pois todos os lotes analisados
RTIQ de leite em p (Brasil, 1996), apresentam valores de EST superiores a
tendo em vista que apresentaram 96% (Brasil, 2006).
valores inferiores a 1,5%. A partir
destes resultados, tem-se a indicao de Em relao acidez titulvel, os valores
que o processamento industrial e a encontrados esto expressos de forma
padronizao dos trs lotes de leite em diferente da estabelecida na legislao
p foram realizados corretamente, brasileira (Brasil, 1996), devido
garantindo que os mesmos sejam diferena de tcnicas utilizadas (Brasil,
considerados ideais para a produo de 2006). Apesar dessa diferena, todos os
leites fermentados desnatados. leites apresentaram resultados dentro
dos padres, pois a legislao estabelece
Como pode ser verificado na Tabela 1, que sejam utilizados no mximo 18ml
os resultados percentuais de umidade de NaOH 0,1N para cada 10 gramas de
tambm se encontram dentro dos amostra e, na anlise realizada, foram
padres preconizados pela legislao utilizados no mximo 9 ml para cada 5
brasileira para leite em p (Brasil, gramas de amostra.
2006), a qual estabelece o limite de
4,0% de umidade. Apesar de o RTIQ de Os parmetros de protena no podem
leites fermentados no mencionar ser discutidos com base no RTIQ de
diretamente os parmetros para Extrato leite em p (Brasil, 1996), pois no
Seco Total (EST), o mesmo pode ser possuem padres estabelecidos.
discutido com base no parmetro de Entretanto, os resultados desse
umidade, tendo em vista que o teor parmetro em conjunto com os demais
percentual de EST igual todos os (extrato seco total, acidez titulvel,
constituintes do alimento (representado umidade e gordura) proporciona a
pelo nmero 100) exceto a umidade. verificao de que a composio fsico-
Portanto, para leite em p desnatado, qumica dos trs lotes de leite em p
esse valor seria de no mnimo 96%. analisados semelhante, indicando
Com base nessa hiptese, pode-se dizer padronizao do leite em p desnatado
que foi utilizado no experimento. Uma foi observado, demonstrando que o
possvel falta de padronizao poderia tratamento trmico aplicado (110C por
alterar o metabolismo dos 10 minutos, seguido de resfriamento a
microrganismos, os resultados fsico- 37C) foi adequado para garantir a
qumicos, sensoriais e microbiolgicos esterilidade dos leites em p desnatados
dos leites fermentados produzidos a reconstitudos a 10%, adoado a 8%.
partir dos mesmos.
6.3. Curva de Fermentao /
Nas anlises microbiolgicas realizadas Crescimento
para os trs lotes de leite em p, foi
verificado ausncia de bolores e 6.3.1. pH
leveduras, microrganismos mesfilos
aerbios; microrganismos termodricos, A Figura 1 apresenta os resultados
Salmonella spp., Staphylococcus spp. mdios de duas repeties da medida
Para coliformes totais e fecais o dos valores de pH a cada duas horas,
resultado foi menor que 3,0 NMP/ml. partindo do tempo zero (adio do
Estes resultados superam os padres inculo) at a coagulao completa,
estabelecidos pela legislao brasileira durante a incubao a 37C do leites
para leite em p (Brasil, 1996) e, desnatados esterilizados adicionados de
portanto, apresentaram qualidade Lactobacillus rhamnosus e
microbiolgica adequada. Lactobacillus fermentum.

6.2. Controle de qualidade do leite em


p desnatado reconstitudo

O crescimento de colnias de
microrganismos em meio MRS
(Acumedia, Lansing, Michigan, United
States) plaqueado na diluio 100 no

35
Figura 1: Mdias de duas repeties de pH durante a fermentao de leites fermentados
esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e Lactobacillus fermentum
(LF).
enquanto que para o leite fermentado
O final da fermentao foi baseado na por Lactobacillus rhamnosus, o pH
formao do cogulo, com o mdio inicial de 6,44 e o final 4,63.
desprendimento do mesmo, como pode
ser observado nos Anexos 5 e 6. Pode- Em relao ao tempo de fermentao
se verificar que a formao do cogulo (Anexo 9), leite fermentado por
coincidiu com o ponto isoeltrico da Lactobacillus fermentum apresentou
casena, ou seja, pH em torno de 4,6 duas horas a menos de fermentao
(Fennema, 1996). quando comparado ao leite fermentado
por Lactobacillus rhamnosus.
Avaliando as variaes de pH (Figura Considerando a escassez de trabalhos
1), percebe-se que at o tempo de quatro avaliando a fermentao do leite com
horas o decrscimo foi pequeno e, a ambos os microrganismos, esses
partir deste tempo, houve uma queda resultados possuem grande relevncia
brusca no pH para o leite fermentado para avaliar o comportamento de tais
por Lactobacillus fermentum. Para o microrganismos durante todo o tempo
leite fermentado por Lactobacillus de fermentao em leites desnatados.
rhamnosus, o pH comeou a reduzir
bastante a partir das seis horas de O baixo tempo de fermentao possui
incubao 37 2C. alto valor para a indstria de
processamento de leites fermentados,
Observa-se tambm, que o pH inicial e uma vez que um menor tempo de
final de ambos os leites fermentados fermentao poder resultar em um
foram prximos, o pH mdio inicial do maior volume de produo; portanto
leite fermentado por Lactobacillus esses dados apresentam grande
fermentum foi de 6,39 e o final 4,58;

36
relevncia para a indstria de laticnios A Figura 2 apresenta os resultados de
e derivados. acidez titulvel durante a fermentao
de leites desnatados esterilizados
6.3.2. Acidez Titulvel adicionados de Lactobacillus
rhamnosus e Lactobacillus fermentum.

Figura 2: Mdias de duas repeties de acidez titulvel (%) durante a fermentao de


leites fermentados esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e
Lactobacillus fermentum (LF).

A Figura 2 demonstra que, assim como produto e a final, 0,55 g de cido


o pH apresentou-se inicialmente estvel, lctico/100 g de produto.
a acidez tambm. Isso demonstra que os
dois parmetros esto relacionados na Na Figura 2, verifica-se que todos os
produo de leites fermentados, pois leites fermentados apresentaram valores
esperado que com a reduo do pH acidez titulvel inferiores a 0,60%, que
ocorresse um aumento da acidez. o valor mnimo oficial estabelecido
pela legislao brasileira para leites
Os valores iniciais e finais de acidez fermentados (Brasil, 2007). Apesar de
titulvel de ambos os leites fermentados os valores serem menores que 0,60%,
foram prximos, sendo para o leite pode-se dizer que os mesmos esto bem
fermentado por Lactobacillus prximos da referncia, pois para o leite
fermentum 0,19g de cido lctico/100 g fermentado por Lactobacillus
de produto inicialmente e 0,58 g de fermentum, a diferena foi de 0,02% e
cido lctico/100 g de produto no final para o leite fermentado por
da fermentao, e para o Lactobacillus Lactobacillus rhamnosus a diferena foi
rhamnosus a acidez titulvel inicial foi de 0,05%. Vale ressaltar que os valores
de 0,20 g de cido lctico/100 g de estabelecidos no RTIQ de leites
fermentados (Brasil, 2007) so baseados

37
em culturas comerciais, as quais no acrescidos ou no de concentrado
foram utilizadas neste trabalho, pois proteico de soro.
conforme j mencionado anteriormente,
as culturas foram isoladas de produtos Oliveira et al. (2009) verificaram que
lcteos artesanais brasileiros. durante a fermentao de leites
fermentados contendo Lactobacillus
Viegas et al. (2010) verificou em sua rhamnosus em associao com
pesquisa com bactrias tambm isoladas Streptococcus thermophilus a acidez
de queijos de coalho artesanais, tambm teve um aumento com o passar
diferena semelhante entre a acidez do tempo.
titulvel durante a fermentao. Os
valores encontrados foram mais baixos 6.3.3. Enumerao das bactrias
que aqueles postulados pela legislao produtoras de cido lctico
brasileira (Brasil, 2007), variando entre
0,32% e 0,47%, entre os leites Na Figura 3 podem ser observados
fermentados elaborados com os valores que permitem acompanhar o
microrganismos testados. Os crescimento dos microrganismos
microrganismos utilizados foram Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus acidophilus, Weissella Lactobacillus fermentum durante o
confusa, isolados ou em associao, processo de fermentao de leites
desnatados esterilizados.

Figura 3: Mdias de duas repeties das contagens (log UFC/g) durante a fermentao
de leites fermentados esterilizados adicionados de Lactobacillus rhamnosus (LR) e
Lactobacillus fermentum (LF).

Segundo Shah (2000) e Hassan e Frank mesmos esto em culturas puras, como
(2001), o crescimento de espcies o caso deste trabalho, lento. Por isso,
probiticas de Lactobacillus e outros at o tempo de oito horas aps a adio
microrganismos em leites, quando os do inculo inicial, a curva para a

38
fermentao por Lactobacillus produtos finais so desejadas no intuito
rhamnosus se manteve mais constante e de garantir que quantidades de bactrias
depois desse tempo ocorreu um pico de viveis sejam mantidas durante todo o
crescimento. No caso da fermentao tempo de estocagem. Segundo Hekmat,
por Lactobacillus fermentum, o Soltani e Reid (2009), Lactobacillus
crescimento praticamente constante rhamnosus apresentou contagens entre
em todo o tempo at a coagulao. 107 e 1010 UFC/g na fermentao de
leite, garantindo a contagem adequada
Ao comparar os resultados de acidez durante todo o tempo de estocagem.
titulvel e da enumerao dos Para Lactobacillus fermentum, h uma
microrganismos produtores de cido escassez de trabalhos, no sendo
lctico, verifica-se que Lactobacillus possvel uma comparao, tornando os
rhamnosus foi mais resistente ao dados deste trabalho bastante relevantes
ambiente mais cido em relao a para pesquisas futuras.
Lactobacillus fermentum, pois seu
crescimento possuiu um pico em uma 6.4. Avaliao fsico-qumica dos
acidez mais alta. leites fermentados

Os dois leites fermentados apresentaram 6.4.1. pH


aps o fim da fermentao contagens de
bactrias em valores superiores ao A Tabela 2 apresenta os resultados de
mnimo estabelecido no RTIQ de leites pH nos tempos um, 15, 30 e 45 dias de
fermentados (Brasil, 2007). Essa estocagem sob refrigerao a 8-10C
legislao estabelece como valor elaborados com as culturas
mnimo de 106 UFC/g para leites Lactobacillus rhamnosus e
fermentados. Contagens mais elevadas Lactobacillus fermentum.
de microrganismos probiticos nos

Tabela 2: Resultados mdios percentuais de trs repeties pH de leites desnatados


esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus fermentum,
armazenados sob refrigerao entre 8 a 10 C, durante 45 dias de estocagem

Leite Dias Mdias


fermentado 1 15 30 45
LR 4,68 4,43 4,13 4,14 4,35
LF 4,63 4,49 4,19 4,18 4,37
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Dados da Tabela 2 demonstram que no tipo de leite fermentado no foram


houve diferena significativa (P>0,05) diferentes durante os 45 dias de
para os valores de pH, ou seja, as estocagem sob refrigerao entre 8 e
variaes encontradas nas medies de 10C.
pH a cada tempo de anlise e para cada

39
No possvel discutir os resultados de fermentados produzidos com diferentes
pH com base na legislao brasileira, microrganismos produtores de cido
pois o RTIQ de leites fermentados lctico, o pH tambm decresceu.
(Brasil, 2007) no estabelece
parmetros para essa anlise. Entre os dois leites fermentados
avaliados o que apresentou a menor
Donkor et al. (2006) verificaram que mdia de pH foi o leite fermentado por
com a estocagem, mesmo em Lactobacillus rhamnosus.
refrigerao controlada, o pH de leites
fermentados sofre um declnio, devido a 6.4.2. Acidez Titulvel
maior produo de cido lctico pelos
microrganismos adicionados ao leite e A Tabela 3 apresenta os resultados de
que essa reduo de pH pode afetar ou acidez titulvel nos tempos 1, 15, 30 e
no a viabilidade das bactrias 45 dias de estocagem sob refrigerao
probiticas produtoras de cido lctico. entre 8 e 10C elaborados com as
culturas Lactobacillus rhamnosus e
Viegas et al. (2010) observaram que Lactobacillus fermentum.
durante 40 dias de estocagem de leites

Tabela 3: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de acidez titulvel
de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10C, durante 45 dias
de estocagem

Leite Dias Mdias


fermentado 1 15 30 45
LR 0,65 0,69 0,93 1,03 0,82
LF 0,60 0,66 0,91 1,06 0,81
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Os valores de acidez titulvel estavam mesmo aps o trmino da coagulao os


de acordo com o preconizado no RTIQ microrganismos no pararam de
de leites fermentados (Brasil, 2007), o fermentar o leite. Isso foi observado
qual estabelece que os limites mximo e pelo fato de que entre os tempos de
mnimo sejam 0,6 e 2,0g de cido anlise sempre havia nova coagulao.
lctico por 100g de produto. Apesar de Alm disso, o comportamento
haver diferenas entre os valores relacionado com o pH, pois conforme j
encontrados, a mesma no foi observado, o pH diminuiu com os
significativa estatisticamente. dias, o que indica que o leite ficou mais
cido.
O comportamento da acidez tambm
est dentro do esperado, ou seja, com o Na anlise de acidez titulvel, o leite
passar dos dias, a mesma aumenta, pois fermentado por Lactobacillus

40
rhamnosus apresentou maior mdia, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus
confirmando o que foi mencionado acidophilus, Weissella confusa, com ou
anteriormente na anlise de pH; e o leite sem CPS, assim como foi verificado no
fermentado por Lactobacillus presente trabalho.
fermentum apresentou menor mdia,
tambm em acordo com a anlise de 6.4.3. Teor de protena
pH.
A Tabela 4 apresenta os resultados de
Donkor (2006) e Viegas et al.(2010) teor de protena nos tempos 1, 15, 30 e
tambm verificaram aumento na acidez 45 dias de estocagem sob refrigerao
titulvel durante os 40 dias de entre 8 e10C elaborados com as
estocagem de leites fermentados culturas Lactobacillus rhamnosus e
elaborados com Bifidobacterium lactis, Lactobacillus fermentum.

Tabela 4: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de protena de


leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10C, durante 45 dias
de estocagem

Leite Dias Mdias


fermentado 1 15 30 45
LR 3,56 3,45 3,29 3,22 3,38
LF 3,52 3,43 3,30 3,25 3,38
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Dados da Tabela 4 mostram que no produzidos atendem tal legislao em


houve diferena entre os tempos de todos os tempos de anlise, durante os
anlise e os tipos de microrganismo 45 dias de estocagem sob refrigerao
utilizado para a fermentao em relao entre 8 e 10C.
ao valor proteico. Assim como no h
diferena (P>0,05) entre as mdias dos Viegas et al. (2010) verificaram que os
45 dias. Isso demonstra que, embora leites fermentados sem o acrscimo de
haja diferena entre os percentuais de CPS apresentaram variaes em seus
protena entre os leites fermentados teores proteicos, no tendo sempre um
produzidos, essas variaes no so aumento ou reduo do mesmo,
significativas. havendo picos de protena precedidos
de aumento com posterior reduo no
Com base nos requisitos estabelecidos teor.
pela legislao brasileira para leites
fermentados, RTIQ de leites 6.4.4. Teor de gordura
fermentados (Brasil, 2007), a qual
determina que o mnimo de protena Nas trs repeties de teor de gordura
de 2,9%. Os leites fermentados nos leites fermentados, os mesmos

41
apresentaram zero por cento de gordura de gordura em leites fermentados
durante os tempos de estocagem (45 desnatados no mximo 0,5% ou 0,5g
dias) sob refrigerao a 8-10C. Esses de gordura por 100g de produto.
resultados esto em consonncia com o
tipo de leite em p utilizado no processo 6.4.5. Teor de umidade e extrato seco
de fabricao dos leites fermentados, o total
leite em p desnatado, que tambm
apresentou zero por cento de gordura Dados da Tabela 5 apresenta os
em sua anlise. Alm disso, os resultados de umidade nos tempos 1,
resultados esto de acordo com os 15, 30 e 45 dias de estocagem sob
padres estabelecidos no RTIQ de leites refrigerao entre 8 e 10C elaborados
fermentados (Brasil, 2007), o qual com as culturas Lactobacillus
determina que a porcentagem mxima rhamnosus e Lactobacillus fermentum.

Tabela 5: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de umidade de


leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao a 8-10 C, durante 45 dias de
estocagem

Leite Dias Mdias


fermentado 1 15 30 45
LR 82,60 83,26 83,90 84,85 83,65
LF 83,19 81,84 83,05 82,94 82,76
Letras minsculas diferentes na mesma linha e maisculas na mesma coluna indicam
diferena estatstica significativa (p<0,05)
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Os valores de umidade apresentados na reduzem a umidade e aumentam a


Tabela 5 indicam que no houve quantidade de extrato seco total. Para
diferena (P>0,05) entre os 45 dias de garantir maior qualidade a esses
estocagem sob refrigerao a 8-10C, produtos, seria necessrio o
isso significa que apesar das variaes estabelecimento de parmetros pela
entre as porcentagens de umidade as legislao, de modo a garantir a
mesmas foram similares durante toda a uniformidade dos mesmos, facilitando a
estocagem. inspeo.

O RTIQ de leites fermentados (Brasil, A Tabela 6 apresenta os resultados de


2007) no estabelece padres para as extrato seco total nos tempos um, 15, 30
anlises de umidade, no sendo e 45 dias de estocagem sob refrigerao
possvel, portanto, comparar os entre 8 a 10C elaborados com as
resultados. Observa-se que alguns culturas Lactobacillus rhamnosus e
laticnios fazem uso de aditivos que Lactobacillus fermentum.

42
Tabela 6: Resultados mdios percentuais de trs repeties dos teores de extrato seco
total de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10 C, durante 45 dias
de estocagem
Leite Dias Mdias
fermentado 1 15 30 45
LR 17,40 16,74 16,10 15,15 16,35
LF 16,81 18,16 16,95 17,06 17,24
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Assim como nas anlises umidade, no 6.5. Avaliao microbiolgica dos


houve diferena (P>0,05) entre os 45 leites fermentados
dias de estocagem sob refrigerao a 8-
10C e os leites fermentados, 6.5.1. Enumerao dos microrganismos
demonstrando que mesmo com produtores de cido lctico
variaes de porcentagens essas no
foram suficientemente significativas. A Tabela 7 apresenta as contagens totais
Alm disso, o RTIQ de leites das bactrias produtoras de cido lctico
fermentados (Brasil, 2007) no nos tempos 1, 15, 30 e 45 dias de
estabelece padres para o extrato seco estocagem a 8-10C de leites
total, impossibilitando a comparao fermentados elaborados com as culturas
com valores oficiais. Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum.

Tabela 7: Contagens mdias (UFC/g) em gar MRS, de trs repeties de leites


desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus
fermentum, armazenados sob refrigerao a 8-10 C, durante 45 dias de estocagem

Leite Dias Mdias


fermentado 1 15 30 45
LR 1,0x1010 2,2x1011 1,9x109 1,5x1011 9,6x1010
LF 5,4x109 1,7x1010 8,3x108 6,5x1010 2,2x1010
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Comparando os valores mdios das trs dessas contagens durante os 45 dias de


repeties das contagens (UFC/g) de armazenamento e estocagem sob
bactrias produtoras de cido lctico refrigerao entre 8 e 10C (Tabela 7).
totais presentes nos leites fermentados
no foi observado entre eles diferena A legislao brasileira determina as
significativa (P> 0,05). Tambm no contagens mnimas para
houve diferena (P>0,05) entre os microrganismos especficos em leites
valores mdios das trs repeties fermentados, as quais devem ser

43
cumpridas durante todo o perodo de 45 dias quando comparado a
validade do produto. Para leites Lactobacillus fermentum. Essa
fermentados, cuja fermentao ocorre a diferena na contagem pode ter ocorrido
partir de uma ou vrias bactrias pelo fato de que a cultura de
produtoras de cido lctico, a contagem Lactobacillus fermentum estava h mais
mnima definida. Portanto, esse valor tempo sem ser ativada; enquanto a
de contagem, segundo a legislao de cultura de Lactobacillus rhamnosus
106 UFC/g. havia sido ativada recentemente, h
menos de seis meses de seu uso para
Comparando os dados da Tabela 7 com este trabalho.
a legislao, verifica-se que tanto o leite
fermentado produzido pela fermentao Realizando um paralelo comparativo
de Lactobacillus rhamnosus quanto por entre os valores de acidez titulvel e a
Lactobacillus fermentum esto de enumerao dos microrganismos
acordo com a mesma, tendo em vista produtores de cido lctico, verifica-se
que as mdias das contagens foram de que, mesmo com o aumento da acidez,
9,6x1010UFC/g para o Lactobacillus o nmero de microrganismos no
rhamnosus e 2,2x1010UFC/g para o reduziu significativamente, eles se
Lactobacillus fermentum. mantiveram constantes durante o tempo
de estocagem, demonstrando potencial
Ainda sobre essas contagens, elas no tolerncia dos mesmos aos nveis de
s esto cumprindo a legislao vigente acidez encontrados nos produtos
para leites fermentados como superam a durante a fermentao.
mesma, garantindo assim um produto
de qualidade para o consumidor, com Hekmat, Soltani e Reid (2009)
todos seus efeitos benficos verificaram que durante a estocagem
sustentados. Pois para que um produto refrigerada de leites fermentados
seja considerado probitico ele deve ter produzidos com Lactobacillus
seus microrganismos em nmeros rhamnosus e Lactobacillus reuteri
viveis durante todo o seu prazo de associados, Lactobacillus rhamnosus se
validade. Vrios estudos vm sendo manteve mais vivel durante o perodo,
realizados para determinar qual essa mantendo sempre contagens entre 107 e
quantidade ideal de microrganismos 108 UFC/g, resistindo sempre elevao
para garantir o seu efeito benfico, com da acidez e reduo do pH.
isso alguns autores sugerem que a
quantidade mnima de bactrias por 6.5.2. Pesquisa de coliformes totais e
grama de leite fermentado deva ser de termotolerantes
106UFC/g, sendo que a dose ingerida
recomendada est em torno de 108- Nas trs repeties de pesquisa de
109UFC (Rasic e Kurmann, 1983 coliformes totais e termotolerantes nos
citados por Gomes e Malcata, 1999). leites fermentados, no foi observada a
presena de gs em nenhum dos tubos
Alm disso, pode-se verificar que contendo Caldo Verde Brilhante e tubos
Lactobacillus rhamnosus sempre de Durhan invertidos. Portanto apenas a
apresentou contagem maior durante os prova presuntiva foi realizada nesta

44
anlise. Esses resultados garantem que 10C. Isso demonstra que no houve
houve condies higinicas sanitrias contaminao ambiental ou por
adequadas durante o processo de manipulao com esses
elaborao e armazenamento dos leites microrganismos, garantindo qualidade
fermentados produzidos. microbiolgica superior ao exigido pelo
RTIQ de leites fermentados, o qual
Alm disso, esses resultados indicam permite no mximo duas mostras com
ausncia de coliformes totais e contagens entre 50 e 200 UFC/g (Brasil,
termotolerantes durante os 45 dias de 2007).
estocagem sob refrigerao entre 8 e
10C, garantindo qualidade 6.6. Avaliao sensorial dos leites
microbiolgica dentro do exigido pelo fermentados
RTIQ de leites fermentados, o qual
permite at duas amostras com 6.6.1. Teste de aceitao pela escala
contagens entre 10 e 100 UFC/g para hednica de cinco pontos
coliformes totais, e at duas amostras
com contagens menores que 3 at 10 As medianas apresentadas na Tabela 8
UFC/g (Brasil, 2007). representam os resultados das anlises
sensoriais dos leites fermentados por
6.5.3. Pesquisa de bolores e leveduras Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum representados
No se observou crescimento de em forma de pontos atribudos a cada
colnias de bolores e leveduras nas degrau de aceitao (adorei, gostei, no
placas, portanto os resultados indicam gostei nem desgostei, no gostei,
ausncia dos mesmos em todos os leites detestei) presente na escala hednica de
fermentados durante os 45 dias cinco pontos da ficha de anlise
estocados sob refrigerao entre 8 e sensorial.

Tabela 8: Medianas dos resultados do teste de aceitao (escala hednica de cinco


pontos) de leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 a 10 C, durante 60 dias
de estocagem
Leite Dias
fermentado 15 60
LR 4,0a 3,0b
LF 4,0a 3,0b
Letras minsculas diferentes na mesma linha indicam diferena estatstica significativa
(P<0,05).
1- Detestei, 2- No gostei, 3-No gostei nem desgostei, 4-Gostei, 5-Adorei
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Os dados da Tabela 8 demonstram que significativa entre os dois tipos de leites


no houve diferena (P>0,05) fermentados produzidos, havendo

45
diferena (P<0,05) apenas entre cada como referncia na avaliao sensorial.
leite a cada momento de anlise. Isso foi observado nos comentrios
realizados pelos provadores durante a
As notas atribudas pelos provadores no anlise sensorial.
dia 15 tiveram como mediana, em
ambos os leites, 4, o que significa Com relao anlise sensorial, pode-se
gostei; j no dia 60, as notas foram 3, verificar que 60 dias pode ser um tempo
significando no gostei nem desgostei. longo para o prazo de validade, pois
Essa diferena entre as notas pode ser apesar dos provadores no gostaram
explicada pelo fato de que com o passar nem desgostaram do leite neste prazo.
do tempo os leites foram acidificando e
o consumidor tem preferncia por 6.6.2. Teste de aceitao pela escala no
sabores mais suaves e menos cidos de estruturada
leites fermentados.
As medianas apresentadas na tabela 9
Alm disso, verificou-se que a maior representam os resultados das anlises
parte dos provadores associou o termo sensoriais dos leites fermentados por
leite fermentado marca comercial que Lactobacillus rhamnosus e
utiliza a cultura Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum representados
indicando que os mesmos em forma de escala no estruturada
provavelmente utilizam esses produtos ancorada nos nmeros 0 e 10.

Tabela 9: Medianas dos resultados do teste de aceitao (escala no estruturada) dos


leites desnatados esterilizados, fermentados por Lactobacillus rhamnosus e
Lactobacillus fermentum, armazenados sob refrigerao entre 8 e 10 C, durante 60 dias
de estocagem
Leite Dias
fermentado 15 60
LR 6,87Aa 4,90Ab
LF 6,43Aa 5,94Ba
Letras minsculas diferentes na mesma linha e maisculas na mesma coluna indicam
diferena estatstica significativa (P<0,05).
LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

Os dados apresentados pela Tabela 9 no houve diferena (P>0,05) entre os


demonstram que houve diferena mesmos; entretanto, aos 60 dias h
(P<0,05) entre os dois tempos de anlise diferena (P<0,05).
para o leite fermentado por
Lactobacillus rhamnosus, sendo que o Esses resultados no demonstram muita
mesmo comportamento no pde ser semelhana com a os apresentados na
observado para o Lactobacillus tabela anterior (Tabela 8), pois o leite
fermentum. Comparando os dois leites fermentado por Lactobacillus
em cada tempo de anlise, aos 15 dias rhamnosus apresentou diferena

46
(P<0,05) entre os tempos de anlise, acidez titulvel (%) mais altos ao final
assim como na tabela anterior; por outro da fermentao.
lado, o leite fermentado por
Lactobacillus fermentum apresentou Todos os parmetros fsico-qumicos
outro comportamento, mantendo-se sem no apresentaram diferenas (P>0,05)
diferena (P>0,05) entre os tempos de entre os tempos de anlise e os leites
anlise. fermentados.

As notas atribudas pelos provadores Em todos os leites fermentados, as


apresentaram perfis diferentes com o concentraes de bactrias produtoras
tempo, pois aos 15 dias houve de cido lctico foram suficientes
preferncia pelo leite fermentado por (mdias acima de 108 UFC/g) para
Lactobacillus rhamnosus, em termos de garantir provveis efeitos probiticos,
valores numricos de notas; entretanto, durante os 45 dias de estocagem sob
aos 60 dias a preferncia foi pelo refrigerao entre 8 e 10C, sugerindo,
Lactobacillus fermentum. tambm, que este tempo pode ser
utilizado como prazo de validade para
Durante a anlise das fichas sensoriais, tais produtos.
verificou-se que os provadores
referiam-se ao leite fermentado por Os resultados das anlises
Lactobacillus rhamnosus aos 15 dias microbiolgicas, principalmente da
como um excelente leite, muito gostoso, pesquisa de coliformes totais e
muito similar ao de uma famosa marca, termotolerantes e bolores e leveduras,
enquanto que aos 60 esse mesmo leite que indicaram valores adequados dos
era referenciado como muito cido, de mesmos durante os 45 dias de
sabor desagradvel. Portanto, verifica- refrigerao, garantindo a qualidade dos
se que esse leite acidificou mais que o leites fermentados, possuindo a mesma
produzido por fermentao por superior ao exigido na legislao
Lactobacillus fermentum. (Brasil, 2007).

Durante as anlises sensoriais, os


7. RESUMO DOS RESULTADOS provadores sempre se referiam a um
produto comercial fermentado por
Todos os leites fermentados Lactobacillus casei ao avaliar o leite
apresentaram contagens de fermentado por Lactobacillus
microrganismos com valores superiores rhamnosus e, no teste de escala
ao mnimo estabelecido no RTIQ de hednica, no verificaram diferenas
leites fermentados por Lactobacillus entre os dois leites. Como a segunda
spp. (Brasil, 2007) e adequadas do anlise sensorial ocorreu aos 60 dias de
ponto de vista probitico. estocagem, verificou-se que o mesmo
um prazo muito longo para estocagem,
Os leites fermentados por Lactobacillus tendo em vista que a maioria dos
rhamnosus apresentaram valores mais avaliadores comentou sobre a alta
baixos de pH e, consequentemente, de acidez de ambos os leites.

47
8. CONCLUSES

possvel produzir leites fermentados


com qualidade a partir de
microrganismos isolados de produtos
lcteos artesanais brasileiros, ou seja, as
culturas lcticas Lactobacillus
rhamnosus e Lactobacillus fermentum
podem ser utilizadas para a produo de
novos leites fermentados, os quais
poderiam ter prazo de validade de 45
dias, quando armazenados a 8-10C.

Leites fermentados por Lactobacillus


rhamnosus e Lactobacillus fermentum
isolados de queijo de coalho artesanal
apresentaram caractersticas fsico-
qumicas e microbiolgicas (incluindo
contagens de microrganismos)
adequadas e de acordo com a legislao
vigente para os produtos disponveis
para o consumo, atualmente. No
entanto, os mesmos leites fermentados
apresentaram aceitaes distintas nos
dois tempos de anlise avaliados,.

Comparando os dois tipos de leites


fermentados, verifica-se uma maior
aceitao do leite fermentado por
Lactobacillus fermentum teve uma
maior aceitao aos 60 dias de anlise,
possivelmente por apresentar menor
acidez e maior pH. Isso ainda pode ter
influenciado a viabilidade do
microrganismo, pois o mesmo
apresentou menor contagem quando
comparado com o leite fermentado por
Lactobacillus rhamnosus, apesar de no
haver diferena significativa entre os
valores na enumerao de bactrias
cido lctica.

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54
10. ANEXOS

Anexo 1: Teste de Gram Lactobacillus rhamnosus (100x de aumento Microscpio


ptico)

55
Anexo 2: Teste de Gram Lactobacillus fermentum (100x de aumento Microscpio
ptico)

56
Anexo 3: Crescimento em caldo MRS do Lactobacillus fermentum aps 72 horas de
incubao

57
Anexo 4: Crescimento em Caldo MRS do Lactobacillus rhamnosus aps 72 horas de
incubao

58
Anexo 5: Fotografia do cogulo formado por Lactobacillus rhamnosus

59
Anexo 6: Fotografia do cogulo formado por Lactobacillus fermentum

60
Anexo 7: Modelo da Ficha de Anlise Sensorial utilizada nas anlises sensoriais dos
leites fermentados estocados por 15 e 60 dias sob refrigerao 8-10C.

FICHA DE ANLISE SENSORIAL

Nome: ________________________________________ Data: ________

Por favor, prove com ateno as amostras.


Identifique o nmero de cada amostra e marque um x na linha abaixo, como se
estivesse dando uma nota para o produto numa escala de 0 (zero) a 10 (dez). Marque
tambm uma das opes a seguir, dando sua opinio sobre cada amostra.

Amostra: __________
0 _______________________________________________ 10

Amostra: __________
0 _______________________________________________ 10

61
Anexo 8: Modelo do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para a Anlise
Sensorial
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Ttulo da Pesquisa: Caractersticas fsico-qumicas, microbiolgicas e sensoriais de leites fermentados


probiticos produzidos com bactrias produtoras de cido lctico isoladas de queijo coalho de
Pernambuco
Nome dos Pesquisadores: Marcelo Resende de Souza e Debora Pinheiro Guimares Mendes
O senhor (senhora) est sendo convidado (a) a participar desta pesquisa que tem a finalidade de avaliar as
caractersticas sensoriais de leites fermentados produzidos a partir de bactrias produtoras de cido lctico
isoladas de queijo coalho de Pernambuco.
Essa pesquisa contar com 30 pessoas, que tenham o hbito de consumir leites fermentados, sendo que o
sexo e a idade no interferem na mesma.
O senhor (senhora) tem a liberdade de recusar a participar e ainda se recusar a continuar participando em
qualquer fase da pesquisa.
O senhor (senhora) ir avaliar os leites fermentados produzidos nessa pesquisa atravs de formulrios
prprios, no laboratrio de anlise sensorial do Departamento de Tecnologia e Inspeo de Produtos de
Origem Animal, localizado na Escola de Veterinria da Universidade Federal de Minas Gerais.
A participao nesta pesquisa no traz complicaes legais, pois os produtos passaro por anlises
microbiolgicas antes da anlise sensorial, garantindo segurana ao senhor (senhora). Os procedimentos
adotados nesta pesquisa obedecem aos Critrios da tica em Pesquisa com Seres Humanos conforme
Resoluo no. 196/96 do Conselho Nacional de Sade. Nenhum dos procedimentos usados oferece riscos
sua dignidade.
Todas as informaes coletadas nesse estudo so confidenciais e somente os pesquisadores tero acesso
aos dados individualmente e os mesmos sero divulgados de forma conjunta, sem citar nomes de
participante.
Ao participar desta pesquisa o senhor (senhora) no ter benefcio direto, mas esperamos que este estudo
traga informaes importantes sobre a produo de leites fermentados, de forma que esse conhecimento
os pesquisadores se comprometem a divulgar os resultados obtidos.
O senhor (senhora) no ter nenhum tipo de despesa para participar da mesma.
Aps estes esclarecimentos, solicitamos o seu consentimento de forma livre para participar desta
pesquisa. Portanto preencha, por favor, os itens que se seguem: Confiro que recebi cpia deste termo de
consentimento, e autorizo a execuo do trabalho de pesquisa e a divulgao dos dados obtidos neste
estudo.
Obs: No assine esse termo se ainda tiver dvida a respeito.
Consentimento Livre e Esclarecido
Tendo em vista os itens acima apresentados, eu, de forma livre e esclarecida, manifesto meu
consentimento em participar da pesquisa
_____________________________________________________________
Nome do Participante da Pesquisa
_____________________________________________________________
Assinatura do Participante da Pesquisa
_____________________________________________________________
Assinatura do Pesquisador 1
______________________________________________________________
Assinatura do Pesquisador 2

Pesquisadores: Marcelo Resende de Souza, Debora Pinheiro Guimares Mendes


Cmite de tica em Pesquisa - Av. Antnio Carlos, 6627 Unidade Administrativa II 2 andar
Sala 2005 Campus Pampulha Belo Horizonte MG Brasil CEP: 31270-901 Tel: (31)
3409-4592 - Email: coep@prpg.ufmg.br

62
Anexo 9: Mdia das duas repeties do tempo de fermentao dos leites desnatados
adoados esterilizados adicionados de Lactobacillus fermentum e Lactobacillus
rhamnosus

LR: leite fermentado por Lactobacillus rhamnosus; LF: leite fermentado por
Lactobacillus fermentum

63