Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Cultura de Clulas
o processo pelo qual clulas so mantidas vivas e em crescimento fora de seu tecido original em condies controladas.
Conjunto de tcnicas que permitem cultivar ou manter clulas isoladas fora do organismo onde existem, mantendo as
caractersticas prprias.
Podem fazer-se culturas a partir tecidos humanos, animais e vegetais.
A cultura de tecidos implica a prvia desagregao (mecnica ou enzimtica) do tecido original e em que as clulas so
cultivadas numa camada aderente, num substrato slido ou em suspenso em meio de cultura.
Introduo
Cultura de Clulas:
Objetivo principal de reproduzir as mesmas condies in vivo, permitindo o crescimento das clulas para estuda-las
isoladamente e/ou suas interaes, avaliando seu crescimento, desenvolvimento e formao de produtos
economicamente viveis.
Indstria biotecnolgica: inmeras possibilidades de sntese de produtos.
Produtos de clulas animais so tipicamente molculas de peso elevado, que podem ser classificadas em:
o Substncias imunobiolgicas vacinas virais, anticorpos monoclonais e citocinas;
o Bioinseticidas baculovrus;
o Enzimas asparaginase, colagenase, citocromo P450, fatores sanguneos, pepsina, renina;
o Hormnios de cadeias longas hormnios luteinizantes, corinico, folculo estimulante, entre outros.
Breve Histrico
O cultivo de clulas se iniciou no princpio do sculo XX com Harrison, em 1907, e Carrel, em 1912.
Descrio de resultados de um experimento no qual foram cultivadas clulas nervosas de um embrio de um anfbio, em fludo
linftico.
Essa tcnica foi desenvolvida como um mtodo para estudar o comportamento de clulas animais fora do organismo, em um
meio ambiente controlado.
Em 1912, Alexis Carrel, utilizando informaes obtidas nas observaes de Harrison, desenvolveu um modelo a partir de clulas
cardacas de embrio de galinha para o cultivo. Seus experimentos foram muito importantes, pois com Carrel descobriu-se a
necessidade da troca de fonte de nutrientes contidos nos frascos. Essa renovao constante de nutrientes em cultivo permitiu
que as clulas pudessem ser cultivadas por perodos ainda maiores do que os utilizados por Harrison.
Em 1951, George Otto Gey cultivou clulas de tecido tumoral humano estabelecendo a linhagem HeLa (Henrietta Lacks) a partir
de uma bipsia de um adenocarcinoma do colo do tero.
Clulas HeLa:
1952: Uma epidemia de poliomielite ataca os EUA e uma vacina contra a doena se torna prioridade mdica nacional.
Para desenvolver a imunizao, era necessrio ter uma enorme quantidade de clulas para serem infectadas - e
curadas. As HeLa eram as nicas disponveis.
1953: Graas trapalhada de um cientista do Texas, que misturou um lquido errado a um bolo de HeLa, o ncleo das
clulas inchou e tornou possvel ver pela primeira vez o que havia l dentro: os cromossomos.
1954: Nada de ovelha Dolly. O primeiro ser vivo (ou melhor, pedao de ser vivo) clonado da histria foram as clulas
de Henrietta. Com elas, se tornou possvel aperfeioar a tcnica de reproduo perfeita das clulas.
1960: Durante a Guerra Fria, as HeLa viraram a cobaia favorita em ambos os lados do Muro de Berlim. Soviticos as
mandaram para o espao. Americanos as bombardearam com radiao atmica e as rodaram em centrfugas para
simular a gravidade.
1965: As clulas de Henrietta so FUNDIDAS COM CLULAS ANIMAIS (ratos e galinhas), e se tornam os primeiros
hbridos entre humanos e animais. Essa tcnica permite que os cientistas entendam as funes e o funcionamento de
cada gene.
1984: Um mdico alemo descobre a existncia do vrus HPV (cncer de colo do tero), graas s pesquisas com HeLa.
O tipo de HPV que gerou o tumor de Henrietta era um dos mais perigosos - o que talvez explique a agressividade do
cncer e a fertilidade das clulas. A descoberta rendeu o prmio Nobel.
2011: Depois de 5 dcadas pesquisando com as HeLa, as clulas j foram usadas em quase todos os campos da
medicina: vacinas, quimioterapia, clonagem, mapeamento de genes, fertilizao in vitro, longevidade humana, DSTs,
digesto de lactose, mal de Parkinson etc.
Bioengenharia
Transplantes de
tecidos
Produao de
Hormnios
Diferenciao celular
Cultura de Metabolismo celular
Clulas Produo de vacinas
Interao celular
Estudos
citotoxicidade
Terapia celular
Estudos
biocompatibilidade
5. Hibridomas
Clulas obtidas por meio da fuso de linfcitos e clulas tumorais, que so capazes de expressar anticorpos
monoclonais.
Caractersticas das Clulas em Cultura
Clulas aderentes
Clulas em suspenso
Clulas mistas (suspenso e aderente)
Criopreservao
Princpio da Criopreservao: Desidratao celular
Retirada de gua intracelular para impedir a formao de cristais de gelo.
Consequncias dos cristais de gelo: Rompimento de organelas e da membrana citoplasmtica.
Adio de criopreservantes (Glicerol e DMSO).
Congelamento lento (1C/minuto).
Condies Necessrias para o Cultivo
BIOSSEGURANA em laboratrios de cultivo celular;
INFRA-ESTRUTURA (4 reas: rea para lavagem e esterilizao; preparo de meios; incubao e observao de
culturas; manipulao assptica de culturas);
LIMPEZA, DESINFECO E ESTERILIZAO.
Limpar a cmara
Umedecer a lamnula com gua, fazer uma leve presso at visualizar por refrao os anis de Newton
Diluio 1:1 com corante Azul de Trypan
Preencher ambos os lados da cmara com a suspenso de clulas (+/- 10 ul) o observar ao microscpio
Ideal n de clulas entre 100 200 (exatido na contagem)
Contar e calcular as clulas viveis e no viveis
O BCRJ o nico do Brasil e o maior Banco de Clulas na Amrica do Sul, no s no acervo, mas na prestao de servios.
Limitaes
Neste mesmo ano, nos EUA, foi aprovado o primeiro biofrmaco produzido em um sistema de expresso baseado em clulas
de inseto uma vacina divalente, contendo as protenas principais do capsdeo do vrus papiloma humano 16 e 18.
Mercado :
Eritropoetina: U$ 8 bilhes
TECNOLOGIA DE PRODUO DE ANTICORPOS
Clulas de Hibridomas:
A propriedade de anticorpos se ligarem seletivamente contra antgenos amplamente utilizada pela pesquisa
farmacutica e biomdica.
Antes da introduo da tecnologia hibridoma, os anticorpos eram isolados do soro sanguneo, que, por conterem uma
grande variedade de anticorpos diferentes que reagiriam com vrios eptopos de um antgeno, eram chamados de
anticorpos policlonais.
Hibridomas: clulas conjugadas, produzidas pela fuso de linfcitos humanos ou de mamferos, os quais podem
secretar anticorpos especficos, com uma clula de mieloma.
Tecnologia de Hibridomas
1975: Khler e Milstein fundem uma clula de mieloma murino com linfcitos obtidos do bao de um camundongo imunizado
com um determinado antgeno (clulas hbridas (hibridoma) tm a caracterstica de linfcitos por produzirem anticorpos
especficos contra um eptopo).
A tecnologia bsica para a produo de anticorpos monoclonais por clulas de hibridomas, desenvolvida por Khler e Milstein
apresenta as seguintes etapas:
FUSO: linfcitos B isolados a partir de bao de um camundongo, previamente imunizado com um determinado
antgeno, so fundidos com clulas de mieloma.
SELEO: as clulas hbridas so separadas das outras clulas com ajuda de um meio seletivo (meio HAT).
Isolamento e clonagem: aps o isolamento dos clones resistentes ao meio seletivo, deve-se avaliar quais so os
produtores de anticorpos de interesse.
Manuteno dos clones: clulas expandidas, criopreservadas e descongeladas quando necessrio.
Produo de Anticorpos Monoclonais
Os anticorpos produzidos fisiologicamente so em geral policlonais, isto porque so produzidos por vrios clones de
Linfcitos B. So especficos, mas possuem algum grau de heterogeneidade.
J os anticorpos monoclonais so derivados de um nico clone de linfcitos, e podem ser dirigidos a qualquer alvo
molecular.
So capazes de localizar a substncia contra a qual foram produzidos de forma muito precisa e especfica.
Apresenta grande aplicao na oncologia, no tratamento de doenas autoimunes, para prevenir a rejeio de
transplantes, como marcadores para testes diagnsticos e instrumentos de investigao cientfica (BRITTO, 2014).
o Nos ltimos 20 anos a sua utilizao para fins teraputicos vm revolucionando o tratamento de diversas
enfermidades (OLIVEIRA, 2009).
Tipos de Anticorpos Monoclonais
Os tipos de anticorpos so determinados pela percentagem de peas de camundongos e humanas que compem as molculas
de anticorpos.
Anticorpos monoclonais murinos = imunogenicidade
o A sequncia de aminocidos de anticorpos murinos contm sequncias de 100% dos camundongos.
Anticorpos monoclonais quimricos
o Compostos por cerca de 35% de sequncia murina.
o Reduo da imunogenicidade e aumento da meia vida srica.
Anticorpos monoclonais humanizados
o Contm aproximadamente 5-10% dos aminocidos de camundongo.
Anticorpos monoclonais humanos
o As sequncias de aminocidos so 100% de origem humana.
o Produzidos a partir de camundongos transgnicos manipulados geneticamente para conter os genes
humanos que expressam os anticorpos. Camundongos imunizados antgenos alvo clulas B fuso com
mieloma tecnologia de hibridomas para a produo dos anticorpos.
Omalizumabe (Xolair)
Anticorpo anti-IgE monoclonal humanizado no anafilaticognico, com caractersticas humanas >95% (SANTOS, 2006).
Mecanismo de Ao: reconhece o mesmo stio de ligao do receptor
de alta afinidade FceR1 da IgE livre circulante.
Forma pequenos complexos trimricos ou pentamricos com a IgE
livre.
Bloqueia e previne a liberao de histamina, leucotrienos e citocinas
pelos mastcitos e basfilos. Reduz assim o nmero de clulas
inflamatrias, como eosinfilos e linfcitos.
Indicaes: Asma e rinite alrgicas com nveis sricos de IgE de 20-1300 UI/mL; outras aplicaes tm sido sugeridas de acordo
com a funo das IgEs.
Vantagens: Devido humanizao do anticorpo e ao pequeno tamanho dos complexos anti-IgE/IgE, o omalizumabe no
desencadeia doenas auto-imunes porque esses complexos so incapazes de ativar o complemento.
Administrao: 0,016 X peso (Kg) X IgE pr-tratamento (UI/mL) = dose (mg)/28 dias = Via subcutnea
Reaes Adversas: Reao no local da injeo; fadiga; rash cutneo; urticria; infeco viral; infeco de vias areas superiores;
sinusite; cefalia; faringite.
Produo:
CHO Clulas de ovrio de hamster chins = Considerada o principal e mais bem caracterizado sistema de produo de
protenas recombinantes teraputicas.
Cultura CHO segura, pois muitos dos principais vrus patolgicos para humanos no conseguem se replicar nela, por exemplo,
o da plio.
Nvel de biossegurana 1.
Muito utilizada na engenharia gentica na obteno de biofrmacos como: eritropoetina, fator IX de coagulao recombinante,
omalizumabe, entre outros.
Deve ser realizada levando em conta algumas necessidades das clulas, como:
- Suprimento de nutrientes e fatores necessrios para a proliferao celular;
- Suprimento e controle do nvel de oxignio dissolvido;
- Manuteno da concentrao de metablitos txicos (amnia e lactato) em nveis no inibitrios;
- Controle da temperatura, pH e presso osmtica.
Soluo Tripsina-EDTA Corantes
Utilizao de uma soluo balanceada com tripsina (2,5 - Diferenciam as clulas viveis das no viveis
g/L) sem ons clcio e magnsio e com um agente - Soluo cristal violeta
quelante (EDTA). - utilizada para colorao dos ncleos das
- Permite o desprendimento de clulas clulas.
aderentes de frascos de cultivo, - Soluo azul de Trypan
- Desagrega clulas entre si atravs de sua ao - utilizada para colorao das clulas
proteoltica sobre protenas intercelulares
- Altera a estabilidade das membranas ao quelar
o on clcio.
Integrao do gene recombinante (Hepatite B) no genoma de tabaco, que pode ser feita por meio de uma transformao,
utilizando-se Agrobacterium
Exemplos de vacinas comestveis em estudo
Batata transgnica que produz subunidade B da toxina da clera (CTB);
Batata transgnica para o antgeno da hepatite B (Hbsag);
Protena de fuso do vrus sincicial respiratrio (RSV-F) foi expressa em tomates transgnicos;
Alface transgnica que expressa Hbsag;
Batata transgnica contendo vacina comestvel contra a E. Coli enterotoxignica;
Expresso do vrus da raiva em folhas de espinafre.
*Cianovirina-N = medicamento anti-HIV obtido de soja transgnica (Pesquisa FAPESP, abril/2013)
Em maio de 2012, a FDA, aprovou para uso comercial o primeiro frmaco produzido com engenharia gentica em clulas de
plantas para seres humanos.
O princpio ativo a protena taliglucerase alfa, produzida em clulas de cenoura transgnica para tratamento da doena de
Gaucher, uma enfermidade gentica e rara provocada pela falta no organismo da glucocerebrosidase, uma enzima atuante no
processamento de glicocerebrosdeos, um tipo de gordura celular. O paciente tem anemia e aumento do bao e do fgado.
O medicamento desenvolvido e produzido pela empresa israelense Protalix, e distribudo em parceria com a norte-americana
Pfizer, foi tambm aprovado em Israel e no Brasil, pela Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (Anvisa), com o nome de Uplyso.