O maracujazeiro uma planta mutante

Por ser filho dileto da selva tropical

Suas folhas conservam o verde pujante
Para sobressair como espcie vegetal.

Num remoto passado agora distante

Talvez por contemplar um recurso natural,
Buscou da natureza cada tom resultante
Para vestir suas flores com a cor do local.
 Citogentica clssica e molecular em
passifloras
Marta Dias Soares-Scott
Laura Maria Molina Meletti
Lus Carlos Bernacci
Ilene Ribeiro da Silva Passos

Introduo

A
citogentica desenvolveu-se principalmente a partir do incio
do sculo passado, e seu progresso acompanhou o
aprimoramento de tcnicas e equipamentos de microscopia.
a cincia que estuda os constituintes celulares portadores da informao
gentica (cromossomos). Com o renascimento das leis de Mendel, surgiu a
teoria da herana cromossmica que relaciona os cromossomos com as leis
mendelianas de herana sendo um marco para o estudo dos cromossomos,
no qual a citologia e a gentica passaram a sobrepor seus conhecimentos
numa rea denominada Citogentica.

Citogentica clssica
A partir da forma e do nmero de cromossomos de uma espcie,
estabelecido seu caritipo. A representao do caritipo pode ser um
cariograma (imagem dos cromossomos) ou um ideograma (esquema dos
cromossomos) e ele que fornece as informaes substanciais para o
estabelecimento das relaes entre espcies, com respeito organizao dos
cromossomos.

Estudos cromossmicos tm sido utilizados na determinao das

relaes filogenticas e evolutivas entre grupos de plantas (Raven, 1975).

213
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

A anlise citogentica comumente utilizada na citotaxonomia vegetal

inclui basicamente o nmero e a morfologia dos cromossomos mitticos, o
aspecto do ncleo interfsico, o comportamento de cromossomos meiticos
e a microsporognese (Vosa, 1985, Guerra, 1988).

A anlise cariotpica envolvendo a avaliao de dados como tamanho

de cromossomos, relao entre os braos, presena de constrio secundria
e satlite, propriedades de colorao, podem trazer informaes valiosas,
principalmente quando se quer comparar espcies diferentes ou examinar a
variao entre indivduos da mesma espcie (Ruas, 1989). Rearranjos
estruturais podem ser detectados por meio de diferenas no tamanho relativo,
posio de centrmero, nmero bsico de cromossomos (x) e nmero,
tamanho e posio de satlites.

Variaes quanto ao nmero posio e tamanho de constries

secundrias e de satlite so freqentemente observadas em vegetais, sendo
teis como marcadores. Murray (1975) e Stebbins (1971) sugerem que esses
marcadores podem ser incorporados ou suprimidos ao longo do processo
evolutivo.

Nessa anlise cromossmica para determinao de um caritipo, so

utilizadas coloraes ditas como convencionais usando corantes como
Giemsa, Orcena Actica, reativo de Schiff, hematoxilina/eosina (Figura 1).
Cedoc

Cedoc

Lamela Prfase
mdia
Cedoc

Telfase
Metfase

Anfase

Figura 1. Diviso celular, fases da mitose.

214
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

A diviso meitica tem sido descrita e estudada em diferentes

organismos, mostrando alta estabilidade evolutiva. Alteraes
cromossmicas, quando aparecem, podem ser barradas pela complexidade
desses eventos, pela dificuldade no pareamento dos cromossomos, na
formao e na manuteno de quiasmas e na co-orientao dos centrmeros
(Moraes-Fernandes et al., 1985). Alguns estudos tm mostrado a ocorrncia
de irregularidades meiticas em clulas-me de plen que esto relacionadas
com o comportamento e a distribuio dos cromossomos. As irregularidades
mais freqentes so: presena de clulas com alterao de nmero
cromossmico; ocorrncia de univalentes por falta de pareamento de alguns
pares de homlogo; bivalentes no orientados por problemas de fuso; pontes,
terminalizao inadequada de quiasmas; microncleos resultantes de quebras
ou univalentes (Consolaro et al., 1996, Pagliarini, 1990, Soares-Scott al., 2003).
A fertilidade dos gametas masculinos e femininos dependente da
normalidade meitica.

A poliploidia o tipo de variao cromossmica predominante na

evoluo das plantas, sendo de fundamental interesse para o melhoramento
vegetal. Diferentes tipos de clula podem sofrer ciclos endomitticos ou
mesmo um erro meitico (no-reduo cromossmica) e resultam em clulas
poliplides (Guerra, 1988).

Dentro de um gnero ou mesmo de uma espcie, podem ocorrer

diversos nmeros gamticos que so mltiplos perfeitos, denominados de
srie poliplide, sendo considerado como nmero bsico o menor nmero
haplide dessa srie, representado por x (Rieger et al., 1976, Guerra, 1988).

Do mesmo modo, quando se trabalha com qualquer grupo vegetal a fim

de desenvolver novas combinaes e cruzamentos, necessrio conhecer o
nmero, o tamanho e a forma dos cromossomos, alm de marcadores teis
para o reconhecimento de cada par cromossmico. A partir das informaes
citogenticas de duas espcies de plantas, pode-se prever a viabilidade de um
possvel hbrido. Moraes-Fernandes et al. (2000) enfatizam que o
conhecimento sobre relaes citotaxonmicas, estrutura citogentica e
histria evolutiva das espcies envolvidas nos cruzamentos tambm

215
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

importante para a escolha da espcie doadora de caractersticas como

resistncia a doenas e fornecem contribuio valiosa ao melhoramento
varietal (Moraes-Fernandes, 1982). Vrios genes de resistncia a estresses
biticos e abiticos esto localizados em cromossomos homelogos com
distncias similares do centrmero, sugerindo que eles devem representar
variantes allicas em diferentes locos homelogos. Como a homologia no
perfeita, pois no ocorre com todos os genes, os cromossomos so
chamados homelogos (Moraes Fernandes, 1982, Law et al., 1987). A
introduo de genes pode ser incrementada por procedimentos eficientes
para a deteco de cromossomos ou segmentos cromossmicos (Jiang et al.,
1994), pois o estado hbrido de uma planta pode ser determinado pelo
nmero somtico de cromossomos e tambm pelo comportamento meitico
(Sharma & Gill, 1983; Sethi, 1989).

Colorao diferencial, bandeamentos

A caracterizao cromossmica foi por muito tempo baseada
unicamente em parmetros morfolgicos, como tamanho dos braos,
posio dos centrmeros e localizao das constries secundrias
(Figura 2).

A introduo das tcnicas de bandeamento permitiu a visualizao de

blocos de colorao diferenciada, essas regies geralmente aparecem como
faixas transversais mais coradas nos cromossomos, recebendo assim a
denominao de bandas, permitindo que a caracterizao cromossmica seja
significativamente melhorada.

Os bandeamentos identificam a distribuio e a quantidade de

heterocromatina (C, G, N), diferenciao de tipos de heterocromatina (AT e
CG) usando fluorocromos (DAPI e CMA), localizao de regies organizadoras
de nuclolo, mediante impregnao pela prata (Ag-NOR). Estes so
importantes para a identificao de cromossomos homlogos e homelogos
e para a caracterizao de polimorfismos ou de relaes de parentesco entre
espcies prximas, distinguindo possveis rearranjos cromossmicos.

216
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Figura 2. Esquema de cromossomo metafsico, com bandas.

As tcnicas de bandeamento cromossmico expandiram os horizontes

da citogentica, e a primeira aplicao do bandeamento deu-se no
pareamento cromossmico. Essas tcnicas tm possibilitado compreender
melhor as alteraes cromossmicas que se estabelecem em cada gentipo
(Guerra, 1988).

O bandeamento C diferencia regies de heterocromatina constitutiva

que so seqncias de DNA altamente repetitivas as quais no codificam
protenas (no tm atividade gnica). Outra caracterstica desse tipo de
cromatina seu alto grau de condensao em quase todas as fases do ciclo
celular. Ela se concentra em blocos, distribudos preferencialmente em
algumas regies dos cromossomos, como ao redor da constrio secundria,
e em pores proximais e terminais. Essa distribuio, como tambm o
tamanho dos blocos, igual nos cromossomos homlogos.

217
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Assim, esse procedimento pode ser empregado na caracterizao de

diferentes acessos de uma mesma espcie, na identificao de linhas de
adio e de substituio (Friebe et al., 1993) e na deteco de alteraes
estruturais, como delees, inverses e translocaes (Gill et al., 1991).

O bandeamento N um procedimento inicialmente reportado por

Gerlach (1977) e modificado por Endo & Gill (1984). Consiste na imerso das
lminas em cido actico 45% quente e uma curta imerso em tampo fosfato
quente. Assim como o bandeamento C uma tcnica usada na anlise de
caritipos e na construo de ideogramas (Jewell, 1979, Gill et al., 1991).

O DNA ribossmico (DNAr) responsvel pela sntese de protenas por

meio da transcrio dos diferentes tipos de RNAr. Esses genes esto
localizados em pores que, aps a compactao, formam as constries
secundrias, denominadas regies organizadoras de nuclolos ou RONs. Para
a deteco das RONs so utilizadas diversas tcnicas. A mais comum a da
impregnao pela prata, o bandeamento com a prata, (AgAS) que detecta as
regies ativas na interfase precedente pela associao da prata com as
protenas nucleolares (Howell & Black, 1980, Margarido & Galettip, 2000). Nem
toda constrio secundria pode ser considerada regio organizadora de
nuclolo.

A tcnica de bandeamento C-CMA/DAPI um procedimento de

colorao com os fluorocromos CMA (reconhece stios ricos em GC) e DAPI
(reconhece stios ricos em AT) aplicado aps o desgaste cromossmico pelos
passos normais de bandeamento: hidrlise cida, relaxamento dos
cromossomos com hidrxido de brio 5% e retirada de cromatina com 2xSSC.
Esse tipo de tratamento oferece maior contraste entre as regies marcadas
pelos fluorocromos e o restante dos cromossomos, proporcionando melhor
diferenciao entre regies ricas em GC (CMA+/DAPI-), AT (CMA-/DAPI+) e
balanceada GC/AT ou neutra (CMA0/DAPI0).

O fato de se detectar a ocorrncia e a posio fsica de diferentes

famlias de DNA altamente repetido (heterocromatina) implica maior
compreenso de como os genomas esto organizados e as relaes entre
espcies, gneros e famlias, bem como os mecanismos de ajustes que

218
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

ocorrem nos caritipos de diferentes organismos durante o processo

evolutivo.

Citogentica molecular
Mais recentemente, com o advento das tcnicas em Biologia Molecular,
a citogentica tem acumulado refinamentos, sobretudo, os relacionados com
a localizao de genes ou de seqncias de DNA repetitivo. Esses estudos so
possveis com as Hibridaes Fluorescentes in situ ou FISHs. Alm dessas, a
hibridao de genomas inteiros, atravs de GISH (Hibridao Genmica in
situ), tem fornecido interessantes dados sobre o estudo de hbridos e espcies
proximamente relacionadas. Essas tcnicas tm sido amplamente utilizadas
para localizar diferentes seqncias de DNA em cromossomos mitticos ou
meiticos, em ncleos interfsicos e em fibras de cromatina estendidas (Dong
et al., 2001). A deteco dessas seqncias in situ tem gerado avanos
importantes na citogentica de plantas, destacando-se a construo de
mapas fsicos, a investigao detalhada da estrutura cromossmica, o
acompanhamento da quantidade de cromatina introduzida em cruzamentos
interespecficos e a anlise de pareamentos intergenmicos em plantas
hbridas.

A tcnica de FISH (fluorescent in situ hybridization) tornou-se a mais

promissora dentro da Citogentica nos ltimos anos. Os segmentos de DNA
ou RNA, marcados, funcionam como sondas para localizar as seqncias do
DNA cromossomal complementares a ela e reconhecem especificamente um
nico par cromossmico, regies especficas, tais como centrmeros e
telmeros ou at mesmo um stio especfico denominado DNA-alvo. Para
visualizar as regies hibridizadas com a sonda, necessrio associar um
corante sonda e outro ao restante dos cromossomos. A deteco da sonda
era feita, inicialmente, por auto-radiografia, utilizando radioistopos ou pela
associao da seqncia de DNA com um sistema enzimtico (geralmente a
fosfatase alcalina). Atualmente, realizada mediante o emprego de
fluorocromos (molculas que fluorescem quando excitadas por um
comprimento de luz especfico). A marcao das sondas envolve a

219
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

incorporao de anlogos de nucleotdeos trifosfatados, diretamente

associados a compostos fluorescentes (marcao direta), ou a molculas
reprteres marcadoras que sero detectadas atravs de reagentes
secundrios (deteco indireta). As molculas marcadoras mais usadas na
marcao indireta so a biotina e a digoxigenina, enquanto os fluorocromos
mais utilizados para sinalizar a presena das sondas so o FITC (isotiocianato
de fluorescena), de cor verde, e a rodamina, de cor vermelha. O primeiro
passo o desenvolvimento da sonda que so seqncias de DNA,
geralmente, com cerca de 100 a 300 pb at acima de 1Mpb, complementar ao
DNA-alvo (Figura 3).

Essas seqncias podem ser cpias de um gene ou de qualquer

fragmento do DNA que possa ser isolado. Sondas contendo elementos
repetitivos, usados para detectar regies heterocromticas ou grandes
repeties gnicas so particularmente teis no mapeamento e estudo
evolutivo dessas seqncias nos genomas vegetais.

O grau de especificidade cromossmica varia de sonda para sonda e

depende, em muitos casos, do rigor da reao de hibridao. A
especificidade de uma hibridao est baseada no princpio da
complementaridade das bases na dupla fita.

As primeiras seqncias detectadas foram as de DNA repetitivo cujas

unidades de repetio podem estar distribudas em tandem ou dispersas ao
longo do genoma. As seqncias em tandem ocorrem em blocos de centenas
a milhares de cpias, localizadas em um ou mais stios de um dado genoma.
Essa categoria inclui DNA codificante, como genes para RNAr, e no-
codificante, como DNA telomrico, centromrico e outros (Leitch et al., 1994).
Os genes ribossomais 5S e 45S tm sido as seqncias mais utilizadas na
hibridizao in situ. A unidade de repetio do DNAr 45S uma seqncia com
cerca de 9,2 kb contendo os genes para DNAr 18S, 5,8S e 26S, sempre nessa
ordem. Esses genes foram muito bem conservados durante a evoluo
vegetal, o que permite a hibridizao de uma seqncia extrada de uma
espcie em qualquer outra espcie vegetal.

220
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Figura. 3. Esquema simplificado da tcnica de hibridizao in situ. (a) A seqncia de

DNA a ser utilizada como sonda deve ser isolada e marcada. (b) Paralelamente,
devem ser preparadas lminas com cromossomos bem espalhados. (c, d, e)
Posteriormente, os DNAs da sonda e dos cromossomos devem ser desnaturados e
colocados em contato para que ocorra a renaturao e conseqentemente a
hibridizao in situ. (f, g) A localizao da sonda feita por uma molcula
reconhecedora ligada a um fluorocromo e observada na microscopia de fluorescncia.
Fonte: Brasileiro-Vidal & Guerra, (2002).

221
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Alm dos genes ribossomais, as seqncias em tandem mais utilizadas

na FISH so as do DNA telomrico e as do DNA centromrico. A hibridizao
de seqncias exclusivas da regio terminal ou da regio centromrica permite
identificar alteraes estruturais que modifiquem a localizao dessas sondas,
como delees, inverses ou translocaes.

Os microssatlites so formados geralmente por unidades de repetio

com cinco nucleotdeos ou menos, tambm, encontram-se arranjados em
tandem e podem ser detectados por FISH.

A segunda categoria de DNA repetitivo a de seqncias dispersas,

intercaladas por seqncias de DNA de cpia simples ou repetitivas. Um
exemplo de seqncias dispersas so os retrotransposons, amplamente
encontrados nos genomas de plantas, em especial, naqueles com elevada
quantidade de DNA.

A hibridizao in situ tambm pode utilizar como sonda o DNA

genmico total de uma espcie, proporcionando a marcao de todos os
seus cromossomos. Esse tipo de hibridizao denominado de GISH
(Genomic In Situ Hybridization). A tcnica de GISH permite distinguir os
cromossomos oriundos de diferentes parentais, em hbridos interespecficos,
ou em espcies alopoliplides (Raina & Rani, 2001).

Um fator que interfere na visualizao dos sinais de hibridao o nvel

de condensao dos cromossomos mitticos; a alternativa para aumentar o
nvel de resoluo da hibridizao in situ o uso de cromossomos meiticos
na fase de paquteno. Esses cromossomos encontram-se de 7 a 40 vezes mais
estendidos que os cromossomos mitticos (De Jong et al., 2000). Esses
aprimoramentos tambm sero importantes para facilitar a integrao dos
mapas cromossmicos com os de ligao j existentes e a anlise comparada
desses mapas em espcies prximas (Cheng et al., 2001, Draye et al., 2001).

Citogentica de Passiflora
O gnero Passiflora, bem como os demais gneros de passiflorceas,
tem sido muito pouco estudado citolgicamente. As mais amplas contagens
cromossmicas foram realizadas por Bowden (1945), Beal (1969ab,1973),

222
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Storey (1950), Guerra (1986) e Snow & MacDougal (1993). Segundo Soares-
Scott (1998), existem informaes citogenticas registradas na literatura para
apenas 68 espcies do gnero Passiflora, 8 subespcies e 14 hbridos
interespecficos, mostrando que das 400 espcies conhecidas, menos de 30%
apresentam identificao cromossmica, restringindo-se em sua maioria (mais
de 20%) contagem do nmero cromossmico (Tabela 1). Segundo Melo et
al. (2001) esse nmero de espcies representa 16,1% no gnero, das 83
registradas. A maioria dos trabalhos compilados nesse levantamento cita
apenas o nmero cromossmico, raramente, com anlises cariotpicas e
medidas cromossmicas. A escassez de tais dados pode ser em parte
justificada pela dificuldade de coleta e germinao de sementes das espcies
e pelo pequeno tamanho dos cromossomos nas espcies do gnero.

Tabela 1. Nmeros cromossmicos de Passiflora spp.: espcies subespcies e hbridos.

Nomes dos subgneros em negrito. * Apud Snow & MacDougal (1993).

Espcies n 2n Referncias

Astephia Killip
P. penduliflora DC. 6 Beal, 1971*
Astrophea (DC.) Mast.
P. lindeniana Triana & Planch. 12 Berry, 1987
Calopanthanthus (Harms) Killip
P. racemosa Brot. 18 Beckett, 1960
Decaloba (DC.) Rchb.
P. aurantia G.Forst. 6 12 Beal, 1969
12 Snow & MacDougal, 1993
P. biflora Lam. 6 Beal 1971*
12 Snow & MacDougal, 1993
P. bryonioides Kunth 12 Bowden, 1945; Snow & MacDougal,
24 1993 Bowden, 1945
P. aff. candollei Triana & Planch. 12 Snow & MacDougal, 1993
P. capsularis L. 12 Bowden, 1945; Beal, 1971*; Snow &
MacDougal, 1993; Melo et al., 2001
P. cinnabarina Lindl. 6 12 Beal, 1969
P. citrina J.M.MacDougal 12 Bowden, 1945
P. cobanensis Killip 12 Snow & MacDougal, 1993
P. conzattiana Killip 12 Snow & MacDougal, 1993
P. coriacea Juss. 6 Diers 1961*; Beal, 1971*
12 Snow & MacDougal, 1993;
Melo et al., 2001
P. costaricensis Killip 12 Snow & MacDougal, 1993

Continua...

223
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Tabela 1. Continuao.

Espcies n 2n Referncias

P. escobariana J.M.MacDougal 12 Snow & MacDougal, 1993

P. exsudans Zucc. 24 Snow & MacDougal, 1993
P. gibertiana J.M.MacDougal 12 Snow & MacDougal, 1993
P. gracilis Link 20 Bowden, 1945
18 La Cour, 1952*
P. herbetiana Ker Gawl. 6 12 Beal, 1969; Melo et al., 2001
P. holosericea L. 14 Snow & MacDougal, 1993
P. juliana J.M.MacDougal 12 Snow & MacDougal, 1993
P. karwinskii Mast. 6 Snow & MacDougal, 1993
P. lutea L. 84 Bowden1940, 1945; Darlington &
Janaki Ammal ,1945*
24 Baldwin, 1949
P. misera Kunth 12 36 Melo et al., 2001
P. morifolia Mast. 6 Snow & MacDougal, 1993
12 Melo et al., 2001
P. nubicola J.M.MacDougal 6 MacDougal, 1989b
P. oaxacensis J.M.MacDougal 12 Snow & MacDougal, 1993
P. obtusifolia Sess & Moc. 12 Snow & MacDougal, 1993
P. porphyretica Mast. 12 Snow & MacDougal, 1993
P. bicornis Mill. 6 12 Storey, 1950
P. quinquangularis J.M.MacDougal 12 Snow & MacDougal, 1993

P. rovirosae Killip 12 Snow & MacDougal, 1993

P. rubra L. 12 Snow & MacDougal, 1993
P. sanguinolenta Mast. & Linden 12 Snow & MacDougal, 1993
P. standleyi Killip 12 Snow & MacDougal, 1993
P. suberosa L. 12 24 Storey, 1950; Beal, 1969
18 36 Storey, 1950
12 Diers, 1961*
24 Beal, 1971*; Snow & MacDougal, 1993.
P. tricuspis Mast. 12 Melo et al. 2001
P. xiikzodz J.M.MacDougal 12 Snow & MacDougal, 1993
Distephana (Juss.) Killip
P. cocicnea Aubl. 18 Beal, 1971*; Soares-Scott et al., 2001;
Melo et al., 2001
P. vitifolia Kunth 9 18 Storey, 1950
9 Beal, 1969
18 Snow & MacDougal, 1993
Dysosmia (DC.) Rchb.
P. foetida L. 18 Heitz, 1927*; Janaki Ammal, 1945*
20 Nishiyama & Kondo, 1942*;
Guerra, 1986
22 Bowden ,1945; Harvey, 1966*
10 20 Storey, 1950
10 Beal, 1969

Continua...

224
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Tabela 1. Continuao.

Espcies n 2n Referncias

Murucuja (Tourn. ex Mill.) Mast.

P. cubensis Urb. 12 Lepper & Duharte Gongora, 1988*
Passiflora
P. actinia Hook. 18 Soares-Scott et al., 2001;Melo et al.,
2001
P. alata Curtis 9 Beal, 1969
18 Guerra, 1986; Mayeda & Vieira, 1994;
Souza et al., 2003; Meletti et al., 2003.
P. amethystina J.C.Mikan 18 Mayeda & Vieira, 1994
P. caerulea L. 18 Heitz, 1926*; Nakajima, 1931 Simonet &
Miedzyrzecki, 1932*; Bowden, 1940;
Darlington & Janaki Ammal, 1945*
9 Beal, 1969
P. cincinnata Mast. 18 Beal, 1971*; Guerra, 1986.
P. edmundoi Sacco 9 18 Melo et al., 2001; Souza et al., 2003
P. edulis Sims 9 18 Jannaki Ammal, 1945*; Beal, 1969
18 Storey, 1950; Dornelas & Vieira, 1991;
Mayeda & Vieira 1994; Soares-Scott
et al.,2003
9 Beal, 1969; Soares-Scott et al., 2003
P. galbana Mast. 18 Melo et al., 2001
P. gibertii N.E.Br. 18 Mayeda & Vieira, 1994
P. incarnata L. 18 Heitz, 1926*; Bowden, 1945; Storey,
1950; Mayeda & Vieira, 1995; Soares-
Scott et al., 2003
36 Lloyd, 1963*
9 Beal, 1969; Soares-Scott et al., 2003
P. jilekii Wawra 9 Melo et al., 2001
P. kermesina Link & Otto 9 18 Storey, 1950; Beal, 1969
18 Mayeda & Vieira, 1995; Melo et al., 2001
P. laurifolia L 9 18 Storey, 1950
18 Simmonds, 1954
P. ligularis Juss 18 Storey, 1950
9 18 Beal, 1969
9 Beal, 1971*
18 Guerra, 1986; Snow & MacDougal,
1993; Soares-Scott et al., 2001
P. malacophylla Mast. 9 18 Souza et al., 2003
P. manicata (Juss) Pers. 18 Storey, 1950
P. mucronata Lam. 9 18 Guerra, 1986; Melo et al., 2001; Souza
et al., 2001
P. nitida Kunth 18 Dornelas & Vieira, 1991; Passos, 1999;
Melo ect al., 2001
P. quadrangularis L. 18 Janaki Ammal, 1945; Beckett, 1960;
Soares-Scott et al., 1999; Souza et al.,
2003
9 Storey, 1950; Beal, 1969

Continua...

225
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Tabela 1. Continuao.

Espcies n 2n Referncias

P. semantic Grebes. 9 18 Storey, 1950; Beal, 1969

P. serrato-digitata 9 18 Soares-Scott et al., 1999
P. setacea DC. 9 18 Soares-Scott et al., 1998, 2003
9 Melo et al., 2001; Soares-Scott et al.,
2003
P. subpeltata Ortega 9 18 Storey, 1950; Beal, 1969; Melo et al.,
2001
P. trisulca Mast. 18 Snow & MacDougal, 1993
Pseudomurucuja (Harms) Killip
P. perfoliata L. 12 Beal, 1971*
Tacsonia (Juss) Triana & Planch.
P. antioquiensis H.Karst. 9 Beal, 1969
18 Snow & MacDougal, 1993
P. cumbalensis (H.Karst.) Harms 9 Escobar, 1986
P. mixta L.f. 18 La Cour, 1952*; Melo et al., 2001
P. tripartita (Juss.) Poir. 9 Beal, 1969; Berry, 1987
18 Bowden, 1945; Storey, 1950; Heiser,
1963*
hbridos
P. alata x P. caerulea 18 Storey, 1950
P. caerulea x P. quadrangularis 9 La Cour, 1951*
P. caerulea x P. sp Storey, 1950
P. edulis + P.amethystina 36 Dornelas, 1995
P. edulis + P.cincinatta 36 Dornelas, 1995
P. edulis + P.giberti 36 Dornelas, 1995
P. edulis + P.incarnata 36 Knight, 1991; Soares-Scott et al., 1995
P. edulis x P. alata 18 Soares-Scott et al., 1995
P. maliformis x P. laurifolia 18 Storey, 1950
P. quadrangularis x P.racemosa 27 Beckett, 1960
P. racemosa x P. coccinea 9 18 Janaki Ammal ,1945*; Storey, 1950

As espcies estudadas no gnero Passiflora possuem amplitude

significativa para tamanho e nmero de cromossomos, podendo ser
agrupadas segundo o nmero bsico de cromossomos (x) em trs grupos: x =
6, x = 9 e x = 9 ou 10 que esto em maior freqncia, mas h registros para x=
7, 10, 11, 12,18 e 42. O nmero cromossmico 2n varia no grupo x = 6,
havendo espcies com 2n = 12, 2n = 24, 2n = 36 e 2n = 84 cromossomos; no
grupo x = 9 com espcies onde 2n = 18 cromossomos e no grupo x = 9 ou 10
com espcies 2n = 18, 2n = 20, 2n = 22. Em P. foetida foram identificados
vrios nmeros cromossmicos, 2n = 18, 28 e 22. Esses resultados parecem
indicar a ocorrncia de aneuploidia na evoluo dessa espcie, o que nos

226
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

permite acreditar que esse processo tambm faz parte do processo evolutivo
no gnero Passiflora.

O menor nmero haplide x = 6 (n = 6) e sugere a ocorrncia de

poliploidia nos processos evolutivos. Uma possvel triploidia foi sugerida para
a origem das espcies com 2n = 18 (Storey, 1950), hexaploidia nas espcies
com 2n = 36 (Meletti et al., 1992) e poliploidia na espcie P. lutea com 2n =
84 (Bowden, 1940, 1945).

No gnero, constata-se uma variao no nvel de ploidia que vai at 14x

(14n).

Todas as espcies horticulturalmente importantes mostram 2n = 18,

inclusive, Passiflora edulis (Figura 4) (Lopes, 1994, Soares-Scott 1998).

H indicaes sugerindo que as espcies com 2n = 18 poderiam ter

evoludo atravs da poliploidia ou pelo processo inverso, a partir de espcies
com 2n = 24 por sucessivas perdas de pares cromossmicos.

Em P. suberosa, so descritos trs nmeros cromossmicos, 2n=12,

24 e 36; essas diferenas esto associadas a grandes diferenas morfolgicas
nesse grupo.

A hiptese de perdas cromossmicas pode ser sustentada pela

existncia de espcies com nmeros cromossmicos intermedirios, com 2n
= 18 (Heitz, 1927, Janaki Ammal, 1945), 2n = 20 (Nishiyama & Kondo, 1942,
Guerra, 1986) e 2n = 22 (Bowden, 1945; Harvey, 1966) em P. foetida e 2n = 20
(Bowden, 1945), 2n = 18 (La Cour, 1952) em P. gracilis.

Segundo Melo et al. (2001) a anlise citogentica at o presente, divide

o gnero Passiflora em trs grandes grupos: um com n=6, 12,18 (5
subgneros); outro com n=10 (1 subgnero); um terceiro grupo com n=9,36
(6 subgneros). H uma exceo com 2n=14, para P. holosericea L. e P. lobata
(Snow & MacDougal, 1993) que pode ter sido originado por disploidia de
2n=12. Ainda segundo e autor, o registro para P. lutea L. (2n= 84), no foi
confirmado em trabalhos posteriores, sugerindo que possam ser contagens
imprecisas, devido no-utilizao de bloqueadores de diviso, assim como
os diferentes nmeros em P. foetida (2n=18, 20, 22).

227
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

1 2 3 4 5

6 7 8 9

Figura 4. Metfase mittica de Passiflora edulis 2n=18.

Melo & Guerra (2003) passam a considerar o grupo x=12, no como

grupo secundrio, j que ele aparentemente tem papel importante na
evoluo do gnero e representado em outros gneros da famlia. Dentro da
citotaxonomia do grupo, importante lembrar que x=6 derivado de x=12 ou
vice-versa.

Todas as espcies estudadas mostram cromossomos pequenos, com

comprimento mdio variando de 1,63 a 3,73 mm. Possuem caritipos em sua
maioria simtricos, mas com diferenas significativas entre os txons
analisados at agora. Os centrmeros em posio mediana e submediana,
com relao de braos variando de 1,12 a 1,59 mm e presena de satlites.

Foi detectada a presena de satlites em P. maliformis, P. seemanni e

P. quadrangularis que possuem cromossomos muito pequenos sendo trs
pares com satlites (Beal, 1969a, 1969b).

228
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Alguns cromossomos com satlite foram identificados por Mayeda &

Vieira (1995) no par 8 das espcies, P. edulis, P. amethystina, P. alata e P. giberti.

Soares-Scott (1998) identificou satlites em P. edulis (4 e 7) e P. incarnata

e trs pares em P. setacea (4, 7 e 8) (Figura 5).

Melo et al. (2001) identificam satlites em P. capsularis, P. misera,

P. morifolia, P. coccinea e P. nitida. Souza et al. (2003) apontam satlites em seis
espcies (P. alata, P. malacophylla, P. edmundoi, P. mucronata, P. galbana e
P. quadrangularis).

Foram encontradas divergncias em relao a nmero de satlites e a

posio deles. Em P. edulis, Mayeda & Vieira (1995) aponta dois satlites e
Soares-Scott et al. (1999) trs. Em P. alata h divergncias na localizao dos
cromossomos com satlite Melo et al. (2001) observaram satlites nos dois
pares menores, Soares-Scott et al. (1998, 1999) concordaram quanto ao par 7,
mas indicaram tambm o par 4 e Souza et al. (2003) observaram-nos nos pares
1 e 2. Essas diferenas devem ocorrer por causa da qualidade da preparao
citolgica, devido ao grau de compactao dos cromossomos ou mesmo em
razo da variabilidade em diferentes populaes dentro das espcies.

Estudos citogenticos em hbridos interespecficos de Passiflora, tanto

zigticos como somticos, so muito pouco freqentes. importante
considerar que a maioria dos hbridos obtidos, mesmo os que no foram
analisados citogeneticamente originada de progenitores com 2n = 18
cromossomos sempre envolvendo espcies de interesse agronmico. Esses
hbridos sexuais mostraram compatibilidade interespecfica, j que
apresentaram alguma fertilidade na parte masculina ou feminina, apesar de
no produzirem frutos sugerindo que podem ser espcies relacionadas e com
origens em comum.

4 7 8
Figura 5. Cromossomos metafsicos de P. setacea
portadores de satlites.

229
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Hbridos interespecficos em Passiflora foram obtidos por fuso de

protoplastos por Otoni et al. (1995), Dornelas . (1995), Barbosa & Vieira (1997).
Matos et al. (2005) obtiveram plantas por fuso de protoplastos, este material
est sendo analisado molecular e citogenticamente para confirmao da
hibridao. Soares-Scott et al. (2003) observaram irregularidade meitica e
alteraes na formao do plen, bem como diminuio na viabilidade
polnica em ambos os hbridos, sexual (P. edulis x P. setacea) e somtico
(P. edulis + P. incarnata). Quando se compara a meiose entre os hbridos, o
hbrido sexual (Figuras 6 e 7) mostra-se mais regular que o somtico.
O nmero cromossmico foi identificado nesses hbridos, mostrando
2n=18 (P. edulis x P. setacea) e 4n=36 (P. edulis + P. incarnata)
Na microsporognese, observa-se a presena de multivalentes e a de
univalentes confirmando, tambm, a recombinao meitica no hbrido,
fundamentais para a introduo gnica.
No hbrido somtico P. edulis+ P. incarnata, observam-se diferenas no
tamanho de gro de plen e diminuio na viabilidade polnica (Soares-Scott
et al. 2003). Barbosa & Vieira (1997) apesar de constatarem irregularidades na
meiose, obtiveram alta viabilidade polnica no hbrido somtico P. edulis f.
flavicarpa + P. amethystina. A obteno de plens viveis indica que esses
hbridos podem e devem ser usados em novos cruzamentos, sendo material
com potencial no melhoramento gentico.

Figura 6. Anormalidades em
hbrido sexual P. edulis x P.
setacea: A. multivalentes em MI.
B. cromossomos retardatrios
em anfase I. C. diferena de
nmero de cromossomos
diferentes nos plos.
Fonte: Soares-Scott et al.
(2003).

230
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Figura 7. Gros de plen de P. edulis x P. setacea,

plens viveis e inviveis.

Citogentica molecular em Passiflora

Melo & Guerra (2003), utilizando hibridao in situ FISH, tentaram
encontrar correlao entre nmero de stios rDNA 45s e 5S com nvel de ploidia
em 20 espcies de Passiflora. Entretanto, esse nmero pode variar bastante,
conforme j observado por diversos autores em outros vegetais (Vanzela et al.
1998, Frello & Heslop-Harrison, 2000). Para o rDNA 5S, mostra-se em um nico
stio exceo de P. suberosa e P. foetida com 2 stios e P. misera com 6 stios,
talvez indicando possvel origem poliplide. .

Quanto a rDNA 45S, o sinal maior, o nmero de sinais maiores

tambm. A metodologia usada resultou em cromossomos muito
compactados com dificuldade na localizao dos pares portadores desses
stios, talvez pelo tempo empregado com o bloqueador de diviso que utiliza
24 horas. Segundo esses autores, as espcies de importncia agronmica (do
grupo x=9) indicam que a posio e o nmero de stios de rDNA so muito
restritos e que esse marcador no seria um marcador citolgico para
caracterizar espcies.

Soares-Scott et al. (2003 ) vem trabalhando com hibridao in situ FISH

utilizando a sonda de Pta 71 para a deteco das regies organizadoras do
nuclolo, (Pta 71 que tem 9 kb e que contm o DNAr 45S (18S + 5,8S = 26S)
de Triticum aestivum (Gerlach & Bedbrook, 1979).

231
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

As anlises foram realizadas nas espcies P. edulis, P. incarnata,

P. setacea, P. coccinea e nos hbridos P. edulis x P. incarnata e P. edulis x
P. setacea. O hbrido P. edulis x P. incarnata apresentou dois sinais fluorescentes
(Figura 8). No hbrido P.edulis x P. setacea foi observado de quatro a seis sinais
fluorescentes com essa mesma sonda (Figura 9). Pde-se verificar que
algumas marcaes dos stios de DNAr 45S envolveram apenas parte das
constries secundrias. Em P. incarnata, verificaram-se apenas dois sinais. As
espcies P. setacea e P. coccinea mostraram 4 sinais.

A espcie progenitora, P. edulis, mostra quatro sinais, concordante com

Melo & Guerra (2003) que observaram, tambm, nessa espcie 4 stios
subterminais de DNAr 45S. Esses resultados parecem confirmar a hiptese de
herana nos hbridos de cromossomos portadores de satlite conforme
sugerido anteriormente (Soares-Scott, 1998). No caso, talvez se possa
observar perda ou recombinao de seqncias de rDNA 45S nesses hbridos
por mecanismos de supresso gnica (Leitch & Bennet, 1977; Vogel et al.,
1999).

A hibridizao in situ, utilizando como sonda o DNA genmico total de

uma espcie denominado de GISH (Genomic In Situ Hybridization), est sendo
feita em hbridos de Passiflora (Soares-Scott et al., 2003).

O resultado demonstrou que existe realmente um hbrido (P. edulis x P.

setacea) (Figura 10) e que a sonda feita foi capaz de evidenciar diferentes
seqncias cromossmicas das duas espcies. Pde-se verificar um lote de
cinco cromossomos inteiros corados em vermelho o de P. setacea, outro lote
de 9 com fluorescncia em amarelo de P. edulis e um lote de colorao laranja
indicando seqncias de ambas as espcies P.setacea e P.edulis.

Na microsporognese, observa-se a presena de multivalentes e

univalentes confirmando tambm a recombinao meitica nos hbridos,
fundamentais para a introduo gnica. Outros hbridos esto sendo
trabalhados e vm confirmando a eficincia do mtodo e da sonda.

232
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Figura 8. HIS rDNA45S P. edulis x P. incarnata 2 sinais.

A B

A1 B1
Figura 9. Hibridao in situ P.edulis x P. setacea quatro a seis
sinais.

233
 Citogentica clssica e molecular em passifloras

Figura 10. Hibridao genmica in situ (Gish),

P. edulis x P.setacea.

Concluso
O conhecimento mais exato e preciso possvel da origem e relao
entre as espcies indicar os procedimentos adequados manipulao
gentica dentro de um programa de melhoramento gentico. Portanto, o
conhecimento adquirido nas reas de biologia celular e molecular tem e vem
contribuindo para o entendimento de como os genes esto organizados nos
genomas.

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