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COORDENADORES:
RIO CLARO
2008
II Curso de Monitoramento Teórico e Prático da Fermentação Etanólica
1. OBJETIVO
O controle do crescimento da população microbiana dentro de um complexo
industrial de açúcar e álcool objetiva essencialmente a diminuição das perdas de
matéria-prima e, conseqüentemente, alcançar melhores rendimentos econômicos.
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3. COLETA DE AMOSTRAS
As amostras devem ser coletadas com muito cuidado, sempre da mesma forma
e por pessoas de alta responsabilidade.
Da coleta correta das amostras, acoplado ao bom desenvolvimento laboratorial,
depende o resultado de uma empresa.
O ideal é que as coletas sejam feitas em frascos inquebráveis, autoclaváveis e
transparentes. Existem frascos especiais de coleta, que podem ser autoclavados.
Quando as análises são para microbiologia, os frascos são de 200; 300 a 500
mL. As amostras preferencialmente devem ser amostras mistas ou compostas.
Uma vez coletadas as amostras, os frascos devem ser fechados e guardados
sob refrigeração de 5 ± 2ºC, pelo menor tempo possível. Dependendo da amostra é
conveniente anotar no momento da coleta a temperatura e o pH (ficar atento quando as
amostras estão em etapa fermentativa, pois podem gerar pressão nos frascos).
˚ MICROSCOPIA
A análise por contagem microscópica é importante, pois permite relacionar
possíveis aumentos das bactérias no mosto proveniente das diferentes etapas do
processo.
Para contagem pode-se empregar várias técnicas, entretanto a câmara de
Neubauer é simples e confiável.
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˚ PLAQUEAMENTO
O plaqueamento embora não forneça o resultado imediato pode garantir a
viabilidade dos microrganismos presentes, além de permitir avaliar a presença de
microrganismos em volumes maiores.
˚ FISIOLOGIA
O método de resazurina ou corantes diferenciais (azul de metileno e eritrosina)
permitem avaliar de forma relativa à presença de atividade microbiana em função da
mudança de cor no corante.
A produção de ácido pode ser avaliada e comprovada mediante medida do pH,
ou com aplicação de corantes como indicadores diferenciais, ou ainda nos meios os
quais se adiciona CaCO3.
Quanto à produção de goma, que é o resultado da polimerização de açúcares
simples glicose e frutose que formam respectivamente dextrana e levana.
5. MATERIAL E MÉTODOS
• Preparar uma solução de NaCl 9 g/L, ajustar o pH a 7,0 com solução de NaOH.
• Solução de resazurina a 10 mg/L de solução de NaCl 9,0%. A solução não deve
ser estocada por muito tempo (10 dias), e deve ser protegida da luz e de altas
temperaturas.
• Preparar tubos com 9 mL de solução de resazurina, tampar com algodão,
autoclavar 10 minutos a 121 ºC.
• Nos tubos com resazurina, adicionar 1 mL da amostra. Incubar em estufa ou
banho-maria a 37 ºC.
• Anotar as mudanças de cor a cada 30 minutos (violeta-róseo-incolor), estão em
relação direta com a atividade microbiana.
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Avaliação Tratamento
Modificação da cor (horas)
da infecção
violeta róseo incolor
- 0,5 3,0 alta imediato
0,5 2,0 4,0 alta imediato
1,0 4,0 6,0 média imediato
3,0 5,0 7,0 fraca normal
3,0 5,0 - desprezível preventivo
5.2. Plaqueamento
Para este teste deve-se dispor dos seguintes materiais:
• Autoclave;
• Estufa de incubação;
• Placas de petri;
• Tubos para diluição;
• Pipetas;
• Bico de bunsen;
• Algodão;
• Reagentes: meios de cultura que podem ser adquiridos prontos ou preparados a
partir de seus componentes. Os meios podem variar de acordo com a
necessidade e o ponto de amostragem.
Preparo do material:
Placas de Petri e pipetas devem ser esterilizadas embrulhadas em papel ou em
recipientes próprios.
A solução salina (NaCl a 0,85%) é colocada no volume de 9 mL em tubos. A
seguir tampa-se com algodão e esteriliza-se em autoclave.
Os meios de cultura quando preparados devem ser autoclavados para
esterilização durante 15 minutos a 121ºC.
A amostra a ser analisada deve ser representativa do ponto selecionado.
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Das amostras são feitas diluições decimais utilizando-se soluções contidas nos
tubos. Deve-se diluir a amostra para se atingir entre 30 e 300 UFC (Unidades
Formadoras de Colônias) por placa.
Feitas as diluições, selecionam-se as que serão processadas. A seguir, retira-se
uma alíquota do tubo da diluição selecionada e transfere-se para a placa que conterá
ou não o meio de cultura, dependendo da técnica a ser aplicada (superfície = 0,1 mL ou
“pour plate” = 1 mL).
Caso a placa não contenha o meio, este deverá ser colocado posteriormente, já
liquefeito e a uma temperatura (± 50ºC), vertendo-o sobre a amostra, fazendo-se
movimentos em forma de oito para homogeneizá-la no meio antes da solidificação
(técnica “pour plate”).
Caso o meio já tenha sido colocado na placa, este deve estar frio e solidificado
ao se colocar a amostra na superfície. Neste caso a amostra é espalhada com auxílio
de uma espátula de Drigalsky (técnica de superfície).
Marcar na placa o meio, a amostra, a diluição, o volume de amostra e a data do
experimento.
Após estarem solidificadas, as placas então são incubadas a 36 ºC (bactérias) ou
28 ºC (leveduras). Pode-se aplicar também uma temperatura de 30ºC para bactérias e
leveduras, embora esta esteja abaixo do ideal para as bactérias que demorarão mais
para crescer.
A incubação deve ser por 24 a 48 horas e, a seguir, as colônias são contadas. O
experimento deve sempre ser feito em placas com duplicatas.
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• VOLUME DE FERMENTO
• VIABILIDADE CELULAR E BROTAMENTO CELULAR
• FLOCULAÇÃO
• LEVEDURAS SELVAGENS
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Lembrando que:
10 x 0,1 mm3 = 1 mm3
1000 x 0,001 mm3 = 1 mm3
10000 x 0,1 mm3 = 1 cm3 ou
104 x 0,1 mm3 = 1 cm3
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REGRAS DE CONTAGEM
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B) Pode haver menos de 200 células por quadrado grande, neste caso será
necessário a contagem de células de alguns quadrados grandes laterais para
atingir cerca de 200. Divida o número de células pelo número de quadrados
grandes e multiplique por 104 para achar o número de células por mL ou cm3.
C) Pode haver mais de 200 células por quadrado grande, neste caso conte as
células dos quadrados médios até haver contado cerca de 200. Determine o
número de células de um dos quadrados médios. Multiplique a média por 25
para obter as células por quadrado grande. Este número x 104 fornece o número
de células por cm3.
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5.6.1.2 Procedimento
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Solução estoque A:
Pesar 0,2 g e dissolver em 1 mL de acetona. Juntar 9 mL de água e esterilizar
por filtração em membrana “millipore” GSWP-01300, 0,22 micrometros. Essa
solução terá a concentração de 20 mg/mL. Guardar em geladeira.
Solução de trabalho B:
Transferir 5 mL da solução A e adicionar 95 mL de água destilada estéril.
A solução de trabalho terá a concentração de 1mg/mL. Usar 0,5 mL para cada
100 mL de meio já esterilizado e fundido. Guardar em geladeira.
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5.6.3.2 Plaqueamento
Plaquear em superfície 0,1 mL de suspensão de células por placa, espalhando
com espátula de Drygalsky. Incubar em estufa a 28oC e proceder às leituras de 2 a 5
dias.
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Peptona ou triptona............................................................................10 g
Glicose...............................................................................................40 g
Ágar ..................................................................................................17 g
Água destilada............................................................................1000 mL
Misturar os componentes e fundir em banho-maria. A seguir, distribuir
em frascos ou tubos, tampar e esterilizar em autoclave por 10 minutos a 1 atmosfera
(1210C).
Observação: este meio pode ser preparado com 20 g de glicose.
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6 – LITERATURA CONSULTADA
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