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Biotecnologia Microbiana

Produção de Bioplásticos por Culturas Microbianas


Mistas

Luísa S. Serafim¹, Paulo C. Lemos¹,² Maria A.M. Reis¹


¹ CQFB/REQUIMTE, Chemistry Department, FCT/UNL, Quinta da Torre, 2829-516 Caparica Portugal
² Instituto de Tecnologia Química e Biológica (ITQB), UNL, 2870-156 Oeiras, Portugal
amr@dq.fct.unl.pt

1  Introdução alternativa interessante às culturas 2- Características e Aplica-


puras. A selecção de culturas mistas ções dos PHAs
Os plásticos convencionais, produzi-
com elevada capacidade de acumula-
dos a partir de derivados de petróleo,
ção de PHAs ocorre naturalmente em Os PHAs existem no citoplasma da
originam enormes problemas de
resultado das condições de operação célula sob a forma de grânulos (0.2
contaminação ambiental por não
serem biodegradáveis, persistindo
do reactor e, consequentemente, não a 0.5 µm de diâmetro) rodeados por
há necessidade de esterilização do uma membrana (Sudesh et al., 2000)
como contaminantes durante longos
sistema. Por outro lado, a utilização (Figura 1). Os grânulos fluorescentes
períodos de tempo. Tem havido uma
de culturas mistas facilita o uso de de PHAs podem ser observados por
grande pesquisa no sentido de desen-
substratos complexos obtidos a partir microscopia de epifluorescência
volver polímeros biodegradáveis com
de resíduos orgânicos, dado que a usando corantes lipofílicos tais como
propriedades idênticas às dos plásticos
população microbiana se adapta con- o Azul de Nilo (Figura 4).
convencionais, de modo a poderem
tinuamente à mudança de substrato.
substituir estes últimos em aplicações A fórmula química geral dos PHAs
semelhantes. Assim, a possibilidade de produção de está representada na Figura 2. Foram
PHAs por culturas microbianas mistas identificados mais de 100 monómeros
Existem no mercado diversos plásticos
pode reduzir substancialmente o custo diferentes como constituintes dos
biodegradáveis tais como polihidro-
destes biopolímeros e, consequente- PHAs em várias bactérias. O polihi-
xialcanoatos (PHAs), polilactato
mente, torná-los economicamente droxibutirato (PHB), constituído por
(PLA) e poliglicolatos (PGA). Os
mais competitivos com o polipropile- monómeros de 3-hidroxibutirato, é
PHAs são termoplásticos e possuem
no. O preço dos PHAs produzidos por o PHA mais bem caracterizado e o
propriedades físicas e químicas mui-
culturas mistas pode, de facto, baixar acumulado com maior frequência
to semelhantes às do polipropileno,
para cerca de metade do preço dos por bactérias (Madigan et al., 2000).
o que os torna possíveis candidatos
produzidos por culturas puras, devido Outros PHAs frequentemente acu-
progressivamente mais aplicáveis na
essencialmente à redução do custo dos mulados por bactérias incluem o
sua substituição.
substratos e dos custos de investimen- polihidroxivalerato (PHV), polihi-
O grande obstáculo à substituição do to (Meesters, 1998). droximetilvalerato (PMHV) e o
polipropileno por PHAs tem sido de
natureza económica. De facto, o preço
dos PHAs é cerca de nove vezes supe-
rior ao do polipropileno (€ 9/kg para o
PHB contra €1/kg para o polipropile-
no) (Biby, 2002).
A razão principal do elevado custo
dos PHAs decorre do facto de actual-
mente serem produzidos por culturas
microbianas puras e substratos caros
(glucose e ácido propiónico), o que
resulta em custos elevados de inves-
timento e de produção (necessidade
de um maior controlo da operação e
de equipamento auxiliar para esteri-
lização).
O uso de culturas mistas para pro-
dução de PHAs pode constituir uma
Figura 1 – Grânulos de PHB acumulados por Azotobacter vinelandii UWD (Page et al., 1995)

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térias pode atingir 80 % do seu peso


celular (Kim et al. 1994).
Para além de culturas puras microbia-
nas, as culturas mistas tem sido refe-
renciadas como produtoras de PHAs.
A acumulação de PHAs por culturas
mistas é particularmente importante
em populações microbianas presentes
em estações de tratamento de efluen-
tes que experimentam condições
transientes de disponibilidade de
carbono e/ou oxigénio. Exemplos de
microrganismos que sintetizam PHAs
em condições transientes de oxigénio
são as Bactérias Acumuladoras de Fós-
foro (PAOs “Polyphosphate Accumu-
lating Organisms”), responsáveis pela
remoção de concentrações elevadas
Figura 2 – Fórmula química geral dos PHAs (Lee, 1996) de fósforo de efluentes. Nas estações
de tratamento biológico de efluentes
contaminados com fósforo, a bio-
polihidroximetilbutirato (PMHB). HV é de 30% (mol/mol).
massa recircula continuamente entre
A sua presença e proporção relativa
As aplicações mais gerais dos PHAs ambientes anaeróbios e aeróbios, o que
dependem do tipo de substrato usado
incluem filmes para embalagens e estimula a síntese de reservas intrace-
pelo microrganismo.
plásticos convencionais. Dado que os lulares. A acumulação de reservas
Se forem usadas misturas de subs- PHAs são biocompatíveis, são usados intracelulares, nomeadamente PHAs,
tratos, os microrganismos podem em aplicações médicas e farmacêuti- tem um papel muito importante no
sintetizar co-polímeros, compostos cas (fios de sutura cirúrgica, implantes metabolismo destes microrganismos.
por diferentes monómeros. O co- ósseos, fármacos de libertação lenta, Nestes sistemas ocorre um outro
polímero constituído por monómeros etc.). Na agricultura, os PHAs são grupo de microrganismos designado
de 3-hidroxibutirato e de 3-hidroxi- usados em produtos de libertação de Bactérias Acumuladoras de Glicogé-
valerato (3 HB-co-3HV) é produzido reguladores de crescimento de plantas nio (GAOs-”Glycogen Accumulating
industrialmente por uma cultura pura ou de pesticidas. Organisms”) que sintetizam PHAs
de Ralstonia eutropha, usando como mas não acumulam fósforo (Liu et al.,
substratos ácido propiónico e gluco- 1996). A quantidade de biopolímero
se. A formação de um co-polímero 3- Microbiologia acumulado por PAOs e GAOs é rela-
contendo unidades de 3HB e 3HV tivamente baixa, não ultrapassando
altera as propriedades do material, Os PHAs são sintetizados por um 20% do peso celular, o que limita a sua
conduzindo a uma diminuição da grande número de bactérias Gram utilização para a produção industrial
cristalinidade e da temperatura de negativas e Gram positivas pertencen- de PHAs.
fusão, obtendo-se um polímero tes pelo menos a 75 géneros diferentes.
Alguns exemplos de culturas puras A produção de PHAs por culturas
menos rígido e mais resistente, que
usadas industrialmente para produzir mistas aeróbias é especialmente eleva-
proporciona melhores condições de
PHAs incluiem a Ralstonia eutropha, da quando estas são submetidas a con-
processamento. Consequentemente, as
Alcaligenes latus, Azotobacter vinelan- dições transientes de disponibilidade
propriedades do co-polímero podem
dii e diversas espécies de Pseudomonas. de carbono. As condições transientes
ser definidas variando a composição
Os PHAs podem ser eficientemente de excesso e falta de substrato causam
relativa dos ácidos orgânicos presentes
produzidos por microrganismos respostas dinâmicas no metabolismo
no meio de cultura.
geneticamente modificados, como celular. Sob estas condições dinâmicas,
O peso molecular dos PHAs produ- o crescimento torna-se desequilibra-
por exemplo a Echerichia coli recom-
zidos industrialmente por culturas do (“unbalanced”), i.e. o substrato é
binante.
puras varia entre 1.7 x 105 e 4.5 x 106. consumido sem ocorrer um aumento
Os PHAs mais comuns são polímeros A produção de PHAs por estas bacté- correspondente de todos os com-
semicristalinos. O grau de cristali- rias ocorre, na maioria dos casos, em ponentes celulares (sem síntese de
nidade depende da composição do situações em que um nutriente, que biomassa activa) (Beccari et al., 1998).
polímero: sendo 60-80% para o PHB não a fonte de carbono, é limitante Neste caso, o substrato é armazenado
e decrescendo para 30-40% para o co- para o crescimento. A quantidade de no interior da célula sob a forma de
polímero cujo conteúdo em unidades polímero acumulado por estas bac- PHAs. A produção de PHAs por cul-

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turas expostas a condições dinâmicas


de disponibilidade de carbono, pode
atingir valores superiores a 60% do
peso celular (Reis et al., 2003). Não
existe, até ao momento, uma identifi-
cação microbiológica dos grupos ou
grupo de bactérias pertencentes a este
fénotipo.
Algumas plantas produtoras de cere-
ais, tais como o girassol e a soja, con-
seguem sintetizar PHAs. Contudo, o
rendimento de produção (4% do peso
da planta) é muito inferior ao produ-
zido por bactérias, o que, actualmente,
reduz a viabilidade de produção de
PHAs por esta via.
Este artigo aborda a produção de Figura 3 – Perfis de concentrações e da velocidade especifica de crescimento num processo com
PHAs por culturas mistas sujeitas a culturas mistas submetidas a condições dinâmicas de adição de carbono.
condições dinâmicas de disponibilida-
de de carbono. crescimento. Se o tempo de exposição GAOs, a acumulação de reservas
ao substrato se prolongar de tal modo intracelulares a partir do substrato
que ocorra adaptação fisiológica, o externo e o crescimento, ocorrem
4  Processo de Produção crescimento celular torna-se o proces- em simultâneo.
de PHAs por culturas so dominante.
Neste tipo de sistemas dinâmicos,
mistas em Condições O mecanismo de acumulação de os microrganismos que possuem a
Transientes de Adição de reservas poliméricas quando os capacidade de acumular substrato
Carbono microrganismos são sujeitos a condi- sob a forma de reservas intracelula-
ções transientes de carbono (períodos res podem sobreviver durante a fase
curtos de excesso de carbono alterna- de ausência de carbono externo e,
4.1- Mecanismo de produção de dos com períodos longos de limitação portanto, têm uma vantagem competi-
PHAs de carbono externo) foi proposto por tiva sobre os microrganismos que não
Majone et al. (1999): possuem esta capacidade, tornado-se
Quando uma cultura microbiana dominantes.
experimenta um aumento brusco na - Após um período prolongado de
concentração de substrato disponível, limitação de carbono (“fome”), os A Figura 4 representa os grânulos de
após um período de limitação do microrganismos, quando expostos PHB corados no início e no fim da fase
crescimento, podem ocorrer dois tipos a elevadas concentrações de car- de “fartura” para uma cultura mista
de adaptação, que dependem essen- bono (“fartura”), transformam a sujeita a ciclos de “fome” e “fartura”.
cialmente da natureza do substrato, maior parte do substrato em reser-
da cultura microbiana e das condições vas poliméricas internas e o restan-
4.2-Metabolismo
de operação (Daiger e Grady, 1982): te em crescimento celular (Figura
a biomassa pode adaptar-se às novas 3). Após a exaustão do substrato Não existe ainda nenhum modelo
condições aumentando o crescimento externo, as reservas internas são metabólico para o processo de pro-
celular (crescimento como resposta) usadas para crescimento e manu- dução de PHAs por culturas aeróbias
ou rapidamente acumular o substrato tenção celular. Neste período de sujeitas a condições dinâmicas de
sob a forma de reservas intracelulares limitação de carbono, a velocidade adição de carbono, mas provavelmen-
(acumulação como resposta). A acu- específica de crescimento atinge te não será muito diferente do que é
mulação de reservas é a resposta mais valores muito baixos, o que obriga conhecido para culturas puras que
rápida porque requer uma menor o microrganismo a uma adaptação acumulam PHAs (Figura 5). O com-
adaptação fisiológica dos micror- fisiológica na fase seguinte quando posto intermediário chave na síntese
ganismos. Nestas condições, há um confrontado com um excesso de e degradação de PHAs é o acetil-CoA.
desacoplamento entre o consumo de carbono disponível, resultando Enquanto existe substrato externo for-
substrato e o crescimento, ocorrendo preferencialmente num mecanis- ma-se acetil-CoA, que é parcialmente
acumulação de reservas intracelula- mo de acumulação de reservas em desviado para a produção de PHAs
res. O fenómeno de acumulação de detrimento do crescimento celular. e para crescimento, através do ciclo
reservas intracelulares é geralmente Nestas condições, e contrariamen- dos ácidos tricarboxílicos (TCA). Na
dominante (cerca de 70%) sobre o te ao que acontece com as PAOs e síntese de PHB são condensadas duas

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(a) (b)
Figura 4 – Grânulos de PHAs observados por microscopia de epifluorescência após coloração com Azul de Nilo.(a) início da fase de “fartura” ; (b)
fim da fase de “fartura”

moléculas de acetil-CoA para formar parâmetros de operação do processo, o sequencial (SBR). O SBR é operado
acetoacetil-CoA, sendo esta reacção rendimento de produção de PHAs por em ciclos de cerca de 12 a 24 horas. A
catalisada pela enzima 3- Cetotiolase. culturas mistas possa atingir valores adição de substrato é feita por pulso,
A síntese de PHB prossegue pela acção superiores aos descritos na literatura. sendo consumido em cerca de 1 a 2
das enzimas NADPH redutase e PHB horas, seguindo-se um período de
A optimização da produção de PHAs
sintetase. Após a exaustão do substrato cerca de 10 a 22 horas de ausência
tem de passar necessariamente pela
externo, o PHB é degradado, produ- de carbono externo (Dircks et al.,
selecção da configuração de reactor e
zindo-se acetil-CoA que é usado para 2001, Serafim et al., 2002). Os SBRs
das condições de operação que con-
crescimento e manutenção celular são reactores ideais para seleccionar
duzam à obtenção de rendimentos e
(ciclo a tracejado na Figura 5). populações microbianas com elevada
produtividades elevadas. A configura-
capacidade de acumulação de PHAs,
ção de reactor mais usada para estudar
porque a biomassa cresce em condi-
4.3 – Optimização do processo a produção de PHAs por culturas
ções transientes. Este tipo de reactor
mistas, usando o processo de “Fome
Um dos factores que tem limitado a é fácil de controlar e é altamente
e Fartura”, é o reactor descontínuo
produção de PHAs por culturas mis-
tas tem sido o baixo rendimento de
produção quando comparado com o
obtido por culturas puras, nomeada-
mente por Ralstonia eutropha, usada
na produção Industrial de PHAs (Kim
et al., 1994). De facto, enquanto este
microrganismo é capaz de acumular
cerca de 80% (massa de PHA por
massa celular), o valor referido na
literatura para culturas mistas não
ultrapassa 60% (Reis et al., 2003).
Este valor máximo de acumulação
de PHAs foi obtido com culturas de
lamas activadas, sujeitas a condições
transientes de adição de substrato
(“Fome e Fartura”) descritas anterior-
mente. Deverá notar-se, contudo, que
o interesse pela produção de PHAs
por culturas mistas tem tido como
principal objectivo estudar os meca-
nismos de acumulação de reservas
intracelulares e não a sua optimização
com vista à produção industrial, pelo Figura 5 – Metabolismo de síntese e degradação de PHB por diversos microrganismos (modifica-
que é de esperar que, manipulando os do a partir de Sudesh et al., 2000).

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Figura 7. A alimentação em contínuo


(Figura 7a) resultou numa diminuição
na produtividade do reactor (0.30
Cmmol HB/Cmmmol X.h) e no
conteúdo em polímero nas células
(56%), relativamente à situação em
que a mesma quantidade de substrato
(180mmol C/l) tinha sido adicionada
num pulso (Figura 6). Este resultado
pode ser explicado pelo facto de no
sistema alimentado em contínuo, o
substrato dentro do reactor ter sido
limitante para o processo de acumu-
lação de PHB. Pelo contrário, quando
a mesma quantidade de substrato foi
adicionada em três pulsos (Figura
7b), a produtividade (0.80 Cmmol
HB/Cmmmol X.h) e a quantidade de
polímero acumulado (78.5%) aumen-
Figura 6 – Efeito da concentração de substrato na produtividade especifica (qp), no rendimento taram significativamente em relação
de produção de PHB (Yp/s) e no conteúdo em PHB na biomassa (%HB). às experiências em que o substrato
foi adicionado num único pulso e em
flexível, permitindo a alteração rápida É interessante notar que as produtivi- contínuo. O conteúdo em PHB nas
dos ciclos de operação (duração da dades específicas (0.41-0.75 Cmmol células (78.5%) é idêntico ao obtido
alimentação e extensão do ciclo). HB/Cmmmol X.h) obtidas por por culturas puras (80%), o que torna
culturas mistas sujeitas a condições o processo de “ Fome e Fartura” extre-
4.3.1- Efeito da concentração de transientes de adição de carbono, mamente atractivo para a produção
substrato são cerca de uma ordem de grandeza industrial de PHAs.
superiores às obtidas (0.013 Cmmol A adição de 4 pulsos de carbono não
O efeito da concentração de substrato HB/Cmmmol X.h) por culturas puras originou qualquer aumento na acu-
na quantidade de polímero produzida usadas industrialmente (Kim et al., mulação de PHB, podendo afirmar-se
foi estudado usando acetato como 1994). Do ponto de vista da optimiza- que as células atingiram a máxima
substrato e um SBR operado com ção do processo, esta característica das capacidade de acumulação de políme-
ciclos de 12 horas. O acetato foi adi- culturas mistas é muito importante, ro para 180mmol C/l, distribuído em
cionado num único pulso, sendo con- por permitir obter elevadas produti- três pulsos.
sumido entre 1-4 horas, dependendo vidades com concentrações celulares
da concentração usada, seguindo-se baixas.
um período de 8 a 11 horas de ausên-
cia de carbono. Os resultados obtidos
5-Conclusões
4.3.2- Estratégia de operação do
para as diferentes concentrações de Reactor Manipulando os parâmetros de opera-
acetato estão representados na Figura ção do reactor, a quantidade de PHB
6. Verifica-se que o conteúdo em PHB Uma forma de garantir a produção obtida por culturas mistas pode atin-
na biomassa aumenta com a concen- de elevadas quantidades de polímero, gir valores semelhantes aos obtidos
tração de substrato, atingindo 67% do minimizando a inibição por substrato, por culturas puras.
peso celular. No entanto, a produtivi- será adicionar o substrato de forma
dade específica em polímero atinge o semi-contínua (“fed-batch”) ou con- Embora este estudo tenha sido efec-
máximo (0.75 mmmol C/mmol X.h) tínua. No último caso o substrato, tuado com ácido acético, experiências
para 90mmol C/l e decresce acentua- correspondente ao máximo anterior realizadas com outro tipo de substra-
damente para a concentração de subs- (180mmol C/l), é adicionado conti- tos, tais como ácido propiónico e ácido
trato de 180mmol C/l. Este decréscimo nuamente durante a fase de “fartura”, butírico, revelaram que os ácidos orgâ-
é originado pela inibição da síntese de seguindo-se um período de “fome”. No nicos voláteis são excelentes substratos
PHB para elevadas concentrações de primeiro caso, a mesma quantidade de para a produção de PHAs por culturas
substrato. A razão entre a quantidade substrato é distribuída por três pulsos mistas. Tendo em conta este aspecto,
de polímero produzido e de substrato sequenciais, seguindo-se igualmente pode-se concluir que a produção de
consumido (Yp/s), é independente da um período de “fome”. PHAs por culturas mistas abre novas
concentração de substrato usada, atin- perspectivas à utilização e valorização
Os resultados obtidos para os dois de resíduos industriais que possuam
gindo um valor médio de 0.72 Cmmol
tipos de estratégia de alimentação na sua composição compostos orgâni-
HB/Cmmol HAc.
do reactor estão representados na

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(a) (b)
Figura 7 – Produção de PHB para dois tipos de adição de substrato: (a)- alimentação em contínuo; (b) – alimentação por pulsos. (æ - velocidade
de adição de acetato (a) e concentração de acetato (b), à- % de PHB, ç- OUR (velocidade específica de consumo de oxigénio (oxygen uptake rate),
ó-concentração de amónia).

cos fermentáveis (ex. soro de leite, res- feeding. Water Research 32 (11): 3403-3413. Page, W.J., Sherburne, R., D’Elia, L., Graham,
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foi financiado pela Fundação para a Ciên-
cia e Tecnologia (FCT). Luísa S. Serafim e Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J., 2000.
Paulo C. Lemos agradecem à FCT pelas Brock Biology of Microorganisms, Prentice-
Hall International Editions, Upper Saddle
bolsas PRAXIS XXI BD/18287/98 e BPD/
River.
20197/99, respectivamente.
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Boletim de Biotecnologia 21