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Diviso de Atendimento ao Cliente e Ps - Marketing

DIACM

Maro de 2012

ndice
Princpio do Ensaio .................................................................................................................... 1
Introduo a Biologia.................................................................................................................. 3
CIDOS NUCLICOS................................................................................................................ 3
ESTRUTURA DA MOLCULA DE DNA .................................................................................... 6
ESTRUTURA DA MOLCULA DE RNA .................................................................................... 8
Cdigo do DNA .......................................................................................................................... 9
DA SEQUENCIA DE DNA SNTESE PROTICA ................................................................... 9
Duplicao / Replicao ........................................................................................................... 11
Transcrio .............................................................................................................................. 12
Sntese de Protenas Traduo ............................................................................................. 13
HIV HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS ......................................................................... 15
ESTRUTURA VIRAL E GENMICA ........................................................................................ 15
REPLICAO DO HIV ............................................................................................................. 16
CARGA VIRAL ......................................................................................................................... 19
DINMICA DO HIV NO ORGANISMO INFECTADO ............................................................... 19
HCV HEPATIT VIRUS C ....................................................................................................... 20
Estrutura Viral e Genmica do Vrus ........................................................................................ 20
REPLICAO DO HCV ........................................................................................................... 22
TRANSMISSO ....................................................................................................................... 23
CARGA VIRAL ......................................................................................................................... 24
Princpio da tcnica .................................................................................................................. 25
Reao de polimerase em cadeia ............................................................................................ 25
Cintica da reao ................................................................................................................... 26
Etapas da reao de PCR ........................................................................................................ 27
Condies da PCR ................................................................................................................... 28
PCR em Tempo Real ............................................................................................................... 29
PCR Multiplex .......................................................................................................................... 29
RT-PCR.................................................................................................................................... 29
PCR em Tempo Real no NAT HIV / HCV de Bio-Manguinhos ................................................. 31
Biossegurana ......................................................................................................................... 32
Componentes e Apresentao do Kit ....................................................................................... 33
Formato do Kit .......................................................................................................................... 33
Componentes e Apresentao do Kit........................................................................................33
Relao dos componentes fornecidos com o produto:............................................................. 33
Relao dos materiais necessrios no fornecidos ................................................................. 34
Indicao das condies adequadas de armazenamento e transporte ................................... 34
Material de reposio ............................................................................................................... 34
Precaues, cuidados especiais e esclarecimentos sobre os riscos decorrentes do manuseio
do produto e seu descarte .................................................................................................... 35
Influncias pr-analticas, tais como, anticoagulantes e temperatura ...................................... 36
Cuidados com as amostras biolgicas ..................................................................................... 36
Plataforma NAT Nacional ......................................................................................................... 37
Fluxo Metodolgico .................................................................................................................. 38
Esquema do Teste ................................................................................................................... 38
NAT Teste de cido Nuclicos .............................................................................................. 39
A) Preparo do Pooling .............................................................................................................. 40
Etapas e Equipamentos: .......................................................................................................... 40
Procedimento ........................................................................................................................... 41
Utilizao do Janus .................................................................................................................. 41
Inicializao do rob (Initialize): ............................................................................................... 42
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ii
Reviso: 29/03/2012

Remoo de bolhas e lavagem do sistema (FlushSysLiq) ....................................................... 42


Procedimento Pool de seis amostras ....................................................................................... 45
Rotinas utilizando somente amostras em Single ...................................................................... 55
B) EXTRAO ......................................................................................................................... 56
PROCEDIMENTOS.................................................................................................................. 56
Utilizao do MDx: ................................................................................................................... 56
2.1. Instrues gerais Sistema de reposio e descarte de lquido: ..................................... 60
- Preparo da Mesa de Trabalho e Carrossel do Equipamento ................................................. 62
Carregamento das amostras na mesa de trabalho .................................................................. 72
2.4 Verificao de cogulos ..................................................................................................... 73
C) Protocolo de Reao de PCR - JANUS............................................................................... 79
D) Amplificao e Deteco ..................................................................................................... 86
Amplificao ............................................................................................................................. 86
Deteco .................................................................................................................................. 86
4. Procedimento para Amplificao e Deteco Real Time 7500 ......................................... 87
E) Processamento de dados e Resultados .............................................................................. 90
E.1 Gerao do laudo de resultados no Software de Bio-Manguinhos .................................... 92
E.2 Interpretao dos Resultados ............................................................................................ 95
E.2.1: Interpretao do Laudo .................................................................................................. 95
E.2.2 Interpretao das curvas de amplificao no ABI 7500 .................................................. 97
A. Controle interno e amostras no detectveis ....................................................................... 98
B.Controles Negativos e positivos ............................................................................................ 99
C. Perfis dentro do padro esperado ..................................................................................... 101
Perfis fora do padro esperado .............................................................................................. 102
Armazenamento do Kit ........................................................................................................... 105
Condies de Transporte ....................................................................................................... 105
Conservao e Estocagem .................................................................................................... 105
Instrues de uso do Tag........................................................................................................106
EQUIPAMENTO MDx ............................................................................................................ 107
PROCEDIMENTOS DE MANUTENES ............................................................................. 107
Liquid containers cleaning Limpeza dos recipientes de lquidos ...................................... 110
MANUTENES DIRIAS .................................................................................................... 110
Tip-Disposal Station Cleaning Maintenace - Limpeza da estao Tip-Disposal..................... 110
Worktable cleaning Maintenance Limpeza da mesa de trabalho ........................................ 110
Bar Code Reader Windows Cleaning Maintenence Limpeza da janela do leitor de cdigos de
barra ................................................................................................................................... 111
High-Dispensing System and Liquid Detectors Maintenance - Manuteno do Sistema de
detector de lquido e sistema dispensador de alta velocidade ............................................ 111
MANUTENES SEMANAIS ................................................................................................ 111
Reagent Carousel Cleaning Maintenance Limpeza o carrossel de reagentes .................... 114
MANUTENES MENSAIS .................................................................................................. 114
System Liquid Container Cleaning Maintenance Limpeza do recipiente de lquido do sistema
............................................................................................................................................ 114
Worktable Cleaning Maintenance Limpeza da mesa de trabalho ....................................... 115
Robotic Handling System Cleaning Maintenance Limpeza do Lab Hand ......................... 115
Biannual Maintenance Procedure Manuteno semestral .................................................. 115
MANUTENES SEMESTRAIS ........................................................................................... 115
EQUIPAMENTO ABI 7500 ..................................................................................................... 116
Calibrao do ABI 7500 ......................................................................................................... 116
A) Calibrao ROI: ................................................................................................................. 116
B) Calibrao Background ..................................................................................................... 117
C) Calibrao ptica .............................................................................................................. 117
D) Calibrao do Dye ............................................................................................................. 118
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iii
Reviso: 29/03/2012

E) Calibrao do DYE 3 ......................................................................................................... 119


BACKUP DOS EQUIPAMENTOS .......................................................................................... 121
BACKUP JANUS: ................................................................................................................... 121
BACKUP MDx: ....................................................................................................................... 122
BACKUP ABI 7500: ................................................................................................................ 122
ENVIO DE ARQUIVOS PARA A DIACM................................................................................ 123
Problema na consolidao no Janus :.................................................................................... 123
Problemas no MDx: ................................................................................................................ 123
MENSAGENS DE ERROS DOS EQUIPAMENTOS: ............................................................. 125
Mensagens de Erros no Janus: .............................................................................................. 125
ERRO: Liquid Handling Error ................................................................................................. 125
ERRO: System liquid empty ................................................................................................... 126
ERRO : Dilutor Module Error .................................................................................................. 126
ERRO 2: Liquid Handling Error .............................................................................................. 127
Cuidados bsicos para a preveno de ERROS no Janus: ................................................... 128
Cdigos de ERROS BioRobot MDx : ..................................................................................... 129
Cuidados bsicos para a preveno de ERROS no MDx: ..................................................... 130
Mensagem de erro do ABI 7500 : .......................................................................................... 131
Cuidados bsicos para a preveno de ERROS no ABI 7500: .............................................. 131
Descontaminao .................................................................................................................. 132
Ambiente ................................................................................................................................ 132
Janus...................................................................................................................................... 132
MDx ........................................................................................................................................ 132
ABI ......................................................................................................................................... 133
Cuidados adicionais para os hemocentros no uso da plataforma NAT .................................. 133
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ....................................................................................... 140

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iv
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Siglas
AIDS Sndrome da Imunodeficincia Adquirida
cDNA DNA complementar
DNA cido desoxiribonuclico
EPC Equipamento de proteo coletiva
EPI Equipamento de proteo individual
FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
HCV Vrus da Hepatite C
HIV Vrus da imunudeficincia humana
IL interleucina
mRNA RNA mensageiro
NAT Teste de cidos nuclicos
ORF Open Reading Frame
PCR Reao de Polimerase em Cadeia
RNA cido ribonuclico
rRNA RNA ribossmico
TNF - fator de neurose tumoral
tRNA RNA transportador

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v
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Princpio do Ensaio
A Plataforma NAT Multiplex HIV/HCV emprega tcnicas de Biologia Molecular para a
deteco, em tempo real, dos produtos de amplificao gerados numa reao de PCR
(Reao da Polimerase em Cadeia). O diagnstico laboratorial, nesta tecnologia, usado
para a pesquisa de cidos nuclicos especficos baseada na amplificao e deteco
simultnea de sequncias de RNA de HIV (Vrus da Imunodeficincia Humana) e HCV (Vrus
da Hepatite C). O processo de deteco realizado atravs da captao de fluorescncia
emitida pela amplificao do produto, com maior especificidade, devido utilizao de sondas
especficas marcadas com fluorforos para o fragmento alvo na reao.
Esse ensaio consiste na extrao automatizada de cidos nuclicos de um conjunto de
seis amostras biolgicas, chamado pool, juntamente com uma partcula calibradora
biossegura, ocorrendo purificao do material gentico que amplificado enquanto reage
com sondas marcadas (TaqMan chemistry). Estes marcadores utilizam a atividade nuclease
5' da enzima polimerase. O sistema de sondas possui fluorforos especficos (Reporter) e
uma molcula dissipadora de energia (Quencher) (Fig.1). A transferncia de energia ocorre
em virtude do fenmeno FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer. A reao
acontece quando h degradao da sonda, pois o aumento da distncia entre o reporter e a
molcula do quencher causa a emisso de fluorescncia, que pode ser detectada pela leitura
do comprimento de ondas especficas para cada tipo de fluorforo liberado. O monitoramento
do progresso da PCR medida que ela ocorre, em tempo real, possibilitado por meio da
leitura das intensidades da fluorescncia a cada ciclo, uma vez que as intensidades so
proporcionais ao nmero de amplicons gerados. Utiliza-se o fluorforo VIC para HIV, FAM
para HCV e DYE 3 para a partcula calibradora. Abaixo o esquema da reao de amplificao
em tempo real e as sondas utilizadas (Fig. 1).

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1
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Fig 1. Processo de liberao do Reporter aps a atividade 5 3 nuclease da enzima DNA polimerase.

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2
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Introduo a Biologia Molecular


CIDOS NUCLICOS
Os cidos nuclicos so macromolculas de extrema importncia biolgica em todos os
organismos vivos. As clulas recebem instrues sobre que protenas sintetizarem e em que
quantidades, a partir dos cidos nuclicos, que so molculas que estocam e transmitem a
informao gentica na clula.
Essas molculas constituem os genes, localizados nos cromossomos das clulas (Fig.
2). Essa informao transmitida atravs do cdigo gentico, cuja traduo resulta na sntese
protica.

Fig. 2: Cada cromossomo formado por uma nica molcula de dupla hlice de DNA condensada com protenas
(histonas). Esse complexo de DNA mais protenas chamado de cromatina. Em uma clula eucaritica, quase
todo o DNA est compactado na cromatina. O DNA "empacotado na cromatina para diminuir o tamanho da
sua molcula, e para diminuir o tamanho da sua molcula, e para permitir maior controle por parte da clula de
tais genes.

Os cidos nuclicos so polmeros lineares de nucleotdeos, unidos por ligaes


fosfodister. Polmeros lineares so molculas muito longas compostas por um grande
nmero de subunidades pequenas que se repetem chamadas de monmeros.
Existem dois tipos de cidos nuclicos: cido desoxirribonuclico (DNA) e cido
ribonuclico (RNA). O acar que compe ambos os cidos nuclicos uma pentose, a nica
diferena est na presena de um oxignio ligado ao carbono 2 da cadeia, o DNA composto
de uma desoxirribose e o RNA de uma ribose (Fig. 3).
Elaborado pela DIACM
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3
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A
.

B
Desoxirribose
Ribose

Base

Fosfato

Base

Fosfato

OH

OH

OH

Fig. 3. A: Representao de um nucleotdeo mostrando o acar, o grupo fosfato e a base nitrogenada. B:


Molculas representativas dos aucares Ribose e Desoxirribose que compem o RNA e o DNA respectivamente.
Notar que essas duas molculas diferem entre si somente pelo fato da ribose possuir um tomo de oxignio a
mais em relao desoxirribose.
. :

As bases adenina (A), guanina (G), e citosina (C), so encontradas em ambos os


cidos nuclicos, enquanto que a timina (T), s encontrada no DNA e a uracila (U), s no
RNA. Essas bases nitrogenadas so classificadas em dois tipos: purinas e pirimidinas. As
purinas (adenina, guanina e uracila) possuem dois anis unidos e as pirimidinas (timina e
citosina - DNA) possuem um nico anel heterocclico (Fig. 4).
H

NH2

N
H

N
H

H
H2N

Adenina (A)

N
H

O
H

Pirimidina

N
H

Guanina (G)

NH2

N
H

HN

Purina

HN
N
H

Citosina (C)

N
H

Uracil (U)

Fig. 4. Estrutura das bases nitrogenadas que compem a molcula de DNA e RNA.

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4
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Cada nucleotdeo (monmero) composto de um grupamento fosfato, um acar


(pentose), uma base nitrogenada (purinas e pirimidinas) e cido fosfrico (Fig. 3A). Esses
nucleotdeos so interligados por pontes ou ligaes do tipo fosfodister. Essas ligaes
unem o carbono 3 da pentose do nucleotdeo adjacente. O esqueleto de um cido nuclico
composto por fosfatos e pentoses que se alternam. As bases nitrogenadas esto ligadas aos
acares desse esqueleto.
Uma sequncia de nucleotdeos possui uma orientao qumica de extrema
importncia. Em uma fita de DNA ou RNA, numa das extremidades h um grupo fosfato ligado
ao carbono 5 do acar (extremidade 5) e na outra h uma hidroxila ligada ao carbono 3 do
acar (extremidade 3). Convencionou-se escrever e ler a sequncia nucleotdica da
esquerda para a direita, no sentido 5 3 (Fig. 5). A cadeia polipeptdica possui
individualidade, determinada pela seqncia de suas bases, conhecida como estrutura
primria. nessa estrutura primria que a informao gentica est contida. O gene
corresponde a uma sequncia particular de DNA codificadora de uma informao (protena ou
RNA).

Ligao
Fosfodister

Fig. 5: Esquema ilustrativo do segmento de uma cadeia de DNA e RNA mostrando os nucleotdeos (A= adenina,
C = citosina, G = guanina, T = timina, U = uracila) interligados por uma ligao fosfodister.

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5
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ESTRUTURA DA MOLCULA DE DNA


O DNA est presente nos organismos vivos na forma de molculas lineares de peso
molecular extremamente elevado, contendo informaes necessrias para manter a
hereditariedade das clulas. Em 1953, James Watson e Francis Crick propuseram um modelo
de estrutura tridimensional do DNA, baseado principalmente, nos estudos de difrao de raios
X de Rosalind Franklin e Maurice Wilkins e em estudos qumicos da molcula.
Este modelo mostrou que o DNA uma dupla-hlice, no qual essas duas fitas se
enrolam em torno do eixo da hlice (Fig. 6). As desoxirriboses ficam externas em relao s
bases nitrogenadas como se fossem os corrimes de uma escada circular, expostas ao meio
aquoso (Fig. 5). As ligaes fosfodister, nas duas fitas, esto em direes opostas uma em
direo 5 3 e a outra 3 5 sendo, portanto, antiparalelas (Fig. 6). Os anis aromticos
das bases nitrogenadas so hidrofbicos e ficam orientados para o interior, quase
perpendiculares ao eixo da hlice. As bases esto pareadas entre as duas fitas da molcula,
mantendo a sua estrutura.

Fig. 6: Desenho ilustrativo da estrutura em dupla hlice da molcula de DNA proposta por Watson e Crick.

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6
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As duas cadeias polinucleotdicas mantm-se unidas atravs de ligaes de hidrognio,


que se estabelecem entre pares de bases especficas: adenina com timina e citosina com
guanina. Desde que exista uma distncia fixa entre as duas molculas de acar nas fitas
opostas, somente certos pares de bases podem se encaixar na estrutura. Os nicos pares
possveis so AT e CG. importante salientar que o par AT unido por duas pontes de
hidrognio e o par CG, por trs pontes de hidrognio, isso faz com que o par CG seja mais
estvel que o AT (Fig. 7).

Duas ligaes de hidrognio


entre Adenina e Timina

Trs ligaes de hidrognio


entre Guanina e Citosina

Fig. 7: Esquema ilustrativo mostrando os dois pares de bases do DNA. As bases complementares so adenina e
timina (A -T) e citosina e guanina (C - G). Observe que entre A - T existem duas ligaes de hidrognio, e entre
C - G so trs ligaes de hidrognio.

A sequncia de bases dispostas ao longo de uma cadeia de polinucleotdeo pode variar


consideravelmente, porm na outra cadeia a sequncia ser sempre complementar (Fig. 6).
Assim, as duas cadeias de polinucleotdeos que constituem um segmento de DNA so ditas
complementares entre si.
J que a estrutura de dupla hlice do DNA preservada por ligaes intermoleculares
fracas (ex.Ligao de hidrognio), possvel separ-las atravs de mtodos que envolvem,
por exemplo, aquecimento ou pH alcalino. A temperatura necessria para romper os pares
GC maior do que a necessria para romper o par AT, uma vez que este ligado por duas
ligaes de hidrognio. A temperatura na qual ocorre separao das cadeias de DNA (ponto
de desnaturao) depende da razo AT/GC.
Se o DNA aps a desnaturao for vagarosamente resfriado, as cadeias
complementares pareiam-se de forma ordenada, restabelecendo assim a conformao
original de dupla hlice (renaturao).

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7
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ESTRUTURA DA MOLCULA DE RNA


A estrutura primria do RNA semelhante do DNA, sendo composta tambm por
nucleotdeos (Fig. 3A). A primeira diferena, entretanto, que o acar presente a ribose
em vez da desoxirribose, vindo da o seu nome, cido ribonuclico. Como visto anteriormente,
a molcula de ribose difere da molcula de desoxirribose por apresentar um grupo OH ligado
ao carbono 2 em vez de um tomo de hidrognio (Fig. 3B).
Outra diferena que a base timina do DNA substituda no RNA pela base uracila
(U). Enquanto o DNA formado pela dupla hlice, o RNA encontrado principalmente como
uma cadeia simples de nucleotdeos, embora a molcula de RNA possa dobrar-se e formar
cadeia dupla entre bases complementares.
Existem trs principais classes de RNA: RNA mensageiro (mRNA), o RNA
transportador (tRNA) e o RNA ribossmico (rRNA). Todos esto envolvidos na sntese
protica e cada um consiste de uma fita nica de ribonucleotdeos e possuem um peso
molecular, uma sequncia nucleotdica e funes biolgicas caractersticas.
O RNA mensageiro (mRNA) possui as informaes para a sntese do RNA. Ele possui
as trincas de bases nitrogenadas que definem os aminocidos. O mRNA funciona como um
arquivo de computador, no qual um programa pode ser fielmente copiado. Vale ressaltar, que
o mRNA no fabricado como uma cpia exata do DNA, mas sim como uma molcula
complementar que respeita as mesmas regras de ligao entre as bases nitrogenadas,
somente a base timina (T) do DNA substituda pela base uracila (U) no RNA. A esse evento,
se d o nome de transcrio (discutida em maiores detalhes a diante). J o RNA transportador
(tRNA) tem a funo de identificar e transportar os aminocidos at os ribossomos e o RNA
ribossmico (rRNA) liga-se s protenas para compor os ribossomos, que so organelas do
citoplasma, onde acontece a sntese das protenas.
Apesar da molcula de RNA possuir uma nica cadeia de polinucleotdeo, o RNA no
uma estrutura linear simples e lisa. As molculas de RNA possuem extensas regies de
complementao nas quais as pontes de hidrognio entre os pares de bases AU e GC so
formadas unindo diferentes pores da mesma molcula. Como resultado disso, a molcula
dobra-se sobre si mesma, formando estruturas denominadas alas (Fig. 8).

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8
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Fig. 8: Esquema ilustrativo da molcula de RNA dobrando-se e formando alas.

DA SEQUENCIA DE DNA SNTESE PROTICA


Cdigo do DNA
Como a molcula de DNA carrega a informao correta da sequncia de aminocidos
que compem milhares de protenas na clula?
Comparando-se a molcula de DNA com a cadeia polipeptdica, ambas so formadas
por cadeias lineares, sem ramificaes. Portanto, o cdigo do DNA deve ser linear, de acordo
com a sequncia de nucleotdeos na molcula. Alm disso, cada posio na molcula de DNA
pode ser ocupada por um dos quatro nucleotdeos, enquanto na protena qualquer um dos 20
aminocidos pode aparecer em determinado ponto.
obvio, portanto, que o cdigo no pode ser um simples nucleotdeo controlando a
posio de um aminocido, pois, nesse caso, teramos somente quatro possibilidades. Mesmo
dois nucleotdeos no seriam suficientes para definir a posio dos 20 aminocidos na cadeia
polipeptdica, pois o nmero de cdigos possveis seria somente 16. Se, por outro lado, cada
trs letras do DNA definir um dos aminocidos, teremos 64 possibilidades, mais do que
suficiente para designar os 20 aminocidos diferentes.
Em 1966, com o cdigo do DNA ou cdigo gentico completamente decifrado, foi
demonstrado que: 1. todos os aminocidos das protenas so codificados por uma
combinao de trs bases do DNA, formando um trplex chamado cdon; 2. um mesmo
aminocido pode ser definido por mais de um cdon e, por isso, o cdigo dito degenerado;
3. existem trs cdons que, em vez de determinar a entrada de um aminocido especfico na

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9
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cadeia polipeptdica, funcionam como o fim de um programa, determinando a interrupo da


cadeia que esta sendo sintetizada (Fig. 9).

Fig. 9: Cdigo gentico. Cada conjunto com trs bases (cdon) determina a entrada de um aminocido
especfico ou marca o fim da sntese na cadeia polipeptdica (cdons em cinza com a denominao STOP em
vermelho). O cdon AUG (marcado em laranja) representa a iniciao de uma cadeia de aminocidos, em
eucariotos.

O dogma central da biologia molecular foi sugerido em 1957 por Crick. Essa teoria
estabelece que o fluxo da informao gentica na clula unidirecional, sendo que o DNA
transcrito em RNA, o qual ento traduzido em protena. Entretanto, dois outros eventos
constituem exceo a essa regra. Primeiro, por ocasio da diviso celular, o DNA copiado
em outras molculas de DNA, em um processo conhecido como duplicao do DNA.
Segundo, alguns vrus, que possuem como material gentico o RNA em vez do DNA (como o
caso do HIV), tm sua molcula de RNA copiada e revertida em DNA em um processo
chamado de transcrio reversa (Fig. 10).
Duplicao

DNA

Transcrio
reversa

Transcrio

mRNA

Traduo

Protena

Fig. 10: Dogma central: estabelece que o fluxo da informao gentica na clula unidirecional. A duplicao do
DNA e a transcrio reversa constituem excees a essa regra.

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10
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Duplicao / Replicao
Toda clula ao se dividir, tem seu contedo de DNA duplicado na ntegra, transmitindo
assim, todas as caractersticas genticas, esse processo chamado de replicao. Ela ocorre
de maneira semiconservativa, porque quando as duas fitas originais so separadas, cada uma
vai servir de molde para a construo de uma fita nova.
A fita cpia sintetizada pela ao catalisadora da DNA polimerase III, enzima que
utiliza como molde cadeia precursora e incorpora os nucleotdeos de forma sequencial na
nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases (Fig. 11). Como
essa polimerase sintetiza DNA na direo 5 3, a sntese de uma das cadeias
complementares realizada de forma contnua enquanto que a outra sintetizada
descontinuamente. Os fragmentos da cadeia descontnua so ligados pela enzima DNA
ligase. Muitas outras protenas esto envolvidas na estabilizao e manuteno da
integridade das cadeias simples que so precursoras para a sntese da fita dupla, assim como
no reconhecimento dos stios de iniciao. As DNA polimerases possuem alm da funo de
sintetizar polinucleotdeos, atividade exonuclesica chamada de correo de leitura na qual
os nucleotdeos incorporados incorretamente so removidos. Esta propriedade fundamental
para a manuteno da integridade da sequncia original.
Muito da complexidade inerente replicao de DNA advm do fato de que as duas
cadeias da dupla hlice se orientam em direes opostas ( 5 3 e 3 5) e suas cpias
devem, igualmente, apresentar direes opostas. Ainda, h o alongamento de todas as
cadeias cpias individuais que ocorre na direo 5 3. Esse aparente paradoxo foi
esclarecido com a descoberta de que uma fita cpia construda de forma descontnua, a
partir de pores menores que se alongam, individualmente em direo oposta. Essa
construo necessita de duas enzimas a DNA polimerase I para preencher as lacunas e a
DNA ligase para juntar os fragmentos.

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11
Reviso: 29/03/2012

Fig. 11: Esquemas ilustrativos da replicao de DNA.

Transcrio
Apenas uma das fitas do DNA transcrita dando origem a uma nica sequncia de
mRNA para cada gene (Fig. 12). A indicao de qual fita deve ser transcrita orientado por
uma sequncia especfica chamada promotor, localizada antes da sequncia a ser transcrita,
que reconhecida pela RNA polimerase (enzima sintetizadora de mRNA). Como a RNA
polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosdeo extremidade 3 da
cadeia de RNA em crescimento, a polimerizao ocorre na direo 5 3 (Fig. 11 e 13). Isso
significa que cada molcula de mRNA ser idntica sequncia nucleotdica da fita de DNA
que no transcrita. O mRNA transcrito transportado para os ribossomos (rRNA) no
citoplasma, onde ocorre a sntese protica.
No caso do retrovrus (como o HIV), a informao gentica segue o sentido inverso
de RNA para DNA esse processo conhecido por transcrio reversa e ocorre devido
presena de uma enzima a transcriptase reversa.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

12
Reviso: 29/03/2012

Fig. 12: Esquema ilustrativo da transcrio do DNA, ou seja, formao do mRNA a partir de uma fita de DNA.
Cada sequncia de trs bases nitrogenadas representam 1 cdon.
.

Nos organismos superiores, incluindo o homem, uma regio do DNA com a mensagem
para a sntese de uma cadeia polipeptdica , geralmente, interrompido por certas pores
que no tm funo codificante e, portanto, no aparecem representadas na protena. Tais
pores so referidas como ntrons, enquanto as regies que carregam a informao
codificada para a sntese de protenas so os xons. Quando um arquivo ativado, o RNA
copia fielmente tanto os ntrons como os xons; entretanto, antes de o RNA deixar o ncleo,
as pores correspondentes aos ntrons so removidas, em um evento chamado de
processamento do RNA ou splicing. Dessa forma, no RNA mensageiro, aquele que
efetivamente carrega a mensagem para o citoplasma, est presente somente as pores que
correspondem aos xons (Fig. 13).

Fig. 13: Esquema ilustrativo do processo de transcrio do DNA. As partes em cinza mostram as pores
referidas como ntrons que so retiradas aps o splicing atravs da enzima RNA polimerase.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

13
Reviso: 29/03/2012

Sntese de Protenas Traduo


A sntese proteica no resultante da leitura direta da sequncia nucleotdica do DNA.
Como o DNA est localizado no cromossomo (Fig. 2) (no ncleo da clula) e a sntese
protica ocorre quase que na sua ntegra, nos ribossomos localizados no citoplasma, as
informaes genticas contidas na sequncia nucleotdica do DNA tem que ser transferida
para uma molcula intermediria que pode mover-se para o citoplasma, o RNA mensageiro
(Fig. 12).
O processo de decodificao, pelo qual a informao gentica presente na molcula de
mRNA dirige a sntese protica, chamada traduo. Esse processo envolve os trs RNAs
mensageiro, ribossmico e transportador.
Na traduo, o ribossomo liga-se primeiro a um stio especfico na molcula de mRNA
(cdon de iniciao - ATG - Fig. 9) que ajusta a fase de leitura. O ribossomo ento se
movimenta ao longo da molcula de mRNA, traduzindo um cdon de cada vez usando os
tRNA para adicionar aminocidos ao final da cadeia polipeptdica em alongamento. A
traduo finalizada quando o ribossomo reconhece na fita de mRNA a presena do cdon
de terminao (Fig. 14). A direo da leitura de 5 3, sendo que a sequncia de
nucleotdeos da fita de DNA corresponde sequncia de aminocidos da protena traduzida
na direo amino-terminal para carboxi-terminal.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

14
Reviso: 29/03/2012

Fig. 14: Representao grfica do processo de sntese de protena, que ocorre no citoplasma celular.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

15
Reviso: 29/03/2012

HIV HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS


ESTRUTURA VIRAL E GENMICA
O HIV pertence famlia Retroviridae, gnero dos Lentivirus. Esse vrus possui uma
forma esfrica, com aproximadamente 110 nm de dimetro. A estrutura da partcula viral
infectante recebe o nome de vrion. Nessa estrutura so observadas as protenas estruturais
que so codificadas pelos genes gag, env e pol. O gene gag codifica as protenas do
capsdeo viral (p24 e p17); o gene env, as glicoprotenas contidas no envelope do vrus (gp41
e gp120); e o gene pol codifica as enzimas transcriptase reversa, integrase e protease (Fig.
15).

Fig. 15.:Esquema ilustrativo do vrus HIV mostrando o RNA viral, as protenas que compem o envelope viral e a
enzima transcriptase reversa.

O HIV apresenta genoma diplide duas molculas de RNA de fita simples de


polaridade positiva = de 9,8 kb covalentemente ligadas dentro de um nucleocapsdeo protico
em formato de cone, circundado por um envelope lipoprotico onde se encontram ancoradas
as glicoprotenas (Fig. 15).
O genoma j foi todo sequenciado e analisado, sendo que seus genes receberam a
seguinte nomenclatura: gag, pol, vif, vpr, tat, ver, vpu, env e nef.
Elaborado pela DIACM
Aprovado por Linda Khalili Boukai

16
Reviso: 29/03/2012

As protenas sintetizadas a partir do gene gag compem o ncleo (core) que envolve
o genoma viral. O gene gag traduzido na forma de uma protena precursora Pr55 gag que
posteriormente clivada para compor as protenas p17 (protena de matriz), p24 (protena
estrutural do capsdeo), p9 (protena do nucleocapsdeo que se liga fortemente ao RNA viral)
e p7. O gene pol tambm traduzido na forma de um precursor, Pr160 gag-pol e codifica para as
enzimas virais: Protease (p10), transcriptase reversa Rnase-H (p51/66) e integrase (p32). O
gene vif (p23), parece atuar aumentando a infectividade, mas sua funo ainda no foi
totalmente elucidada. A funo do gene vpr (p15) codifica os ativadores da transcrio. A
protena p14, codificada pelo gene tat, atua como transativador transcricional, interagindo com
fatores de transcrio celulares e a sequncia TAR viral, promovendo a iniciao e elongao
dos transcritos virais. O gene ver (p19), indispensvel replicao viral, age como
transativador ps-transcricional, ligando-se sequncia RRE viral e fatores celulares,
promovendo splicing e/ou transporte do mRNA viral. O gene vpu (p16) influencia a liberao
das partculas virais e aumenta a reciclagem do antgeno CD4+. O gene env codifica a
glicoprotena precursora gp160, que posteriormente clivada para formar a gp41,
transmembranar, e a gp120, glicoprotena de face externa, responsvel pela ligao do vrus
ao receptor celular. Por fim, o gene nef (p27) potencializa a infectividade viral, mantendo altos
os nveis de infeco.

REPLICAO DO HIV
O principal receptor para a entrada do HIV-1 (subcategoria do vrus HIV) na clula do
hospedeiro o linfcito TCD4+. A infeco tem inicio quando uma partcula viral, que contm
duas cpias de RNA HIV, encontra uma clula com uma molcula de superfcie chamada
CD4. A interao do vrus com a membrana celular feita pela ligao da gp 120 ao receptor
CD4 da clula hospedeira, porm co-receptores (quimiocinas CCR5 e CXCR4 - mediadores
ou regulares de processos inflamatrios com habilidade de recrutar e ativar subpopulaes
especficas de leuccitos) ou receptores secundrios so tambm necessrios para a entrada
do vrus na clula.
Quando o gene que codifica o CCR5, apresenta uma deleo mutante, o receptor
celular codificado por esse gene fica estruturalmente alterado. A condio de homozigose
est associada a um efeito protetor infeco pelo HIV-1. A condio de heterozigose, apesar
de no proteger o indivduo da infeco, est associada no progresso, ou perodos de
latncia clnica mais prolongados.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

17
Reviso: 29/03/2012

Embora as clulas TCD4+ paream ser o principal alvo para o HIV, outras clulas do
sistema imune com molculas CD4 em suas superfcies tambm so infectadas. Entre elas
esto os moncitos e macrfagos, que podem hospedar grandes quantidades de vrus sem
serem mortos, desse modo, atuam como reservatrios.
Aps a interao da membrana do envelope viral com a membrana celular, ocorre uma
alterao conformacional que expe um peptdeo de fuso a gp41. O capsdeo viral ento
liberado no citoplasma da clula hospedeira.
Por ao da transcriptase reversa do vrus, no citoplasma da clula, a fita de RNA
serve de molde para a transcrio reversa de duas fitas complementares de DNA viral
(cDNA). O cDNA viral (fita dupla) transportado para o ncleo, e incorporado ao genoma da
clula hospedeira pela ao da integrase, e passa a ser denominado provrus (DNA do HIV
incorporado aos genes da clula hospedeira. Em um mesmo organismo o provrus pode, em
algumas clulas, permanecer em latncia e no dar sinal de sua presena. Em outras clulas,
o processo replicativo pode ser lento com multiplicao controlada, ou acelerado levando
lise celular). Para que o DNA proviral produza novos vrus, cpias de RNA devem ser feitas.
O provrus, para se replicar, subverte a maquinaria celular e passa a comandar os
mecanismos enzimticos da clula hospedeira. Isso significa dizer que as enzimas celulares
passam a trabalhar na sntese de RNAs genmicos mensageiros (RNAm) e na sntese de
protenas virais.
As citocinas, protenas envolvidas na regulao normal da resposta imune, podem
tambm regular a transcrio. Molculas como fatores de necrose podem tambm regular a
transcrio. Molculas como fatores de necrose tumoral alfa (TNF-) e interleucinas (IL)-6,
secretados em nveis elevados pelas clulas de pacientes HIV positivos, podem auxiliar na
ativao do DNA proviral.
O mRNA viral transportado do ncleo celular para o citoplasma e comea a traduo
das protenas virais, utilizando a maquinaria celular de sntese protica. O prximo passo a
montagem da partcula viral (protenas e RNAs virais) e o ancoramento da partcula
membrana plasmtica da clula hospedeira. Uma partcula viral imatura formada e ao aderir
membrana celular, adquire um envelope. Ocorre o brotamento do vrus imaturo de forma
intensa

provocando

destruio

da

clula

hospedeira.

Durante

este

ponto

do

amadurecimento feito pela ao da protease viral que cliva as longas cadeias de protenas e
enzimas que constituem o ncleo em pedaos menores. Essa clivagem resulta em partculas
virais infecciosas (Fig. 16).

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

A.

B.

Figura 16: A: Imagem ilustrativa do HIV (representado pelos crculos verdes) infectando uma clula. B: Infeco
pelo HIV-1 atravs da ligao gp120 (envelope viral) receptores CD4 e CCR5 (clula hospedeira) (Fase 1).
Citoplasma, transcrio reversa da fita de DNA complementar ao RNA viral pela transcriptase reversa (Fase 2).
Ncleo, insero do DNA pr-viral ao DNA da clula hospedeira, (integrase do HIV) (Fase 3). Ativao celular,
transcrio de cpias do RNA viral (RNA polimerase humana), sntese de protenas e glicoprotenas virais bem
como cpias ntegras do RNA genmico do HIV (Fase 4). Por fim, empacotamento do RNA viral seguido de
brotamento da clula hospedeira (Fase 5), dando incio a disseminao da infeco de novas clulas.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

DINMICA DO HIV NO ORGANISMO INFECTADO


Estudos indicam que cerca de 10 bilhes de vrus so produzidos por dia e que essas
partculas virais tem uma meia vida de aproximadamente 4 horas. De forma semelhante, um
grande nmero de linfcitos TCD4+ produzido e destrudo, sendo que a meia vida de um
linfcito infectado de 2,4 dias. O linfcito TCD4+ a principal clula-alvo do HIV.
No h, portanto, perodo de latncia virolgica e, mesmo durante a infeco crnica
assintomtica, observa-se uma grande batalha entre o sistema imune do indivduo infectado e
o vrus. Com o passar do tempo, o vrus desestrutura a arquitetura dos rgos linfticos,
comprometendo a reposio dos linfcitos TCD4+.

CARGA VIRAL
O nmero de partculas virais presentes em uma determinada amostra de um indivduo
infectado conhecido como carga viral.
A carga viral plasmtica, detectada na forma de RNA do HIV, reflete a dinmica desse
vrus nos indivduos infectados, quantificando as partculas que esto sendo produzidas e
lanadas na circulao sangunea.
O nvel de RNA do HIV no plasma um marcador clnico importante. O nmero de
partculas virais mais elevado durante a infeco primria e mais baixo na fase
assintomtica. Existe uma relao direta entre a quantidade de HIV detectada e a rapidez com
que a infeco progride. Nveis elevados de replicao do vrus e o aumento da carga viral
esto associados deteriorao acelerada do sistema imune (Fig. 17). O colapso do sistema
imune, que antecede o aparecimento da AIDS, resultado da destruio das clulas CD4+ e
das alteraes imunitrias provocadas pelo vrus.

Fig. 17: Grfico representativo da contagem de linfcitos TCD4+ e da carga viral, ao longo da infeco pelo HIV.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

HCV HEPATIT VIRUS C


A hepatite C vem sendo estudada h vrios anos, mesmo antes da descoberta do vrus
causador da doena o Vrus da Hepatite C (VHC). Nesta ltima dcada, entretanto, houve
avanos significativos no entendimento de sua epidemiologia, modos de transmisso,
patognese, diagnstico e teraputica.
Sabemos, hoje, que a hepatite C compete com a doena heptica alcolica como a
maior causa de doena crnica do fgado, podendo ser a vencedora em vrias reas
geogrficas. Estima-se que 3% da populao mundial esteja contaminada, sendo relevante o
nmero de pessoas que desconhece o fato de albergar o vrus. Um estudo populacional na
cidade de So Paulo mostrou prevalncia de 1 a 4% de anti-VHC, variando com a faixa etria.
As altas porcentagens de cronicidade da doena, seu potencial evolutivo para cirrose e
hepatocarcinoma, assim como o fato de ser a mais freqente etiologia diagnosticada em
casos de transplante heptico, fazem com que constitua grave problema de sade pblica.

Estrutura Viral e Genmica do Vrus


O HCV um vrus RNA da famlia Flaviviridae, com genoma em fita simples de
polaridade positiva medindo 9,7 kilobases de comprimento e com cerca de 9400 nucleotdeos
(FIg. 18). Nessa sequncia, encontra-se uma longa fase de leitura aberta (ORF Open
reading frame) que compreende quase todo o genoma e codifica uma poliprotena de pouco
mais de 3000 aminocidos.

Fig. 18: Representao do vrus da hepatite C, que um vrus RNA da famlia Flaviviridae de 50 nm de dimetro.

Na extremidade 5, encontram-se trs a quatro pequenas ORFs, cuja real traduo em


protenas questionada. Entretanto, esta regio mais conservada entre os diferentes vrus
isolados, sugerindo que deve ter um papel regulatrio muito importante durante a replicao
Elaborado pela DIACM
Aprovado por Linda Khalili Boukai

21
Reviso: 29/03/2012

viral. Esta sequncia conservada, aliada ao fato de conter uma estrutura secundria que a
torna mais resistente digesto por ribonucleases (RNAses), torna esta regio como a melhor
para seleo de primers para a biologia molecular com fins de deteco deste vrus em
amostras provenientes de diferentes regies do mundo.
Uma pequena regio no traduzida na extremidade 3 tambm est presente,
possuindo uma cauda de poli-A caracterstica. Esta pequena regio, no traduzida, apresenta
estruturas secundrias que parecem ser bem conservadas, podendo ter um significado
importante durante a replicao genmica do vrus, pois nela que ocorre a ligao da
sequncia complementar enzima replicase. Porm, observou-se que, quando ocorrem
variaes na sequncia genmica desta regio, pode haver diminuo da eficincia de ligao
da replicase, bem como alterao na replicao viral. Tais fatos podem ser parcialmente
responsveis pelos diferentes nveis de patogenicidade do vrus da hepatite C e tambm pela
sensibilidade ao interferon.
As protenas estruturais do HCV so trs: protena C encontrada na extremidade Nterminal e duas glicoprotenas E1 (GP 33) e E2/NS1 (GP 72), provveis constituintes do
envelope viral. A E1 uma protena matriz e a outra, E2/NS1, provavelmente anloga
glicoprotena principal do envelope dos pestivrus.
As protenas no estruturas NS2, NS3, NS4 e NS5 representam a extremidade carboxiterminal do genoma viral. NS2 e NS4 so protenas hidrofbicas e, portanto devem estar
ligadas membrana da clula hospedeira. NS3 tem pelo menos duas funes; helicase, no
desdobramento do genoma viral durante a replicao, e protease participando na clivagem de
protenas no estruturais a partir do precursor. A protena NS5 contm pelo menos a funo
de RNA replicase RNA dependente, mas deve ser multifuncional.
A anlise filogentica das sequncias genmicas permitiu a caracterizao de 6
gentipos (1 a 6) que so subdivididos em grupos a, b, c, etc. Dentro de um mesmo gentipo
e subtipo podemos ainda ter variaes do HCV, que so denominadas quasispcies. Isso
possvel devido replicao imperfeita do vrus, com o surgimento de pequenas e constantes
mutaes. A maior ou menor diversidade das quasispcies parece estar relacionada com a
presso imunolgica, j que costuma ser pequena nas fases iniciais da doena, com
aminotransferases normais, sendo de alta heterogeneidade nos casos de doena heptica
mais avanada e/ou baixa resposta teraputica.
O tempo de incubao da hepatite C mostra-se bastante varivel, de 1 a 13 meses,
com mdia de 8. Logo aps a contaminao, o melhor marcador e nico disponvel at o
presente a determinao do RNA-HCV, j que os anticorpos surgem apenas 4 a 20
semanas aps o contgio.
Elaborado pela DIACM
Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

REPLICAO DO HCV
O vrus da hepatite C replica principalmente nos hepatcitos do fgado, onde
estimado que cada clula infectada produza diariamente cerca de cinquenta partculas virais
com um total calculado de um trilho de partculas virais geradas. O vrus tambm pode se
replicar em clulas mononucleares de sangue perifrico, contribuindo potencialmente para os
altos nveis de distrbios imunolgicos encontrados em pacientes infectados pelo HCV
cronicamente. O HCV tem uma grande variedade de gentipos e sofre mutaes rapidamente
devido a uma alta taxa de erro por parte do vrus "dependente de RNA-polimerase do RNA. A
entrada nas clulas do hospedeiro ocorre atravs de interaes complexas entre os virions
(partcula viral) e as molculas da superfcie de clulas.
Uma vez dentro do hepatcito, o HCV assume parcelas da mquina intracelular para
replicar. A dinmica de replicao do HCV pode ser deduzida a partir das rpidas taxas de
produo de vrus e emergncia de mutantes. Outra caracterstica da replicao do HCV a
gerao rpida de variantes de vrus. Mesmo dentro de um paciente HCV no existe como
uma entidade nica, mas sim como um enxame de microvariants de predomnio de, um
fenmeno que tem sido referido como quasispecies (para uma reviso ver Holanda et al.,
1992).
A deteco de anticorpos anti-HCV pode ser realizada inicialmente por mtodos de
elevada sensibilidade (100%) e especificidade (entre 99,6% a 99,84%), como o
enzimaimunoensaio (ELISA) e o enzimaimunoensaio de micropartculas (MEIA), que
empregam peptdeos sintticos do VHC. Posteriormente, os resultados reagentes obtidos nos
mtodos de triagem devem ser confirmados por mtodos de elevada especificidade, como o
recombinant immunoblot assay (RIBA) ou Western Blot (WB), a deteco de RNA viral pela
reao em cadeia da polimerase (PCR) qualitativa e quantitativa e a tcnica do cido
desoxirribonuclico (DNA)-branched (bDNA).

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

TRANSMISSO
Demonstrou-se que o HCV o agente causal de mais de 90% das hepatites pstransfusionais. Assim, todas as pessoas que receberam transfuso de sangue ou
hemocomponentes at o incio dos anos 90, com ou sem histria de hepatite pstransfusional, devem ser avaliadas para provvel contaminao com o vrus da hepatite C. No
Brasil, a partir de 1993, h a obrigatoriedade dos testes sorolgicos (anti-HCV) em candidatos
a doadores de sangue. Assim, a hepatite ps-transfusional tornou-se rara, mas outros meios,
parenterais ou no, continuam a disseminar a doena. Alm dos produtos do sangue,
agulhas/seringas contaminadas ou mesmo a inalao de drogas com o uso de espelhos e
canudos contaminados so vias importantes.
Outras formas parenterais de contaminao so os procedimentos mdicos,
odontolgicos, acupunturistas ou tatuagens. Portanto, qualquer material cortante ou
perfurante pode ser veculo transmissor do vrus de uma para outra pessoa, como o alicate da
manicura, a lmina do barbeiro ou mesmo a escova de dentes, compartilhada por cnjuges ou
filhos. Em nosso meio, demonstramos que dentre os casos eventualmente rotulados como
espordicos por serem afastados transfuso de sangue ou o uso de drogas ilcitas houve uma
porcentagem significativa de pacientes com cirurgias prvias e/ou atendimentos mdicos de
urgncia em prontos-socorros ou ainda a hiptese j confirmada de contaminao mdica
durante o ato cirrgico.
Dentre as formas no parenterais de transmisso da hepatite C torna-se importante
ressaltarmos a possibilidade da transmisso sexual. Embora pouco eficiente, deve-se
examinar e alertar o parceiro sexual, particularmente nos indivduos promscuos, para os
quais mandatrio o uso de preservativos. Aos casais monogmicos de longa data, sem
doenas sexualmente transmissveis, facultativo o uso continuado de preservativos, sendo
possvel a gravidez. A disseminao intrafamiliar tambm pode existir, possivelmente por
compartilharem materiais cortantes ou ento pela exposio de ferimentos abertos. A
transmisso materno-fetal revela-se pouco significativa na hepatite C, podendo ocorrer
particularmente no momento do parto. No existe profilaxia para o recm-nascido, que ter o
anti-HCV da me nos primeiros 6 a 12 meses de vida. Os anticorpos costumam desaparecer
nesse perodo, podendo haver verdadeira contaminao com permanncia do RNA-HCV em
raros casos, principalmente quando a co-infeco HCV e HIV.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

24
Reviso: 29/03/2012

CARGA VIRAL
Existem vrios mtodos para medir a concentrao do vrus no soro, que uma
avaliao indireta da carga viral. Estes mtodos incluem o PCR (Polimerase Chain Reaction)
quantitativo e em tempo real, que sero discutidos posteriormente. Os nveis de HCV RNA
so normalmente bastante estveis, embora possam variar de forma espontnea, 3 a 10
vezes ao longo do tempo. Esses ensaios quantitativos podem fornecer importantes dados
sobre a natureza da hepatite C. A maioria dos pacientes com hepatite C crnica tm nveis de
HCV RNA (carga viral) entre 100.000 (105) e 10 milhes (107) cpias / mL. Expressos em IU,
estas mdias so de 50.000 a 5.000.000 UI.
As taxas de resposta a um curso de peginterferon e ribavirina so maiores em
pacientes com baixos nveis de HCV RNA. H vrias definies de "baixo nvel" do RNA do
HCV, mas a definio usual de 400.000 UI (~ 1 milho de cpias / mL) ou menos.
No incio da infeco observar-se um aumento no nvel da carga viral e ao redor do 70
dia aps a infeco, h o incio da produo de anticorpos e consequentemente uma
diminuio da carga viral no paciente.

Fig. 19. Marcadores do HCV durante o incio da infeco.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

Reao de polimerase em cadeia


A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) consiste em fazer cpias do material
gentico in vitro usando elementos bsicos do processo de replicao natural do DNA e foi
desenvolvida principalmente por Mullis et al. (1985).
A especificidade da tcnica dada pelo uso de iniciadores especficos para o gene ou
regio do DNA de interesse. A utilizao de dois iniciadores delimitam o alvo e a repetio dos
ciclos da PCR, dando origem a bilhes de cpias do alvo.
Mullis utilizou a ento recm-descrita Taq DNA polimerase termoestvel isolada da
bactria de fontes termais Thermus aquaticus, origem do nome da enzima. Esta enzima se
mantm estvel em temperaturas de at 117C, com temperatura tima de 72C. Porm, a
realizao manual dos ciclos de temperatura, banhando-se um rack de tubos em vrios
banhos-maria de temperaturas diferentes, ainda constitua um fator dificultante do processo.
Em 1989, o DNA Thermal Cycler apareceu como o primeiro termociclador automtico.
At hoje, a maioria dos termocicladores automticos funciona com o mesmo princpio:
aquecimento por resistncias eltricas e refrigerao com ventoinhas e tubulaes em
serpentina preenchidas por etileno glicol. Aperfeioaram-se os sistemas de contagem de
tempo, para aumentar a confiabilidade das reaes. Em meados dos anos 90 surge o padro
Peltier, cujo bloco de aquecimento composto por uma liga metlica que aquece ou resfria de
acordo com o sentido da corrente eltrica aplicada e este o utilizado pelo equipamento
ABI7500 da Plataforma NAT.

Princpio da tcnica
A tcnica explora funo natural da enzima Taq polimerase, esta enzima semelhante
enzima DNA polimerase que capaz de sintetizar DNA a partir de seus precursores no
sentido 5 3. Para catalisarem essa sntese, os precursores de DNA devem estar presentes
sob a forma de deoxirribonucleotdeos trifosfatos (dATP, dTTP, dGTP e dCTP).
Esta consiste em ciclos de reaes de sntese de regies especficas do DNA (gene ou
parte dele), na qual a cada ciclo o nmero de fragmentos duplicado, havendo assim um
crescimento exponencial do fragmento desejado.
Hoje, a PCR se constitui no mtodo diagnstico de rotina para isolar rapidamente
sequncias especficas a partir de uma mistura complexa de sequncias genmicas ou de
DNA complentares (cDNAs), DNA gerados a partir de uma sequencia de um RNA
mensageiro.
Elaborado pela DIACM
Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

Cintica da reao
A PCR realizada em trs etapas, repetidas em ciclos. Cada etapa desenvolvida a
uma temperatura apropriada para sua maior eficincia, as etapas so:

a) desnaturao das cadeias do DNA ou c-DNA por aquecimento, realizada a uma


temperatura prxima de 95C. A essa temperatura as pontes de hidrognio existentes
entre as duas fitas rompem separando-as;

Fig 20. Representao grfica da separao das fitas do DNA durante o processo de desnaturao (95C), na
qual ocorre o rompimento das pontes de hidrognio.

b) anelamento (annealinng) dos iniciadores ao DNA da amostra (DNA molde ou template).


Iniciadores so oligonucleotdeos com 20-24 bases usualmente seletivos o suficiente
para localizar um stio nico em um genoma de alta complexidade de tamanho. Sua
funo delimitar a sequncia a ser amplificada atravs do estabelecimento de pontes
de hidrognio com a sequncia alvo, respeitando a regra de pareamento descrita por
Watson e Crick (Adenina Timina; Citosina Guanina);

Iniciador 1
Iniciador 2

Fig 21. Representao do anelamento dos pares de iniciadores complementares aos flancos da sequncia alvo
na faixa de 55C a 65C, durante a PCR.

c) extenso, na qual ocorre a incorporao dos deoxirribonucleotdeos dispersos no meio


a partir dos iniciadores, em suas extremidades 3, em temperatura tima especfica. A
adio de nucleotdeos ocorre apenas se os inicadores estiverem pareados seus
stios especficos obedecendo a propriedade de complementaridade de bases dos
cidos nucleicos.
Elaborado pela DIACM
Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

Taq DNA
Polimerase
3

Fig. 22. Representao da etapa de extenso da fita no sentido 53 com incorporao de deoxinucleotdeos
presentes no meio pela Taq-polimerase.

Por fim, o objetivo da repetio destes eventos de desnaturao, anelamento e


extenso duplicar a quantidade deste fragmento presente no meio a cada ciclo, acumulando
este produto exponencialmente.

Etapas da reao de PCR


Fase de screening - ciclos iniciais.
Os iniciadores se anelam na fita simples de DNA em sua regio complementar. Nesta etapa, a
quantidade de iniciadores abundante em relao aos fragmentos de DNA, tronando fcil
este processo.
Fase intermediria:
O processo de amplificao est ocorrendo, com os iniciadores agindo de modo a permitir o
acmulo exponencial do fragmento de DNA. O pareamento do iniciador com a sequncia que
lhe complementar j est bem facilitada, pois j existem vrias cpias das sequncias alvos.
Fase tardia ou fase de plat:
A amplificao j sub-tima devido limitao dos reagentes e competio dos produtos
gerados. Esta fase ocorre devido aos fatores relacionados abaixo:
- Perda da atividade da enzima;
- Acmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do
pareamento com os inicadores;
- Aumenta a possibilidade de amplificao de produtos inespecficos
- Gasto dos reagentes, especialmente de iniciadores e deoxirribonucleotdeos;
- Acmulo de pirofosfato, resultante das ligaes fosfodisteres;
- Competio com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficincia menor, mas
tambm foram se acumulando.

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

Condies da PCR
Inibidores da PCR podem ter origem na prpria amostra ou nos reagentes usados na
coleta e no preparo desta. Substncias tais como grupamentos heme presentes no sangue
total, produtos da lise das clulas vermelhas, bilirrubina, bile e sais inibem a PCR ou podem
ainda degradar o cido nucleico de amostras biolgicas como clulas do sangue perifrico,
tecido animal e fluidos corporais, incluindo, fluido crebro-espinhal, material de bipsia, entre
outros.
Uria, detergentes (SDS), acetato de sdio, heparina, fenol entre uma grande
variedade de compostos orgnicos e inorgnicos podem ser inibidores da reao de PCR por
interferir no funcionamento da DNA polimerase na reao. Como exemplo, podemos citar o
magnsio (Mg+2), que um ction presente na reao de PCR que se liga DNA polimerase,
sendo um co-fator essencial para a atividade da enzima. Esta concentrao precisa ser tima,
pois em falta na reao, acarretar formao de menor quantidade de produtos, e, em
excesso, reduzir a fidelidade do resultado por formao de produtos inespecficos (aumento
da taxa de erro). Por este motivo, substncias quelantes de ctions divalentes como o EDTA
podem interferir reduzindo a atividade da enzima.
O tempo e a temperatura de armazenamento da amostra podem tambm impactar
significativamente na recuperao dos cidos nucleicos e na eficincia dos procedimentos
subsequentes.
Os laboratrios de biologia molecular precisam ter uma estrutura que permita um
perfeito fluxograma de trabalho, com reas dedicadas. Cada estao possui seus prprios
equipamentos, as superfcies devem ser lisas e construdas de forma a facilitar a limpeza.
Programas de qualidade devem incluir verificao peridica dos equipamentos, como
manutenes mensais, trimestrais e ou semestrais usualmente realizadas pelas empresas
parceiras. Manutenes dirias e semanais so executadas pelos operadores. Nestas
manutenes esto inclusos os procedimentos de limpeza, descontaminao e algumas
outras verificaes, dependendo do equipamento.
Finalmente, o resultado da PCR baseado na presena ou no do produto amplificado
em eletroforese em gel de agarose, ou na visualizao de resultados grficos captados em
sistema ptico.
Para garantir que um resultado negativo ou no, deve-se ter a certeza de que a
ausncia de bandas, ou de fluorescncia, devido ausncia de DNA molde, e no falhas
na reao. Para tanto, deve-se considerar utilizar um controle interno de amplificao nas
reaes. Os controles nas reaes de PCR so verificados a partir da amplificao de uma

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Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

sequncia que obrigatoriamente existe no material analisado, e preferencialmente em uma


nica cpia.

RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR)


Em algumas situaes, a fonte inicial da informao a ser amplificada uma molcula
de RNA. Neste caso necessria a realizao de uma etapa prvia PCR que a sntese de
uma fita de cDNA (DNA complementar) tendo a molcula de RNA como molde.
Em sua extrao o mRNA separado de uma soluo de RNA total extrada de um
tecido ou suspenso celular.
A soluo catalisada pela enzima transcriptase reversa que converter o RNA-m em
cDNA. Em seguida o cDNA pode ento submetido reao de PCR semelhana do DNA
genmico.
Esta tcnica chamada de RT-PCR (Reverse Transcriptase Polimerase Chain
Reaction).
Sintetiza-se cDNA empregando-se a enzima transcriptase reversa de origem viral. A
partir do cDNA, emprega-se o mtodo de PCR para amplificao. A deteco do mRNA til
no diagnstico de infeces causadas por vrus que possuem uma fase latente. A deteco do
mRNA expressa somente infeco produtiva e evidncia de uma infeco viral ativa

PCR Multiplex
A PCR Multiplex uma reao onde vrias regies diferentes de DNA (ou c-DNAs) so
amplificadas ao mesmo tempo. Isto possvel devido a utilizao simultnea de diversos
pares de iniciadores especficos para cada locus a ser identificado sem que eles possam
hibridizar entre si. Se a temperatura de anelamento for semelhante e os diferentes amplicons
produzidos apresentarem tamanhos distintos, possvel que o diagnstico atravs de uma
PCR multiplex seja realizado. A vantagem a economia de reagentes e tempo, visto que,
duas reaes ou mais podem ser realizadas conjuntamente.

PCR em Tempo Real


Este procedimento permite, de forma simultnea, a deteco e quantificao de um
fragmento especfico de DNA ou cDNA. O PCR convencional no apresenta valores
quantitativos, por isso foi desenvolvido o PCR em tempo real, que uma tcnica descrita
como quantitativa porque consegue quantificar o nmero de molculas produzidas a cada
ciclo.

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Reviso: 29/03/2012

A localizao da sequncia alvo feita pelos iniciadores, assim como no processo de


PCR convencional, porm, dispe ainda em sua reao, de outro oligonucleotdeo; uma
sonda marcada por fluorforo (molcula que, quando excitada por luz, emite fluorescncia em
comprimento de onda especfico), na sonda h duas molculas, o reporter e um quencher, na
qual o primeiro possui a fluorescncia, enquanto o segundo a absorve. Por questes fsicas,
enquanto o quencher estiver prximo ao reporter (sonda intacta) no haver a emisso de
fluorescncia. Ao estender as fitas a partir dos iniciadores, a Taq polimerase degrada a sonda
separando a o fluorforo de seu abafador. Desta forma, essa molcula poder emitir energia
que ser captada pelo sistema ptico do equipamento que realiza a PCR em tempo real.
Assim, a cada ciclo, ocorre a deteco do aumento do produto da PCR em tempo real,
a partir do aumento da fluorescncia emitida, decorrente da degradao da ligao do
fluorforo da sonda ligada ao fragmento de DNA que est sendo amplificado. A emisso
crescente de sinal luminoso monitorada em cada reao/tubo de PCR, a cada ciclo, para
gerar curvas de amplificao tpicas da PCR quantitativa.

Fig. 23. Grfico representando uma amostra positiva para um alvo especfico, na qual a fluorescncia gerada
pela amplificao do produto e as trs fases da PCR em tempo real.

A cintica da reao de PCR em tempo real semelhante a reao convencional, a


amplificao dividida em 3 fases: a linha basal na qual no h produtos de PCR suficientes
para detectar fluorescncia, a fase log em que a quantidade de produtos de PCR dobra a
cada ciclo (fase da deteco) e a fase plat onde no h mais aumento no nmero de
produtos, conforme explicado anteriormente (Fig.23).

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As caractersticas relevantes do PCR em tempo real so rapidez, especificidade,


sensibilidade e opcional quantificao. Atualmente o mtodo do PCR em tempo real
considerado um dos mtodos de escolha p/ testes moleculares quantitativos e qualitativos em
decorrncia de suas vantagens sobre o PCR convencional:

Maior rapidez de execuo

Maior sensibilidade e reprodutibilidade;

Menor risco de contaminao de amostras no ambiente laboratorial, devido a

ausncia de manipulao das amostras aps o processo de amplificao.

PCR em Tempo Real no NAT HIV / HCV de Bio-Manguinhos


No ensaio NAT HIV/HCV de Bio-Manguinhos emprega-se uma combinao destes
protocolos, com a identificao de dois genomas virais compostos por RNA, portanto se trata
de uma RT-PCR. necessria a etapa prvia de composio do cDNA.
multiplex, por detectar simultaneamente os vrus HCV, HIV e o controle interno da
reao, a Partcula Calibradora - fragmento sinttico de cido nucleico viral inserido na etapa
de pooling de amostras.
Em adio, esta deteco se faz continuamente, em tempo real, com captao da
fluorescncia decorrente da luminescncia produzida pela dissociao do fluorforo, a partir
da sonda, no momento da extenso.
Ao detectar-se esta fluorescncia, podemos indicar a presena do cDNA que, por sua
vez, identifica a presena vrus na amostra. Ou seja, esse sistema se mostra mais especfico,
pois a sonda degradada apenas aps hibridizar-se ao material a ser detectado.
Desta forma, o ensaio NAT se trata de uma RT-PCR multiplex em tempo real para
deteco do HIV e do HCV em amostras de doadores de sangue.
A simples presena destes tipos virais em uma amostra de sangue inviabiliza a sua
transferncia a outro paciente. Este protocolo no visa a quantificao de carga viral e, sim, a
qualidade do sangue como passvel de transfundir ou no.

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Reviso: 29/03/2012

Biossegurana
Materiais biolgicos tais como sangue, soro e clula so potencialmente infectantes e
muitas vezes esto contaminados com agente etiolgicos diferentes do que se est
pesquisando, ou ainda desconhecidos. Por isso fundamental que medidas de biossegurana
adequadas sejam adotadas nos laboratrios onde h manipulao desses materiais.
Equipamentos de Proteo Individual (EPI) devem ficar em lugar de fcil acesso aos
funcionrios do laboratrio.
culos de segurana, protetor facial e mscara descartvel usadas sempre que
houver possibilidade de aerossis.
Jaleco longo de mangas compridas e punho retrtil, preferencialmente descartvel
deve ser usado somente dentro da rea do laboratrio.
Luvas descartveis devem ser resistentes, de material sinttico (vinil) ou latex para
manipulao de matrias potencialmente infectantes. As luvas descartveis, usadas
para os procedimentos da tcnica PCR devem ser isentas de talco.
Pipetas automticas devem estar calibradas e validadas.
Props descartveis
Calados fechados e de material resistente.
Equipamento de Proteo Coletiva (EPC) so utilizados para minimizar a exposio dos
funcionrios ao risco e em caso de acidentes, reduzir suas conseqncias.
Chuveiro de emergncia e lava-olhos devem estar instalados prximos ao ambiente
laboratorial.
Extintores de incndio.
Centrifugas com rotor provido de tampa.
Cabines de segurana biolgica classe II devem ser posicionadas longe de portas,
janelas e de equipamentos que de alguma forma promovam a movimentao do ar,
empurrando ar no filtrado, diretamente para a superfcie de trabalho, podendo assim
contaminar o material que est sendo manipulado.

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Reviso: 29/03/2012

Formato do Kit
Componentes e Apresentao do Kit
Relao dos componentes fornecidos com o produto:
MDULO
Controles

Extrao

Amplificao

COMPONENTES

VOLUMES

Controle Positivo

02 Frascos com de 800 L cada

Controle Negativo

02 Frascos com de 800 L cada

Partcula Calibradora

02 Frascos com de 800 L cada

Tampo de Lise

01 Frasco com 33 mL

Carreador de RNA

01 Frasco liofilizado

Tampo de Lavagem 1

01 Frasco com 83 mL

Tampo de Lavagem 2

01 Frasco com 68 mL

Tampo de Eluio

09 Frascos com 2,0 mL cada

Fluido TE

04 Frascos com 1,4 mL cada

Placa de Vcuo

01 Unidade de 96 poos

Placa de Eluio

01 Unidade de 96 poos

Placa de Reao

01 Unidade de 96 poos

Protease

01 Frasco liofilizado

Solvente de Protease

01 Frasco com 6 mL

Recipientes Descartveis

02 Unidades

Placa ptica

01 Unidade

Selo ptico

01 Unidade

Tubo de 5 mL

01 Unidade

Manual de Instruo

01 Unidade

Carto Bio

01 Unidade

Mistura de PCR

02 Frascos com 900 L cada

Enzima RT

02 Frascos com 30 L cada

gua/DEPC

02 Frascos com 600 L cada

Sondas

02 Frascos com 180L cada

Iniciadores

02 Frascos com 50L cada

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Reviso: 29/03/2012

Material de reposio

Etanol P.A. Merck 96%;

Tubo BD PPT EDTA K2 com gel (600 tubos/rotinas);

Desinfetante amnia quaternria 50% (soluo de uso diluda 1:600. Ex.: 5 ml de


desinfetante para 3 L de gua);

1 Frasco plstico de 500 mL para etanol dedicado para utilizao de 12


processamentos no MDx;

Ponteiras de 1100 L MDx - 7 caixas com 96 unidades cada;

Ponteiras de 175L Janus - 9 caixas com 96 unidades cada;

Tubo Secundrio - 4 embalagens com 25 unidades cada.

Relao dos materiais necessrios no fornecidos

gua destilada

Luva descartvel sem talco

Etiquetas com cdigo de barras para tubo secundrio

Proveta de 500 mL calibrada

Sacos de descarte de lixo biolgico

Duas pipetas automticas 1000 L (calibradas)

Ponteiras com filtro 1000 L

Indicao das condies adequadas de armazenamento e transporte


O KIT NAT HIV/HCV composto por 3 mdulos, com temperaturas de estocagem
diferentes:

Mdulo de Controle: armazenar de -80C a -60C;

Mdulo de Extrao: armazenar de 15C a 25C;

Mdulo de Amplificao: armazenar de -30C a -10C;

Obs.: Os mdulos de Controle e de Amplificao sero transportados em gelo seco


(-80C a -60C), mas devero ser armazenados nas temperaturas indicadas, no rtulo
externo, desde o ato do recebimento at a utilizao do conjunto.

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Reviso: 29/03/2012

Precaues, cuidados especiais e esclarecimentos sobre os riscos


decorrentes do manuseio do produto e seu descarte
A Partcula Calibradora e o Controle Positivo no possuem capacidade replicativa in
vivo e, portanto, so biosseguros (no infecciosos).
Este kit contm produtos qumicos, podendo representar uma fonte de risco. Ao
manusear qualquer um dos reagentes observe as precaues necessrias. A qualidade dos
resultados obtidos depende do cumprimento s boas prticas de laboratrio tais como:

O teste deve ser usado somente para monitoramento in vitro e uso profissional,
de acordo com as instrues fornecidas no kit;

Os reagentes contm agentes irritantes e devem ser manipuladas com cuidado.


Observar as recomendaes em relao s medidas de segurana dos reagentes;

Tampo de Lise e Tampo de Lavagem 1 contm cloridrato de guanidina, que


pode formar compostos reativos quando combinado com hipoclorito de sdio.
perigoso e irritante se ingerido ou em contato com olhos e pele;

Protease contm subtilisina: sensibilizante, irritante se inalado (prejudicial para o


sistema respiratrio e para a pele); tambm acarretar risco quando em contato com os
olhos;

Utilizar equipamento de proteo individual (EPI) tais como luvas descartveis (sem
talco) e jaleco em todas as etapas do teste;

Aps o uso, desprezar ponteiras, tubos, placas, reagentes, insumos/produtos bem


como os itens consumveis (tubos de coleta e secundrios, entre outros) no descarte de
risco biolgico;

Os tubos com amostras devero ser colocados em saco vermelho duplo (descarte
de risco biolgico) e encaminhados para um local apropriado para resduos. De acordo
com a poltica de descarte de cada hemocentro;

Desprezar a placa ptica aps a amplificao e deteco em descarte no


reciclvel;

Todas as sobras de reagentes devero ser descartadas aps a utilizao de cada


mdulo do kit, de acordo com os procedimentos de cada Hemocentro;

No utilizar reagentes com a validade vencida.

Nunca misturar componentes de lotes diferentes;

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Reviso: 29/03/2012

Cuidados com as amostras biolgicas

A coleta das amostras de sangue perifrico deve ser feita, preferencialmente, em tubo
PPT contendo anticoagulante K2 EDTA e gel de poliester para separao de plasma e
frao celular do sangue total. Coletar 5 mL de sangue total;

Homogeneizar a amostra por inverso aps a coleta;

Centrifugar o tubo at oito horas aps a coleta 800g (em uma centrfuga com 100
mm de raio, corresponde a 2700 rpm) por 10 minutos;

No utilizar tubos de coleta reciclados;

No congelar o tubo aps a coleta, pois o gel pode se desprender e alterar a carga
viral do paciente;

Aps a centrifugao conservar as amostras refrigeradas de 2C a 8C por no mximo


72h at a realizao do teste;

Os fatores interferentes para o uso da amostra so hemlise, lipemia e presena de


bilirrubina.

No utilizar tubos com anticoagulante heparina;

Influncias pr-analticas, tais como, anticoagulantes e temperatura

No devero ser aceitas amostras que no forem coletadas no tubo BD PPT contendo
anticoagulante K2 EDTA e gel de polister;

A temperatura do espao fsico destinado ao teste deve ser monitorada e mantida entre
15 e 25C.

Utilizar gua destilada/deionizada.

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Reviso: 29/03/2012

Plataforma NAT Nacional


A plataforma integrada para o Teste de cidos Nuclicos Brasileiro foi desenvolvida por
Bio-Manguinhos para a Hemorrede Nacional, integrando tecnologias modernas existentes no
mercado. A plataforma Brasileira NAT Multiplex HIV/HCV, contm os equipamentos JANUS
(PerkinElmer) (Fig.: 24), BioRobot MDx (Qiagen) (Fig.: 25) e Termociclador ABI 7500 (Life
Technologies) (Fig.: 26).
JANUS = Estao de pipetagem automtica (funes: Preparo do pool, Confeco da
mistura da reao de PCR e Pipetagem da mesma na microplaca de 96 poos).

Fig. 24: Fotografia do equipamento Janus vista frontal.

BioRobot MDx = Dispositivo de purificao simultnea de DNA e RNA (Lise, Extrao


e Purificao).

Fig. 25: Equipamento MDx (Visualizao interna).

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Reviso: 29/03/2012

Termociclador ABI 7500 = PCR em Tempo Real (Amplificao e Deteco).

Fig. 26: Foto ilustrativa do equipamento ABI 7500.

As amostras biolgicas a serem testadas sero misturadas em um conjunto (pool) de


seis amostras que, ainda na etapa inicial, ter a partcula calibradora adicionada. O material
completo (pool de amostras + partcula calibradora) ser submetido lise celular e o material
gentico ser purificado e estabilizado. A mistura de PCR acrescentada ao material gentico
que ser levado ao equipamento especifico (termociclador) onde ocorrer amplificao do
material em tempo real. medida que a amplificao acontece, as sondas fluorescentes so
liberadas e a intensidade do comprimento de onda mensurada pelo sistema de filtros do
equipamento, permitindo a deteco do alvo proposto.

Fluxo Metodolgico
(a) Preparo amostras em pool de seis ou individual (quando um pool de amostras
apresentar resultado positivo, as amostras que formaram o pool sero testadas
individualmente (teste single);
(b) Extrao e Purificao de cido nuclico da amostra biolgica (plasma);
(c) Amplificao do cido nuclico;
(d) Deteco do mesmo por PCR em tempo real.

Esquema do Teste:
Amostra
Biolgica

Extrao
MDx

Pool
Janus

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Amplificao
ABI 7500

Deteco
ABI 7500

Mistura de PCR
Janus

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NAT Teste de cido Nuclicos


O teste de cidos nuclicos (NAT) utilizado para a diminuio da janela de deteco
dos antgenos HIV (Vrus da Imunodeficincia Humana) e HCV (Vrus da Hepatite C) em
amostras de sangue de doadores, com a consequente diminuio do risco transfusional
causado por estes agentes.
O objetivo do teste NAT reduzir a janela imunolgica para 10 dias tanto para HIV
quanto para HCV, atualmente para o HIV a janela estimada de 22 dias e para o HCV de 70
dias.
No perodo da janela imunolgica, no h produo sistmica de anticorpos, a triagem desses
agentes infecciosos pelo ensaio NAT, ocorre por rastreamento genmico, portanto, o tempo
de duplicao viral, que de 0,3 dia e 1 dia para os HCV e HIV, respectivamente, de
fundamental importncia para a eficcia do ensaio.
A regio genmica selecionada para o rastreamento destes vrus, so regies Cterminal do gene da integrase do HIV e 5-no traduzida (5-UTR) do HCV. Essas regies
foram escolhidas por terem uma boa estabilidade gentica e alto grau de conservao entre
os diversos tipos, gentipos e subtipos destes patgenos.
A metodologia foi desenvolvida em pool de seis amostras, impactando no custo da utilizao
da mesma e no tempo gasto durante a execuo da rotina. O consenso de se trabalhar em
pool com seis amostras, foi estabelecido, pelos resultados de sensibilidade do limite de
deteco, obtidos a partir dos testes de replicatas de painis virais calibrados por padres
internacionais. Ser adicionada aos pool de amostras a partcula calibradora, que participar
em todas as etapas do processo imposto aos pool. Seu volume adicionado deve ser constante
e relativo a 100 UI de vrus/mL, estando sempre perto do limite de deteco do teste.
A partcula calibradora um vrus HIV/HCV mimtico biosseguro, que exerce a funo
de controlar as condies ideais da reao (intra-ensaio) validando os resultados das
determinaes e garantindo a qualidade metodolgica. Este calibrador interno possui
mutaes genmicas, que o diferencia estruturalmente das caractersticas comuns do vrus
selvagem, tornando-o no infeccioso.
Durante a confeco dos pool o equipamento Janus identifica todas as amostras por
cdigo de barras, sendo possvel o reconhecimento dos materiais pertencentes a cada pool, o
que permite a rastreabilidade das amostras. Aps a preparao dos pool o material
transportado para o equipamento BioRobot MDx onde ser extrado o RNA.
A tecnologia de extrao com alta recuperao de cido nuclico, baseada na
utilizao de partculas magnticas, realizada por uma estao robtica que executa a
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Aprovado por Linda Khalili Boukai

40
Reviso: 29/03/2012

extrao do genoma viral, alm da transferncia automtica do material extrado na placa,


previamente identificada pelo leitor de cdigo de barras do equipamento.
A metodologia de amplificao especfica do alvo com sondas marcadas com fluorescncia
(Taqman Probe) ser usada para determinar a presena dos HIV e HCV de forma
discriminatria. Isso possvel devido utilizao de sondas especificas para cada alvo.
O Kit nacional fornece material para 96 reaes, tendo capacidade para processar 552
amostras primrias (92 pool de seis amostras + 2 controles negativos + 2 controles positivos).
A deteco pela plataforma NAT Multiplex HIV/HCV Nacional se desenvolve em
etapas, integrando trs equipamentos com tecnologias distintas:

Etapas e Equipamentos:
A. Preparo do Pool - JANUS
B. Extrao - BioRobot MDx
C. Preparao e pipetagem da reao de PCR - JANUS
D. Amplificao e deteco Termociclador ABI 7500
E. Processamento de Dados e resultados

A) Preparo do Pool
Para realizar o preparo do pool, com 6 amostras, equivalente a uma placa com 96
poos, utiliza-se 100 L de cada uma das 552 amostras primrias. Cada amostra primria
deve ser coletada em tubos dedicados ao NAT de flebotomia a vcuo do tipo PPT (K2 EDTA,
com gel de polister para separao de plasma e frao celular do sangue total). A
transferncia feita, gerando tubos secundrios (tubos de poliestireno de 15 ml), onde ser
adicionada a partcula calibradora.
Quando ocorrer resultado positivo para o pool todas as 6 amostras que o compem
sero obrigatoriamente re-testadas individualmente (single).

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Reviso: 29/03/2012

Procedimento
1) Utilizao do Janus

Ligar o computador do Janus;

Para o funcionamento correto da mini rede, o computador do equipamento Janus deve


ser SEMPRE o primeiro a ser ligado (Fig. 27)!

Fig. 27: Computador acoplado ao Janus.

Na rea de trabalho, abrir o programa com duplo clique no cone WinPREP for JANUS
(Fig. 28).

Fig. 28: Detalhe do cone do programa WinPREP for JANUS na rea de trabalho.

Antes de iniciar a rotina, observar se h gua destilada suficiente no galo de lquido


do sistema Janus e se o galo de resduos (descarte) precisa ser esvaziado.

Quando encher o galo com gua destilada, prestar ateno se o conector esta bem
encaixado ao sistema para evitar falhas no seu reconhecimento.

Antes de utilizar o equipamento para realizar qualquer protocolo, so necessrios dois


procedimentos (itens 1.1 e 1.2).
Elaborado pela DIACM
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42
Reviso: 29/03/2012

1.1 - Inicializao do rob (Initialize):


No software WinPREP for JANUS s ser utilizado para esta primeira etapa, para a
inicializao do equipamento. Para inicia-lo basta clicar em: Utilities > Setup > Instrument >
Initialize (Fig.29).

Fig.29: Tela do programa WinPrep, com as opes selecionadas em azul que precisam ser clicadas para a
inicializao do rob.

1.2 - Remoo de bolhas e lavagem do sistema (FlushSysLiq)


O Flush System Liquid realizado para retirar bolhas no sistema de liquidos do rob,
evitando problemas de pipetagem e de deteco.
Todos os protocolos utilizados na plataforma NAT, Pooling de amostras; Reao de
PCR; Consolidao de dados e o Flush System (FlushSysLiq), devem ser realizados
abrindo o cone, Janus Application Assistant (Fig.30), na rea de trabalho, com um duplo
clique.

Fig. 30: Detalhe do cone do programa JANUS Application Assistant na rea de trabalho.

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43
Reviso: 29/03/2012

Dentro do software selecionar a aba Select. Para a realizao do procedimento de


lavagem, selecionar o ltimo cone dentro da janela Select Protocol, o FlushSysLiq. Verificar
na janela Answer Questions se o volume est em 10.000 L para o Flush e para o Wash.
Clicar na aba 4.Run (Seta laranja).

Fig. 28: Tela ilustrativa do procedimento de FlushSysLiq.

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44
Reviso: 29/03/2012

Clicar em START (Seta vermelha) para iniciar o Flush System Liquid.

Fig.29:Tela ilustrativa do procedimento de incio do Flush System Liquid.

Repetir este procedimento at que no se observem mais bolhas de ar nas


mangueiras do equipamento (Fig.33 A e B) e seringas.

B
Fig. 30: Mangueiras do equipamento Janus. Essas so verificadas com relao a presena de bolhas. A) As
setas indicam bolhas no sistema; B) Visualizao das mangueiras localizadas no brao robtico.

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45
Reviso: 29/03/2012

1.3 . Procedimento Pool de seis amostras


O servio de Hemoterapia deve gerar 96 etiquetas com cdigos de barras, para os
tubos secundrios. As etiquetas nos tubos secundrios devem ser coladas na vertical
acima da marcao de 2 mL do tubo.
As etiquetas nos tubos primrios devem ser coladas na vertical acima da altura do gel.
Verificar se os tubos primrios (BD PPT EDTA K2 com gel), depois de centrifugados
contm volume suficiente para a anlise (mnimo de 1 mL).
A amostra no deve ser processada se a mesma apresentar vestgio de cogulo ou
volume insuficiente.

Ateno ao sentido dos tubos primrios nas estantes. A leitura dos tubos feita de
trs (fundo do aparelho) para frente. Sendo assim, o tubo n 1 aquele que est na
ltima posio na estante 1A (Fig. 34).

Fig. 31: A) Estante com os tubos primrios do equipamento Janus, numerados de 1 a 9. possvel notar que a
estante 10 est vazia (s utilizada para abertura de pool) e as estantes 11 e 12 esto com os tubos secundrios.
B) Esquema ilustrativo mostrando a posio dos tubos primrios na estante do Janus. Notar que a numerao
comea de trs para frente (sensor do brao do laser) para frente (frente do equipamento).

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Reviso: 29/03/2012

A estante 10 da mesa de trabalho do equipamento deve permanecer vazia. Essa


estante s utilizada na abertura de pool.
O equipamento JANUS deve ser carregado no mximo com os 138 tubos primrios,
originando 23 pool de seis amostras (tubos secundrios), por vez. Esse procedimento
ser repetido 4 vezes durante o processo para gerar ao final 92 tubos secundrios.
Nas estantes TS1A e TS2A (exclusiva para os tubos secundrios) colocar os 23 tubos
secundrios (15mL). Obs: Para o preparo dos 23 pools correspondentes as estantes
1B a 9B utilizar as estantes de tubos secundrios TS1B e TS2B e assim
sucessivamente at as estantes TS1D e TS2D.

Verificar se todos os cdigos de barras dos tubos primrios e secundrios esto


posicionados corretamente (voltados para a janela frontal esquerda da rack)
para evitar erros de leitura (Fig.35).
Verificar se todos os tubos encontram-se encaixados at o final da estante para
evitar quebra dos mesmos devido ao movimento do brao do rob.

Fig. 32: Posio correta dos tubos nas racks. As etiquetas com os cdigos de barras devem sempre ficar
voltadas para a janela esquerda das racks. A Tubos Primrios. B Tubos secundrios.

Colocar as caixas de ponteiras condutivas de 175 l (Fig. 36, seta azul).

Fig. 33: Mesa de trabalho do equipamento Janus. Setas azuis apontam para os locais onde so colocadas as
caixas de ponteiras de 175 L.

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Reviso: 29/03/2012

Retirar a partcula calibradora do Mdulo de Controle do freezer -70C, esperar o


descongelamento completo.

Homogeneizar a partcula calibradora por ressuspenso, utilizando uma pipeta


automtica de 1000 l, ou por inverso.

Colocar o flaconete contendo a partcula calibradora nas primeiras posies da estante


esquerda (Fig. 37).

Cuidado ao homogeneizar a partcula calibradora para no formar bolhas. Se isso


ocorrer o Janus no pipetar a partcula nos tubos secundrios.
A forma ideal para homogeneizar por ressuspenso aspirar e dispensar o volume
vagarosamente, de 4 a 5 vezes. No preciso aspirar todo o lquido contido nos
flaconetes. Isso evita a formao de bolhas.

Fig. 34: Suporte para os flaconetes de partcula calibradora na mesa do Janus. Os dois flaconetes de partcula
calibradora devem ser posicionados nas duas primeiras posies no lado esquerdo.

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48
Reviso: 29/03/2012

O primeiro protocolo utilizado o Pooling de Amostras que se encontra na aba 1.


Select Para selecion-lo clicar sobre o mesmo (seta vermelha) e clicar em Next Step (seta
verde). Tambm possvel pular as etapas 2.Gather e 3.Place, indo diretamente para a
aba 4.Run.

Fig. 35: Tela indicando o procedimento de realizao do protocolo de Pooling de Amostras.

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

Na aba Gather, ir aparecer todos os itens que sero utilizados neste protocolo. Clicar
em Next Step ou ir diretamente para a aba 4.Run.

Fig. 36: Lista dos itens que so necessrios para a realizao do protocolo de Pooling de Amostras.

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Reviso: 29/03/2012

Na aba Place est indicado localizao correta de cada um dos itens. Clicar em Next
Step.

Fig. 37: Tela indicando as posies de cada item necessrio ao protocolo de pooling de amostras.

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Reviso: 29/03/2012

Na aba Run para executar a rotina. Ao selecionar Start dentro da janela principal.
Abrir uma janela Status (Fig. 41), a finalidade desse passo informar para o equipamento o
nmero de ponteiras a serem utilizadas. Dentro da aba Reset Tip Boxes, clicar no primeiro
item Disposible Tips1 e selecionar Fill nas opes do lado direito. Proceder da mesma forma
at o ltimo Disposible Tips. Ao final clicar em OK (seta azul). Sero 9 caixas de tip no total,
apesar de nesta etapa o equipamento utilizar somente 7 caixas, encher todas as caixas nesta
etapa. O valor correto 96/0.

Fig. 38: Tela onde informado para o equipamento o nmero de ponteiras a serem utilizadas em suas devidas
posies.

Abrir a janela onde ser includo o quantitativo de amostras a serem realizadas na rotina
(Fig.42). No campo Nmero de amostras possveis positivas dever ser informado o
quantitativo de amostras em single (seta verde), no campo nmero de amostras primrias
dever ser informado o quantitativo de amostras que sofrero o pooling (seta vermelha). Aps
incluir essas informaes clicar em Mapa de amostras. O Software ir mostrar o desenho
das racks. Aps carregar o equipamento conforme o exposto no mapa, clicar em Atualizar
(seta azul). O equipamento far a leitura dos cdigos de barras dos tubos.

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

Fig. 39: Tela do Mapa de amostras, nesta tela aparecer o perfil de preenchimento da primeira carregada, os
perfis das outras carregadas iro aparecer ao final de cada etapa.

Aps a leitura dos cdigos de barras, o software ir indicar se h tubos faltando, tubos
extra e duplicatas de cdigos de barras dos tubos secundrios. Quando h qualquer problema
de leitura dos cdigos de barras, essa janela de gerao de mapa aparecer novamente.
Clicar em Atualizar (seta azul) para abrir a janela de releitura (Fig. 43).

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Reviso: 29/03/2012

Figura 40: Tela de releitura dos cdigos de barras.

A coluna Lane (Fig. 43) informa qual a rack onde o tubo no foi lido, a coluna Posio
informa qual a posio da rack se encontra o tubo que no foi lido. Para fazer a releitura
selecionar a linha com a falha na leitura, ler o cdigo de barras com o leitor manual ou digitar
o mesmo. Quando reler todos os cdigos, certifique-se de que as racks esto todas
posicionadas corretamente na mesa de trabalho do equipamento Janus e selecione Atualizar.
Aps o trmino da primeira etapa de preparo de 23 pools de seis amostras (a partir de 138
tubos primrios). Retirar as estantes contendo os tubos primrios A e carregar o equipamento
com as estantes B. Retirar as estantes contendo os tubos secundrios TS1A e TS2A e
carregar o equipamento com as estantes TS1B e TS2B. Clicar em Next
Aps o trmino desta etapa, substituir as estantes conforme descrito acima seguindo o
sequencial C e posteriormente as racks com a letra D.

Tabela referente ao nmero total de amostras. O nmero de amostras em pool e


o nmero de amostras singles.
N Amostras
Totais
552
522
492
462
432
402
372
342
312

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N Amostras
Pools
552
516
480
444
408
372
336
300
264

N Amostras
Singles
-6
12
18
24
30
36
42
48

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Reviso: 29/03/2012

Pouco antes de terminar a etapa de pool ( 15 min.) retirar, do freezer, os


Controles Negativo e Positivo, e esperar que descongelem completamente
temperatura ambiente.

Quando o Janus desligado, as Varispans descem. Com isso importante


sempre mover o brao robtico para a posio de repouso. Entrar em: UTILITIES
> SETUP > INSTRUMENT > PARK ALL ARMS

Caso haja necessidade da realizao de duas rotinas no mesmo dia, utilizando apenas
uma plataforma, devem-se seguir as seguintes orientaes:
- Iniciar a segunda rotina aps ter passado uma hora de durao no MDx da primeira rotina.
- O protocolo da Reao de PCR da primeira rotina pode ser efetuado logo aps o pooling da
segunda, no haver conflito de informaes, desde que os cdigos de barras dos tubos
secundrios sejam diferentes.
* Se ao trmino da etapa de extrao da primeira rotina no MDx, o Janus ainda estiver realizando
o pooling das amostras da segunda, colocar a placa de RNA da primeira, no freezer a -80C at o
momento de iniciar a reao de PCR Setup. CERTIFIQUE-SE que a placa esteja totalmente
descongelada.
- Iniciar a reao de PCR da segunda rotina, apenas quando estiver faltando 20 minutos para
terminar a reao de amplificao da primeira, no equipamento ABI7500.

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Reviso: 29/03/2012

Rotinas utilizando somente amostras em Single


Seguir o protocolo de pooling normalmente at o momento em que aparece a tela do mapa
de amostras (Fig. 44).
Na aba Modo de Carregamento selecionar Ensaio de Amostras Simples para a
realizao de 92 amostras.
Esta rotina, com apenas amostras em single, ser feita em uma carregada, como mostra a
figura abaixo:

Mapa de carregamento dos tubos primrios com as amostras em single


Mapa de carregamento dos tubos secundrios.

Fig. 41: Mapa de amostras utilizando Ensaio de Amostras Simples.

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56
Reviso: 29/03/2012

B) EXTRAO
A extrao totalmente automatizada pelo Biorob MDx (Qiagen) (Fig. 36) e utiliza
tecnologia com alta recuperao de cido nuclico, baseada nas propriedades de ligao
seletiva da membrana de slica. As amostras so lisadas com tampo de lise e protease sob
condies desnaturantes (a temperatura de 56C). O etanol auxilia na precipitao do
material. O carreador permite a perfeita ligao do lisado membrana de slica. O material
gentico absorvido pela membrana atravs de uma etapa de vcuo. O cido nuclico ligado
membrana, passa por trs etapas de lavagem sob vcuo para a purificao. A primeira
realizada com a adio do Tampo de Lavagem 1 e subseqente vcuo (o equipamento pede
a verificao visual de cogulos), em seguida realiza-se a adio do Tampo de Lavagem 2 e
vcuo (as condies de sal e pH dos tampes de lavagem garantem a retirada das diferentes
impurezas e dos inibidores de PCR das amostras), posteriormente adiciona-se etanol e
realizado mais um vcuo. Antes da eluio, a membrana de slica passa por uma secagem
onde o etanol restante ajuda na desidratao da placa.
Aps todas essas etapas o produto final eludo livre de albumina srica, outras
protenas, nucleases, sais inorgnicos e orgnicos e outros possveis interferentes.

PROCEDIMENTOS
2. Utilizao do MDx:
Ligar o computador do equipamento de extrao MDx.

Fig. 42: Computador do equipamento Janus.

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57
Reviso: 29/03/2012

Ligar o equipamento MDx (no boto liga/desliga: de O para I) (Fig. 46).

Fig. 43: Seta indica boto liga/desliga do equipamento.

Abrir o software QIAsoft 4. O equipamento solicita informaes sobre o nome do usurio e


senha, conforme figura 47.

Fig. 44: Caixa de dilogo Login do programa QIAsoft 4.

Sempre verificar se as luzes verdes, atrs do equipamento, do lado direito, esto


acesas (Fig.48). Se no estiverem, verificar o problema indicado.
Ateno: Dependendo da bomba de vcuo existente no equipamento, o
status da luz do Pump ser diferenciado.
- Se a bomba for suspensa, a luz ficar apagada e s acender em caso de
problemas.
- Se a bomba no for suspensa, a luz permanecer acesa, apagando
somente em caso de problemas.

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58
Reviso: 29/03/2012

Power
Pump
System
Waste
Vacuum

Fig. 45: Parte de trs do equipamento MDx. Mostrando em detalhes as 5 luzes verdes. Que so: Power
(energia), Pump (bomba), System (sistema), Waste (descarte), Vacuum (vcuo).

Seguir as instrues para a realizao das etapas de manuteno diria;


Clicar na opo Tools da barra de ferramentas. Selecionar Reinitialize Robot. Ao trmino
deste procedimento, selecionar Flush System, e ao fim deste, Flush Dispenser (Fig. 49)

Fig. 46: Tela do programa QIAsoft MDx.

Preparar o equipamento MDx, seguindo as instrues do software QIAmp One for all MDx
cV98 para preparo dos reagentes e da mesa de trabalho.

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59
Reviso: 29/03/2012

Na tela abaixo (Fig.50) ler o cdigo de barras do carto BIO, que vem dentro de cada
mdulo de extrao. (Fig. 51).

Figura 47: Janela do programa QIAsoft MDx, para a leitura do cdigo de barras do Carto Bio que vem dentro do
mdulo de extrao do kit NAT.
.

Figura 48: A) Leitor de cdigos de barras que fica ao lado do computador. B) Carto Bio com o cdigo de barras.

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60
Reviso: 29/03/2012

2.1. Instrues gerais Sistema de reposio e descarte de lquido:


Para montagem da mesa de trabalho, siga as orientaes abaixo (Fig. 52 a 54) e aps a
execuo de cada etapa, selecionar continuar.

A.

B.

Fig. 49: A) Tela com Instrues gerais mostrando a etapa de reposio de gua destilada do sistema.
B) Inserido fotografia do galo de gua destilada, dentro do armrio embaixo do equipamento.

A..

B.

Fig. 50: A) Tela com Instrues gerais mostrando a etapa de descarte de gua do sistema (sem risco
biolgico). B) Inserido fotografia do galo de descarte de gua.

Elaborado pela DIACM


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61
Reviso: 29/03/2012

A.

B.

Figura 51: A) Tela com Instrues gerais mostrando a etapa de descarte biolgico (Vacuum Trap) e do frasco
de condensao. B) Inserido fotografia do galo de descarte biolgico.

Aps essa etapa de reposio e descarte de lquidos, verificar se todas as conexes


dos gales e mangueiras esto desobstrudas e conectadas corretamente, permitindo
o fluxo contnuo dos lquidos.

Fig. 52: Sistema de reposio e descarte de lquidos. Setas indicam as conexes dos gales que precisam ser
verificadas.
.

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62
Reviso: 29/03/2012

2.2 - Preparo da Mesa de Trabalho e Abastecimento do Carrossel


O software QIAsoft MDx descreve todo o procedimento de montagem da mesa de trabalho
e do abastecimento do carrossel, orientando o usurio durante a execuo das tarefas. Aps
seguir as orientaes das telas e execuo de cada etapa, clicar em Next

Figura 56: Tela com instrues para colocar o saco de descarte de ponteiras.

Figura 57: Tela com instrues para reconstituio dos tampes e do etanol.

Elaborado pela DIACM


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63
Reviso: 29/03/2012

Figura 58: Tela com instrues para abastecimento do carrossel.

Ateno na colocao dos frascos dentro do equipamento. O cdigo de barras de cada


um precisa estar voltado para fora. Se isso no ocorrer, o equipamento no conseguir
ler os cdigos e acusar que os frascos no se encontram nos seus lugares.

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64
Reviso: 29/03/2012

Figura 59: Tela com instrues para montagem da mesa de trabalho.

Figura 60: Tela com instrues para montagem da mesa de trabalho.

Elaborado pela DIACM


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65
Reviso: 29/03/2012

Figura 61: Tela com instrues para montagem da mesa de trabalho.

Figura 62: Tela com instrues para montagem da mesa de trabalho.

Elaborado pela DIACM


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66
Reviso: 29/03/2012

Figura 63: Tela com instrues para montagem da gaveta de ponteiras.

Abastecer a mesa de trabalho apenas com as ponteiras de 1100L; no utilizar


as ponteiras de 300 L, estas so utilizadas apenas pelos Engenheiros durante
as manutenes.

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67
Reviso: 29/03/2012

Figura 64: Tela com instrues para reconstituio da Protease.

Para a reconstituio da Protease: Verter o frasco de solvente no frasco de Protease


liofilizada e homogeneizar lentamente, a fim de evitar aquecimento e possvel
desnaturao da enzima.
Depois de reconstituda a Protease pode ser armazenada em temperatura de 15-25C,
se mantendo estvel at a validade indicada.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

68
Reviso: 29/03/2012

Figura 65: Tela com instrues para montagem da mesa de trabalho.

Figura 66: Tela com instrues para preparao do Tampo de Lise.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

69
Reviso: 29/03/2012

CUIDADO ao transferir o tampo de lise para o recipiente descartvel para que no


haja formao de bolhas.

Figura 67: Tela com instrues para montagem da mesa de trabalho.

Figura 68: Tela com instrues para montagem da mesa de trabalho.

Elaborado pela DIACM


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70
Reviso: 29/03/2012

Figura 69: Tela com instrues para montagem da mesa de trabalho, placa de eluio.

CUIDADO com a posio da placa de Eluio. O cdigo de barras deve estar


voltado para a direita do equipamento. Assim, garantimos a posio correta da
placa, posio 1A na esquerda superior.

Elaborado pela DIACM


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71
Reviso: 29/03/2012

Figura 70: Tela com alerta de movimentao do brao do rob.

Figura 71: Tela com instrues para montagem das amostras na mesa de trabalho.

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72
Reviso: 29/03/2012

2.3 Carregamento das amostras na mesa de trabalho

Colocar 4 tubos secundrios (15ml) etiquetados vazios nas 04 primeiras posies da


estante do MDx conforme Figura 72:

Figura 7253: Fotografia das racks do MDx. Setas azuis apontam para a posio onde sero encaixados os tubos
secundrios do controle negativo. Setas vermelhas apontam para as posies onde sero encaixados os tubos
secundrios de controle positivo. As outras posies correspondem s amostras.

Controle
Negativo

Controle
Positivo

Posio 5
1 tubo
secundrio

Figura 543: Esquema ilustrativo das 12 racks do MDx. Em azul representa a posio dos tubos do controle
negativo e em vermelho a posio dos tubos dos controles positivos.

Utilizando uma pipeta automtica de 1000 L (calibrada), homogeneizar e adicionar 600


L do Controle Negativo nos tubos das posies 1 e 2, e 600 L do Controle Positivo nos tubos
das posies 3 e 4.
Retirar os tubos secundrios de amostras da estante do equipamento Janus e transferir
para a estante do equipamento MDx. Os tubos secundrios contendo o pool de seis
amostras devero preencher a primeira estante do MDx a partir da posio 5 (logo aps os
controles Negativo e Positivo).

Elaborado pela DIACM


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73
Reviso: 29/03/2012

Figura 74: Tela com aviso para fechamento de porta.

Aps essa etapa, o equipamento iniciar o protocolo de extrao automaticamente.

2.4 Verificao de cogulos


Faltando aproximadamente 36 minutos para o trmino da extrao, o equipamento MDx
solicitar a interveno do usurio para verificao visual da presena de cogulo nos poos da
placa de vcuo (Fig. 75):
Poos com cogulos

Fig.75: Janela de checagem de cogulos. A caixa de texto diz: Verifique a placa de vcuo. Voc pode ver algum
poo com cogulo?

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74
Reviso: 29/03/2012

1. Retire a placa de vcuo do equipamento e verifique se h algum poo com cogulo. Se


houver, selecione YES, aparecer uma janela para identificao do(s) poo(s) (Fig. 76). Se
no houver, selecione NO.

Figura 76: Janela para o usurio marcar a posio do(s) poo(s) com cogulo.

Recoloque a placa de vcuo na posio e continue o procedimento.


Ao final do processo de extrao, seguir as orientaes descritas nas telas abaixo para
retirada da placa de eluio e limpeza da rea de trabalho.

Figura 77: Janela para a retirada da placa de eluio ao final do processo.

Elaborado pela DIACM


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75
Reviso: 29/03/2012

Aps retirar a placa de eluio, coloc-la no freezer -80C a -60C, por no


mnimo 20min.

Figura 78: Tela com instrues para descarte dos materiais da mesa de trabalho.

Figura 79: Tela com instrues para retirada dos acessrios lavveis da mesa de trabalho.

Elaborado pela DIACM


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76
Reviso: 29/03/2012

Deixar as peas submersas em detergente amnia quaternria 50% (soluo de


uso diluida 1:600. Ex.: 5 ml de detergente para 3 L de gua).
Posteriormente lavar as peas em gua corrente abundante, sendo a ltima
lavagem com gua destilada.
Deixar as peas secarem bem e antes da utilizao expor a luz UV da capela
(enviada para utilizao na plataforma) por 15min.

Figura 80: Tela com instrues para lavagem do sistema de vcuo.

Elaborado pela DIACM


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77
Reviso: 29/03/2012

Figura 81: Tela com instrues para descarte dos tampes e etanol.

Figura 82: Tela com alerta de movimentao do brao do rob.

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78
Reviso: 29/03/2012

Figura 83: Tela com instrues para descarte das amostras.

Figura 84: Tela com instrues para retirada do saco de descarte de ponteiras.

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79
Reviso: 29/03/2012

Figura 85: Tela exibida ao final do protocolo.

C) Protocolo de Reao de PCR - JANUS


Aps o trmino da limpeza do equipamento MDx, o JANUS j pode ser preparado para a
realizao da reao de PCR.
- Passado os 20min da placa de eluio no freezer, retirar a mesma e coloc-la para
descongelar no Janus (no local indicado no software).
- Ligar o bloco resfriado (INHECO) do equipamento JANUS e aguardar que chegue at a
temperatura de trabalho (6C 2C);
- Retirar do freezer os reagentes (Iniciadores, Sondas, Mistura PCR, gua DEPC) e
aguardar o descongelamento temperatura ambiente, exceto a Enzima RT, que dever ser
colocada diretamente, na sua posio determinada, no bloco resfriado (quando este j estiver
com a temperatura de 6C 2C). A Sonda deve ser descongelada ao abrigo da luz.
- Carregar o equipamento (conforme mostrado na Figura 86) com os reagentes
necessrios para a realizao da reao de PCR (este quantitativo suficiente para a
realizao da reao de PCR para 96 testes: 92 pools + 02 controles negativos + 02 controles
positivos).

Elaborado pela DIACM


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80
Reviso: 29/03/2012

Fig. 86: Desenho Ilustrativo das posies dos reagentes. Circulo A: Iniciadores, Crculo B: Sondas, Crculo C:
Enzima RT, Crculo D: Mistura de PCR, Crculo E: gua DEPC.

O tempo de descongelamento da placa de eluio (placa com o material


extrado) de aproximadamente 30 a 45 minutos em temperatura ambiente
entre 15C a 25C. Deve-se observar o descongelamento total da placa.
- Colocar a placa de PCR e o tubo de 5 mL para a reao de mistura de PCR no
equipamento Janus;

Ao colocar a placa ptica e a placa de eluio no equipamento Janus,


certifique-se de que ambas estejam com o poo A1 voltado para o canto
superior esquerdo.

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81
Reviso: 29/03/2012

- O protocolo de Reao de PCR encontra-se na aba 1. Select. Para selecion-lo clicar


sobre o mesmo (seta vermelha) e clicar em Next Step (seta verde). Tambm possvel pular
as etapas 2.Gather e 3. Place, indo diretamente para a aba 4.Run .

Figura 87: Tela ilustrativa indicando o procedimento de Reao de PCR.

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82
Reviso: 29/03/2012

Na aba Gather, ir aparecer todos os itens que sero utilizados neste protocolo. Clicar
em Next Step ou ir diretamente para a aba 4.Run.

Fig.88: Listagem de todos os itens necessrios para realizao do protocolo de Reao de PCR.

Na aba Place est indicado a localizao correta de cada um dos itens. Clicar em Next
Step (seta verde).

Fig. 89: Tela indicativa das posies de cada item necessrio para reao de PCR.

Elaborado pela DIACM


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83
Reviso: 29/03/2012

Na aba Run, clicar em Start (seta vermelha).

Figura 90: Tela ilustrativa do incio da reao de PCR.

Abrir uma janela Status, dentro da aba Reset Tip Boxes, verifique se o Disposible Tips 8
e 9 esto completos (96/0). Se estiver, selecione OK; se no estiver selecione cada um,
clique em Fill e em OK.

Figura 91: Tela onde informado para o equipamento o nmero de ponteiras a serem utilizadas em suas devidas
posies.

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84
Reviso: 29/03/2012

Abrir a tela para ser inserido o cdigo de barra da placa de PCR (seta azul). Ler o cdigo
de barras da Placa de reao (ptica) com leitor manual do equipamento Janus. Clicar em
OK (seta vermelha) (Fig. 92).

Fig. 92: Tela que solicita a insero do cdigo de barras da placa de reao (ptica) com o auxlio do leitor
manual do Janus.

Abrir a tela para ser inserido o cdigo de barra da placa da Qiagen (seta azul). Ler o
cdigo de barras com o leitor manual do JANUS. Clicar em OK (seta vermelha) (Fig. 93).

Fig. 93: Tela que solicita a insero do cdigo de barras da placa de eluio com o auxlio do leitor manual do
Janus.

Elaborado pela DIACM


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85
Reviso: 29/03/2012

Abrir a tela perguntando sobre as condies do Inheco e se os reagentes esto na


posio devida. Clicar em OK (seta vermelha) (Fig.94).

Fig. 94: Tela de verificao da temperatura do inheco (6C).

Abrir a tela perguntando se a placa de PCR e o tubo de 5 mL esto posicionados


corretamente no Janus . Clicar em Ok (seta vermelha) (Fig.95).

Fig. 95: Tela de verificao do posicionamento do tubo de 5mL.

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86
Reviso: 29/03/2012

Aps a mistura de PCR ser transferida para a placa de Reao, aparecer uma janela
no software do JANUS solicitando a placa de eluio. Retirar a tampa da placa e verificar se
esta se encontra totalmente descongelada. Selecionar OK na janela emitida.
Aps o JANUS transferir o RNA para a placa de reao, vedar esta placa com o selo
ptico, com o auxlio da esptula (ABI).
Observar a placa para ver se h bolhas nos poos. Se houver, fazer movimentos firmes
de cima para baixo com a placa para retirar as bolhas.
Colocar a placa de reao no equipamento de deteco ABI 7500 Real Time PCR
System.

No tocar o fundo da placa!


- Recolocar a tampa na placa de eluio e armazen-la no freezer a 70C at o final
da rotina com emisso de laudo.

D) Amplificao e Deteco
Amplificao
A metodologia de amplificao especfica do alvo com sondas marcadas com
fluorescncia usada para determinar a presena de: HIV, HCV e da partcula calibradora de
forma discriminatria. O equipamento utilizado na etapa de amplificao e deteco o ABI
7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems/LifeTechnologies).

Deteco
A tcnica possibilita a dosagem dos produtos de PCR durante o transcorrer da mesma
em tempo real. Isto conseguido atravs de uma sonda de DNA sinttico que tem duas
modificaes em suas extremidades. A emisso de luz diretamente proporcional massa de
produto de PCR que est sendo sintetizado, possibilitando a dosagem em tempo real.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

87
Reviso: 29/03/2012

4. Procedimento para Amplificao e Deteco Real Time 7500


- Ligar o equipamento de PCR em tempo real e o seu computador, 15 min. antes de utiliz-lo,
para que o sistema Peltier de aquecimento da placa de reao se estabilize.

- Selecionar o cone 7500 System Software

Fig. 96: Icone do software 7500, na rea de trabalho.

Aps a inicializao do software, ir aparecer uma caixa de texto pedindo para escolher o
usurio. Selecionar NAT. Clicar OK.

Fig. 97: Tela de login do software 7500.

Dentro da tela inicial do programa selecionar TEMPLATE.

Fig.98: Icone do Template de dentro do software.

Abrir a janela de seleo de arquivos do Windows. Selecionar o arquivo denominado


NAT e clicar em Open.
Elaborado pela DIACM
Aprovado por Linda Khalili Boukai

88
Reviso: 29/03/2012

Selecionar Set up > Experiment Properties. Em Experiment Name, seta vermelha,


colocar o cdigo de barras da placa ptica (utilizando o leitor manual de cdigo de barras do
equipamento ABI 7500) (Fig. 99).

Fig.99: Tela do programa 7500 Software.

Clicar em Save e selecionar Save as


Clicar no cone
Aps o fim da corrida, clicar no cone Analyse e depois em Save.
Clicar no cone Export .

Fig.100: Tela do programa 7500 Software. Imagem mostra a rea EXPORT selecionada.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

89
Reviso: 29/03/2012

Abrir a janela abaixo; selecionar somente a opo RESULTS e alterar a opo File type
para *.txt. No campo Export File Name estar o cdigo de barras da placa, apagar o _data.
em Export File Location aparece o diretrio onde o arquivo ser gravado.

Fig.101: Tela do programa 7500 Software.

Clicar em START EXPORT, seta verde (Fig.101).

Fig. 102: Tela de informao do export.

Clicar em Close Export Tool e fecha o software.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

90
Reviso: 29/03/2012

E) Processamento de dados e Resultados


Este procedimento realizado no computador do equipamento JANUS.
O protocolo de Consolidao dos Dados encontra-se na aba 1. Select. Para
selecion-lo clicar sobre o mesmo (seta vermelha).

Fig.103: Tela para realizao do protocolo de consolidao dos dados.

Selecionar 4. Run e Clicar em Start.

Fig. 104: Tela indicando o incio do protocolo de Consolidao de Dados.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

91
Reviso: 29/03/2012

Nesta etapa, basta clicar direto em OK (seta vermelha), uma vez que ele no utiliza
nenhuma ponteira (tip).

Fig. 105: Tela de Reset Tip Boxes

Posteriormente, selecionar a rotina que deseja processar na opo Novos Relatrios (o


arquivo selecionado ficar marcado com V);
- Exemplo: 298_11022010_001_RJ

Fig.55: Quadro onde lista as rotinas a serem consolidadas.

Clicar em Gerar, seta vermelha. Ao final da consolidao dos dados a opo Fechar
estar habilitada, selecion-la para encerrar o protocolo, seta verde.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

92
Reviso: 29/03/2012

Se houver necessidade de Reconsolidar a rotina. Selecion-la na opo


Todos os Relatrios (o arquivo selecionado ficar marcado com V);

E.1 Gerao do laudo de resultados no Software de Bio-Manguinhos


Clique no cone localizado no desktop do computador do Janus.

Fig.107: cone do software de Bio-Manguinhos.

Abrir a tela abaixo:

Fig. 108: tela de login do software.

Digite o nome de usurio e a senha. Clique em Login

Fig. 109: Tela de comandos do software.

Para gerar o laudo, d um clique em Processa Rotina, seta vermelha (Fig. 109).

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

93
Reviso: 29/03/2012

Fig. 110: Tela de seleo das rotinas.

Nesta tela sero mostradas todas as rotinas para gerao dos laudos (Fig.110).
Digite o nmero do lote utilizado para realizao da rotina, no campo Lote. Selecione a
rotina desejada e clique em Sim.
Aparecer o status do processamento da rotina (Processo Finalizado. Rotina OK ou
Rotina Invlida) e a pergunta se o usurio deseja gerar nova rotina (Fig.111).
Se houver a necessidade de gerar nova rotina, clicar em Sim, seta vermelha e refazer o
processo (Fig.111).

Fig. 111: Tela com o Status da rotina

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

94
Reviso: 29/03/2012

Para consultar a rotina, clicar em Consultar Rotina (Fig.112):

Fig. 112: Tela de comandos do software.

Aparecer a tela abaixo:

Fig. 113: tela de visualizao de rotinas geradas

Nesta tela, o usurio poder visualizar o contedo de uma rotina gerada selecionando a
data em que a mesma foi gerada. Em seguida clicar em Visualizar (Fig.113).

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

95
Reviso: 29/03/2012

Clicar duas vezes na rotina para visualizao do laudo em PDF (Fig. 114).

Fig. 114: Laudo em PDF.

E.2 Interpretao dos Resultados


E.2.1: Interpretao do Laudo
Deteco
Amostra No detectvel
Controle interno OK
Controle interno No OK

Procedimento
Liberar o resultado das amostras.
Repetir a amostra. Se confirmar o resultado, acionar a
assistncia tcnica de BM relatando o fato.

Amostras em pool Detectvel

Refazer as 6 amostras, que constituem o pool,

Controle interno OK

individualmente.

Amostra em single Detectvel


Controle interno OK

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

Seguir o fluxograma descrito a seguir.

96
Reviso: 29/03/2012

Ao confrontar os resultados da plataforma NAT com os da sorologia, caso haja


alguma amostra no detectvel para o NAT e reagente na sorologia, seguir
conforme o fluxograma supracitado.
Doador de
sangue

Flebotomia
para
sorologia

TESTE GOLD STANDARD NESTE TRABALHO ROTINA SOROLOGIA

Flebotomia
para NAT
BioM

Execuo de
sorologia

Descarte da bolsa
Execuo do
NAT BioM

Convocao do doador

+
NAT
HCV

NAT
HIV

Bolsa em
quarentena
+

pos+

ELISA
HCV

Bolsa em
quarentena

pos+
Caracterizao virolgica
molecular da amostra:
UFRJ

pos+

ELISA
HIV

pos+
Convocao
do doador de
sangue

Acompanhamento sorolgico do
doador de sangue
-soroconverso?-

ELISA
HCV

pos+

ELISA
HIV

pos+
Liberao da bolsa

Descarte da bolsa
Convocao do doador

Confirmatrio:
Western blot HIV ou
RIPA HCV

Figura 115: Fluxograma de aes dos resultados na triagem sorolgica.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

97
Reviso: 29/03/2012

E.2.2 Interpretao das curvas de amplificao no ABI 7500


Se a corrida a ser analisada no estiver exposta na tela, deve-se busc-la no seguinte
caminho:
rea de Trabalho > Pasta NAT > Selecionar o nmero da corrida> Clicar Open.
Clicar na opo Analysis (seta roxa). Para melhor visualizao da curva, selecionar as
opes Target (seta verde) e marcar a opo Threshold (seta rosa).
Primeiramente, a curva deve ser avaliada pela opo Amplification plot, e em seguida
pela opo Multicomponent plot (setas vermelhas) (Fig. 116).

Fig. 116: Tela para anlise das corridas.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

98
Reviso: 29/03/2012

A. Controle interno e amostras no detectveis


O Ct ideal do controle interno de 33 (+2,47) (Fig. 117). O controle interno aparecer no
OK, no laudo, quando o Ct da partcula ultrapassar o valor mximo de 35,47 ou quando no
houver amplificao do mesmo (Fig.118). Nesses casos ser necessrio a repetio dessas
amostras (O resultado informado no laudo ser Repetir Amostra).
Para determinar se uma amostra detectvel para HIV e para HCV, deve-se verificar se
as curvas esto ultrapassando a linha do threshold (analisando o Amplification Plot). Se a
linha no estiver ultrapassando o threshold, esta amostra no detectvel (Fig.118).
A

Fig. 117:Grficos representativos de controle interno OK e amostras no detectveis para HIV e HCV. A Anlise pelo Amplification Plot: Curva vermelha representa o controle interno ultrapassando a linha do Threshold.
B Anlise pelo Multicomponent plot: Curva rosa representa o controle interno com curva padro de
positividade, linha verde representa o HIV, linha azul o HCV e linha vermelha a referncia passiva (ROX).

Fig.118: Grficos representativos de controle interno No OK. A - Anlise pelo Amplification Plot: tracejado
vermelho representa o controle interno que no sofreu amplificao. B Anlise pelo Multicomponent plot: linha
rosa representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha azul o HCV e linha vermelha a referncia
passiva (ROX), no se observa presena de curva.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

99
Reviso: 29/03/2012

B. Controles Negativos e Positivos


Nos controles negativos, h apenas a curva referente partcula calibradora. Se ocorrer
curvas referentes ao HIV ou HCV ultrapassando a linha do Threshold (Fig. 119), a rotina sair
como invlida no laudo (Fig.120).
A

B
.

Figura 119: Grficos representativos de controles negativos dentro do padro esperado. A- Anlise pelo
Amplification Plot: Curva referente a partcula calibradora. B- Anlise pelo Multicomponent Plot: linha rosa
representa o controle interno, linha azul o HCV e linha vermelha a referncia passiva (ROX).

B
.

Figura 120: Grficos representativos de controles negativos positivando. A- Anlise pelo Amplification Plot: A curva
verde ultrapassando a linha do threshold representa que houve amplificao para HIV. B- Anlise pelo
Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha azul o HCV, linha vermelha a referncia passiva
(ROX) e a linha verde representa o HIV. Nesta anlise, houve amplificao para HIV, presena de uma discreta
curva.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

100
Reviso: 29/03/2012

Nos controles positivos o Ct ideal para HIV e HCV de 24 ( 2.47) (Fig. 121). Qualquer
valor fora deste intervalo, mnimo de 21,53 e mximo de 26,47, a rotina sair como invlida no
laudo.
A

B
.

Fig. 121: Grficos representativos de controles positivos dentro do padro esperado. A- Anlise pelo
Amplification Plot: h duas curvas ultrapassando a linha do threshold referentes a HCV e HIV. B- Anlise pelo
Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha azul o HCV e
linha vermelha a referncia passiva (ROX), houve absoro elevada de fluorescncia tanto para HIV quanto para
HCV.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

101
Reviso: 29/03/2012

C. Perfis dentro do padro esperado


A amostra pode ser positiva caso a curva esteja ultrapassando a linha do threshold dentro
de um perfil esperado, tanto para HIV quanto para HCV (Fig 122 e 123).
A.

B
.

Fig. 56: Grficos representativos de amostras positivos para HCV. A- Anlise pelo Amplification Plot: A curva
referente ao HCV est ultrapassando a linha do threshold . B- Anlise pelo Multicomponent Plot: linha rosa
representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha vermelha, referncia passiva (ROX) e a linha
azul o HCV. Nesta anlise, observa-se absoro de fluorescncia mais alta para HCV apresentando uma curva
caracterstica de positividade.

A
.

B.

Fig.123: Grficos representativos de amostras positivos para HIV. A- Anlise pelo Amplification Plot: A curva
referente a HIV est ultrapassando a linha do threshold . B- Anlise pelo Multicomponent Plot: linha rosa
representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha vermelha referncia passiva (ROX) e a linha
azul o HCV. Nesta anlise, observa-se absoro de fluorescncia mais alta para HIV apresentando uma curva
caracterstica de positividade.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

102
Reviso: 29/03/2012

D. Perfis fora do padro esperado


Existem casos em que o perfil encontra-se fora do padro esperado.
- Ocasionado por poo vazio = sendo a causa possvel problemas na pipetagem nos
equipamentos ou presena de bolhas na placa (Fig.124).

B
.

A
.

Fig.124: Grficos representativos de poos da placa vazia ou presena de bolhas. A- Anlise do poo pelo
Amplification Plot: no h uma curva com perfil esperado ultrapassando a linha do threshold. B- Anlise pelo
Multicomponent Plot: No houve amplificao. C- Perfil da corrida pelo Amplification Plot: perfil fragmentado das
curvas que apresentando poos vazios.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

103
Reviso: 29/03/2012

- Por presena de backgrounds = pois ao analisar a curva pelo Amplification plot, a


mesma ultrapassa a linha do threshold. Entretanto, quando analisado pelo Multicomponent plot
pode-se observar que no houve uma curva satisfatria. (Fig. 125).
A
..

B
.

Figura 125: Grficos representativos de amostras com backgrounds para HIV e HCV. A- Anlise pelo Amplification
Plot: A curva referente a HCV est ultrapassando a linha do threshold fora do padro esperado. B- Anlise pelo
Multicomponent Plot: linha rosa representa o controle interno, linha verde representa o HIV, linha vermelha,
referncia passiva (ROX) e a linha azul o HCV. No houve absoro considervel de fluorescncia para HCV.

- Na figura 126, mostra o perfil de uma corrida de PCR ideal. Na figura 127, mostra um perfil de
curvas com background.

A.

Fig. 126: Viso do grfico no Amplification Plot apresentando curva ideal, ou seja, dentro do padro esperado
para o Kit NAT.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

104
Reviso: 29/03/2012

A.

B.

C.

Fig. 127: Grfico representativo de uma curva com background. A- Perfil de uma rotina apresentando uma curva
fora do padro esperado para o Kit NAT, viso no Amplification Plot: B- Anlise de uma amostra com background
pelo Amplification Plot: A curva referente ao HIV est ultrapassando a linha do threshold fora do perfil esperado.
C- Anlise pelo Multicomponent Plot: linha rosa representa a partcula calibradora, linha verde representa o HIV,
linha vermelha, referncia passiva (ROX) e a linha azul o HCV. No houve absoro considervel de
fluorescncia.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

105
Reviso: 29/03/2012

Conservao e Estocagem
Armazenamento do Kit
Visando otimizao dos resultados e a manuteno da qualidade do produto NAT, devese observar e armazenar os mdulos na temperatura adequada conforme descrio no rtulo.

- Mdulo de Controle: armazenar de -80C a -60C;


- Mdulo de Amplificao: armazenar -30C a -10C;
- Mdulo de Extrao: armazenar de 15C a 25C;

Estas temperaturas devero ser monitoradas, periodicamente, para garantir o timo grau
de eficincia do ensaio. O uso de instrumentos de medio de temperatura com calibrao,
atualizada, recomendvel.

Condies de Transporte
O transporte deve ser efetuado respeitando as condies ideais de temperatura, sendo
os mdulos controle e de amplificao transportados em gelo seco (-80C a -60C), mas
devero ser armazenados nas temperaturas indicadas, no rtulo externo, desde o ato do
recebimento at a utilizao do conjunto.
O transporte da embalagem final contendo o mdulo de extrao deve ser transportado
em bubina de gelo. Os mdulos de Amplificao e controle devem ser transportados em gelo
seco (-80C a -60C). Para controle de temperatura de transporte do Kit, enviado dentro da
caixa um termmetro (Tag), que acionado em Bio-Manguinhos e parado no ato do
recebimento no cliente.
Aps o recebimento, solicitamos que seja encaminhado a Bio-Manguinhos uma pesquisa
de satisfao de entrega, com informaes do recebimento dos Kits e acessrios.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

106
Reviso: 29/03/2012

Instruo de uso do Tag:


Assim que receber o kit, deve-se pressionar o boto Stop do monitor de temperatura de
3 a 5 segundos. Quando o visor estiver ntido, observar o crculo (STOP ICON) na parte
superior direita (conforme ilustrado na figura abaixo). Este crculo o indicativo de que o
procedimento foi executado corretamente.
Para efetuar a leitura, deve-se esperar at que o visor esteja visvel, em torno de dez
minutos. Esse tempo no deve exceder, pois a temperatura no permanece muito tempo
exposta no visor.
A temperatura do kit deve estar entre -80oC a -60 oC, conforme descrito em bula.
O visor do TAG deve estar apresentando o smbolo do SOL, na parte superior
esquerda. Este smbolo indica que o boto START foi acionado antes dos kits serem
transportados aos hemocentros.
Caso o smbolo do sino aparea no visor, isto um sinal de que em algum momento do
transporte houve uma variao na temperatura no kit.

Fig. 128: Imagem do visor do Tag de temperatura.

Caso o kit no chegue nas condies apropriadas ou tenha algum outro


problema, deve-se avisar imediatamente a DIACM (08000 - 210310).

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

107
Reviso: 29/03/2012

PROCEDIMENTOS DE MANUTENES
EQUIPAMENTO MDx
Devem ser realizados os seguintes procedimentos de manuteno para garantir uma
operao confivel da estao de trabalho BioRobot MDx:

Manuteno diria

Manuteno semanal

Manuteno mensal

Manuteno preventiva a cada 6 meses agendadas pela DIACM.

Os procedimentos de manuteno diria, semanal e mensal devero ser realizados pelo


usurio.
Para acessar as manutenes do equipamento MDx preciso:

Abrir o software QIAsoft MDx no computador do Rob.

Na barra de ferramentas clicar em: Environment

Selecionar: Maintenace (Fig.129).

Fig. 129: Imagem do software para seleo das manutenes.

Elaborado pela DIACM


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108
Reviso: 29/03/2012

Fig. 130: Imagem da janela Maintenance no software do MDx.

As colunas mostradas na aba New Maintenance (Novas Manutenes) (Fig. 130)


representam:
# - o nmero de colunas da tabela.
Date/Time a data e a hora em que o procedimento foi emitido pelo software.
Item o componente do BioRobot MDx que requer o procedimento de manuteno.
Task uma breve descrio dos procedimentos demanuteno.
Type a frequncia do procedimento (Dirio, Semanal, Mensal ou Bienal)
Operator esta coluna permanece vazia
Nesta aba encontram-se procedimentos de manutenes que esto pendentes e
precisam ser realizados.
Na aba Maintenance (Manutenes) se encontram os procedimentos dirios, semanais,
mensais e preventivas j realizadas.
Manutenes

Frequncia

Limpeza dos recipientes de lquidos

Dirio

Limpeza da estao Tip-Disposal (onde as Tips so dispensadas)


Limpeza da mesa de trabalho

Dirio

Limpeza da janela do leitor de cdigos de barras

Semanal

Manuteno do Sistema detector de lquido e sistema dispensador de alta velocidade


Limpeza do carrossel de reagentes

Semanal

Manuteno do sistema dilutor

Semanal

Limpeza do recipiente de lquido do sistema

Mensal

Limpeza do descarte do condensador

Mensal

Limpeza da mesa de trabalho

Mensal

Limpeza do Lab Hand

Mensal

Manuteno semestral (feita pela Qiagen)

Semestral

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

Dirio

Semanal

109
Reviso: 29/03/2012

Para a realizao de manutenes pendentes deve-se:


1. Clicar duas vezes sobre o item desejado e ler a caixa de dilogo que aparecer.
2. Aps executar o solicitado, clicar em YES para confirmar a realizao do procedimento de
manuteno (Fig. 131).

Fig. 131 Caixa de dilogo com instruo para a realizao das tarefas.

A seguir, o procedimento de manuteno passa da aba New Maintenance (Nova


Manuteno) para Maintenance (Manuteno).
Para visualizao do procedimento realizado, selecionar a aba Maintenance. Nesta, a
coluna Operador apresenta os nomes dos usurios que executaram os procedimentos.

O boto RUN no modo Executar fica amarelo se um procedimento de manuteno


precisar ser realizado. Este boto volta para sua cor original (Cinza), no momento em que
voc confirmar que este procedimento de manuteno foi realizado.

Elaborado pela DIACM


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110
Reviso: 29/03/2012

MANUTENES DIRIAS
Liquid containers cleaning Limpeza dos recipientes de lquidos
1. Esvaziar o recipiente de lquido do sistema (galo sob a estao de trabalho) e o frasco de
lquido do sistema (garrafa que fica no carrossel de reagentes). Ao abrir o recipiente de lquido
do sistema, desconectar primeiro a tubulao e depois remover a tampa.
Enxaguar o recipiente e o frasco completamente com gua deionizada/destilada e reabasteclos com nova gua deionizada/destilada. Aps reabastecer o recipiente de lquido do sistema
com gua deionizada/destilada, fechar primeiro a tampa e depois conectar a tubulao.
2. Executar o Flush System e o Flush Dispenser.
3. Esvaziar o sifo a vcuo (vacuum trap) e o descarte/lixo ( Waste Container).
4. Limpar e lavar os gales, os sifes e as tampas do vacuum trap e do Waste Container
com detergente e enxaguar com gua.

Tip-Disposal Station Cleaning Maintenace - Limpeza da estao de descarte das


ponteiras
1. Selecione Tool (Ferramenta)

Move Arm To (mover brao para) e selecione

Middle (Meio) ou Right (Direita) para mover o brao robtico para a posio adequada na
mesa de trabalho.
2. Borrifar toda a estao Tip-Disposal com desinfetante a base de etanol (ou lcool 70%) e
secar com papel toalha.
Worktable cleaning Maintenance Limpeza da mesa de trabalho
1. Selecione Tool (Ferramenta)

Move Arm To (mover brao para) e selecione

Left (Esquerda), Middle (Meio) ou Right (Direita) para mover o brao robtico para a
posio adequada na mesa de trabalho.
2. Limpar com gaze umedecida em lcool 70%, toda a mesa de trabalho. Certifique-se que ao
final do procedimento toda a mesa de trabalho estar limpa e seca.

Elaborado pela DIACM


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111
Reviso: 29/03/2012

MANUTENES SEMANAIS
Bar Code Reader Windows Cleaning Maintenence Limpeza da janela do leitor de
cdigos de barra
1. Inspecionar a janela do leitor do cdigo de barra do:
Sistema de localizao da amostra
Sistema de localizao da placa da Qiagen (porttil e interno)
Sistema de localizao de tampo
2. Se a janela estiver suja, limpar a superfcie gentilmente com gaze seca.

High-Dispensing System and Liquid Detectors Maintenance - Manuteno do


Sistema de detector de lquido e sistema dispensador de alta velocidade
1. Limpar a superfcie do cabeote dispensador com gaze embebida em lcool 70%.
2. Faa um Flush Dispenser. Segure o Dispensador de Alta Velocidade e observe se o fluxo
de gua est saindo constante pelos 8 capilares. Se o fluxo de gua no estiver constante,
checar se os capilares de vidro esto quebrados. Entre em contato com a Assistncia Tcnica
QIAGEN.
3. Calibrar a alta velocidade de distribuio do sistema e verificao de deteco de lquidos:
Na tela inicial do software selecionar na janela de tarefas o Protocolo de Manuteno I V3.0,
seta vermelha (Fig. 132).
Clicar em Run.

Fig. 132 imagem do software para seleo do protocolo de manuteno.

Elaborado pela DIACM


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112
Reviso: 29/03/2012

Um assistente aparece e fornece as instrues necessrias, emitindo as telas abaixo:

Fig. 133 Tela com explicaes sobre a funo do protocolo

Fig. 136 Tela com instrues dos procedimentos. Cdigos de barras da rack 015.

Elaborado pela DIACM


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113
Reviso: 29/03/2012

Ostras telas aparecero como guia de montagem. Deve-se seguir o comando indicada
nas janelas de dilogo de cada tela exibida no software.
Ao final do procedimento ser indicado se o protocolo passou ou falhou (Fig. 137). Se
passar, seguir com as orientaes de limpeza indicada pelo software. Se falhar, repetir o
procedimento totalizando trs vezes e enviar os arquivos gerados para Bio-Manguinhos.

Fig. 137 Tela indicando o status do resultado do protocolo.

A tela final do protocolo, aps a limpeza da mesa, indica o diretrio onde os arquivos
gerados foram gravados no computador (Fig.138).

Fig.138: Tela final indicando o diretrio dos arquivos gerados.

Elaborado pela DIACM


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114
Reviso: 29/03/2012

Reagent Carousel Cleaning Maintenance Limpeza o carrossel de reagentes


1. Abrir a porta da torre tcnica e retirar todos os frascos do carrossel de reagentes.
Inspecionar a superfcie interna para presena de lquido espirrado. Se espirros estiverem
presentes:
2. Retirar o carrossel de reagentes e limpar os respingos.
3. Borrifar cuidadosamente o desinfetante base de etanol (ou lcool 70%) sobre as
superfcies interna e externa do carrossel de reagentes. Garantir que o desinfetante (ou lcool
70%) cubra todas as partes do carrossel de reagentes.
4. Enxaguar com gua deionizada/destilada.
5. Retirar o excesso de gua e secar com papel toalha.
6. Retornar o carrossel de reagentes para a torre tcnica.
MANUTENES MENSAIS

System Liquid Container Cleaning Maintenance Limpeza do recipiente de


lquido do sistema

1. Desconectar a tubulao da tampa do recipiente do lquido do sistema. A seguir


desenroscar e remover a tampa. Retirar o frasco do lquido do sistema do carrossel de
reagentes.
2. Esvaziar o recipiente e o frasco do lquido do sistema.
3. Limpar o recipiente e o frasco com um detergente potente de acordo com as instrues do
fabricante.
4. Enxaguar o recipiente e o frasco 3 vezes com gua da torneira para remover qualquer trao
de detergente. Repetir usando gua deionizada/destilada.
5. Limpar a superfcie interna da tampa e da tubulao com um papel toalha umedecido com
detergente diludo.
6. Enxaguar 3 vezes a tampa e a tubulao com gua da torneira para retirar todos os traos
de detergente. Repetir usando gua deionizada/destilada.
7. Reabastecer o recipiente e o frasco do lquido do sistema com gua deionizada/destilada.
8. Fechar com a tampa do recipiente e reconectar a tubulao tampa. Retornar o frasco ao
carrossel de reagentes.
9. Realizar Flush System e Flush Dispenser.

Elaborado pela DIACM


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115
Reviso: 29/03/2012

Worktable Cleaning Maintenance Limpeza da mesa de trabalho

1. Selecione Tool (Ferramenta)

Move Arm To (mover brao para) e selecione Left

(Esquerda), Middle (Meio) ou Right (Direita) para mover o brao robtico para a posio
adequada na mesa de trabalho.
2. Retire todos os objetos removveis da mesa de trabalho. Alm disso, retirar a estao para

descarte de ponteiras:

Desparafusar a porca que prende a estao para descarte de ponteiras

Levantar a estao para descarte de ponteiras. No remover a base do coletor a vcuo


da mesa de trabalho.

3. Desinfetar os objetos retirados submergindo-os em desinfetante.


4. A seguir, enxaguar 3 vezes os objetos com gua da torneira para remover qualquer trao
de desinfetante. Repetir usando gua deionizada/destilada.
5. Retirar todo excesso de lquido e secar com papel toalha.
6. Devolver os objetos para a mesa de trabalho.
Robotic Handling System Cleaning Maintenance Limpeza do Lab Hand
1. Limpar cuidadosamente as 2 hastes das garras do sistema de manipulao robtica com
um pano livre de desprendimento de fibras ou com leno umedecido com desinfetante base
de etanol. (ou lcool 70%)
2. Limpar as garras com um pano macio umedecido com gua. A seguir retirar todo o excesso
de lquido e secar com papel toalha.

MANUTENES SEMESTRAIS

Biannual Maintenance Procedure Manuteno semestral

Uma janela aparece a cada 6 meses informando que a manuteno preventiva est para
vencer. O procedimento de manuteno preventiva deve ser realizado por um Especialista
da Assistncia Tcnica QIAGEN.

Caso haja suspeita de contaminao no equipamento MDx, favor entrar em contato


com o atendimento ao cliente de Bio-Manguinhos no telefone: 08000 - 210 310.

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

EQUIPAMENTO ABI 7500


De acordo com o manual do equipamento de PCR em tempo real, ABI 7500, devero ser
feitas as seguintes calibraes:

Mensal Background

Semestral ROI e pure dyes.


Calibrao do ABI 7500

A calibrao do equipamento ABI 7500 dever consistir nesta ordem: ROI > Background >
Optical > Dyes (ROX, FAM, VIC, Dye 3).
Retirar a caixa contendo todas as placas de calibrao que sero usadas do freezer e
deixar a temperatura ambiente para descongelar

A) Calibrao ROI:

- Certifique-se que a placa esteja descongelada.


* No retirar a placa da caixa at iniciar a corrida devido a sua fotossensibilidade. No jogar
fora o pacote e a placa, pois elas sero utilizadas mais vezes.

- Remover a placa ROI do envelope metlico.


Se a placa apresentar bolhas, realizar o mesmo procedimento durante a rotina para
remoo de bolhas. Ver se o lquido est homogneo em toda a placa (ou seja, ver se a
quantidade de lquidos est igual para todos os poos, e verificar tambm se o lquido
encontra-se no fundo do poo. Caso no esteja, repetir este procedimento.

- Colocar a placa ROI no equipamento.


1. No software ABI 7500, selecionar a opo Instrument > Instrument Maintenace
Manager, seta vermelha (Fig. 139):

Fig. 139: imagem do software 7500.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

2. Na tela de calibrao, selecionar o cone amarelo, esquerda, escrito ROI.


Selecionar START CALIBRATION.
3. Na caixa de dilogo Setup, selecionar a opo NEXT at aparecer janela do
RUN.
4. Na caixa de dilogo Run, selecionar a opo START RUN.
5. Aparecer uma caixa de dilogo de anlise informando o status da calibrao, se
passou (passed) ou no (failed).
6. Retirar a placa do equipamento. Coloc-la dentro do envelope metlico e na caixa.

No preciso guardar, nesse momento, a placa novamente no freezer, pois a


mesma ser utilizada na calibrao ptica.

B) Calibrao Background

- Certifique-se que a placa esteja descongelada.


- Executar o mesmo procedimento relatado acima para a calibrao da placa ROI
1. Na tela de calibrao, selecionar o cone amarelo a esquerda escrito Background.
Selecionar START CALIBRATION.
2. Na caixa de dilogo Set up, selecionar a opo NEXT at aparecer a janela do
RUN.
3. Na caixa de dilogo do Run, selecionar a opo START RUN.
4. Aparecer uma caixa de dilogo de anlise (analysis) informando o status da
calibrao, se passou (passed) ou no (failed).

C) Calibrao ptica

- Certifique-se que a placa esteja descongelada.


- Executar o mesmo procedimento relatado acima para as outras calibraes.
1. Na tela do Optical do Instrument Maintenace Manager, selecionar a opo START
CALIBRATION.

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

2. Na caixa de dilogo Set up, selecionar a opo NEXT at aparecer a janela do


RUN.
3. Na caixa de dilogo do Run, selecionar a opo START RUN. E em seguida NEXT
4. Aparecer uma caixa de dilogo de anlise (analysis) informando o status da
calibrao, se passou (passed) ou no (failed).
5. Remover placa ROI do equipamento. Coloc-la na caixa e armazen-la no freezer.

D) Calibrao do Dye

- Certifique-se que a placa esteja descongelada.


* As placas que sero utilizadas sero a da ROX, FAM, VIC e TAMRA. No retirar a placa da
caixa at iniciar a corrida devido a sua fotossensibilidade. No jogar fora o pacote e a placa,
pois elas sero utilizadas mais vezes.
1. Na tela de calibrao, selecionar o cone amarelo a esquerda escrito Dye. Selecionar
START CALIBRATION.
2. Clicar em START CALIBRATION. Aparecer 4 janelas.
3. A primeira janela a do Overview pede para selecionar os Dye que deseja calibrar
(ROX>FAM>VIC).
4. Na segunda janela, a de SET UP, selecionar NEXT at aparecer janela do RUN.

* No momento em que o software solicitar cada placa de Dye, preparar e carregar as placas
da seguinte forma:
- Executar o mesmo procedimento relatado acima para as outras calibraes.

Verificar se a placa da Dye condiz com o Dye que esta sendo pedido pelo
software.
5. Na janela do Run selecionar a opo START RUN, e em seguida NEXT.
6. Aparecer uma caixa de dilogo de anlise (analysis) informando o status da calibrao,
se passou (passed) ou no (failed).
7. Clicar em NEXT.
8. Clicar em FINISH
9. Preparar e correr a prxima placa que o software pedir.
Elaborado pela DIACM
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Reviso: 29/03/2012

E) Calibrao do DYE 3
Selecionar na lateral esquerda DYE (seta vermelha), Custom Dye Calibration (retngulo
laranja) e Start Calibration (seta laranja).

Fig. 140: Tela para calibrao

Na Figura 141 no campo 2. Select a dye or create a new dye (retngulo vermelho),
selecionar New Dye e digitar DYE 3 ( necessrio digitar exatamente dessa forma: letras
maisculas e espao entre a palavra e o nmero).
No campo 6, marcar o quadrado (retngulo azul). Essa ao habilitar a opo Next
(retngulo verde). Selecionar Next at aparecer Start Run (estar escrito num retngulo
verde, no canto superior esquerdo).

Elaborado pela DIACM


Aprovado por Linda Khalili Boukai

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Reviso: 29/03/2012

Fig. 141: Tela para calibrao de Dye customizado.

Esta calibrao realizada com a placa de TAMRA, pois as sondas possuem o mesmo
comprimento de ondas.

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

BACKUP DOS EQUIPAMENTOS


Devido ao grande nmero de arquivos que so gerados nas rotinas, os computadores
dos equipamentos, podem apresentar lentido impactando no bom funcionamento dos
mesmos. Por isso recomendado fazer backup dos arquivos:

BACKUP JANUS:
Os arquivos que podem sofrer backup no computador do Janus so:
Atualmente os arquivos .csv que podem ser apagados na pasta Bin so:
BCMap_(id da corrida)_Scan1
BCMap_(id da corrida)_Scan2
BCMap_(id da corrida)_Scan3
BCMap_(id da corrida)_Scan4

BCOutput_(id da corrida)_Scan1
BCOutput_(id da corrida)_Scan2
BCOutput_(id da corrida)_Scan3
BCOutput_(id da corrida)_Scan4

CalibrationReagent (id da corrida)_WellMap1

Extract1
Extract2

PlateTransfer_(id da corrida)_WellMap

PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap1
PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap2
PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap3
PoolingTransfer_(id da corrida)_WellMap4

Test_numero do dataset_rpt

A pasta Bin encontra-se: Meu computador> C:\ > Packard > Janus > Bin

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

BACKUP ABI 7500:


Fazer uma cpia (CD ou DVD) da pasta onde os arquivos em extenso EDS so salvos
ao final da corrida. Normalmente essa pasta denominada NAT e est na rea de trabalho
(Desktop) do Windows.
Aps a cpia, todos os arquivos podem ser apagados de dentro dessa pasta.
Executar a limpeza do disco: Iniciar > Programas > Acessrios > Ferramentas do
Sistema > Limpeza de disco (disk cleanup)
Executar a desfragmentao de disco: Iniciar > Programas > Acessrios >
Ferramentas do Sistema > Desfragmentador de disco (Selecionar o drive C:/)

BACKUP MDx:
Fazer uma cpia (CD ou DVD) da pasta USER DATA que se encontra:
Meu Computador (My Computer) > C:\ > Arquivos de Programa (Program Files) >
QIAsoft MDx > User Data .
Nesta pasta esto os relatrios de execuo, os arquivos de log, os relatrios de
manuteno e tambm os relatrios de protocolos de servio realizado pelos engenheiros.
Aps a cpia, todos os arquivos podem ser apagados de dentro dessa pasta.
Executar a limpeza do disco: Iniciar > Programas > Acessrios > Ferramentas do
Sistema > Limpeza de disco (disk cleanup)
Executar a desfragmentao de disco: Iniciar > Programas > Acessrios >
Ferramentas do Sistema > Desfragmentador de disco (Selecionar o drive C:/)

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Reviso: 29/03/2012

ENVIO DE ARQUIVOS PARA A DIACM


Problemas no MDx:
Quando ocorrer uma falha no MDx ser pedido o envio de 3 arquivos com as seguintes
extenses: rtf, pcl, msl. Esses arquivos so encontrados no seguinte caminho:

Meu Computador > C:\ > Arquivos de Programa (Program Files) > QIAsoft MDx > User
Data > Log Files

Dentro da pasta Log Files esto os 3 arquivos da corrida que precisam ser enviados.
Procurar pela data da corrida.
Se for pedido para correr algum protocolo de manuteno, os arquivos precisaro ser
enviados. Eles so encontrados no seguinte caminho:

Meu Computador > C:\ > Arquivos de Programa (Program Files) > QIAsoft MDx > User
Data

Dentro da pasta User Data, esto os arquivos da manuteno. Cada manuteno


efetuada gera 3 arquivos: 2 com extenso csv e 1 com extenso rtf. Procurar pela data que foi
executada a manuteno.

Problema na consolidao no Janus :


Ser pedido o envio dos seguintes arquivos:
1 Arquivos do MDx: Sero enviados 2 arquivos com a extenso csv e rtf. Eles so
encontrados no seguinte caminho no computador do Janus:

Meu Computador > C:\ > Qiagen


2 Arquivo do ABI: Ser enviado 1 arquivo com a extenso txt. Ele encontrado no seguinte
caminho no computador do Janus:

Meu Computador > C:\ > ABI File

Elaborado pela DIACM


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124
Reviso: 29/03/2012

3 Arquivos do Janus: Sero enviados todos os arquivos com a data correspondente a rotina
rodada. Os mesmos so encontrados no caminho no computador do Janus:

Meu Computador > C:\ >Packard > Janus > Bin


4 Se for necessrio, ser pedido o envio do arquivo FioCruz MetaData. O mesmo
encontrado no caminho no computador do Janus:

Meu Computador > C:\ >Packard > Janus > Integration

Para o envio dos relatrios de cada corrida efetuada, enviar os seguintes arquivos:
1 Arquivo Word com o relatrio da corrida
2 Arquivo eds que se encontra dentro do computador do ABI 7500
3 Arquivo PDF do laudo da rotina, que se encontra no seguinte caminho:

Meu Computador > C:\ > Nat Laudo > ArqJanus

Os arquivos devem ser enviados para o e-mail: nat@bio.fiocruz.br

SALVAR TODOS ESSES ARQUIVOS EM CD. NUNCA UTILIZAR PENDRIVE !

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

MENSAGENS DE ERROS DOS EQUIPAMENTOS:


Os equipamentos fornecem mensagens de erros quando ocorrem problemas. A grande
maioria dessas mensagens aparece em ingls. Para facilitar o entendimento das mesmas,
segue abaixo os principais erros dos equipamentos com suas respectivas tradues.

Mensagens de Erros no Janus:


ERRO: Liquid Handling Error
Liquid not detected in tip X.
O erro de deteco de lquido ocorre toda a vez que o volume a ser aspirado pelo
equipamento em uma amostra ou reagente no suficiente para finalizar a operao. Para
prevenir esse erro, deve-se verificar se o volume das amostras suficiente para a pipetagem.
Caso haja alguma amostra com volume fora do padro esperado, aparecer uma tela de erro,
indicando a agulha (tip) em que a deteco ocorreu e as opes para melhor gerenciamento
do mesmo:
Abort: Para a rotina no momento do erro;
Retry: A checagem do erro realizada novamente;
Ignore: O erro ignorado e a aspirao realizada sem a deteco do lquido;
Skip Sample: A amostra ignorada a partir de ento para todos os processos seguintes.
Go to Bottom: A pipetagem realizada do fundo do tubo ou frasco, sem a deteco do
lquido.
O que deve ser feito?
-Tubo contendo gel (Tubos primrios): clicar em Retry e aumentar o volume de
amostra no tubo.
- Tubo no contendo gel (Tubos secundrios e frascos): clicar em Go to Bottom.

Fig. 142: Tela com a mensagem de Erro.

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

ERRO : Dilutor Module Error


Move error on tip: X
O erro de movimento geralmente ocorre por algum elemento que evitou que a agulha
realizasse o seu movimento completo. Clicar em Yes e analisar a causa do problema.
Corrigido o problema, clicar em OK, na prxima janela.

Fig.143: Tela com a mensagem de Erro

ERRO: System liquid empty


Refil bottle and press Continue to resume test
Esse tipo de erro ocorre por dois motivos:

- Falta de gua no galo: verificar se no h bolhas no sistema de mangueiras, se a resposta


for positiva, o ensaio pode estar prejudicado e a melhor soluo encher o galo de gua e
realizar outro teste. Se negativa, encher o galo de gua, e clicar em Continue.
- Mal contato: Ao reconectar o cabo de deteco do nvel de gua do galo, ele pode voltar
com mal contato. Dessa forma ao iniciar um procedimento, esta mensagem pode ocorrer.
Checar o nvel da gua e, caso esteja na altura que permita a realizao do ensaio, clique
Ignore.

Fig.144: Tela com a mensagem de Erro

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

O preenchimento do galo com a rotina em andamento pode acarretar na


formao de bolhas dentro do galo de gua e do sistema de alimentao.
Dessa forma as bolhas de ar so transferidas para o sistema de pipetagem,
interferindo na qualidade do ensaio.
ERRO 2: Liquid Handling Error
Liquid not detected in tip X.
Este tipo de erro ocorre quando a agulha afunda no gel do soro, mesmo que o volume
das amostras seja suficiente.
* A tela de erro a mesma do Liquid Handling Error:

Fig.145: Tela com a mensagem de Erro

Nesse caso deve-se seguir o seguinte procedimento:


1. Clicar em Retry
2. Verifica o tubo se realmente havia material, caso no tenha, troc-lo. Se tiver, transferir
o soro para um tubo de plstico novo e coloc-lo na posio da amostra removida.
3. Limpar a agulha com gaze embebida em lcool isoproplico.
4. Clicar em Ok.

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

Cuidados bsicos para a preveno de


ERROS no Janus:

Observe o volume dos reagentes e das amostras;

Centrifugue as amostras adequadamente;

Colagem correta das etiquetas dos tubos secundrios (colar em cima do valor de 2 mL
no tubo);

Verifique sempre se a etiqueta com o cdigo de barras est voltada para a janela das
racks;

Qualidade das etiquetas;

Volume de gua no galo do Janus;

Verificar o posicionamento da mangueira dentro do galo de lquidos, para que esta


no empurre para baixo o sensor de deteco de lquido (pea azul);

Verificao de bolhas nos microtubos da partcula calibradora, aps mixagem, pois elas
atrapalham o sensor de lquido, fazendo-o entender como nvel de aspirao o contato
com a bolha;

Verificao da altura dos tubos primrios e secundrios;

Posicionamento correto dos reagentes, placas, frascos, principalmente no

suporte do

controle de temperatura (INHECO) e das racks (qualquer dvida basta colocar a seta
do mouse sobre a mesma);

Checagem das ponteiras.

Ao realizar a releitura de cdigos de barras, seja cauteloso, pois em caso de


duplicidade de valores de cdigos de barras em tubos secundrios, sua rotina
ser invalidada.

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

Cdigos de ERROS BioRobot MDx :

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

Cuidados bsicos para a preveno de ERROS no MDx:

Colagem correta das etiquetas dos tubos secundrios (colar em cima do valor de 2 mL
no tubo);

Qualidade e integridade das etiquetas dos tubos secundrios;

Verifique sempre se o cdigo de barras est virado para a janela esquerda das racks.

Cheque a integridade do vidro do condensador;

Certifique-se de que as mangueiras esto bem conectadas e que no h tores ou


dobramentos das mesmas;

Cheque o posicionamento das etiquetas dos gales para que nenhuma etiqueta cubra
o sensor, impedindo deteco de lquido;

Cheque se os gales e sensores esto secos e limpos;

Verifique a mesa de trabalho para se assegurar de que todas as peas removveis (ex:
peas do sistema de vcuo, suporte da protease) esto corretamente encaixadas;

Verifique a bandeja das ponteiras, se est completamente encaixada;

Dentro da torre tcnica, certifique-se que os cdigos de barras dos rtulos dos
reagentes estejam virados para a janela do carrossel para que seja possvel a leitura
dos mesmos;

Ao preparar as racks, lembre-se que as quatro primeiras posies so destinadas aos


controles: negativo nas posies 1 e 2 e positivo nas posies 3 e 4 da primeira rack.

Elaborado pela DIACM


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Reviso: 29/03/2012

Mensagem de erro do ABI 7500 :


Quando o equipamento ABI 7500 no consegue se comunicar com o computador a
seguinte mensagem no desaparecer, mesmo clicando em Retry

Fig. 146: Tela com a mensagem de Erro

Desligar o computador e o equipamento. Ligar novamente.

Verificar o cabo de conexo entre o computador e o equipamento (verificar se est bem


encaixado)

Retirar e reconectar o cabo no equipamento.

Trocar a porta USB onde o cabo est conectado no computador.

Chamar a equipe de TI do hemocentro para verificar se h algum problema com a


conexo de cabos.

Se todas as conexes estiverem Ok, restaurar o Windows para o ltimo dia em que o
equipamento funcionou corretamente. Para isso entrar no caminho: INICIAR>
PROGRAMAS> ACESSRIOS> FERRAMENTAS DO SISTEMA> RESTAURAO
DO SISTEMA.

Cuidados bsicos para a preveno de ERROS no ABI 7500:


Aps o trmino da PCR setup a placa deve ser corretamente selada com membrana
ptica, que deve estar ntegra e sem amassados. O usurio deve certificar-se tambm da
vedao de todos os poos;
Ao trmino do preparo da placa, deve-se verificar a presena de bolhas nas amostras.
Se houver bolhas no fundo dos poos, remov-las com a centrifugao manual;
Ao inserir a placa no equipamento, verifique se a posio A1 est voltada para o canto
superior esquerdo;

Aps o trmino da PCR, ao analisar a rotina, certifique-se de que toda a placa esteja
selecionada.

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Reviso: 29/03/2012

DESCONTAMINAO
Ambiente
1. Limpar as pipetas com lcool 70% e se necessrio com hipoclorito
2. Limpar as bancadas com lcool 70% e se necessrio com hipoclorito
3. Trocar as luvas antes de pipetar os controles negativos e positivos do kit NAT.
4. Possuir preferencialmente duas pipetas, uma para pipetar os controles negativos e a outra
o positivo, caso no possua, pipetar os controles negativos primeiro e posteriormente os
controles positivos.
5. Limpar com lcool 70% suporte de transporte da placa de PCR.
6. Diminuir o fluxo de entrada e sada na sala de PCR.

Janus
1. Limpar as agulhas com lcool 70%.
2. Limpar com lcool 70% o suporte preto da placa de PCR que fica na mesa de trabalho.

MDx
1. Realizar diversas vezes Flush and Wash.
2. Fazer a limpeza com etanol 70% na mesa de trabalho do MDx.
3. Desinfetar a bacia onde as peas do MDx so colocadas de molho.
4. Limpar a pea extensora do MDx.
5. Se necessrio, limpar a pea extensora do MDx com Hipoclorito (1:1. Ex.: 50mL de
hipoclorito para 50 mL de gua deionizada) por 15 minutos. Posteriormente, lavar bastante em
gua corrente e colocar a pea de molho no detergente fornecido por Bio-Manguinhos.
6. Se necessrio, aumentar a concentrao do detergente que colocado na bacia de
lavagem. Para cada 3 litros de gua pode ser usado 5 mL de detergente.
7. No caso de contaminao do local, as tips que sobram no MDx devem ser descartadas e a
cada rotina, utilizar somente tips novas. Seguir esse procedimento at resolver o problema de
contaminao.
8. Se o problema persistir, por favor, entrar em contato com o atendimento ao cliente de BioManguinhos (08000-210 310)

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Reviso: 29/03/2012

ABI
Caso durante a calibrao background seja observado algum poo com suposta
contaminao, seguir o seguinte procedimento:
1. Desligar o equipamento;
2. Abrir a tampa do equipamento;
3. Levantar o pino e empurrar a frente, expondo assim o bloco;
4. Limpar o poo contaminado com gua (com uma pipetada calibrada, dispensar 200 L de
gua, aspirar e dispensar e aspirar novamente e secar com um papel que no solte pelos o
poo);
5. Colocar novamente a placa background, caso o poo ainda esteja contaminado, dispensar
e aspirar 200 L de lcool e repetir o passo 4 com gua, certifique-se que o poo esteja
completamente seco;
6. Colocar novamente a placa background, caso o poo ainda esteja contaminado, dispensar
e aspirar 200 L de hipoclorito 2%, e repetir o passo 5 e o 4 com gua, certifique-se que o
poo esteja completamente seco;
7. Caso a contaminao persista, favor entrar em contato com o suporte de Bio-Manguinhos
(08000-210 310).

Cuidados adicionais para os hemocentros no uso da plataforma NAT


Visando melhor utilizao do Kit e da Plataforma NAT HIV/HCV de Bio-Manguinhos,
recomendamos a realizao de alguns procedimentos e orientamos seguir as sugestes
abaixo que podero aperfeioar o desempenho do Produto e da plataforma:
1 Controle do acesso ao laboratrio
importante que somente a equipe tcnica capacitada para processar o Kit NAT
HIV/HCV e outros colaboradores autorizados pela chefia do laboratrio tenham acesso sala
de testes, evitando, assim, possveis riscos de contaminao de amostra/rotina e a
manipulao equivocada dos equipamentos.
2 Organizaes gerais do laboratrio
a) imprescindvel que a sala onde o teste realizado esteja completamente livre de
caixas, sacos plsticos e qualquer outro material que possam acumular poeira e
sujeira;

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Reviso: 29/03/2012

b) Recomendamos que no sejam colados papis nas paredes e bancadas. Neste


sentido, deve-se manter o menor volume possvel de papis no interior do laboratrio;
c) Os materiais como insumos ou acessrios devem ser guardados no interior de
armrios, quando possvel , ou estocados fora do laboratrio;
d) A limpeza de superfcies, bancadas e equipamentos deve ser realizada antes e depois
de cada rotina de processamento de amostras;
e) O lixo deve ser recolhido diariamente.
3 Instalao e utilizao de lmpadas UV na rotina
A fim de prevenir contaminaes ambientais, recomendamos enfaticamente a instalao
de lmpadas UV na sala dos equipamentos Janus e MDx, bem como na sala do ABI 7500.
Para uma desinfeco eficiente de ambiente, os seguintes fatores so importantes: tempo de
exposio, o tamanho da sala e a posio da lmpada.

a) O tempo de 30 minutos para exposio costuma ser suficiente para uma desinfeco
eficaz. Como a exposio prolongada luz UV prejudicial sade, deve-se garantir
que as salas no sejam usadas durante os perodos de desinfeco. Recomenda-se a
colocao de avisos e o trancamento das salas durante o perodo de uso da luz UV;
b) Recomendamos que a cada 5,7 m2 de sala seja efetuada a instalao de uma lmpada
UV;
c) A distncia recomendada para ambientes de at 2,44 m (8 ps) da lmpada at a
superfcie alvo.

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Reviso: 29/03/2012

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
- Ascher, M. S. & Wilber, J. C. Immunofluorescence for Serodiagnosis of Retrovirus Infection.
Arch.Pathol.Lab.Med. 114: 246-248, 1990.
- BioManguinhos BioRobot MDx User Manual_v1.1_7/10
- Farah, S.B. DNA, Segredos e Mistrios. 2 ed. So Paulo, Sarvier, 2007
- Gallo, D.; Hoffman, M. N.; Yeh, E.T.; George, J. G. & Hanson, C. V. Comparison of
Indirect Immunofl uorescence and Membrane Fluorescence Assays for the Diferentiation of
Antibodies to Human Immunodeficiency Virus Types 1 and 2 J. Clin. Microbiol. 30: 2275-2278,
1992.
- Manual de Instrues NAT LATED. Verso setembro 2010.
- Rossetti, Ma L. Doenas Infecciosas Diagnstico Molecular 1 edio. Ed Guanabara
Koogan; 2005.
- Sandstrom, E. G.; Schooley, R. T.; Ho, D. D.; Byington, R.; Sarngadharan, M. G.;
MacLaren, M. E.; Essex, E.; Gallo, R. C. & Hirsch, M. S. Detection of Human anti-HTLV-III
Antibodies by Indirect Immunofluorescence Using Fixed Cells. Transfusion, 25/41: 308-12,
1986.
- Sullivan, M. T.; Mucke, H.; Kadey, S. D.; Fang, C. T. & Williams, A. E. Evaluation od an
Indirect Immunofl uorescence Assay for Confi rmation of Human Immunodeficiency Virus Type
1 Antibody in U.S. Blood Donor Sera. J. Clin. Microbiol., 30: 2509-2510, 1992.

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