PROGRAMAÇÃO AULAS PRÁTICAS BIOQUÍMICA GERAL –

ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Prof. Lívia Bracht

Dia Aula Página

Aula prática 1: Curva de titulação
28/08/2015 3
da alanina
04/09/2015 Aula prática 2: Fotometria 4
Aula prática 3: Determinação da
11/09/2015 concentração de proteínas pelo 13
método de Biureto
Aula prática 4: Extração,
25/09/2015 caracterização e dosagem da 14
caseína
Aula prática 5: Cinética da
02/10/2015 16
invertase de leveduras
Aula prática 6: Hidrólise
09/10/2015 18
enzimática do amido
Aula prática 7: Glicólise e
06/11/2015 19
fermentação em leveduras
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NORMAS RECOMENDÁVEIS AO LABORATÓRIO

O uso de guarda-pó.
Desligar o celular.
Não fumar no laboratório.
Ler o roteiro das práticas com antecedência para melhor aproveitamento das
aulas.
Realizar somente os experimentos indicados na sala.
Todo material referente à aula prática é de responsabilidade da equipe que o
utilizar. Qualquer incidente com este material deve ser comunicado ao
professor.
Qualquer incidente como: derramamento de reagentes sobre a pele, ingestão
dos mesmos durante a pipetagem, lavar a região com bastante água, não esfregar
a área afetada. Comunicar o professor imediatamente.
Não jogar fora o material que julgar inutilizado, pois o mesmo poderá ser
recuperado.

PRINCÍPIOS GERAIS DE TÉCNICA

Usar sempre uma pipeta para cada reagente, evitando contaminação dos
mesmos.
Não trocar as rolhas e tampas dos frascos de reativos.
Ler atentamente o rótulo dos frascos de reativos antes de utilizá-los.
Não abandonar o laboratório durante o desenvolvimento de uma reação.
Ao acender o bico de gás, sempre acender a chama antes de abrir a torneira
do mesmo.
Não trabalhar com substâncias inflamáveis (álcool, éter, clorofórmio, etc...)
nas proximidades de uma chama.
Os reagentes tóxicos ou corrosivos, como álcalis ou ácidos fortes e
concentrados não deverão ser pipetados com a boca, caso não tenha pêra, ou
pipetador automático, utilize cilindros graduados ou buretas.
Após o uso de gás ou água, sempre fechar as torneiras.
Ao desprezar na pia os produtos das reações, sempre fazer com descarga de
água, para evitar corrosão dos encanamentos.
Não jogar na pia papéis de filtro usados nas reações ou substâncias sólidas
que obstruam os encanamentos.
Os equipamentos só deverão ser manipulados após a instrução de como usá-
los.
Ao término da aula, realizar a limpeza da área de trabalho e lavar o material
utilizado ou depositá-los em cubas próprias.
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AULA PRÁTICA BIOQUÍMICA GERAL - 1

CURVA DE TITULAÇÃO DA ALANINA

Reagentes
Solução de alanina 0,02 M
Ácido clorídrico 1 M
Hidróxido de sódio 0,1 M

Materiais
1 Béquer pequeno de 20 ou 50 mL
1 proveta de 50 mL
Pipetas automáticas de 1 mL
Ponteiras para pipeta automática
Papel absorvente
Barra magnética
Pissete com água destilada

Equipamentos
pHmetro
Agitador magnético

Procedimento

1) Calibre cuidadosamente o medidor de pH, utilizando as soluções-tampão pH 4,0

e pH 7,0.
2) Após calibração lave cuidadosamente o eletrodo com água destilada e seque
com papel absorvente.
3) Utilizando a proveta, coloque 20 mL da solução de alanina no béquer
4) Coloque a barra magnética, deposite o béquer sobre o agitador magnético,
mergulhe o eletrodo no líquido e comece a agitação (CUIDADO: comece a
devagar! O béquer deve estar posicionado bem no centro do agitador para evitar
que a barra magnética quebre o eletrodo).
5) Leia o pH inicial e tome nota.
6) Mantendo a agitação, adicione 1,0 mL de HCl 1 M; após a estabilização, leia o
pH e tome nota, anotando-o na primeira linha do quadro abaixo.
7) Adicionar a esta mesma solução em agitação 0,5 mL de NaOH 0,1 M.
8) Espere a estabilização e tome nota da medida do pH.
9) Repita o procedimento anterior (itens 7 e 8), sempre anotando o pH resultante
até que este atinja valores de aproximadamente 12.
10) Faça um gráfico, colocando os valores de pH na ordenada (eixo y) e a
quantidade acumulada de NaOH na abscissa (eixo x).
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AULA PRÁTICA BIOQUÍMICA GERAL – 2

FOTOMETRIA

1. Aspectos gerais

A fotometria clássica é, sem dúvida, um dos maiores trunfos de que

dispõe o laboratório na atualidade. Esta técnica de medida, continuamente
aperfeiçoada, ainda permanecerá durante longo tempo sendo um dos mais úteis
instrumentos de medida. Com esta técnica, compostos desconhecidos podem ser
identificados por seus espectros característicos ao ultravioleta, visível ou
infravermelho. As concentrações de soluções de compostos conhecidos podem ser
determinadas, medindo-se a absorção de luz em um ou mais comprimentos de onda.
Reações enzimáticas podem ser freqüentemente seguidas, medindo-se,
espectrofotometricamente, o aparecimento de produto ou desaparecimento de
substrato. As regiões espectrais do ultravioleta e visível têm mais importância para
uso quantitativo, enquanto que a região do infravermelho e outras, para elucidação
estrutural.
Nossa idéia é apresentar os princípios e operações básicas que devem ser
parte integrante do conhecimento daqueles que operam com espectrofotômetros.
Quando usamos a espectrofotometria como processo de medida,
basicamente estamos empregando as propriedades dos átomos e moléculas de
absorver e emitir energia eletromagnética, em uma das muitas áreas do espectro
eletromagnético. Os fenômenos físicos que acompanham a absorção de luz nas
várias regiões do espectro eletromagnético e as características da faixa visível são
ilustradas nas tabelas abaixo.

Região Comprimento de onda Fenômeno físico

Raios X 0,1 - 100 nm efeito na molécula

Ultravioleta 100 - 400 nm elétrons de subvalência excitados a níveis
energéticos mais altos
Visível 400 - 700 nm elétrons de valência excitados a níveis
energéticos mais altos
Infravermelh 700nm - 100 m vibração molecular
o
Microonda 100m - 30 cm rotação molecular

Tabela 1. Características do Espectro Eletromagnético Radiante

(EMR).

Comprimento Cor Cor

de onda (nm) da solução absorvida
380 - 430 violeta amarelo-verde
430 - 475 azul amarelo
475 - 495 verde-azul laranja
495 - 505 azul-verde vermelho
505 - 555 verde púrpura
555 - 575 amarelo-verde violeta
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575 - 600 amarelo azul

600 - 620 laranja azul-verde
620 - 700 vermelho verde-azul

Tabela 2. Faixa visível do Espectro Eletromagnético Radiante.

Ao falarmos em fotometria, pensamos instintivamente em luz. Na

realidade, a porção visível do espectro eletromagnético (EMR) é pequena, sendo ela
que excita a retina, produzindo nosso mais importante sentido: a visão. Esta relação
fotometria-luz é desvantajosa porque encaramos o EMR em termos de luz e cor,
quando deveria ser considerado em termos de energia, o que é a realidade.
Essa energia é propagada sob a forma de ondas, que poderiam ser
esquematicamente consideradas como uma união de vales e elevações que partem do
ponto de emissão de energia. A distância entre dois pontos mais altos de duas
elevações contíguas é denominada comprimento de onda, simbolizado por  (Figura
1). Os comprimentos de onda variam de menores que 0,1 nm (raios gama) a maiores
que 25 x 107 nm (ondas de rádio). O nanômetro (nm) é a unidade empregada
atualmente para medida do comprimento de onda. A quantidade de energia é
inversamente proporcional ao comprimento de onda e, portanto, os menores
comprimentos de onda fornecem os maiores níveis de energia.


Figura 1. Propagação da energia radiante.

Os aparelhos que medem a absorção de energia eletromagnética radiante

por soluções e que têm aplicação no laboratório são: os fotocolorímetros, que
utilizam filtros compostos para selecionar porções do espectro, e os
espectrofotômetros, que utilizam grades de difração ou prismas na seleção da porção
desejada do espectro.

2. Componentes básicos da fotometria

 6

A Figura 2 esquematiza os componentes básicos da fotometria:

1. Fonte de energia elétrica: fornecedora de energia regulada, constante e
apropriada para a operação do aparelho.
2. Fonte de energia radiante: capaz de emitir uma mistura de
comprimentos de onda.
A lâmpada de tungstênio é a mais utilizada fonte de energia radiante
para o ultravioleta próximo ao visível. Já a lâmpada de hidrogênio é a melhor fonte
de energia radiante constante na região do ultravioleta. Estas lâmpadas requerem
uma estabilização de 15 minutos, após ligadas, para que possam fornecer quantidade
constante de energia radiante.
3. Monocromador: utilizado para isolamento da porção desejada do
espectro. Isto é possível utilizando-se de filtros, prismas e grades de difração.
O mais comum é o uso de prismas. Os pequenos comprimentos de onda
são refratados em grau maior, o que produz um espectro não linear com pequena
definição nos grandes comprimentos de onda.
4. Fenda: o prisma necessita receber energia radiante através de uma
fenda de entrada e o isolamento espectral é feito por uma fenda de saída. Os prismas
permitem o isolamento de faixas do espectro com diminuta faixa de emissão (0,5 a
1,5 nm).
5. Porta-cubeta: recipiente onde se coloca a cubeta contendo a solução a
ser medida.
As cubetas são, provavelmente, a porção mais negligenciada do sistema
fotométrico, apesar de serem de grande importância. Quando não são corretamente
cuidadas, contribuem decisivamente no aumento do erro fotométrico. Existem dois
tipos de cubetas: quadrada e redonda. A cubeta quadrada tem faces planas e
paralelas. É polida óticamente e totalmente isenta dos efeitos de lente ou dos erros
de refração da cubeta redonda. É utilizada para medições onde se requer grande
precisão e exatidão. A cubeta para medidas no ultravioleta, em comprimentos de
onda abaixo de 320 nm, deve ser de quartzo, pois nesta região o vidro absorve
energia radiante. A cubeta redonda, por sua vez, não é exatamente redonda, não é
polida, apresentando irregularidades na superfície. Está sujeita aos erros de refração
e possui efeito de lente. A cubeta redonda é muito sensível ao efeito de posição em
relação ao feixe de luz e, na maioria dos casos, contém uma marca orientadora para
que seja colocada no porta-cubeta, sempre na mesma posição. Caso esta orientação
não seja seguida, pequenos erros de refração ou de efeito de lente podem ser
ampliados, acentuando, portanto, o erro fotométrico.
6. Detector: utilizado para receber a energia radiante transmitida através
da solução e transformá-la em energia elétrica. O detector pode ser uma célula
fotoelétrica ou um fotomultiplicador.
A célula fotoelétrica é composta de uma placa de ferro com uma das
faces recoberta por uma camada de selênio cristalino. Um condutor elétrico
 7

transparente é colocado sobre a camada de selênio e funciona como polo negativo. A

placa de ferro atua como polo positivo. Os fótons, atingindo a camada de selênio,
transferem sua energia para elétrons que passam à placa de ferro, atingem o circuito
medidor que se liga à célula e retornam pelo polo negativo à camada de selênio.
Não há, neste caso, perda de elétrons. O fotomultiplicador se assemelha
a uma válvula e contém um cátodo recoberto de uma substância que emite elétrons
proporcionalmente à energia recebida.
7. Circuito medidor: recebe a energia elétrica emitida pelo detector,
apresentando-a sob a forma útil de medida, isto é, absorbância e/ou transmitância.
Este circuito consiste basicamente em um ímã permanente em forma de ferradura
com uma espiral móvel suspensa entre seus pólos. A espiral móvel recebe a corrente
fornecida pelo detector e seu eixo está perpendicular ao campo magnético formado
pelos dois pólos do ímã permanente. Um ponteiro é ligado à espiral,
movimentando-se sobre uma escala graduada em transmitância e/ou absorbância.

3. Leis da fotometria

Quando um raio de energia radiante atravessa uma solução, a energia

incidente (Io) será sempre mais intensa que a energia emergente (I). Esta atenuação
da intensidade de energia pode ser atribuída a (1) reflexões nas interfaces entre o ar e
a parede da cubeta e entre a solução e a parede da cubeta; (2) dispersão por
partículas presentes na solução; e (3) absorção da energia pela solução em estudo
(Figura 3).

Io 2 I

1 3

Figura 3. Absorção da energia radiante que atravessa uma solução.

Transmitância

É a relação entre a energia transmitida (I) e a energia incidente (Io).

T = I/Io

Se uma determinada solução não absorve energia, I e I0 têm o mesmo

valor e logo I/I0 será igual a 1. Conclui-se, assim, que qualquer solução que absorva
energia terá transmitância menor que 1 (porque I é, neste caso, maior que Io). Para
evitar operações com decimais, recorreu-se ao artifício da multiplicação por 100.
Assim, quando I e Io são iguais T = 1 = 100%.

Absorbância
 8

É a relação logarítmica entre a energia incidente (Io) e a energia

transmitida (I) pela solução.

A = log Io/I = -log T

Nas aplicações da fotometria, a absorção é o fator primário na redução

da energia incidente. Quando se usa energia monocromática (simples comprimento
de onda), a fração de radiação absorvida pela solução, ignorando perdas por reflexão
e dispersão, será função da concentração da solução e da espessura da solução.
Matematicamente, esta função pode ser definida como:
Io = e -( · c · l)

onde:
IO = intensidade de energia incidente
e = base dos logarítimos neperianos (2,303).
 = absortividade; constante característica da solução e que depende do
comprimento de onda.
c = concentração da solução.
l = espessura da solução atravessada pela radiação.

Portanto, esta fórmula estabelece que, quando a energia radiante

monocromática atravessa uma solução, a quantidade de energia transmitida diminui
exponencialmente com (1) o aumento da espessura atravessada e (2) aumento da
concentração ou da intensidade de cor da solução.
O primeiro conceito deriva da Lei de Lambert que pode ser representada
pela equação:

log Io/I =  · l

Já o segundo conceito deriva da Lei de Beer que, por sua vez, pode ser
representada como:

log Io/I =  · c

Estes dois conceitos constituem a Lei de Lambert-Beer, que pode ser

representada por:

log Io/I =  · c · l

Como A = log Io/I, então a equação acima pode ser representada como:

A=·c·l

4. Aplicações da fotometria

4.1. Curva de calibração ou curva padrão

 9

A principal finalidade de uma medida espectrofotométrica, nas regiões

do ultravioleta e visível, é avaliar quantidades. Assim, é extremamente importante
efetuar uma rigorosa calibração visando obter resultados exatos. Para obter-se uma
curva de calibração alguns aspectos devem ser considerados como: a escolha de uma
solução padrão, o estabelecimento de um branco adequado e a seleção da área
espectral.

Soluções padrões

Constituem parte integrante da análise quantitativa no laboratório e

usadas nas dosagens de amostras desconhecidas. Uma solução padrão apresenta
concentração exata de uma substância conhecida, que servirá como referência na
determinação fotométrica de concentrações desconhecidas desta mesma substância.
Uma solução padrão tem grande importância no preparo da curva de calibração.

Brancos

As medidas de absorção de luz devem ser feitas em relação a um branco,

uma solução que contém todos os componentes do experimento exceto o composto
que está sendo medido. Quando usamos o branco em fotometria, para estabelecer o
zero-Absorbância ou 100%-Transmitância, estamos realmente usando um sistema
simples para eliminar a absorbância dos reagentes e das cubetas, perdas por reflexão
e refração, e compensação do efeito de lente produzido pelas cubetas redondas.
Usamos o ponto zero-A ou 100%-T porque assim eliminamos a
necessidade de cálculos, pois neste ponto a energia incidente (Io) torna-se igual a
100 (T = I/Io).
Em algumas dosagens, obtemos brancos com elevada absorbância, o que
dificulta o acerto do zero em muitos aparelhos. Neste caso, deve-se efetuar a leitura
do branco e da amostra acertando o zero com água destilada, determinando-se a
seguir as diferenças entre branco e amostra para os posteriores cálculos.

Seleção da área espectral

Quando se realiza uma medida fotométrica deve-se utilizar uma faixa do

espectro na qual a energia radiante seja absorvida ao máximo, a fim de se obter o
mais alto grau de sensibilidade. Uma solução azul absorve o amarelo com maior
intensidade e, portanto, deve ser escolhida a porção amarela para medida de solução
azul. Na maioria das determinações colorimétricas, utiliza-se sempre uma faixa
espectral cuja cor é complementar à da solução a ser medida (ver Tabela 2).
O melhor processo para avaliar a correta região espectral para uma
medida fotométrica consiste no preparo do espectro de absorção, que consiste no
relacionamento entre as absorbâncias e os respectivos comprimentos de ondas.

Obtenção da Curva de Calibração

O preparo da curva de calibração é de grande importância e deve ser

bem entendido. Todo analista deve ser capaz de preparar suas próprias curvas de
calibração e interpretar os resultados obtidos.
 10

Para se obter o valor da concentração de substâncias cuja concentração

se desconhece, é necessário estabelecer uma relação entre a absorbância desta
solução em diferentes concentrações com as suas concentrações. Isto se chama curva
de calibração.
O procedimento a seguir pode ser usado como processo de preparo da
curva:
1. Preparar uma série de padrões exatos, cobrindo a faixa de trabalho
usada ou indicada. Usar o padrão recomendado para o método a ser calibrado.
2. Dosar todos os padrões de acordo com a técnica recomendada. Efetuar
as leituras colorimétricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A ou
100%-T, além do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pela
curva de absorção espectral previamente realizada.
3. Ao proceder as leituras em Transmitância, recorrer à tabela de
conversão, transformando os resultados em Absorbância.
4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbância
(ordenada) com as concentrações dos padrões (abcissa).
Examinar bem os pontos e decidir se eles serão cobertos por uma linha
reta. Se os pontos aparentemente seguirem uma linha reta, traçar uma curva de modo
que mais se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva não deve ser traçada de
ponto a ponto, mas interpolando através dos pontos.
5. Examinar a curva traçada, avaliando se ela tem sensibilidade correta
(Figura 5).

Abs A

B
C

concentração

Figura 5. Tipos de curva de calibração. (A) curva muito sensível; (B)

curva de sensibilidade ideal e (C) curva pouco sensível.

A curva de calibração ideal deve ter ângulo de 45° em relação ao ponto

de origem. Curvas de ângulos muito agudos ou obtusos não devem ser utilizadas.
6. Se a curva não for ideal devemos procurar um meio de corrigir este
problema usando os seguintes processos:
a. utilizar uma cubeta com diâmetro interno maior ou menor;
b. alterar o comprimento de onda. Este processo irá diminuir a
sensibilidade em muitos casos, mas é um recurso de muita valia;
c. aumentar ou diminuir a alíquota. Isto deve ser feito com muito
cuidado, verificando se não ocorrem alterações no sistema colorimétrico
comprometendo a segurança do método;
d. aumentar ou diminuir o volume final da reação, variando os volumes
dos reagentes.
 11

Evidentemente, uma curva de calibração não é estável indefinidamente,

podendo variar com: (a) variação da sensibilidade do aparelho de medida (fonte de
energia radiante, detector, calibração do comprimento de onda etc) e, (b) com
variações da sensibilidade dos reagentes.
Todas as vezes que forem preparados novos lotes de reagentes ou que
forem substituídas lâmpadas do aparelho, novas curvas de calibração deverão ser
realizadas.
É interessante observar a relação existente entre a curva de calibração e a
Lei de Lambert-Beer. Verifica-se que a Absorbância (A) é diretamente proporcional
à concentração (C) quando considera-se  e l constantes características da solução e
da cubeta, respectivamente.

4.2. Calibração com padrão diário

É prática considerada correta porque a calibração no dia-a-dia é feita

com um padrão dosado praticamente nas mesmas condições das amostras. O cálculo
é feito da seguinte forma:

[amostra] = absorbância da amostra

 · [padrão]
absorbância do padrão

4.3. Calibração com fator

O fator de calibração (FC) é um artifício utilizado rotineiramente e seu

cálculo é feito de acordo com o que se segue:

concentração do padrão
FC = 
absorbância do padrão

Outra maneira de se obter o fator de calibração é através da própria

curva de calibração, ou seja, pelo coeficiente angular da reta obtida.

FC = cotag  = 1/tg 

como tg  = sen  / cos , então:

cos 

FC = sen 

De onde se conclui que:

cateto adjacente x2 – x1
FC =  = y
cateto oposto 2 – y1

De posse do fator de calibração (FC), é possível obter-se a concentração

da amostra:
[amostra] = absorbância da amostra · FC
 12

5. Fotometria - Parte experimental

5.1. Espectro de absorção do permanganato de potássio

Reagente:
Solução de KMnO4 a 4,5 mg/mL

Procedimento:
1. Marcar 3 tubos com as letras B (branco), A(amostra) e A2 (amostra
com a metade da concentração de A);
2. Distribuir os reagentes como indicado no quadro abaixo:
Reagentes/mL Tubo B Tubo A Tubo A2
Água destilada 5,0 - 2,5
KMnO4 - 5,0 2,5

3. Ligar o espectrofotômetro;
4. Escolher um filtro ou selecionar um valor de λ, de acordo com o
aparelho.
5. Colocar o tubo B no local apropriado do aparelho e “zerar” (100%T ou 0
de Absorbância)
6. Substituir o primeiro tubo pelo tubo A, observar e anotar os resultados
mostrados na escala de Transmitância e na escala de Absorbância; e
após, pelo tubo A2 e anotar os resultados na Tabela abaixo.
7. Repetir os itens 4, 5, e 6 (mudando o λ).

Comprimento Transmitância (T) Absorbância (Abs)

de onda - λ A A2 A A2
460
490
520
580
650

8. Representar graficamente: na ordenada os valores de T e de Abs

encontrados e na Abscissa os respectivos λ.
9. Identificar o comprimento de onda onde a Absorbância for máxima e
discutir os resultados.
10. Identificar o comprimento de onda mais sensível para as determinações
fotométricas da substância utilizada, ponto no qual as duas
concentrações apresentam maior diferença de Transmitância (T%)
possibilitando reconhecimento de pequenas diferenças de concentração.
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AULA PRÁTICA BIOQUÍMICA GERAL - 3

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO
DE BIURETO

Objetivos:
- Elaborar uma curva padrão de proteína e estabelecer a sensibilidade de um método
espectrofotométrico. - Resolver problemas específicos: cálculos envolvendo diluição e
determinação da concentração de diferentes soluções.

Reativos:
- Solução padrão de proteína: albumina se soro bovino 5 mg/mL
- Solução de proteína de concentração desconhecida
- Reagente de Biureto

Preparo dos reativos:

1. Reagente de Biureto: dissolver em 500 mL de água destilada:
- 1,5 g de sulfato de cobre pentaidratado
- 6,0 g de tartarato duplo de sódio e potássio
- Adicionar 300 mL de solução de hidróxido de sódio a 10 % com constante
agitação.
- Adicionar água destilada suficiente para 1 litro de solução.

2. Solução padrão de proteína: pesar exatamente 500 mg de albumina bovina

(balança analítica) e dissolver em 100 mL de água destilada (balão volumétrico).
Aliquotar em frações de 10 mL de conservar a -20º C (freezer).

Técnica:
I. Curva de calibração
1. Organizar uma bateria de 8 tubos de ensaio.
2. Identifica-los de 1 a 6 e dois tubos como A e B.
3. Adicionar os reagentes conforme a tabela:
Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo
Reagentes (mL) 1 2 3 4 5 6 A B

Solução padrão de - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 - -

proteína (5mg/mL)
Amostra proteína - - - - - - 1,0 0,5
Água destilada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 - - 0,5
Reagente de biureto 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

4. Agitar e deixar em repouso por 10 minutos

5. Utilizar o tubo 1 para calibrar o espectrofotômetro: 0 de absorbância ou 100% de
transmitância em 540 nm.
6. Determinar a absorbância das soluções dos tubos 2 a 6 e dos tubos A e B.
7. Traçar em papel milimetrado, o gráfico: concentração final de proteínas
(mg/mL) X Absorbância (A). Interpolar a melhor reta possível, passando pela
origem dos eixos cartesianos.
8. Determinar a concentração de proteína (mg/mL) presente nas amostras problema
utilizando o gráfico da curva de calibração.
 14

AULA PRÁTICA BIOQUÍMICA – 4

EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM DE CASEÍNA

1. Extração e caracterização

Em um béquer de 100 ml contendo 10 ml de leite, adicionar 40 ml de

água destilada. Retirar uma alíquota de 1 ml e realizar a reação do biureto (1 ml de
amostra + 4 ml do reagente de biureto). Analisar.
A seguir, utilizando-se de um medidor de pH, acrescentar ácido acético
5%, gota a gota, até que ocorra precipitação. Isto deve ocorrer quando o pH está
próximo de 4,6. A adição do ácido ao leite provoca a precipitação da caseína,
juntamente com água, lipídeos, proteínas. Deixar em repouso por 5 minutos.
Agitar o frasco e recolher uma alíquota de 10 ml.
Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos e recolher o sobrenadante.
Determinar o teor de proteínas no sobrenadante.
Adicionar 2 ml de éter etílico, e a seguir, homogeneizar com um bastão
de vidro. A adição de éter etílico tem por finalidade retirar materiais gordurosos.
Centrifugar a 3000 rpm por 2 minutos e desprezar o sobrenadante.
Se necessário adicionar, novamente, 2 ml de éter etílico,
homogeneizando com bastão de vidro. Centrifugar e desprezar o sobrenadante.
Adicionar 2 ml de etanol absoluto e homogeneizar. A adição de etanol
tem por finalidade retirar a água de solvatação que permaneceu junto à proteína.
Centrifugar a 3000 rpm por 2 minutos e desprezar o sobrenadante. Repetir esta
etapa, adicionando álcool, caso seja necessário.
Opcionalmente, após o tratamento com éter etílico e etanol, pode-se
pesar a matéria seca (caseína) e comparar com o resultado da dosagem de proteínas
feita pela técnica do biureto.
Finalmente, adicionar 2ml de hidróxido de sódio 2 N e redissolver o
precipitado, completando com água destilada para um volume final de 5 ml.
Realizar a dosagem de proteínas.

2. Dosagem quantitativa da caseína do leite

A quantidade de proteínas presentes em uma solução ou suspensão pode

ser medida pelo método quantitativo do biureto.

Material
Solução padrão de albumina 10 mg/ml
Reagente de biureto

Dosagem
Retirar uma alíquota de 0,2 ml de amostra e acrescentar 0,8 ml de água.
A seguir, acrescentar 4 ml do reagente de biureto e ler contra o branco, em 540 nm.
Determinar a concentração de caseína, através da curva de calibração,
obtida em aula anterior. Calcular a concentração de caseína em um litro de leite.

3. Valores teóricos
 15

Proteínas totais do leite de vaca = 3,3 g%

80% deste total corresponde a caseínas

Proteínas do leite de vaca Concentração aproximada pI

(g%)
s1-Caseína 1,37 4,1
K-Caseína 0,37 3,7
-Caseína 0,62 4,5
-Caseína 0,12 5,8 – 6,0
-Lactoglobulina 0,30 5,3
-Lactoalbumina 0,07 5,1
Albumina do soro bovino 0,03 4,7
Imunoglobulina (IgG) 0,06 5,6 – 6,0

3. Esquema operacional

10 ml de leite + 40 ml de água


ácido acético gota a gota até
precipitação


Repouso por 5 minutos. Agitar


Retirar alíquota de 10 ml.
Centrifugar. Desprezar o sobrenadante


2 ml de éter etílico. Homogeneizar


Centrifugar. Desprezar o sobrenadante


2 ml de etanol absoluto. Homogeneizar


Centrifugar. Desprezar sobrenadante


Ressuspender o precipitado


Determinar a concentração de proteínas
 16

AULA PRÁTICA BIOQUÍMICA – 5

CINÉTICA ENZIMÁTICA DA INVERTASE DE LEVEDURAS

Reativos:
1. Solução da enzima invertase (0,05 e 0,1 mg proteína/mL): pesar 50 g de
leveduras secas (fermento de pão), suspender em 250 mL de bicarbonato de
sódio 0,15 mol/L e manter em banho-maria a 37º C durante 6 horas, com
agitação ocasional. Centrifugar por 20 minutos a 3.500 rpm. Coletar o
sobrenadante, que contém a enzima invertase ativa. Conservar a tpt de 4º C.
Normalmente, a concentração de enzima para os ensaios é de 0,1 mg de
proteína/mL.
2. Solução de sacarose 0,2 mol/L
3. Solução-tampão acetato 0,05 mol/L pH 4,7
4. Reativo de 3,5-dinitrosalicilato (DNS): dissolver por aquecimento 5g de ácido
3,5-DNS em 100 mL de NaOH 2 mol/L. Separadamente dissolver também por
aquecimento 150 g de tartarato duplo de sódio e potássio em 250 mL de água
destilada. Misturar as 2 soluções e completar o volume para 500 mL de água
destilada.
5. Soluções-tampão: pH 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0.

Procedimento:
A) Efeito da variação do pH do tampão sobre a atividade enzimática

1. Organizar uma bateria com 9 tubos de ensaio.

2. Identificá-los com números de 1 a 9.
3. Adicionar os diferentes tampões e demais reagentes conforme a tabela:

Tubos
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Reagentes (mL)
Tampão pH 2,0 1,0 1,0 - - - - - - -
Tampão pH 3,0 - - 1,0 - - - - - -
Tampão pH 4,0 - - - 1,0 - - - - -
Tampão pH 5,0 - - - - 1,0 - - - -
Tampão pH 6,0 - - - - - 1,0 - - -
Tampão pH 7,0 - - - - - - 1,0 - -
Tampão pH 8,0 - - - - - - - 1,0 -
Tampão pH 9,0 - - - - - - - - 1,0
Água destilada 1,0 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
Sacarose (0,2 mol/L) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Solução de enzima 0,1 _ 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
mg/mL

4. Levar a bateria de tubos ao banho-maria a 25º C.

5. Incubar durante 5 minutos.
6. Adicionar 1,0 mL de solução de 3,5-dinitrosalicilato (DNS) a cada um dos
tubos.
7. Levar os tubos para aquecer em banho-maria fervente por 5 minutos.
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8. Deixar esfriar por 5 minutos.

9. Adicionar 6,5 mL de água destilada em cada um dos tubos.
10. Calibrar o espectrofotômetro a 540 nm com o tubo 1.
11. Proceder a leitura das absorbâncias dos demais tubos. Traçar o gráfico: pH
(abcissa) x Absorbância (ordenada)
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AULA PRÁTICA BIOQUÍMICA – 6

HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DO AMIDO – CURVA DE TEMPO PARA A

ATIVIDADE DA AMILASE SALIVAR

1. Objetivos
 Traçar uma curva de tempo para a reação de hidrólise do amido pela amilase
salivar
 Quantificar o substrato utilizando uma solução de iodo/iodeto de potássio

2. Relação teórico-prática
Química de carboidratos; enzimas.

3. Reativos
Solução de amido a 0,7%
Solução de iodo 0,1mol/L
Solução de iodeto de potássio 0,5 mol/L
Solução de tampão imidazol 0,1mol/L pH 7,2
Saliva (mistura de 2 ou 3 doadores) diluída em tampão imidazol (1:250 a 1:500)

4. Diluição da saliva
Transferir 20 microlitros da mistura de saliva para um tubo de ensaio contendo 4,98
mL de tampão imidazol
* Evitar pegar só espuma da solução de salina
**Manter na geladeira ou em banho de gelo até o momento do uso

5. Procedimento técnico
a. Organizar uma bateria com quatro tubos de ensaio
b. Identificá-los com números de 1 a 4
c. Adicionar os reagentes conforme a tabela:

Reagentes (mL) Tubo Tubo Tubo Tubo

1 2 3 4
Solução de amido 0,1 0,1 0,1 0,1
Tampão imidazol 0,1 0,1 0,1 0,1
Saliva diluída em tampão imidazol 0,1 0,1 0,1 0,1
Solução de iodo/iodeto 5,0 - - -

d. Levar os tubos 2, 3 e 4 ao banho-maria a 37º C.

e. Incubá-los durante 10 min (tubo 2); 20 min (tubo 3) e 30 min (tubo 4).
f. Após cada tempo, adicionar 5 mL de solução de iodo/iodeto de potássio em cada
tubo.
g. Calibrar o espectrofotômetro a 640 nm (filtro vermelho) com um tubo contendo
5 mL de solução de iodo/iodeto de potássio, 0,1 mL de tampão inidazol e 0,1
mL de saliva diluída em tampão imidazol (tubo branco).
h. Proceder a leitura das absorbâncias dos demais tubos.
i. Traçar o gráfico: tempo de incubação (minutos) X absorbância. Interpretar.
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AULA PRÁTICA BIOQUÍMICA – 7

METABOLISMO - GLICÓLISE E FERMENTAÇÃO EM LEVEDURAS

Curva padrão da glicose pelo método do ácido dinitro-salicílico

(DNS)

Reagentes
 Ácido dinitro-salicílico (DNS) 1%: em um recipiente, misturar 1 g de DNS
em 30 ml de água destilada. Num outro recipiente dissolver 30 g de tartarato de
sódio e potássio em 20 ml de hidróxido de sódio 2 N. Colocar os dois recipientes
em banho-maria à 56°C, até completa dissolução. Misturar ambas soluções e
completar o volume para 100 ml com água destilada.

 Glicose 2,5 mM

 Tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0

 Leveduras  1,5% (em tampão fosfato 0,1 M pH 7,0)
 Glicose 24 mM
 Fluoreto de sódio 1,5 M

Curva de calibração

Preparar uma curva de calibração considerando que o volume final, de

cada tubo, é de 1,0 ml e a concentração do padrão de glicose é de 2,5 mM. Em cada
tubo acrescentar 0,5 ml da solução de DNS. Colocar em banho-maria fervente por 5
minutos. Adicionar 5,0 ml de água destilada em cada tubo. Ler no espectrofotômetro
em  = 540 nm, contra o tubo branco. Traçar um gráfico de absorbância versus
concentração. Calcular o fator de calibração.

Tubo Glicose 2,5 Água Concentração DNS Absorbância

mM - (ml) (ml) (mM) (ml)

1 0,1 0,9 0,25 0,5

2 0,2 0,8 0,50 0,5
3 0,3 0,7 0,75 0,5
4 0,4 0,6 1,00 0,5
5 0,5 0,5 1,25 0,5
6 0,6 0,4 1,50 0,5
7 0,7 0,3 1,75 0,5
8 0,8 0,2 2,00 0,5
9 0,9 0,1 2,25 0,5
10 1,0 ----- 2,50 0,5
Branco ---- 1,0 ------ 0,5
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2. Acompanhamento do consumo de glicose

Técnica

Ação do fluoreto: em um erlenmeyer de 50 ml, colocar 10 ml de

leveduras 1,5%, 4 ml de fluoreto de sódio 1 M e 10 ml da solução de glicose 24
mM.
Controle: em um segundo erlenmeyer, colocar 10 ml de leveduras 1,5%,
4 ml de água destilada e 10 ml de glicose 24 mM.

Incubar, a 37°C, sob agitação. Retirar alíquotas de 0,1 ml dos dois

erlenmeyers, nos tempos 0, 20, 40 e 60 minutos e colocá-las em tubos de ensaio.
Acrescentar, em cada tubo, 0,9 ml de água destilada e 0,5 ml de DNS. Colocar em
banho-maria fervente por 5 minutos. Acrescentar 5,0 ml de água destilada em cada
tubo e transferir o conteúdo dos mesmos para tubos de centrífuga. Centrifugar por 5
minutos a 3.000 rpm. Cuidadosamente, transferir parte do sobrenadante para cubeta
e proceder a leitura em 540 nm.

Branco: preparar um tubo branco contendo 1,0 ml de leveduras 1,5%,

1,0 ml de tampão fosfato 0,1 M pH 7,0 e 0,4 ml de água. A partir desta mistura,
retirar uma alíquota de 0,1 ml e transferir para um outro tubo de ensaio. Acrescentar
0,9 ml de água destilada e 0,5 ml de DNS. Colocá-lo em banho-maria fervente por 5
minutos. Acrescentar 5,0 ml de água destilada e proceder a leitura em 540 nm.

Determinar a concentração de glicose a partir do fator de calibração

(FC).
Construir gráficos de concentração de glicose em função do tempo para
as condições experimentais.
Interpretar os resultados.