Técnicas de Preservação de

Microrganismos

Lara Durães Sette

CBMAI-CPQBA/UNICAMP
lara@cpqba.unicamp.br
Importância da preservação

⚫ armazenamento de culturas por longos períodos e

utilização periódica para pesquisa e/ou produção
– contaminação
– perda de viabilidade
– mutação (perda das características fisiológicas)

⚫ solução → metodologia de preservação de longa duração

– diminuição do crescimento e das atividades metabólicas
⚫ crescimento em meio mínimo
⚫ resíduos metabólicos podem comprometer a viabilidade da cultura
Importância da preservação

⚫ preservação a longo prazo

– evita problemas com o novo isolamento de microrganismos
– economia de tempo, mão de obra e custos com material de consumo

⚫ importante função da coleção de culturas

– pesquisadores: falta de experiência e/ou equipamentos para preservação
por períodos prolongados
– garantia de sobrevivência, estabilidade e pureza
Escolha do método de preservação

⚫ pontos a serem considerados

– manutenção da viabilidade: perda de células no processo de

preservação e durante o armazenamento

– manutenção das propriedades originais: perda de características

de interesse científico ou industrial

– pureza: evitar chances de contaminação do microrganismo

– custos de preservação e manutenção

Escolha do método de preservação

– tamanho estimado do acervo: tempo operacional exigido anteriormente

e posterior à manipulação; espaço disponível para armazenamento

– importância do acervo: conseqüência de sua eventual perda; culturas

com potencial biotecnológico → preservação por mais de um método

– necessidade de acesso e uso da cultura: réplicas em quantidades

adequadas; facilidade de reativação; preservação adequada para
embalagem de envio e condições de transporte

– disponibilidade de equipamentos e de recursos humanos e

financeiros
Métodos de preservação

⚫ curto prazo
– repique contínuo

⚫ médio prazo
– preservação em óleo mineral
– preservação em água
– congelamento a -20°C
– secagem em sílica, solo e papel de filtro

⚫ longo-termo
– liofilização
– congelamento a -80°C
– criopreservação em nitrogênio líquido
Repique contínuo

⚫ princípio
– diminuição do metabolismo (meios mínimos; baixa temperatura)

⚫ fatores a serem considerados

– meio adequado para manter a cultura
– temperatura de estocagem: temperatura ambiente de 2-3 meses;
geladeira (4 a 7 ºC) de 4-6 meses
– freqüência entre as transferências: determinação empírica
⚫ minimizar o n° de repiques → evitar a seleção de mutantes
⚫ examinar a pureza em cada transferência
⚫ conservar em duplicata
Repique contínuo
Repique contínuo

⚫ vantagens
– baixo custo
– não requer equipamentos especializados
– o manuseio é simples

⚫ desvantagens
– riscos de contaminação e possível perda da linhagem
– perda de características morfológicas, fisiológicas ou patogenicidade
– seleção de células atípicas (variantes ou mutantes)
– supervisão especializada
– mão-de-obra
– espaço relativamente grande para a armazenamento
Preservação em óleo mineral e em água

⚫ princípio
– diminuição da atividade metabólica

⚫ fatores a serem considerado (Castellani)

– espessura do ágar
– número de blocos na água
Preservação em óleo mineral

Preservação em óleo
vantagens
- ↓ custo de equipamento
- evita contaminação por ácaros

desvantagens
- necessidade de mais transferências
até que a cultura revigore
- requer espaço para amazenamento

armazenamento em geladeira
Preservação em água (Castellani)

Geladeira

Blocos de ágar de 4-6 mm3 10-15 mL água destilada esterilizada

Preservação em água

Preservação em água
vantagens
- boa taxa de viabilidade
- evita contaminação por ácaros

desvantagens
- limitado a organismos que
aderem ao ágar (Castellani)
- dificuldade da retirada dos cubos
na reativação (Castellani)
- crescimento durante a estocagem
- requer espaço p/ amazenamento
- riscos de contaminação

armazenamento em geladeira
Secagem

⚫ princípio
– diminuição do metabolismo por desidratação e conservação em geladeira

⚫ fatores a serem considerados

– tipo de célula
– idade da cultura
– concentração celular
– condições de estocagem
Secagem em sílica e em solo
Secagem em papel de filtro
Secagem

⚫ vantagens
– simples e de baixo custo
– não requer equipamento especial
– estabilidade elevada
– ácaros não sobrevivem

⚫ desavantagens
– métodos limitados a bactérias e fungos filamentosos esporulados
– risco de contaminação devido ao manuseio sucessivo
– papel: poucos dados sobre o sucesso do método
Liofilização

⚫ princípio
– remoção da água por sublimação

⚫ fatores a serem considerados

– tipo de células
– idade da cultura
– concentração celular
– agentes crioprotetor
– condições de estocagem
– método de reidratação
Liofilização

⚫ agentes crioprotetores
– reduzem danos durante o congelamento e descongelamento
– estabilidade ao microrganismo contra os efeitos adversos da estocagem

⚫ leite desnatado (skim milk) 10%

⚫ leite desnatado 10% + inositol 5%
⚫ sacarose 7% + peptona 7%
⚫ inositol 5% em soro de sangue de cavalo
Liofilização

Maçarico Liofilizador

Maçarico
Cultura pura 3 mL 0,2 mL
Skim Milk na ampola
Liofilização - reativação
Liofilização

⚫ vantagens
– vedação total da amostra
– longa viabilidade
– estabilidade elevada em muitas espécies
– produção em larga escala
– não requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz)
– fácil distribuição e transporte

⚫ desvantagens
– muitas espécies não sobrevivem ao processo
– viabilidade ocasionalmente insatisfatória
– mão-de-obra especializada
– requer equipamentos sofisticado
Congelamento em ultrafreezer

⚫ princípio
– indução da dormência do microrganismo
– armazenamento a - 80˚C

⚫ fatores a serem considerados

– tipo de microrganismo
– idade da cultura
– concentração celular
– agente crioprotetor (dimetilsufoxido 10%; glicerol 10% ou concentração
maior)
– condições de estocagem
– método de descongelamento
Congelamento

1 mL 10 mL 1 mL

Fungos filamentosos não Fungos filamentosos esporulados

esporulados

1 mL

7 mL
Bactérias, arqueas e leveduras
Congelamento em ultrafreezer
Congelamento em nitrogênio líquido

⚫ princípio
– indução da dormência do microrganismo
– armazenamento a - 196˚C

⚫ fatores a serem considerados

– tipo de microrganismo
– idade da cultura
– concentração celular
– agente crioprotetor
– condições de estocagem
– método de descongelamento
Congelamento em nitrogênio líquido
Congelamento em nitrogênio líquido

⚫ vantagens
– condições estáveis por longos períodos
– vedação completa, evitando contaminação
– utilização para esporulados e não esporulados

⚫ desvantagens
– viabilidade ocasionalmente insatisfatória
– requer equipamento sofisticado
– suprimento contínuo de N2
– boa infra-estrutura – caso de acidentes de vazamento
Controle de qualidade de preservação

⚫ contagem de população viável antes e após preservação

– determinar a taxa de mortalidade do microrganismo específico no
protocolo utilizado
– aplicável a métodos de médio e longo-termo
– imprescindível para garantia de preservação de longo-termo

⚫ pureza
– logo após o processamento do lote

⚫ viabilidade
– primeira pós: até um mês após o processamento
– segunda pós em diante: anualmente
 Controle de qualidade de preservação
0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

Suspensão de
células em
crioprotetor

(10-2) (10-4) (10-6) (10-8)

9,9 mL água
+ 0,1% ágar

10-2 10-4
10-8 10-6

no de células mL-1 inoculados na ampola = (no de colônias em 0,1 mL = 3 gotas) x 10 x (fator de diluição) UFC/mL