UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOFÍSICA E FARMACOLOGIA
DISCIPLINA DE FARMACOLOGIA

Roteiro de Aula Prática:

ELABORAÇÃO DE UMA CURVA CONCENTRAÇÂO-EFEITO EM AORTA DE RATO

1) OBJETIVOS

O objetivo desta aula é estudar a relação entre a concentração e a resposta a um

fármaco num órgão isolado, pela elaboração de uma curva concentração-efeito, usando como
preparado experimental aorta isolada de rato. Na presente aula pretende-se registrar a
resposta de contração da aorta induzida pela ligação da Noradrenalina aos receptores alfa-
adrenérgicos existente nas células. Pretendendo-se também ilustrar o antagonismo, vamos
repetir a curva concentração-efeito depois de se incubar a aorta com Prazosina (protótipo dos
antagonistas alfa-adrenérgico).

2) INSTRUMENTAÇÃO

- Ratos Wistar (250-300 g),

- Material cirúrgico,
- Placas de Petri,
- Seringas de 1 ml,
- Solução de Krebs (1 Litro; mM: 120 NaCl;
5 KCl; 25 NaHCO3; 1,2 KH2PO4; 1,1
MgCl2.6H2O; 2,56 CaCl2.2H2O, pH=7,4),
- Glicose 11 mM,
- ~4-5 mm de aorta,
- Banho de órgãos (10 ml),
- Sistema de registro (Fisiógrafo acoplado
a um transdutor isométrico)
- Soluções de fármacos a estudar:
Noradrenalina e Prazosina.

3) ELABORAÇÃO DE UMA CURVA DOSE-EFEITO CUMULATIVA

3.1- Preparar soluções de NA nas concentrações de 10-1M, 10-2M 10-3M; 10-4M e 10-5M,
a partir de uma solução 10M de NA, por diluições sucessivas de 1:10 e uma solução de Prazosin
a 10-3M.

3.2- Para obter curvas dose-resposta cumulativas, aumenta-se a concentração do

agonista por um fator constante até que concentração prévia tenha produzido a resposta
máxima e de esta se manter em patamar. Todas as respostas de contração são expressas como
força em gramas. As concentrações vão crescer segundo uma progressão geométrica de razão
3, isto é, a quantidade de NA adicionada ao banho é tal que a concentração final em cada adição
seja 3 vezes superior à concentração anterior.

3.3- Curvas concentração-efeito (relaxamento) serão geradas adicionando-se NA (10-5 M

a 10M) a cada preparação de anel de aorta. O logaritmo negativo da concentração que produz
50% da resposta máxima (pD2) será calculado das curvas concentração-efeito, obtidas das
preparações da aorta dos diferentes grupos experimentais. Os dados serão expressos em
gramas-força e analisados por regressão não linear através de programas computacionais

4) CÁLCULOS
Em um volume definido de 10ml, a curva concentração-efeito para determinado
agonista, no caso NA, é iniciada com a concentração de 10-8 M de agonista e serão adicionadas
frações de concentrações conhecidas de agonista até que a concentração final em 10 ml seja 10-
2
M.

4.1- O primeiro ponto da curva equivale a 10-8 M de agonista em 10 ml de solução

fisiológica. Acrescentando-se 10μl de solução-mãe de concentração de 10-5 M de agonista em
um volume de 10 ml (ou 104 μl) obtemos volume final com aproximadamente 10-8 M, seguindo
a fórmula: Onde:
C1 = Concentração da solução estoque
C1 x V1 = C2 x V2 V1 = volume necessário da solução estoque a ser utilizado
C2 = Concentração final desejada
V2 = Volume final

Desse modo:

10-5 . X = 10-8 . 104  X = 10μl

4.2- O segundo ponto da curva equivale à concentração de 3.10-8 M de agonista em 10

ml de solução fisiológica. Seguindo a mesma fórmula, temos:

10-5 . X = 3x10-8 . 104  X = 30μl

Porém, considerando-se que no volume final de 10ml já temos 10μl (do ponto anterior),
então adicionaremos a diferença de 20μl para atingir a nova concentração desejada.

4.3 – O terceiro ponto equivale a 10-7 M de agonista em 10 ml de solução fisiológica.

Seguindo a mesma fórmula, temos:

10-5 . X = 10-7 . 104  X = 100μl

Porém, considerando-se que no volume final de 10ml já temos 30μl, então

adicionaremos 70μl (100μl - 30μl ) para atingir a nova concentração desejada.
Até o terceiro ponto da curva, temos a concentração final de 10-7 M do agonista que foi
atingida com a adição de 100μl de solução estoque de 10-5, que é equivalente a 10μl de uma
solução de 10-4 M. Portanto, o novo volume a ser adicionado no quarto ponto deverá ser de 20μl
(30μl - 10μl).
Esse raciocínio deverá ser utilizado para os cálculos dos pontos seguintes.

Ponto Solução Volume Concentração Contração Contração Contração

Mãe [M] (μl) final em 10ml (gms) (gms) (gms)
S/ prazosin C/ prazosin C/ prazosin
10-6M 3x10-6M
1 10-5 10 10-8M 0,05 0,02 0,06
2 10-5 20 3x10-8 M 0,05 0,03 0,03
3 10-5 70 10-7 M 0,33 0,01 0,04
4 10-4 20 3x10-7 M 0,73 0,04 0,05
5 10-4 70 10-6 M 3,13 0,14 0,03
6 10-3 20 3x10-6 M 6,28 0,09 0,12
7 10-3 70 10-5 M 8,09 0,14 0,14
8 10-2 20 3x10-5 M 8,75 0,25 0,14
9 10-2 70 10-4 M 8,76 0,65 0,26
10 10-1 20 3x10-4 M 8,86 3,13 0,99
11 10-1 70 10-3 M 8,82 5,38 3,44
12 10 20 3x10-3 M 9,04 7,49 6,43
13 10 70 10-2 M 8,94 8,80 8,64

5) INCUBAÇÃO DO ORGÃO COM O ANTAGONISTA PRAZOSIN

Depois de lavar extensivamente, proceder do seguinte modo:

Adicionar ao banho de órgãos 0,1 ml de Prazosin 10-3 M e esperar durante 20-30 min
para garantir que o Prazosin se ligue a todos os receptores.

6) ELABORAÇÃO DE UMA CURVA DOSE-EFEITO CUMULATIVA NA PRESENÇA DE ATROPINA

Sem lavar o órgão (portanto na presença do Prazosin), reproduzir a curva dose-efeito

cumulativa de NA descrita em 3). Com esta experiência pretende-se constatar que mudanças
ocorreram na curva de concentração-efeito da NA na presença de Prazosin.

7) CONTRUÇÃO DOS GRÁFICOS

Com o auxílio do Excel, os dados deverão ser plotados em uma planilha e, então, deverá
ser construído um gráfico de curvas. A partir da interpretação do gráfico os alunos deverão
classificar o tipo de antagonismo que está em evidência no presente experimento.