Protocolo para manipulação do vírus Influenza Aviária.

Coleta de material:

- Sangue
- Fezes
- Swab de traquéia
- Swab de cloaca

Material Utilizado para coleta:

- Seringas de 1, 3, ou 5mL dependendo do animal a ser colhido o

sangue;
- Anticoagulante(citrato de sódio a 2% ou heparina);
- Tubos de centrífuga;
- Isopor para acondicionamento do material;
- Gelo
- Meio de transporte;
- Álcool-iodado;
- Algodão;
- Jaleco;
- Luvas.

Material Utilizado no Tratamento do material:

- Kaolin ou RDE (função: destruir os receptores inespecíficos de

Hemaglutinina);
- Meio de transporte: PBS + antibióticos ;
- Antibióticos: estreptomicina, penicilina e fungizona, para evitar
contaminação;
 Processamento do material:

- Sangue: Centrifugação do sangue à 1500 RPM / 10 minutos,

separar o sobrenadante e fazer o tratamento do material, depois
fazer HI.

- Fezes: Homogeneizar bem o material até desfazer todas as

partículas, depois centrifugar 2000 RPM / 10minutos, colher o
sobrenadante, fazer diluições, o meio utilizado para fazer as
diluições devem estar com antibióticos, depois inocular em ovo
embrionado com 8 à 11 dias, incubar a 330C colher o líquido
alantóico depois de 3 dias.

- Swab de traquéia e de cloaca: Após coletado e armazenado em

PBS + antibióticos, homogeneizar bem o material e “apertar” o
swab contra a parede do tubo; centrifugar 2000 RPM / 10 min.,
fazer 2 diluições (1:2 e 1:10) e inocular o sobrenadante em ovo
embrionado com 8 à 11 dias, incubar a 33 0C e colher o líquido
alantóico depois de 3 dias.

- Tramento do plasma

- 1 parte do plasma + 3 partes de caolin ou RDE, incubar à 37 0C e

deixar incubando de um dia para o outro;
- No dia seguinte aquecer a 56 0C / 30 min. para a inativação do
plasma;
- Centrifugar à 1500 RPM / 10 min;
- Colher o sobrenadante;
- A este sobrenadante adicionar um volume igual de papa de
hemácia à 50% ;
- Deixar 1 hora na geladeira (4 0C) e de 10 em 10 min. homogeneizar;
- Centrifugar novamente;
- Colher o sobrenadante e partir para o HI.
- A diluição do plasma no final do tratamento é de 1:5;

HI

10) PBS: 50 L em toda placa;

20) Plasma : no primeiro orifício adicionar aos já existentes 50 L de
PBS 50 L de plasma a ser testado( para fazer um controle do plasma
) no segundo orifício adiciono também 50 L onde a diluição ficará de
1:10, daí fazer diluições sucessivas;
30) Adicionar 50 L de antígeno padrão em toda placa
40) Incubar por 1 hora a temperatura ambiente;
50) Adicionar 50 L de hemácia em toda placa, após 40 minutos fazer
a leitura.

Controle de Vírus

PBS + Vírus + Hemácia

Controle da Hemácia

PBS + Hemácia

Controle do Plasma

PBS + Plasma + Hemácia