Universidade Federal do Rio de Janeiro

Escola de Química
Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos
Biorreações e Biossistemas

Modelagem cibernética da produção de

eritritol pela levedura não-convencional
Yarrowia lipolytica

Felipe Valle do Nascimento

Rodrigo Lannes Poubel

Maria Alice

Rio de Janeiro, Junho de 2015.

Introdução
Diferentes abordagens podem ser utilizadas para a modelagem metabólica de
sistemas biológicos. Nesse sentido, os diferentes caminhos a serem escolhidos tendem a
ter seus parâmetros de decisão pautados sobre a disponibilidade de dados experimentais
que permitam o ajuste e validação dos modelos obtidos à realidade observada, dados
esses tão específicos quanto a expressão de DNA e RNA, para abordagens bottom-up,
como também dados mais generalistas, como as concentrações de substratos e produtos,
bastante utilizados nas abordagens top-down.

Os modelos que aplicam a análise de controle metabólico ou a teoria dos

sistemas bioquímicos normalmente falham nas suas missões, pois a capacidade de
predição de resultados a partir dos modelos é muito dependente da qualidade dos dados
alimentados, devido ao fato de serem muito mais um conjunto de técnicas pré-definidas
para localização dos pontos de análise de sensibilidade do que um método de
modelagem. Assim, a modelagem cibernética apresenta a vantagem de ser uma
metodologia que permite tanto a inclusão de fatores em nível genético quanto
parâmetros de influência externa, tido como efetores globais de modificação (Varner &
Ramkrishna, 1999).

Com isso, propõe-se a modelagem cibernética da produção de eritritol pela

levedura não-convencional Yarrowia lipolytica. O processo de produção de eritritol e
ácido cítrico utilizando glicerol como substrato já vem sendo amplamente reportado na
literatura, mas abordagens de modelagem metabólica ainda não foram feitas. No
entanto, os caminhos metabólicos (Figura 1) para a produção do eritritol já foram
propostos por Tomaszewska et al. (2014), onde a produção seria proveniente da
utilização de eritrose-4-fosfato resultante da via das pentoses para a formação do
eritritol pela ação da enzima eritrose redutase (eritrose  eritritol), com consumo de
NADPH.

Assumindo que este mapa metabólico é correto, até mesmo por ser muito
semelhante às vias comumente observadas nos microorganismos em geral, parte-se para
as seguintes hipóteses prévias necessárias a realização topológica (Figura 2):
 Figura 1. Mapa metabólico proposto por Tomaszweska et al. (2014).

Glicerol (GLC)

e1

Glicerol-3-
fosfato (G3P)
e2
e3A Gliceraldeído-3-
Piruvato (PYR)
fosfato (GA3P)

e4A e4B e3C

e3B Eritrose -4-
fosfato(E4P)

Ácido cítrico Biomassa (X) Frutose-6-

(Ác.C) fosfato (F6P)
NADPH
e5

Manitol (MAN)
e6

Eritritol(ERY)

Figura 2. Mapa topológico do metabolismo da levedura Yarrowia lipolytica para

produção de eritritol.

 O balanço de ATP e NAD ou NADPH está completo;

 Assume-se que não há acúmulo de produto intracelular;
 Assume-se que não há formação de outros subprodutos como arabitol e
pentoses;
 Assume-se que o glicerol é transportado para o interior da célula por
difusão simples.
Taxas reacionais
As taxas reacionais, baseadas nos substratos das reações, têm seus modelos
criados a partir daqueles utilizados por Ramkrishna & Varner (1999), como é visto
abaixo. Genericamente, assume-se que e são constantes de taxa e saturação para
as enzimas que consomem um determinado substrato e que e são constantes de
taxa e saturação relativas à indução da produção da enzima por um determinado
substrato.
 Entretanto, para as taxas reacionais de enzimas que catalisam a transferência de
grupos (transferases), modelos diferentes são propostos na literatura. Tendo isso em
vista, alterações foram feitas para duas reações, de acordo Segel (1976, capítulo 4):

 Para a reação e3C, foi assumido o modelo ping-pong para enzimas com
dois substratos, segundo Sabate et al.(1995). A referência lida com enzimas presentes
em mamíferos, mas como não foram encontradas outras informações na literatura,
optou-se por utilizar essa referência como base para esta enzima teórica;
 Para a reação e6, foi considerado o modelo Bi Bi ordenado para enzimas
com dois substratos, segundo Lee et al., (2003);
 Para ambas as reações acima citadas, foram consideradas que a indução
delas é realizada de forma mútua pelos dois substratos das enzimas.
Variáveis cibernéticas locais
O estudo do mapa metabólico proposto na Figura 1 resulta em uma realização
topológica com cinco vias elementares divergentes (Figura 2). Assim, as variáveis
cibernéticas locais complementares serão da forma genérica:

Assim, tem-se que:

Variáveis cibernéticas globais
As variáveis cibernéticas globais devem refletir a influência dos componentes do
meio de cultivo e das condições ambientais sobre a topologia proposta. Logo,
consideram-se os seguintes fatores como relevantes:

 Altas concentrações de frutose-1,6-bisfosfato inibem, por alosteria, a

atividade da e1 (glicerol quinase) (Selwood & Jaffe, 2012). Como este metabólito foi
excluído por questões de simplificação da rede topológica, julgou-se adequado inserir
esse efeito inibitório para a molécula de F6P, que seria o produto direto do consumo da
frutose-1,6-bisfosfato;

 A pressão osmótica, determinada pelas concentrações de NaCl e glicerol

no meio de cultivo, influenciam na produção de polióis;

 O pH, que desvia o metabolismo da produção de ácido cítrico para

produção de polióis;

 A fonte de nitrogênio, que deve ser limitante para haver a produção do

ácido cítrico e não limitante para produção de biomassa;

 A concentração da fonte de carbono (glicerol), que influenciará na

pressão osmótica, assim como na produção de biomassa e na
produção/degradação de produto;

 A presença de manganês, na forma de cátion bivalente, que aumenta a

atividade de algumas enzimas, como a enzima teórica e3C.

Logo, teremos as seguintes variáveis globais cibernéticas:

1. Para contabilizar os efeitos de inibição do tipo feedback, causado pela F6P na

reação e1 e diminuição da atividade em pH e NaCl baixos:
 onde o denominador da fração representa o nível máximo a partir do qual ocorre
inibição completa da reação e1;

2. Para contabilizar os efeitos de desvio do metabolismo relacionados à mudança

de pH, mudanças na pressão osmótica resultante da adição de NaCl, além do
aumento da atividade da enzima teórica e6 pela presença de íons Mn2+:

o Aumento da atividade em pH e NaCl baixos:

o Aumento da atividade em pH baixo e NaCl alto:

o Aumento da atividade em pH e NaCl baixos:

o Aumento da atividade na presença de manganês, pH baixo e NaCl alto:

3. Finalmente, para contabilizar o efeito dos substratos no crescimento celular e o

meio deficiente em fonte de N que leva à produção de ácido cítrico:
Os efeitos globais de adição de tiamina e cálcio como essenciais para a atividade das
transaldolases presentes na enzima teórica e3C não foram incluídos, uma vez que há a
hipótese de que o extrato de lêvedo usado no meio de cultivo já tenha esses
componentes, mesmo que em quantidades mínimas.
Variáveis cibernéticas completas
As variáveis cibernéticas completas são, então, o produto da variável local pela
variável global. Portanto, teremos as seguintes variáveis cibernéticas completas:

e
Balanço das variáveis de estado e enzimas
Como, diferentemente de Varner & Ramkrishna (1999), não consideramos o uso
de todos os produtos para crescimento celular, apenas o piruvato (PYR), assim apenas
ele entra no balanço de geração de célula.

Só existe glicerol (GLC) como fonte de carbono e ele entra na célula na taxa
por difusão. Além disso, saem da célula ácido cítrico (Ác.C), manitol

(MAN) e eritritol (ERY) nas taxas: , , ,

respectivamente, por difusão.

O subescrito " " denota metabólito externo a célula. é densidade celular.

é o coeficiente de difusividade de cada metabólito pela membrana celular.

Balanço interno da célula

Balanço externo

Balanço de enzimas
 é um parâmetro de decaimento da enzima. Não teremos taxa rg porque nossa
biomassa está atrelada ao piruvato como já foi anteriormente explicado. Não teremos
taxa de síntese de enzima constitutiva porque consideramos todas induzidas por
substrato.
Referências bibliográficas
Lee, J-K.; Kim, S-Y.; Ryu, Y-W.; Seo, J-H.; Kim, J-H. Purification and
Characterization of a Novel Erythrose Reductase from Candida magnoliae APPLIED
AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol. 69, No. 7, p. 3710–3718, July
2003.

Sabate, L.; Franco, R.; Canela, E. I.; Centelles, J. J.; Cascante, M.; A model of the
pentose phosphate pathway in rat liver cells Molecular and Cellular Biochemistry.
v.142. p.9-17, 1995.

TOMASZEWSKA, L.; RYMOWICZ, W.; RYWINSKA, A.; Mineral Supplementation

Increases Erythrose Reductase Activity in Erythritol Biosynthesis from Glycerol by
Yarrowia lipolytica. Appl Biochem Biotechnol. v.172. p.3069–3078. 2014.

Varner, J.; Ramkrishna, D.; Metabolic Engineering from a Cybernetic Perspective:

Aspartate Family of Amino Acids. Metabolic engineering. v.1. p. 88-116. 1999.