ETEC OSASCO II

Técnico em Química

Daiane Aparecida da Silva Barros - nº 03

Joice Aline Cerqueira da Silva - nº 13
Maykon Henrique Pelegrini Bonis - nº 20
Rosângela Corrêa Refundini Pitol - nº 26

​ Bacteriologia

Professores Vitor Amaral e Jorge Luís

Microbiologia

Osasco / São Paulo

Setembro
2016
SUMÁRIO
Aula 01 - Coleta, Inoculação e Análise de Macrocolônias de Bactérias
Presentes em Amostras de Solo.

INTRODUÇÃO
OBJETIVOS
MATERIAIS
MÉTODOS
RESULTADOS E DISCUSSÕES
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aula 02 - Análise de uma única macrocolônia isolada a partir da amostra de

bactérias do solo.
INTRODUÇÃO
OBJETIVOS
MATERIAIS
MÉTODOS
RESULTADOS E DISCUSSÕES
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aula 03 - Coloração Gram

INTRODUÇÃO
OBJETIVOS
MATERIAIS
MÉTODOS
RESULTADOS E DISCUSSÕES
CONCLUSÃO
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aula 01: Coleta, Inoculação e Análise de Macrocolônias de Bactérias
Presentes em Amostras de Solo.

INTRODUÇÃO
As bactérias são conhecidas desde 1674, mas a sua estrutura é ainda objeto
de estudo, são os seres vivos mais simples do ponto de vista estrutural, e de menor
tamanho, podendo ser conhecidas também como micróbios. As bactérias são
micro-organismos unicelulares, procariontes, e algumas causam doenças. São
abundantes no ar, no solo e na água, e na sua maioria inofensivas para o ser
humano, sendo algumas até benéficas.
Por serem microrganismos procariontes, não apresentam um núcleo definido,
estando o seu material genético compactado e enovelado numa região do
citoplasma chamada de nucleoide. As bactérias apresentam uma membrana
plasmática recoberta por uma parede celular, o seu tamanho pode variar entre 0,2 a
5,0 micrômetros, sendo por isso, observáveis apenas ao microscópio óptico. As
bactérias reproduzem-se por divisão celular, as causadoras de doenças
denominam-se patogênicas. Estas possuem diversas formas, que podem variar de
acordo com o meio e com o tipo de associação. A cultura de bactérias é o
crescimento de colônias de micro-organismos induzida pelo Homem para facilitar o
seu estudo.
Para a realização de uma cultura bacteriana, precisamos de um inóculo e de
um meio de cultura. O meio de cultura é uma substância líquida ou sólida, simples
ou complexa, que permite a nutrição, o crescimento e a multiplicação dos
microrganismos do inóculo. Os meios de cultura são selecionados de acordo com o
tipo de bactéria a observar. As bactérias multiplicam-se em meios de cultura
apropriados desde que sejam respeitadas as condições de temperatura, pH,
umidade e sua composição nutricional.

OBJETIVO
Inocular e/ou introduzir artificialmente microrganismos num meio específico
de qualquer objeto de uso corrente num meio de cultura esterilizado, para que as
bactérias presentes nesses objetos se multipliquem, formando colônias visíveis a
olho nu (macrocolônias).

MATERIAIS
Meio de Cultura

● Meio de cultura​ Standard Methods Ágar

● Béquer de 500 mL
● Bastão de vidro
● 200 mL de água destilada
● Tripé
● Tela de amianto
● Bico de Bunsen
● Fósforo ou isqueiro

Coleta de bactérias em amostras de solo

● Amostras de solo (50g)
● Erlenmayer de 250 mL autoclavado
● Funil de vidro
● Micropipeta de 100 µL
● Ponteira para 100 µL (amarela)
● Alça de Drigalski
● Béquer de 50 mL (não estéril) com Álcool 70%
● Placas de Petri (vidro ou descartáveis) já preparadas

METODOLOGIA

Preparação do Meio de Cultura

1. Pesou-se a quantidade de meio de cultura ​Standard Methods Ágar ​em 200

mL de água destilada de acordo com as especificações do fabricante;
2. No béquer de 500 mL, adicionou-se o meio ​Standard Methods Ágar e os 200
mL de água destilada;
 3. Aqueceu-se o conteúdo do béquer em bico de bunsen até ferver, agitando
com o bastão de vidro, para a completa dissolução do meio em água
destilada;
4. O conteúdo foi transferido para um Erlenmeyer de 250 mL, vedado com um
papel alumínio que continha uma etiqueta indicativa de autoclavação.
5. Na autoclave, o conteúdo preparado ficou por 15 minutos à 121°C.

Preparação das Placas de Petri

O meio de cultura preparado e auto-clavado ficou próximo ao bico de bunsen

a fim de evitar contaminações. A preparação das placas foi feita da seguinte forma:
1. Despejou-se cerca de 10 mL do meio de cultura nas placas de Petri que
também foram ser abertas perto do bico de bunsen;
2. As placas de Petri foram deixadas na bancada para esfiarem, à temperatura
ambiente, até o meio de cultura solidificar-se;
3. Após a solidificação do meio de cultura, as placas de Petri foram
invertidas(deixá-las de ponta cabeça).

Preparação da inoculação do solo

1. Coletou-se cerca de 50g de solo da compostagem e misturou-se com 100ml

de água destilada. A mistura foi agitada até homogeneizar;
2. Deixou a mistura descansar, até decantar;
3. 100 µL da amostra da solução de solo foram sugados da parte superior e
despejados sobre o meio de cultura, perto do Bico de Bunsen, para evitar
contaminações;
4. A alça de Drigalski foi mergulhada no álcool 70% e flambada no bico de
bunsen. Depois de apagado o ​fogo, ela foi esfriada próxima ao fogo do bico
de bunsen para não matar os micro-organismos da amostra;
5. Em seguida espalhou-se com a alça de Drigalski e por toda a placa de petri o
conteúdo da amostra;
6. Incubou-se a placa de forma invertida;
 7. A placa foi identificada com turma (módulo, curso e período), tipo amostra (no
caso, solo), local das amostras e data de inoculação.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise das macrocolônias foi realizada de acordo com três características

básicas. E foram elas:
● Tipos de formato da colônia:

Figura 01:​ Ilustração dos tipos de formatos de colônia a serem identificados. ​Fonte:​ Anexo do
Roteiro de Laboratório para a aula prática.

● Tipos de formato da borda:

Figura 02: ​Ilustração dos tipos e formatos de colônia a serem identificados. ​Fonte:​ Anexo do Roteiro
de Laboratório para a aula prática.
● Tipos de Textura da Colônia
○ pastosa (brilho opaco, cera);
○ gelatinosa ou mucoide (muito brilho);
○ rugosa ou cerebriforme;
○ seca (sem brilho);
○ ondulada ou linhas de crescimento.
● Tipos de Opacidade da Colônia (capacidade da luz atravessar a colônia)
○ Transparente (consegue ver tudo o que está do outro lado da colônia);
 ○ Translúcida (não se consegue ver tudo o que está do outro lado da
colônia);
○ Opaca (não se consegue ver através da colônia).

Os resultados obtidos no experimento foram agrupados na tabela 01, para

uma melhor visualização e compreensão dos dados:

Micro-organismo Coloração da Textura da Formato da Opacidade Formato da

colônia colônia colônia borda

1 Bege escuro Gelatinosa Redonda Lisa Opaca

2 Bege Gelatinosa Irregular Rizóide Translúcida

3 Bege Claro Gelatinosa Puntiforme Lisa Translúcida

4 Bege Gelatinosa Irregular Lisa Opaca

5 Transparente Seca Irregular Lisa Transparent

e
Tabela 01: ​Resultados obtidos no experimento e classificados de acordo com os padrões
previamente estabelecidos.

A coleta de 50 g de amostra de solo da compostagem foi realizada no

laboratório. Após uma semana, esta amostra foi analisada e classificada a olho nu,
o que dificultou a identificação de cada colônia pelo fato da cor e textura serem
similares. Pelas colônias estarem muito juntas, houve dificuldade na identificação de
formato da borda e formato da colônia.

C​ONCLUSÃO

Constatou-se que a espécie de micro-organismo 1 foi a que apresentou maior

crescimento, possivelmente pelo fato da temperatura ser ideal para determinada
colônia. O meio de cultura utilizado englobava elevada concentração de
carboidratos e uma estrutura química rica em nutrientes, beneficiando o ambiente
para determinada colônia.

Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com o tipo de

micro-organismo que o pesquisador deseja obter, para pré enriquecimento de
bactérias que sofreram algum processo físico ou químico, manutenção em
laboratório, dosagem de vitaminas e antibióticos, avaliação de atividades
metabólicas e enriquecimento.

O meio de cultura utilizado neste experimento tinha como objetivo enumerar

bactérias em geral. Foi necessário utilizar água destilada e autoclavar para
esterilizar e não ocorrer contaminação de bactérias de meios externos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

RIBEIRO, Maria Cagnoni; SOARES, Maria Magali. Microbiologia Prática: Roteiro e

Manual: bactérias e fungos – São Paulo: Ed. Atheneu, 2000.

AYRES, Adriana Lopes. Meios de Cultura de Microrganismos. Disponivel

em:<http://www.portaleducacao.com.br/biologia/artigos/57896/meios-de-cultura-de-
microrganismos>. Acesso em: 11 de setembro de 2016.
Aula 02 - Análise de uma única macrocolônia isolada a partir da amostra de
bactérias do solo.

INTRODUÇÃO

O isolamento e a cultura de micro-organismos são duas práticas comuns na

microbiologia. O crescimento destes seres microscópicos em meios de cultura de
laboratório permite a obtenção de culturas puras ou mistas. Os estudos
laboratoriais que envolvem estas técnicas, ocorrem, em sua maioria, em culturas
puras, ou seja, em uma única espécie, separada a partir de uma comunidade mista.

O isolamento, portanto, permite a investigação de características

morfológicas sem a interferência de outros micro-organismos, contudo, somente a
observação de caracteres morfológicos não é suficiente para a identificação e
classificação desses organismos.

É importante ressaltar a importância do meio de cultura, pois, ele fornecerá

condições balanceadas de nutrientes, pH, temperatura, pressão de oxigênio e
umidade.

A técnica mais popular de semeadura é conhecida como esgotamento de

alça. Através de uma alça de platina, coleta-se uma pequena parcela do meio e
risca-se, sucessivamente, uma placa de Petri, fazendo movimentos de zigue-zague
de forma contínua ou descontínua.

Após alguns dias, haverá o crescimento dos micro-organismos em grande

número, formando, na maioria das vezes, macrocolônias. O ideal é que pelo menos
uma célula fique isolada das restantes, obtendo-se, ao final, uma colônia derivada
da multiplicação da célula original, sendo, portanto, células geneticamente iguais.

OBJETIVOS

Aplicar a técnica de isolamento conhecida como esgotamento de alça para

obter apenas uma espécie de bactéria contida no solo da compostagem.
MATERIAIS

● Placa de Petri;
● Bico de Bunsen;
● Alça de platina;
● Fósforo ou isqueiro.

MÉTODOS

A placa de Petri utilizada na primeira aula, contendo os micro-organismos formados,

foi utilizada para o isolamento de uma única espécie.

1. Com o Bico de Bunsen devidamente ligado, esterilizou-se a alça de platina;

2. Perto da chama, a placa de Petri contendo as macrocolônias foi aberta e,
utilizando a alça de platina, uma pequena quantidade de uma das colônias,
foi coletada;
3. Em outra placa de Petri, foram aplicadas as técnicas de espalhamento em
estrias, como mostra a figura 01, a seguir:

Figura 01:​ Exemplo da técnica de espalhamento por estrias na placa de Petri.

Fonte:​ <http://www.esac.pt/Abelho/MicroAmbiental/Protocolos%5B1%5D_2012_2013.pdf>

Acesso em 09 de setembro de 2016.

 4. A placa de Petri foi devidamente fechada e armazenada e o Bico de Bunsen,
desligado.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados do isolamento da bactéria podem ser sintetizados na tabela 01,

a seguir:

Características Micro Escolhido Micro Isolado Micro Contaminante

Cor Bege escuro Bege escuro Não houve

Textura Gelatinosa Gelatinosa Não houve

Formato da Redonda Redonda Não houve

colônia

Formato da borda Lisa Lisa Não houve

Transparência Opaca Opaca Não houve

Tabela 01: ​Características morfológicas do micro-organismo isolado.

O isolamento da bactéria escolhida foi executado com sucesso pois não

houve contaminação de outro micro-organismo, entretanto a separação das células
não foi precisa, possivelmente pelo espalhamento não tão preciso, pois o espaço da
placa de Petri não foi ocupado inteiramente.

CONCLUSÃO

Constatou-se que a espécie de micro-organismo 1 escolhida para isolamento

apresentou ótimo crescimento de colônia, possivelmente porque foi utilizado o
mesmo meio de cultura do processo anterior no qual esta mesma especie foi a que
obteve maior crescimento.

O meio de cultura utilizado neste experimento tinha como objetivo cultivar o

crescimento da bactéria escolhida. Foi necessário utilizar água destilada e
autoclavar materiais para esterilizar e não ocorrer contaminação de bactérias de
meios externos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABELHO, Manuela. Protocolos de Microbiologia Ambiental. Parte 1 - Métodos

básicos em microbiologia. Escola Superior Agrária. Instituto técnico de Coimbra.
Portugal. 2013

CARVALHO, Luciana Debortoli de. Preparo de Materiais em microbiologia, Meios de

cultura usados no laboratório, técnicas de semeadura e colorações. Universidade
Federal de Juiz de Fora. Disponível em:
<http://www.ufjf.br/microbiologia/files/2012/11/Meios-de-cultura-usados-no-laborat%
C3%B3rio-e-colora%C3%A7%C3%B5es.pdf>. Acesso em 09 de setembro de 2016.
Aula 03: Coloração Gram

INTRODUÇÃO
A coloração Gram recebeu este nome em homenagem ao seu descobridor,
Hans Cristian Joaquim Gram, médico dinamarquês, em 1884.Gram observou que as
bactérias adquiriram cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes.
Gram classificou-as em dois grupos:
● Gram-positivas: fixam cristais violeta;
● Gram-negativas: apresentam coloração avermelhada.
A técnica de Gram é fundamental para a identificação das bactérias, sendo
muito utilizada atualmente, como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.
Existe um protocolo que se segue para fazer a coração de um esfregaço,
com etapas bem definidas e com misturas de substâncias [solução de cristal violeta;
solução de lugol (iodeto de potássio - KI); solução de safranina e solução de álcool]
que resultarão na coloração positiva ou negativa.
Esta coloração permite distinguir os mais variados tipos de bactérias e que
tipo de parede celular elas têm (se mais simples ou mais complexas, com mais ou
menos peptídeoglicanos – principal componente da parede celular bacteriana).
Estas bactérias de diferentes colorações possuem, também, graus diferentes
de virulência. As gram-negativas, por exemplo, são constituídas por uma endotoxina
denominada LPS (lipopolissacarídeo), que é causadora da patogenicidade. As
Gram-positivas, por sua vez, possuem a exotoxina rica em ácido lipoproteico que
confere aderência à bactéria.
As bactérias gram-positivas, durante o processo de descoloração com álcool
etílico, retêm o corante, permanecendo com a coloração conferida pelo corante
primário (roxo).
Já as bactérias gram-negativas, com parede celular composta por
(lipopolissacarídeos), perdem o complexo iodo-pararosanilina, são incapazes de
reter o violeta, assumindo a cor do corante de fundo (vermelha).
São as diferenças da estrutura da parede bacteriana, principalmente com
relação à espessura da camada de peptideoglicano, que é responsável pelo
diferente comportamento das bactérias diante da coloração de Gram.
 A figura 01, abaixo, exemplificam os tipos de coloração Gram:

Figura 01:​ ​Resultados após a coloração de Gram.

Disponível em:>http://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-de-gram/>
Acesso em 11 de setembro de 2016.

OBJETIVOS

Fazer a coloração Gram para identificação das bactérias obtidas na aula

anterior.

MATERIAIS
● Placa de Petri;
● Bico de Bunsen;
● Lâmina de vidro para microscópio;
● Fósforo ou isqueiro;
● Microscópio óptico;
● Alça de platina.
Reagentes
● Água destilada;
● Corante violeta;
● Lugol;
● Álcool 99%;
● Corante Safranina.
MÉTODOS
Preparação da lâmina
1. Utilizando o isqueiro, acendeu-se o bico de bunsen;
2. Abriu-se a placa de Petri e, utilizando a alça de platina, coletou-se uma parte
da macrocolônia;
3. Pingou-se, na lâmina, uma gota de água destilada e espalhou-se a parte
coletada da macrocolônia na mesma;
4. A lâmina foi seca perto do bico de bunsen, nunca deixando a temperatura
subir acima da temperatura da pele da mão.
Coloração Gram
1. Pingou-se algumas gotas de corante violeta sobre a lâmina e, após 1 minuto,
esta quantidade foi desprezada;
2. Pingou-se algumas gotas de corante lugol sobre a lâmina e, após 1 minuto,
esta quantidade foi desprezada;
3. Rapidamente, a lâmina foi lavada com álcool 99%;
4. Pingou-se algumas gotas de safranina e, após 1 minuto, esta quantidade foi
desprezada;
5. A lâmina foi lavada com água deionizada;
6. A lâmina foi seca mecanicamente.
Observação no microscópio
1. Colocou-se a lâmina no local indicado no microscópio;
2. Ajustaram-se as lentes e o foco para uma melhor observação;
3. Observou-se as bactérias com a lente de 100x e após a utilização do óleo de
imersão, a visualização ficou mais nítida.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após a preparação da lâmina fixou-se as bactérias e procedeu-se a

coloração Gram conforme a técnica descrita na literatura. Iniciou-se a técnica com o
corante violeta, seguindo4-se do Lugol efetuando a lavagem rápida com álcool 99%,
para descorar a lâmina.
 Cobriu-se a lâmina com Safranina e aguardou corar a lâmina. Após esse
procedimento, lavou-se com água deionizada e secou-se a lâmina ao ar livre.
Colocou-se no microscópio testando todas as lentes de aumento, iniciando pela de
menor aumento, de 4X, seguida das outras, de aumento de 10X, 40X e, na última,
de 100X, utilizou-se uma gota de óleo de imersão sobre a lâmina e, assim,
observou-se através do microscópio o resultado da coloração Gram;

Assim, a bactéria foi classificada da seguinte maneira:

Tipo de Células: ​Bacilos
Arranjo de Colônia:​ Estreptobacilos
Gram:​ Positivo (Violeta)
* Observou-se a formação de esporos.

A figura 01, abaixo, ilustra a imagem obtida do microscópio com aumento de

100 X.

Figura 01: ​Imagem obtida do microscópio lente 100X.

Acervo pessoal: ​Foto tirada em 08 de setembro de 2016.
CONCLUSÃO
Observou-se através do microscópio com aumento de 100X que o
micro-organismo isolado é Gram-positivo, o tipo de células são bacilos e o arranjo
de colônias são Estreptobacilos. Houve formação de alguns esporos provavelmente
pelo fato das bactérias serem expostas a altas temperaturas e se não houvesse a
formação dos mesmos, provavelmente o DNA seria destruído. Assim, não haveria
reprodução e formação de novas células-filhas.
Foi necessário utilizar água destilada e autoclavar materiais para esterilizar e
não ocorrer contaminação de bactérias de meios externos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

MARTINEZ, Marina. Portal Info escola. Bioquímica. Microbiologia.

Disponível em<http://www.infoescola.com/bioquimica/coloracao-de-gram/> Acesso
em 11 de setembro de 2016.

ARAUJO, Marilia. Portal Info escola. Microbiologia. Reino Monera. Bactérias

gram-positivas e gram-negativas. Disponível em:
<​http://www.infoescola.com/microbiologia/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativa
s/​>. Acesso em 11 de setembro de 2016.