DISCIPLINA DE HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA - 2005

Prof.a Lizeti T. O. Ramalho

MÉTODOS DE ESTUDO EM HISTOLOGIA

1 - GENERALIDADES: A histologia estuda os tecidos dos animais, engloba não somente a

estrutura microscópica dos tecidos, mas também a das células, órgãos e sistemas de órgãos.
Deve-se entender que o corpo é constituído por células, matriz intercelular e uma
substância fluida, o fluido extracelular ou fluido tissular. Este fluido tissular derivado do plasma
sanguíneo, transporta nutrientes, oxigênio e moléculas de sinalização.
As moléculas de sinalização, os produtos de catabolismo e o dióxido de carbono
inversamente são liberados pelas células e chegam aos vasos sanguineos e linfáticos através do
fluido extracelular. O fluido e a matriz intercelular não são visíveis nas preparações histológicas
de rotina, mas em histologia a sua presença invisível deve ser compreendida.

2 - MÉTODOS COMUMENTE USADOS NO ESTUDO DAS CÉLULAS E TECIDOS: Os

métodos de preparação alinham-se em dois grupos:
2.1 - Exame a fresco ("in vivo"): Consiste na observação de células vivas com a finalidade de:
verificar diferentes tipos de movimentos, estrutura celular, a atividade fagocitária, os aspectos de
reprodução celular, aspectos de ingestão e excreção de substâncias metabólicas. Ex.: Estudo do
esperma com a finalidade de observar a mobilidade do espermatozóide.
2.2. - Métodos de estudo após a morte: É o método mais comumente utilizado em Histologia,
que permite a obtenção de preparados histológicos permanentes (lâminas) para o estudo ao
microscópio.
Os órgãos, porém, na sua maioria são muito espessos e precisam ser reduzidos a cortes finos,
suficientemente transparentes para serem analisados ao microscópio de luz. Compreende as
preparações fixadas e coradas de tecidos ou órgãos. Este é o método de uso corrente na
Histologia. O material é submetido a uma seqüência de tratamentos (técnica histológica) a fim de
adquirir condições de ser analisado ao microscópio de luz.
Obviamente, o que se deseja é levar ao microscópio um preparado no qual os tecidos estejam
perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam
quando vivos. Mas, apesar dos cuidados tomados, este objetivo não é alcançado, observando-se
em todos os preparados histológicos certos artefatos conseqüentes ao processamento que
sofreram.
3 - TÉCNICAS HISTOLÓGICAS:
3.1 - Colheita do material: Para fins citológicos e obtenção de boas preparações histológicas, o
material deve ser retirado de um animal anestesiado ou imediatamente após a sua morte.
Os tipos de colheitas são:
a - Biópsia: remoção de tecido vivo para posterior análise histológica.
b - Necrópsia: remoção do tecido morto para posterior análise histológica.
c – Punção.
d - Escarificação: raspagem.

3.2 - Fixação: A fixação tem como objetivo evitar a destruição das células por suas próprias
enzimas (autólise) ou por bactérias. As peças histológicas (tecidos) devem ser adequadamente
tratados imediatamente após a sua retirada, visando além disso endurecer os tecidos tornando-os
mais resistentes às etapas subsequentes.
3.2.1 - Qualidades de um bom fixador:
a - ter um bom poder de penetração;
b - matar instantaneamente as células;
c - endurecer a peça para facilitar a obtenção de cortes:
d - deve matar microorganismos que eventualmente contaminam as peças;
e - deve conservar o máximo possível da estrutura celular;
f - deve facilitar a posterior coloração dos cortes;
g - deve insolubilizar as proteínas, pois estas são as principais responsáveis pela
estrutura das células e tecidos.
3.2.2 - Agentes fixadores
Em Histologia, utiliza-se quase exclusivamente a fixação química, por meio das
substâncias chamadas fixadores.
Fixadores simples: cloreto de mercúrio, ácido pícrico, aldeído fórmico, tetróxido de
ósmio e glutaraldeído.
Misturas fixadoras: Bouin, líquido de Helly, Gendre, Zenker, alcool-éter.
Tamanho das peças: devem ser pequenas, variando de 3 mm a 1 cm.
O volume do fixador: deve ser de 20 vezes o volume da peça.

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 3.3 - Lavagem da Peça: A peça deve ser lavada em água corrente durante 24 horas, a fim de
remover o fixador.

3.4 - Inclusão: A peça deve ser incluída, afim de se obter cortes suficientemente finos para
serem observados ao microscópio. Os tecidos devem ser embebidos e envolvidos por substância
de consistência firme. Ex.: gelatina, celoidina. Parafina e resinas epoxi.
Para a inclusão da peça em parafina é necessário proceder a:
a - Desidratação: retirada da água presente nos tecidos, pela passagem em álcoois
crescentes: 70, 80, 90 e Absoluto.
b – Diafanização ou clarificação: consiste em impregnar a peça num solvente de parafina,
ou seja, xilol, benzol ou toluol.
c - Impregnação ou embebição na parafina: mergulha-se a peça em parafina fundida (60 o C)
no interior de uma estufa. Devido ao calor, o xilol ou benzol evaporam e os espaços
anteriormente ocupados por eles são ocupados pela parafina.
d - Inclusão propriamente dita e confecção do bloco de parafina com a peça envolvida pela
mesma.

3.5 - Microtomia: A microtomia consiste na obtenção de cortes delgados por meio de uma
navalha de aço do micrótomo. A espessura média dos cortes é de 3 a 8 micrômetros (m).
Etapas subsequentes:
a - Banho Maria a 370 C, com objetivo de não formar dobras no preparo.
b - Adaptação na lâmina
c - Adesão do corte na lâmina: levar a estufa a temperatura de 37 a 400C.

3.6 - Coloração: é realizada com a finalidade de obter contraste e evidenciar os vários

componentes estruturais na delgada fatia de tecido e ao nível do microscópio.
A maioria dos corantes usados em Histologia comportam-se como ácidos ou bases.
Para se corar um corte embebido em parafina deve-se proceder da seguinte maneira:
a - Desparafinar o corte com xilol 1 e xilol 2
b - Hidratar o corte com álcoois decrescentes: Absoluto - 90 - 70 e água destilada.
c - Coloração propriamente dita.
d - Montagem - tem a finalidade de encerrar o corte entre a lâmina e a lamínula, afim de
protegê-lo e conservá-lo. A substância usada como meio de montagem é o Bálsamo.

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 e - Estufa - O xilol evapora, o bálsamo seca e a lamínula adere a lâmina.
f - Rotulagem - colocação de uma etiqueta na lâmina com as principais referências do
material.

3.6.1 - Agentes Corantes: Hematoxilina/Eosina (H/E), Fucsina, Tricrômico de Mallory,

Tricrômico de Masson, Tricrômico de Gomori, Tricrômico de Shorr, Corante de Leishman,
Floxina, etc.
A maior parte dos materiais examinados pela primeira vez no curso de Histologia, é
composta por cortes em parafina corados com Hematoxilina e Eosina (H/E).
A Eosina é um corante ácido e a Hematoxilina, embora não seja um corante básico, tem
propriedades muito semelhantes às dos corantes básicos.
Corante básico é a molécula que tem carga positiva (ou cargas positivas) na porção que
possui cor, e, corante ácido é a molécula que tem carga negativa na sua porção que possui cor. A
cor do corante não tem relação com o fato de o corante ser ácido ou básico.
O fenômeno em que determinado corante (como o azul de toluidina) muda de cor após
reagir com determinado componente tecidual é denominado metacromasia.

3.7 - Exceções:
a - Para o tecidos mineralizados (osso, dentina, cemento), logo após a fixação, a peça terá
que ser descalcificada.
Agentes descalcificadores: EDTA e Morse (Citrato de Sódio a 20% e Ácido fórmico 50%
em partes iguais).
b - Do material obtido por punção ou raspado, realiza-se uma extensão ou esfregaço, que
em seguida deverá ser fixado e depois corado, montado e rotulado.

3.8 - Outros Métodos Usados em Histologia:

- Radioautografia: permite a localização de substâncias radioativas nos tecidos.
- Cultura de tecidos: cultivo "in vivo" para estudos de metabolismo de células.
- Centrifugação fracionada: permite isolar quaisquer organelas e inclusões celulares, para
determinar sua composição química e estudar suas funções in vitro.
- Cariometria e citometria: permite verificar o volume do núcleo e da célula
respectivamente.

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 - Histometria: permite contar as diferentes estruturas de um tecido por unidade de
superfície.
- Histoquímica: tem por base a localização de compostos ou radicais químicos em áreas
específicas de um tecido ou em componentes celulares. Ex.: íons, lipídios, proteínas.
- Interpretação dos cortes: estudar um corte histológico ao microscópio, é preciso ter em
mente que a estrutura das células e tecidos está alterada pela técnicas histológicas. E, também de
que a delgada espessura dos cortes cria um obstáculo ao estudo tridimensional dos tecidos e
órgãos, nos limitando à visualizar em apenas duas dimensões. Torna-se assim, necessário o
estudo de cortes realizados em diferentes direções ou em cortes seriados.
Outra dificuldade encontrada é de que quando se cora um preparado, apenas algumas
estruturas são evidenciadas. Por isso é necessário o estudo de várias lâminas, coradas por
diferentes técnicas, para se ter uma idéia completa da composição e estrutura do tecido ou órgão
em exame.
LIVRO: HISTOLOGIA BÁSICA 10.a ed. Junqueira & Carneiro, Ed. Guanabara Koogan.

OBSERVAÇÕES: Sites para complementação do estudo:

http://www.multipolo.com.br/histologia
http://www.virtual.epm.br/material/histologia/frame.htm
http://open-site.org/Science/Biology/Histology/
http://wberesford.hsc.wvu.edu/histol.htm#HISTOLOGY:%20METHOD%20AND
%20MICROSCOPY