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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Desenvolvimento de método por Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência para diferenciação de
genótipos de Lippia gracilis Schauer
SÃO CRISTÓVÃO - SERGIPE

MAIO/ 2009
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Desenvolvimento de método por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência para diferenciação de
genótipos de Lippia gracilis Schauer
Silvana Vieira Floresta Gomes
Dissertação apresentada ao
Núcleo de Pós-Graduação em
Química da Universidade
Federal de Sergipe como
parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre
em Química.
Orientadora: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes
São Cristóvão
2009
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
Gomes, Silvana Vieira Floresta

G633d Desenvolvimento de método por cromatografia líquida de alta
eficiência para diferenciação de genótipos de Lippia gracilis
Schauer / Silvana Vieira Floresta Gomes. – São Cristóvão, 2009.
139 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal de

Sergipe, 2009.
Orientador: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes
1. Lippia gracilis. 2. Genótipos. 3. Fingerprint. 4. Cromatografia -

CLAE. I. Título.
CDU 543.54.5
Dedico este trabalho a Deus,
meu esposo, Anderson,
meus pais, Salomão e Aurora,
minhas irmãs, Fernanda e Luciana.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A Deus, pela vida, fé, força e coragem para realizar este trabalho.
Ao Anderson, meu esposo, pelo amor, compreensão, estímulo, ajuda

e paciência.
À minha mãe e pai, Aurora e Salomão, pelas orações, força e pelo

amor incondicional em todos os momentos de minha vida.
Às minhas irmãs, Fernanda e Luciana, pelo carinho, orações e por ter

torcido por mim. Vocês são demais.
Ao meu amigo, Djalma, pela força e ajuda neste trabalho.
À toda a minha família e amigos, que ficaram felizes por esta vitória.
Muito obrigada por tudo.
A minha amiga, Maria da Paz, pelo apoio e incentivo para fazer o

mestrado.
AGRADECIMENTOS
À profª Drª Valéria Regina de Souza Moraes, pelo companheirismo,

amizade e orientação deste trabalho.
À Universidade Federal de Sergipe pela concessão da bolsa de

estudo e ao Departamento de Química pela oportunidade de execução deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Paulo César de Lima Nogueira por sua colaboração no

desenvolvimento deste trabalho.
À Profª Drª Samísia Maria F. Machado pela ajuda e amizade.
Ao prof. Dr. Sandro Navickiene pela contribuição e por disponibilizar

equipamentos e materiais do seu laboratório para o desenvolvimento deste
trabalho.
Ao prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank pela identificação da espécie Lippia

gracilis Schauer.
À prof. Drª Quézia Bezerra Cass do Departamento de Química da

UFSCar, pela oportunidade de trabalhar ao seu lado e ensinamentos,
durante a minha passagem no seu laboratório.
Ao prof. Dr. Edenir Rodrigues Pereira-Filho do Departamento de

Química da UFSCar, pelos ensinamentos de quimiometria e pelas análises
quimiométricas das minhas amostras.
Ao prof. Dr. Antonio G. Ferreira do Departamento de Química da

UFSCar, pela colaboração e aquisição dos espectros de Ressonância
Magnética Nuclear.
À Drª Lúcia Regina Rocha Martins pelos ensinamentos em

cromatografia líquida de alta eficiência, análise quimiométrica e ajuda em
tudo o que precisei no desenvolvimento deste trabalho.
Ao prof. Dr. Lucindo José Quintans Júnior do Departamento de

Fisologia da UFS, pela ajuda e apoio nas análises farmacológicas deste
trabalho.
Ao prof. Dr. Carlos Alexandre Borges Garcia por disponibilizar o seu
laboratório para as pesagens de todas as minhas amostras.
Ao prof. Dr. Geraldo Humberto Silva pelos ensinamentos e

contribuição deste trabalho.
Ao prof. Dr. Sócrates Cabral de Holanda Cavalcante do Departamento

de Fisiologia da UFS, pelo incentivo para fazer o mestrado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq) pelo apoio financeiro através do Projeto Casadinho (Processo nº
620212/2006-3) para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus amigos do laboratório METABIO, Alan, Daniele, Pablo,

Sandra, Wesley e Gilmara, por toda a amizade, apoio em todos os
momentos que precisei e ajuda no desenvolvimento deste trabalho.
As minhas amigas do laboratório LAPEC, Adriana Gibara e Mônica,

pelo apoio e ajuda no desenvolvimento deste trabalho.
A todos os amigos e funcionários do Departamento de Química –

UFS, que, direta ou indiretamente, contribuíram e compartilharam a
realização deste trabalho.
CURRICULUM VITAE
1. DADOS PESSOAIS
Nome: Silvana Vieira Floresta Gomes
Nome em citações bibliográficas: Gomes, S. V. F. ou Floresta, S. V.
Naturalidade: Salvador – BA
Data de Nascimento: 13/10/1980
2. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO
Mestrado em Química
Universidade Federal de Sergipe, UFS. Ano de conclusão: 2009.

Orientadora: Profª Drª Valéria Regina de S. Moraes.
Nível Superior
Farmácia Habilitação Clínica Industrial, Universidade Federal de

Sergipe, UFS. Ano de conclusão: 2006
3. ÁREA DE ATUAÇÃO
Química Orgânica, Química de Produtos Naturais
Farmácia, Farmacologia
4. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
3.1 – Trabalhos em eventos
1. Machado, S. M. F.; Guimarães, A. G.; Gomes, S. V. F.; Moraes, V.

R. S.; Nogueira, P. C. L.; Filho, E. R. P.; Viana, M. D.; Blank, A. F. Análise
multivariada dos perfis cromatográficos de genótipos de Lippia gracilis, com
e sem estresse hídrico. 32º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, 2009, PN-66, Fortaleza.
2. Gomes, S. V. F.; Martins, L. R. R.; Santos dos, A. D. C.; Viana, M.
D.; Nogueira, P. C. L.; Machado, S. M. F.; ALVES, P. B.; Pereira-Filho, E. R.;
Cass, Q. B.; Blank, A. F.; Moraes, V. R. S. Análise Multivariada dos perfis
cromatográficos de amostras vegetais para diferenciação de genótipos de
Lippia gracillis. 31º Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química,
2008, PN-056-PN-05, Água de Lindóia.
3. Gomes, S. V. F.; Santos dos, A. D. C.; Viana, M. D.; Moraes, V. R.

S.; Nogueira, P. C. L.; Martins, L. R. R.; Cass, Q. B.; Pereira-Filho, E. R.;
Blank, A. F.; ALVES, P. B. Diferenciação de genótipos de Lippia gracillis por
análise multivariada de fingerprints obtidos por CLAE-DAD. XX Simpósio de
Plantas Medicinais do Brasil/ X International Congress of
Ethnopharmacology, 2008. v. 1. p. 05355-05355, São Paulo.
4. Guimarães, A. G.; Machado, S. M. F.; Gomes, S. V. F.; Moraes, V.

R. S.; Viana, M. D.; Blank, A. F.; Castro, R. D. Influência do estresse hídrico
na composição química (perfil químico cromatográfico) dos extratos das
folhas de Lippia gracillis. 18º. Encontro de Iniciação Científica/4a. Encontro
de Pós-graduação, 2008, Aracaju.
5. Bragança, R. B.; Moraes, V. R. S.; Nogueira, P. C. L.; Gomes, S. V.

F.; Ferreira, A. G.. Busca por metabólitos secundários em Kielmeyera rugosa
Choisy (Clusiaceae). 18º Encontro de Iniciação Científica / 4º Encontro de
Pós-graduação da UFS, 2008, Aracaju.
6. Santos dos, A. D. C.; Nogueira, P. C. L.; Gomes, S. V. F.; Moraes,

V. R. S.; Alves, P. B.; Blank, A. F.; Viana, M. D.; Pereira-Filho, E. R.; Martins,
L. R. R.; Cass, Q. B. Determinação do perfil cromatográfico de plantas
medicinais do nordeste: Lippia gracillis. 18º Encontro de Iniciação Científica /
4º Encontro de Pós-graduação da UFS, 2008, Aracaju.
7. Gomes, S. V. F.; Santos dos, A. D. C.; Viana, M. D.; Moraes, V. R.

S.; Nogueira, P. C. L.; Martins, L. R. R.; Cass, Q. B.; Pereira-Filho, E. R.;
Blank, A. F.; Alves, Péricles Barreto. Diferenciação de genótipos de Lippia
gracillis por análise multivariada de fingerprints obtidos por CLAE-DAD. II
Whorkshop Bioprospecção de Plantas Nativas do Semi-árido, 2008, Aracaju.
8. Moreno, M. P. N.; Ptak, D. M.; Krempser, R. R.; Krempser, M. R.;

Floresta, S. V.; Cavalcanti, S. C. H.; Marçal, R. M.; Fernandes, J. B. Efeito
analgésico do extrato acetato de etila da Hyptis Fruticosa. 29º Reunião
Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2006, Água de Lindóia.
9. Moreira, Ítalo; Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Antoniolli, A. R.;

Santos, M. R. V. Efeito vasorrelaxante da fração diclorometano de Hyptis
fruticosa (LAMIACEAE) em artéria mesentérica isolada de rato. XIX
Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil, 2006, Salvador.
10. Marçal, R. M.; Ptak, D. M.; Krempser, R. R.; Krempser, M. R.;

Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Cardoso, G. C.; Cavalcanti, S. C. H.;
Fernandes, J. B. Antinociceptive profile of ethyl acetate extract of Hyptis
fruticosa Salzm ex Benth (Lamiaceae). International Congress and 54th
Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant Research, 2006, Helsink.
Planta Medica, 2006. v. 72.
11. Moreno, M. P. N.; Floresta, S. V.; Campos, D. A.; Blank, F.; Kava,
C.; Simote, S.; Alves, P. B.; Cavalcanti, S. C. H.; Antoniolli, A. R.; Vieira, P.
C.; Rodrigues Filho, E.; Silva, M. F.; Fernandes, J. B. Avaliação Fitoquímica
e potencial farmacológico da Hyptis fructicosa L. 28º Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Química, 2005, Poços de Caldas.
12. Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Fernandes, J. B.; Cavalcanti, S.

C. H. Estudo químico e biológico da Hyptis fruticosa oriunda do Estado de
Sergipe. VII Congresso de Iniciação Científica/ XV Encontro de Iniciação
Científica, 2005, Aracaju.
13. Doria, G. A. A.; Silva, W. J.; Floresta, S. V.; Alves, P. B.; Marçal,
R. M.; Cavalcanti, S. C. H. Teste larvicida de óleos essenciais de plantas
contra as larvas do mosquito Aedes aegypti. VII Congresso de Iniciação
Científica/ XV Encontro de Iniciação Científica, 2005, Aracaju.
14. Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Cavalcanti, S. C. H. Triagem

Fitoquímica da Hyptis fruticosa oriunda do estado de Sergipe. VI Congresso
de Iniciação Científica, 2004, Aracaju.
SUMÁRIO
Páginas
s
LISTA DE FIGURAS .............................................................................. i
LISTA DE ESPECTROS ........................................................................ v
LISTA DE TABELAS ............................................................................. vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................ vii
RESUMO ................................................................................................ x
ABSTRACT ............................................................................................ xi
1. INTRODUÇÃO ................................................................................... 1
1.1 – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ...................................... 7
1.1.1 – Parâmetros cromatográficos ............................................ 9
1.1.2 – Otimização da separação ................................................ 11
1.1.3 – Modos de separação ....................................................... 15
1.2 – Extração em Fase Sólida (SPE – Solid Phase Extraction) ............ 16
1.2.1 – Etapas de extração .......................................................... 17
1.3 – Análise Multivariada ...................................................................... 18
1.3.1 – Análise Exploratória de Dados ......................................... 19
1.3.2 – Análise dos Componentes Principais .............................. 21
1.4 – Dor e Nocicepção .......................................................................... 23
1.4.1 – Nociceptores – os receptores da dor ............................... 25
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 29
2.1 – Gênero Lippia ................................................................................ 30
2.2 – Lippia gracilis Schauer .................................................................. 32
2.3 – Constituintes químicos do gênero Lippia ....................................... 33
2.3.1 – Óleo essencial ................................................................. 34
2.3.2 – Fitoconstituintes ............................................................... 37
2.3.2.1 – Flavonóides ................................................................... 38
2.3.2.2 – Naftoquinonas ............................................................... 42
2.3.2.3 – Iridóides ........................................................................ 43
3. OBJETIVOS ....................................................................................... 46
3.1 – Objetivo Geral ................................................................................ 47
3.2 – Objetivos Específicos .................................................................... 47
4. PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAL ............................................... 48
4.1 – Equipamentos e materiais ............................................................. 49
4.2 – Técnicas cromatográficas .............................................................. 50
4.2.1 – Sistemas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência .... 50
4.3 – Material vegetal ............................................................................. 51
4.4 – Preparação dos extratos ............................................................... 53
4.5 – Preparação das amostras para CLAE analítica ............................ 53
4.5.1 – Extração em fase sólida ................................................... 53
4.6 – Condições analíticas dos cromatogramas fingerprint .................... 55
4.7 – Cromatografia com resina amberlite XAD-2 .................................. 56
4.8 – Análise em CLAE semipreparativa das folhas .............................. 57
4.9 – Análises por RMN .......................................................................... 59
4.10 – Análise quimiométrica ................................................................. 59
4.11 – Estudo farmacológico do extrato metanólico das folhas de
Lippia gracilis .......................................................................................... 59
4.11.1 – Animais .......................................................................... 60
4.11.2 – Drogas ........................................................................... 60
4.11.3 – Avaliação da Atividade antinociceptiva .......................... 60
4.11.3.1 – Teste de contorção abdominal induzida pelo ácido
acético a 0,85% ...................................................................................... 60
4.11.3.2 – Formalina .................................................................... 61
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................... 62
5.1 – Desenvolvimento dos cromatogramas fingerprint ......................... 63
5.1.1 – Otimização do procedimento de pré-tratamento .............. 63
5.1.2 – Cromatograma fingerprint das folhas de Lippia gracilis ... 67
5.1.3 – Cromatograma fingerprint dos caules de Lippia gracilis .. 79
5.2 – Isolamento dos marcadores químicos ........................................... 87
5.2.1 – Fracionamento do extrato das folhas do genótipo 107 de
Lippia gracilis com resina amberlite XAD-2 ............................................ 87
5.2.2 – Fracionamento do extrato dos caules do genótipo 107 de
Lippia gracilis com resina amberlite XAD-2 ............................................ 90
5.2.3 – CLAE semipreparativa das frações 50% e 85%
MeOH:H2O das folhas de Lippia gracilis ................................................ 93
5.3 – Identificação estrutural .................................................................. 96
5.3.1 – Identificação da substância LGRA 12 .............................. 96
5.4 – Análise quimiométrica ................................................................... 105
5.4.1 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint
das folhas ............................................................................................... 106
5.4.2 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint
dos caules .............................................................................................. 112
5.5 – Atividade Antinociceptiva ............................................................... 118
6. CONCLUSÕES .................................................................................. 122
7. REFERÊNCIAS .................................................................................. 125
Gomes, S. V. F. 2009
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta

eficiência ................................................................................................. 8
Figura 2: Triângulo de seletividade para os solventes preferidos em: -

fase reversa, --- fase normal .................................................................. 13
Figura 3: Nomógrafo no modo reverso .................................................. 14
Figura 4: Esquema do procedimento de SPE; A) Condicionamento do

cartucho; B) Aplicação da amostra; C) Lavagem; D) Eluição ................ 18
Figura 5: Esquema da seqüência usada na análise multivariada de

dados experimentais .............................................................................. 21
Figura 6: Aferências modulares dos nociceptores: corte transversal da

medula espinhal, mostrando sinapses das fibras C e A ....................... 25
Figura 7: Lippia gracilis Schauer ........................................................... 33
Figura 8: Mudas da espécie de Lippia gracilis no DEA ......................... 52
Figura 9: Esquema com as etapas da extração em fase sólida ............ 54
Figura 10: Dispositivo para extração em fase sólida ............................. 55
Figura 11: Cromatograma da fração (a) 5% MeOH:água e (b) 100%

MeOH após tratamento por extração em fase sólida (Varian ).
Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN
(B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, Vinj.= 50µL ........................... 64

MeOH após tratamento por extração em fase sólida (Supelco ).

MeOH após tratamento por extração em fase sólida (JT Baker ).
i
Figura 14: Cromatograma das frações reunidas de 5%, 10%, 15%,

20%, 30%, 50% e 60% MeOH:H2O e 100% MeOH após tratamento
por extração em fase sólida (JT Baker®) ................................................ 66
Figura 15: Cromatograma das frações reunidas 5% MeOH:água e

100% MeOH após tratamento por extração em fase sólida (JT
Baker®). Condições cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100%
de ACN (B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, Vinj.= 50µL ............. 67
Figura 16: Cromatograma do extrato metanólico da Lippia gracillis.

Figura 17: Cromatogramas para seleção de condições para o método

em CLAE. Os números correspondem às condições apresentadas na
tabela 3 ................................................................................................... 72
Figura 18: Cromatograma obtido com a condição de eluição

gradiente: 15-40% ACN (B):solução de 0,5% HCOOH (A) em 50 min;
40-70% (B) em 20 min, vazão 0,5 ml/min, =280nm, Vinj.= 25µL,
coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0x0,46 cm, QC-UFSCar-158) ....... 73
Figura 19: Cromatogramas fingerprint das folhas dos sete genótipos

(106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis .................................................. 74
Figura 20: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra

das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis ......................................... 75
Figura 21: Cromatograma da amostra do genótipo 108 das folhas de

Lippia gracilis. Numeração referente aos picos identificados no
espectro de UV-Vis (CLAE-DAD) ........................................................... 76
Figura 22: Espectros de absorção na região do UV-Vis (CLAE-DAD)

correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura
20, da amostra do genótipo 108 de Lippia gracilis ................................. 77
Figura 23: Cromatogramas dos sete genótipos das folhas de Lippia

gracilis em quintuplicata ......................................................................... 78
Figura 24: Cromatograma (a) extrato metanólico dos caules do

genótipo 108 da Lippia gracilis e (b) extrato metanólico das folhas do
genótipo 108 de Lippia gracilis. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v)
em 50 min, 40-70% (B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.=
25µL ........................................................................................................ 80
Figura 25: Cromatogramas para seleção de condições
ii
cromatográficos para análise dos extratos dos caules de Lippia

gracilis. Os números correspondem às condições apresentadas na
tabela 8 ................................................................................................... 82
Figura 26: Cromatogramas fingerprint dos sete genótipos (106-110,

201 e 202) de Lippia gracilis ................................................................... 83
Figura 27: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra

dos caules do genótipo 108 de Lippia gracilis ........................................ 83
Figura 28: Cromatograma da amostra do genótipo 108 dos caules de

Lippia gracilis. Numeração referente aos picos identificados no
espectro de UV-Vis ................................................................................. 84

correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura
28, da amostra do genótipo 108 de Lippia gracilis ................................. 85
Figura 30: Cromatogramas dos sete genótipos dos caules de Lippia

gracilis em quintuplicata ......................................................................... 86
Figura 31: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite

XAD-2: a) 5% MeOH:H2O; b) 15% MeOH:H2O; c) 25% MeOH:H2O; d)
35% MeOH:H2O; e) 50% MeOH:H2O; f) 70% MeOH:H2O; g) 85%
MeOH:H2O. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 15% a
40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70%
(B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.= 25µL ....................... 89
Figura 32: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite

XAD-2: a) 5% MeOH:H2O; b) 15% MeOH:H2O; c) 25% MeOH:H2O; d)
35% MeOH:H2O; e) 50% MeOH:H2O; f) 70% MeOH:H2O; g) 85%
MeOH:H2O. Condições cromatográficas: eluição gradiente de 15% a
40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70%
(B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.= 25µL ....................... 92
Figura 33: Cromatograma da fração 50% MeOH:H2O para isolamento

dos compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições
cromatográficas: eluição gradiente de 8% a 40% de ACN (B) em 50
min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, Vinj.= 100 µL, minj = 10 mg ............... 95
Figura 34: Cromatograma da fração 85% MeOH:H2O para isolamento

dos compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições
cromatográficas: eluição gradiente de 35% a 53% de ACN (B) em 15
min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, Vinj.= 200 µL, minj = 10 mg ............... 96
Figura 35: Parte do cromatograma das folhas: a) antes do

alinhamento, b) após o alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation
Optimised Warping’’ (COW) ................................................................... 106
iii
Figura 36: Gráfico de pré-processamento centrado na média .............. 107
Figura 37: Variância explicada (%) para cada componente principal

(PC’s) ...................................................................................................... 108
Figura 38: Gráfico de escores (PC1 versus PC2) ................................. 109
Figura 39: Gráfico de loading das folhas de Lippia gracilis ................... 110
Figura 40: Cromatogramas fingerprint sobrepostos das folhas dos

sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracillis ......................... 111
Figura 41: Parte do cromatograma dos caules: a) antes do

alinhamento, b) após o alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation
Optimised Warping’’ (COW) ................................................................... 112
Figura 42: Gráfico de pré-processamento centrado na média .............. 113
Figura 43: Variância explicada (%) para cada componente principal

(PC’s) ...................................................................................................... 114
Figura 44: Gráfico de escores (PC1 versus PC3) ................................. 115
Figura 45: Gráfico de loading dos caules de Lippia gracilis .................. 116
Figura 46: Cromatogramas fingerprint sobrepostos dos caules dos

sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis .......................... 117
Figura 47: Efeito do EMLG sobre as contorções abdominais induzidas

por ácido acético. Cada valor representa a média ± D.P.M. Os
asteriscos denotam a significância estatística, * p < 0,05 e ** p < 0,001
(ANOVA e teste de Dunnett), n = 8 ........................................................ 119
Figura 48: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da

pata, na 1ª fase do teste da formalina. Cada valor representa a média
± D.P.M. O asterisco denota a significância estatística, * p < 0,05
Figura 49: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da

pata, na 2ª fase do teste da formalina. Cada valor representa a média
± D.P.M. O asterisco denota a significância estatística, * p < 0,001
iv
LISTA DE ESPECTROS
Espectro 1: Espectro de RMN 1H da amostra LGRA 12 (400 MHz) .... 98
Espectro 2: Espectro de RMN 1H da amostra LGRA 12 (400 MHz).

Ampliação da região entre 12,45 ppm e 11,7 ppm ................................ 99

Ampliação da região entre 7,60 ppm e 6,37 ppm .................................. 100


Espectro 6: Espectro de 13C da amostra LGRA 12 (400 MHz) ............ 103
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Flavonóides isolados de espécies do gênero Lippia ............. 39
Tabela 2: Dados dos genótipos da espécie Lippia gracilis .................... 51
Tabela 3: Quantidade de material vegetal seco e triturado ................... 52
Tabela 4: Rendimento dos extratos metanólicos das folhas e caules ... 53
Tabela 5: Rendimento das frações obtidas da coluna Amberlite XAD-2 57
Tabela 6: Rendimento das amostras obtidas por CLAE

semipreparativa ...................................................................................... 58
Tabela 7: Condições cromatográficas avaliadas para separação dos

compostos químicos, com detecção em = 280 nm .............................. 70
Tabela 8: Condições cromatográficas para otimização do gradiente

com detecção em = 280 nm ................................................................. 81
Tabela 9: Correlação observadas no espectro de RMN 1H e 13C da

substância LGRA 12 e dados da naringenina da literatura .................... 104
Tabela 10: Variância percentual das Componentes Principais

calculadas para os dados da matriz original centrados na média ......... 108

calculadas para os dados da matriz original centrados na média ......... 114
vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACN Acetonitrila
AS Autoescalonamento
BK Bradicinina
CG Cromatografia Gasosa
CG/EM Cromatografia Gasosa acoplado a espectrometria de massas
CM Centrado na média
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE-DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplado a

detector de arranjo de diodos
CLAE-DAD-EM ou HPLC-DAD-MS Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência acoplada ao detector de arranjo de diodos e espectrometria de
massas
CLAE-FR Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase reversa
COBEA Colégio Brasileiro em Experimentação Animal
COW Correlation Optimised Warping
d Dubleto
dd Duplo dubleto
d.i Diâmetro interno
DABC Drug Administration Bureau of China
DEA Departamento de Engenharia Agronômica
DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado
vii
D.P.M. Desvio padrão da média
EMEA European Agency for the Evaluation of Medicinal Products
EMLG Extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia

gracilis
FDA Food and Drug Administration
HCA Hierarchical Cluster Analysis (Análise de Agrupamentos

Hierárquicos)
HCOOH Ácido fórmico
INPI The International Plant Names Index
J Constante de acoplamento em hertz (Hz)
KNN K-nearest neighbor
LC-DAD-ESI/EM ou LC-DAD-ESI/MSD Cromatografia líquida

acoplado ao detector de arranjo de diodos e ionização por
eletrospray/espectrometria de massas
Lp Comprimento da coluna preparativa ou semipreparativa
La Comprimento da coluna analítica
minj Massa injetada
MeOH Metanol
NO Óxido nítrico
OMS Organização Mundial de Saúde
PAFs Fibras aferentes primárias
PCA Principal Component Analysis (Análise dos Componentes

Principais)
PC Principal Component (Componentes Principais)
PGs Prostaglandinas
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
viii
RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono - 13
Rp diâmetro das coluna preparativa ou semipreparativa
Ra Diâmetro da coluna analítica
s Singleto
S Fator de escalonamento
SIMCA Soft Independent Modeling by Class Analogy
SPE Solid Phase Extraction (Extração em fase sólida)
tg Tempo de gradiente
THF Tetraidrofurano
TMS Tetrametilsilano
UFS Universidade Federal de Sergipe
UFSCar Universidade Federal de São Carlos
v.o. Via oral
Vinj. Volume de injeção
XAD-2 resina de poliestireno-divinil-benzeno
5-HT Serotonina
Deslocamento químico em ppm
%B/min Variação do solvente B por tempo (inclinação do gradiente)
Δ%B Diferença entre a % de B final e inicial
ix
RESUMO
Este trabalho apresenta o desenvolvimento de método por

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para diferenciação de sete
genótipos (106-110, 201 e 202) de folhas e caules de Lippia gracilis
Schauer, o isolamento de marcadores químicos e avaliação da atividade
antinociceptiva das folhas. Os extratos metanólicos das folhas e caules dos
sete genótipos foram analisados por CLAE-DAD e após etapas de
otimizações, foram obtidos os cromatogramas fingerprint. Para uma análise
comparativa entre os genótipos, aplicaram-se ferramentas quimiométricas de
análise exploratória (PCA), com as quais foi possível discriminar os
genótipos, inferindo que o método analítico desenvolvido por CLAE-DAD
pode ser utilizado para o controle de qualidade químico desta espécie. Das
frações 50% e 85% MeOH:H2O, obtidas da cromatografia em coluna com
resina amberlite XAD-2 do extrato metanólico do genótipo 107 das folhas,
foram isoladas sete substâncias por CLAE semipreparativa. A substância
codificada como LGRA 12 foi identificada através de RMN 1H, 13C e por
comparação com dados da literatura como sendo a 5,7,4’-triidroxiflavanona,
conhecida como naringenina. O extrato metanólico das folhas do genótipo
108 foi submetido a dois ensaios farmacológicos, o teste de contorções
abdominais induzidas por ácido acético e formalina, o qual resultou em uma
atividade antinociceptiva provavelmente mediada pela inibição de fatores
pró-inflamatórios (via das ciclooxigenase).
Palavras-chave: Lippia gracilis, genótipos, fingerprint, CLAE-DAD,

quimiometria, naringenina, antinociceptivo.
x
ABSTRACT
This work describes the development of method by High Performance

Liquid Chromatograpy (HPLC) for differentiation of seven genotypes (106-
110, 201 and 202) of Lippia gracilis Schauer, the isolation of chemical
markers and evaluation of antinociceptive activity of leaves. The methanolic
extracts of leaves and stems of seven genotypes were analyzed by HPLC-
DAD and after stages of optimizations, we obtained the fingerprint
chromatograms. For a comparative analysis of the genotypes, were applied
chemometric tools for exploratory analysis (PCA), which it was possible to
discriminate the genotypes, showing that the analytical method developed by
HPLC-DAD can be used for quality control of chemical species. From
fractions of 50% and 85% MeOH: H2O obtained in the chromatography
column with amberlite resin XAD-2 of the methanol extract of leaves of
genotype 107 were isolated seven substances by HPLC semipreparative.
The substance named LGRA 12 was identified by 1H and 13C NMR and by
comparison with literature data as the 5,7,4 '-trihydroxiflavanone known as
naringenin. The methanolic extract of the leaves was submitted two
pharmacological tests, the abdominal contortion test induced by acetic acid
and formalin, which resulted in an antinociceptive activity probably mediated
by inhibition of pro-inflammatory factors (route of cyclooxygenase).
Keywords: Lippia gracilis, genotypes, fingerprint, HPLC-DAD,

chemometric, naringenin, antinociceptive.
xi
Capítulo
1
1. INTRODUÇÃO
Sabe-se que o poder curativo das plantas é tão antigo quanto o

aparecimento da espécie humana na terra, pois, desde cedo as primeiras
civilizações perceberam, que algumas plantas continham em suas essências
princípios ativos, os quais ao serem experimentados no combate às doenças
revelaram empiricamente seu poder curativo.
Conforme Cunha [1], toda informação acumulada sobre o uso de

plantas medicinais, foi inicialmente transmitida oralmente de geração a
geração para só depois, com o advento da escrita, serem compiladas em
livros.
No início do século XIX, com o desenvolvimento da química

farmacêutica, as plantas passaram a representar a primeira fonte de
substâncias para o desenvolvimento de medicamentos. Atualmente, apesar
do grande desenvolvimento da síntese orgânica e de novos processos
biotecnológicos, 25% dos medicamentos prescritos nos países
industrializados são originários de plantas, obtidos a partir de 90 espécies
que são utilizadas na terapia moderna [2].
Estima-se que no ano de 2000 os produtos a base de plantas

medicinais movimentaram cerca de 30 bilhões de dólares. Aliado a isso, a
Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 65-80% da população
mundial depende da medicina tradicional para atender às suas necessidades
de cuidados primários de saúde e grande parte desta medicina tradicional
envolve o uso de plantas medicinais, seus extratos vegetais ou seus
princípios ativos [3].
2
Com o progresso das técnicas cromatográficas e espectrométricas,

novas substâncias de origem natural vêm sendo descobertas, não só de
plantas, mas também de animais e microrganismos. No período de 1981 a
2002, foram descobertas 877 novas moléculas com atividades biológicas.
Destas, 33 % são de origem natural ou derivadas por semi-síntese,
destacando-se especialmente nas áreas terapêuticas como anticâncer e
anti-hipertensivos [4]. Dos fármacos produzidos a partir de 1995, 244
substâncias têm sido utilizadas como protótipos sendo que, destas, 83% são
provenientes de fontes naturais (animais, plantas e microrganismos) e 17%
são provenientes de síntese química ou observações das atividades
biológicas de compostos já existentes [5].
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) [6], as

plantas medicinais são todas as plantas que contêm em um ou mais de seus
órgãos substâncias que podem ser utilizadas com propósitos terapêuticos ou
que sejam precursores de semi-síntese químico-farmacêutico. Ainda nesse
sentido, Morgan [7] afirma que as plantas que contém princípios ativos em
sua composição que sejam úteis à saúde dos seres humanos são
consideradas plantas medicinais.
A utilização de plantas medicinais tem recebido incentivos da OMS,

mediante a Resolução WHA 31.33 (1978) e 40.33 (1987), que reafirmam a
importância das plantas medicinais nos cuidados da saúde, recomendando,
entre outros aspectos, a criação de programas globais para a identificação,
validação, preparação, cultivo e conservação das plantas medicinais
utilizadas na medicina tradicional, bem como assegurar o controle de
qualidade delas [8].
De uma maneira geral, as plantas podem possuir centenas de

constituintes, alguns deles presentes em concentrações mínimas. Os
constituintes das plantas variam em função de fatores externos como
temperatura, umidade, luminosidade, método de coleta, secagem e
transporte [9]. Sendo assim, se faz necessário determinar vários
constituintes químicos para assegurar a confiabilidade e reprodutibilidade da
3
pesquisa farmacológica e clínica. Nessa perspectiva, o conceito de

fitoequivalência tem sido utilizado. Ele sugere que um cromatograma
fingerprint ou „‟impressão digital‟‟ seja comparado com padrões que poderá
ajudar na identificação de amostras autênticas e auxiliar na identificação de
possíveis compostos utilizados em uma adulteração [10].
Muitas técnicas analíticas modernas têm sido utilizadas para a

determinação da „‟impressão digital‟‟ ou fingerprint de plantas medicinais. Na
última década, a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma das
mais utilizadas devido a sua facilidade de manuseio e por não estar limitada
a volatilidade ou estabilidade dos compostos da amostra. No entanto, a
otimização das condições para uma boa separação não são triviais por
envolver fatores como fase móvel, ajuste de pH, pressão de bombas e
tantos outros [10, 11].
Segundo Gan et al. [12], a cromatografia fingerprint tem sido utilizada

para verificar a autenticidade ou fornecer o controle de qualidade de plantas
medicinais. A cromatografia tem a vantagem de separar um sistema
complexo de fitoquímicos em subsistemas relativamente simples e, em
seguida, apresentar o perfil químico da planta medicinal sob a forma de um
cromatograma.
A técnica de cromatografia fingerprint vem atraindo cada vez mais a

atenção da comunidade científica, especialmente por enfatizar a
característica sistêmica dos componentes da amostra focando na
identificação e estabilidade dos constituintes químicos observados. Esta
análise foi introduzida e aceita pela OMS como estratégia para avaliação de
ervas naturais, exigida pelo Drug Administration Bureau of China (DABC)
para padronização das ervas medicinais chinesas e suas matérias primas, e
ainda é recomendado por outras entidades como Food and Drug
Administration dos Estados Unidos (FDA) e a European Agency for the
Evaluation of Medicinal Products (EMEA) [13].
4
Segundo Xu et al. [14], um fingerprint de uma planta medicinal é um

cromatograma representando todos os componentes químicos presentes ou
detectáveis no extrato. Com a ajuda do fingerprint, a autenticação e
identificação de uma planta podem ser fielmente conduzidas até mesmo se a
qualidade e quantidade dos constituintes químicos são desconhecidos.
Assim, para avaliar a qualidade de uma planta medicinal, podemos
considerar os múltiplos constituintes no extrato da planta, em vez de apenas
um ou dois marcadores químicos.
Jiang et al. [15] utilizaram a cromatografia fingerprint para diferenciar

quatro espécies de Cistanche (C. deserticola, C. tubulosa, C. salsa e C.
sinensis), através da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada ao
detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas (HPLC-DAD-MS).
Duas espécies, Cistanche deserticola e C. tubulosa, são oficiais e utilizadas
tradicionalmente para problemas renais e infertilidade na China, mas devido
à escassez de recursos, nos últimos anos duas espécies, C. salsa e C.
sinensis, também têm sido utilizadas em algumas regiões da China. Para
investigar a possibilidade de utilizar estas duas espécies não-oficiais como
alternativa para as espécies oficiais foi desenvolvido um método fingerprint
para analisar comparativamente os extratos brutos destas quatro espécies.
Os resultados comparativos demonstraram que o fingerprint de C. tubulosa
C. salsa possuem alta similaridade, enquanto que o da C. sinensis possui
baixa similaridade. Desta forma, a cromatografia fingerprint foi uma poderosa
ferramenta para diferenciação destas espécies podendo ser utilizado para o
controle de qualidade.
Em outro estudo, Jin et al. [16] desenvolveram um método fingerprint

por meio de cromatografia líquida acoplado a detector de arranjo de diodos
(CLAE-DAD) para o controle de qualidade da espécie Rheum tanguticum
Maxim. ex Balf. Nesta pesquisa foram comparados quarenta e duas
amostras de Rheum tanguticum de diferentes regiões. Ao comparar os
cromatogramas de todas as amostras, o resultado revelou que o método
5
fingerprint desenvolvido foi eficiente para identificar e distinguir as matérias-

primas de R. tanguticum.
A técnica de cromatografia líquida para obtenção de cromatogramas

fingerprint de plantas medicinais fornece um grande conjunto de dados. No
entanto, para que estes dados sejam convertidos em informação útil deve-se
usar métodos matemáticos e estatísticos sofisticados [17]. A aplicação de
métodos quimiométricos, nestes casos, aumenta consideravelmente a
qualidade da „‟impressão digital‟‟ ou fingerprint obtido. Comparações
avançadas de dados podem ser feitas utilizando a Análise dos Componentes
Principais (PCA). Hoje em dia a quimiometria não é mais uma opção na
análise de matrizes complexas como o fingerprint de plantas medicinais,
mas sim uma ferramenta essencial [18].
Dentre as diversas plantas utilizadas como medicinais no Brasil,

destacam-se as plantas do gênero Lippia. No Brasil, diversas espécies deste
gênero são utilizadas na medicina popular para doenças respiratórias,
gastrointestinais, antivirais, antimaláricos e antifúngicos [19]. Embora muitas
espécies deste gênero sejam bem estudadas, muitas outras ainda são
pouco conhecidas. Dentre elas tem-se a espécie Lippia gracilis, conhecida
popularmente como “alecrim-da-chapada” ou “alecrim-de-serrote” [20].
A espécie Lippia gracilis Schauer é objeto de estudo de um programa

de melhoramento genético desenvolvido pelo Laboratório de Culturas de
Tecidos Vegetais e Melhoramento genético do Departamento de Engenharia
Agronômica (DEA) da Universidade Federal de Sergipe (UFS). Os genótipos
encontram-se instalados em um Banco de Germoplasma no Horto de
Plantas Medicinais da Fazenda Experimental “Campus Rural da UFS”.
O interesse pelo estudo desta espécie deve-se ao fato de ser uma

planta medicinal muito utilizada na medicina popular e que apresenta poucos
estudos sobre seus constituintes químicos fixos. Além disso, apresenta um
óleo essencial rico em timol e carvacrol que são substâncias de grande
6
importância econômica e industrial, principalmente na farmacologia,

cosméticos e, recentemente, na agricultura.
Este trabalho visou o conhecimento dos constituintes químicos e a

diferenciação de sete genótipos das folhas e caules de Lippia gracilis através
de CLAE-DAD, para obtenção de cromatogramas fingerprint, e posteriores
análises quimiométricas.
1.1- CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
A exigência cada vez maior na obtenção de produtos de origem

vegetal com qualidade requer o emprego de técnicas seletivas e eficientes,
que possibilitem com segurança a identificação e quantificação de diferentes
classes de compostos, o que pode ser obtido com a utilização da
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) [21].
Esta técnica tem sido usada de maneira rotineira para análise e

isolamento de produtos naturais a partir de matrizes complexas, como
extratos de plantas, obtendo-se cromatogramas que são usados como
„‟impressão digital‟‟ ou fingerprint, fornecendo informações importantes
quanto ao tipo de constituintes presentes.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência é uma técnica de

separação que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos
analíticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos. As razões
para esse crescimento estão relacionadas à sua adaptabilidade para
determinações quantitativas com boa sensibilidade e a possibilidade de
separar espécies não voláteis e termicamente instáveis [22].
A CLAE é definida como um método físico-químico de separação dos

componentes de uma mistura, realizada através da distribuição entre duas
fases. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se
através dela. Durante o desenvolvimento cromatográfico, os componentes
da mistura são distribuídos entre as duas fases, resultando em migrações
diferenciais destes componentes [23].
7
A representação esquemática de um equipamento de CLAE (Figura

1) é composto por um reservatório de solvente, uma bomba de alta pressão,
injetor da amostra, coluna cromatográfica, detector e registrador de dados,
que são divididos em módulos, que podem ser controlados individualmente
ou por computador [24].
Figura 1: Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta eficiência
A bomba de alta pressão empregada em CLAE tem a função de

enviar um fluxo constante e reprodutível de fase móvel para a coluna e
apresenta características totalmente especiais. As principais são: devem
operar a pressões de 0,01 a 35 MPa (0,1 a 350 bar), com a mesma precisão
e exatidão de operações a pressão quase ambiente. Intervalo de vazões
entre 0,01 e 5 mL/min para aplicações analíticas, entre 0,05 e 200 µL/min
para uso com colunas microbore e capilar, e até 100 mL/min para aplicações
preparativas. Repetitividade e constância da vazão de 1%. Elas não devem
ser corroídas pelas fases móveis empregadas. A bomba deve proporcionar
ao sistema uma vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade,
possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado [25, 26].
8
Os detectores mais empregados em CLAE são os espectrofotômetros

no UV/VIS. Eles determinam a diferença de absorvância na região do ultra-
violeta ou no visível, sendo, assim, um detector seletivo para moléculas que
possuem cromóforos. Os detectores por arranjo de fotodiodos fornecem
espectros de varredura do analito no UV-VIS e tem sido utilizado há mais de
uma década para o estudo da química de plantas, o qual vem sendo muito
empregado nos laboratórios de pesquisa [24, 27, 28].
As colunas utilizadas em CLAE são geralmente de aço inoxidável,

com diâmetro interno de cerca de 0,45 cm para separações analíticas e na
faixa de 2,2cm para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns
colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas
colunas são reaproveitáveis, sendo empacotadas com suportes de alta
resolução, não sendo necessária sua regeneração após cada separação
[23].
1.1.1 – Parâmetros Cromatográficos [24, 29]
1.1.1.1 – Fator de Retenção (K)
O fator de retenção, K, é uma medida de retenção de um soluto e ele

é determinado pela razão dos tempos em que as moléculas do soluto ficam
retidas na fase estacionária ou percorrendo a coluna na fase móvel, como
mostra a equação:
onde, tR é o tempo de retenção e t0 o tempo de retenção de um soluto

não retido.
Os valores ideais para K variam de 2,0 a 10,0. Valores menores que

2,0 indicam pouca interação entre o soluto e a fase estacionária, enquanto
valores maiores que 10 indicam interação muito forte com a fase
estacionária, resultando em análises demoradas.
9
1.1.1.2 – Fator de Separação (α)
Mede a seletividade da separação para duas bandas adjacentes. É

calculado pela razão entre os fatores de separação do soluto mais retido (K2)
e do soluto menos retido (K1), como mostra a equação:
Pode ser alterado por variação na fase móvel e/ou estacionária,

temperatura, pH e força iônica.
1.1.1.3 – Número de Pratos (N)
Número de pratos, N, é parâmetro relacionado à eficiência

cromatográfica. Um prato equivale a uma etapa de equilíbrio do soluto entre
a fase estacionária e a fase móvel. Quanto maior o número de pratos, mais
equilíbrios existirão, maior será a eficiência e, portanto, melhor a separação.
Na prática, o número de pratos é uma medida do alargamento do pico que
ocorre quando o analito passa através do sistema e pode ser calculado pela
equação:
onde, Wb é a largura de um pico na linha de base e W0,5 é a largura

do pico na meia altura.
Qualitativamente, a eficiência pode ser avaliada pelo formato do pico

cromatográfico. Quanto mais estreito for o pico, maior a eficiência da coluna
na separação do soluto a que o pico se refere.
1.1.1.4 – Altura Equivalente a um Prato (H)
10
É a correlação entre o número de pratos teóricos e o tamanho da

coluna. É medido pela razão entre o comprimento da coluna (L) e o número
de pratos, que pode ser calculado pela equação:
1.1.1.5 – Resolução (Rs)
É uma medida quantitativa do grau de separação entre dois picos

adjacentes e pode ser calculado de acordo com a equação:
onde,
tR1 e tR2 = tempos de retenção de dois picos adjacentes;
Wb1 e Wb2 = largura dos picos na linha de base;
W0,5 1 e W0,5 2 = largura dos picos a meia-altura.
Valores de Rs acima de 1,5 são considerados ideais, indicando uma

boa separação entre os picos.
1.1.2 – Otimização da separação [24, 27, 29]
A otimização de uma separação é feita alterando-se os parâmetros

cromatográficos K, α e N, de acordo com equação básica da resolução:
O primeiro e mais fácil parâmetro a ser alterado é o fator se retenção

(K), seguido pelo fator de separação (α). Em último caso, torna-se
necessária a alteração no número de pratos teóricos (N).
11
A retenção de um componente é controlada pela força do solvente.

Solventes fortes diminuem a retenção e solventes fracos aumentam a
retenção. A força cromatográfica da fase móvel adequada para uma
separação é selecionada através da análise do fator de retenção, K. Um
valor de K baixo significa pouca interação dos solutos com a fase
estacionária. Por outro lado, um valor de K elevado implica forte interação
entre o soluto e a fase estacionária. Nenhum extremo é recomendado, seja
por fornecerem separações pouco eficientes seja por implicarem tempos de
análises longos, com alargamento dos picos. O intervalo ideal de fator de
retenção é 1≤ K ≤ 10; entretanto, para análises de múltiplos componentes,
também se aceita 0,5≤ K ≤ 20.
É importante ressaltar que, em separações de misturas complexas

pelo modo isocrático, raramente serão obtidos valores ideais de K para
todos os componentes da amostra, sendo recomendável o uso da eluição
gradiente.
O fator de retenção no modo reverso pode ser aumentado pelo

aumento do percentual de água e, conseqüentemente, diminuído pelo
acréscimo do percentual do modificador orgânico. A troca de uma fase C18
por uma C8 também pode ser feita para alterar o fator de retenção.
No modo normal de eluição, o aumento do fator de retenção é

conseguido pelo aumento do percentual do solvente de maior polaridade.
Fases estacionárias de diferentes polaridades também podem ser usadas
para conseguir a desejada retenção.
Após o ajuste do fator de retenção, a seletividade da separação deve

ajustada e para isso deve-se manter o K conseguido. Alteração em α são
feitas levando-se em consideração as interações do soluto com o solvente,
resultando de suas características, tanto no modo reverso quanto no modo
normal.
12
Para determinar a melhor seletividade da fase móvel, pode ser

empregado o método empírico do modelo dos quatro solventes. Apesar de
haver inúmeros solventes passíveis de utilização como fase móvel, verificou-
se que um número reduzido era escolhido, surgindo então o modelo dos
quatro solventes, esquematizado na figura 2. Esse procedimento está
baseado no triângulo de seletividade. A seletividade em cromatografia no
modo reverso pode ser alcançada variando-se três solventes de
seletividades diferentes – metanol (MeOH), tetraidrofurano (THF) e
acetonitrila (ACN) – e utilizando-se água para ajustar a força cromatográfica
da mistura. Para separações por cromatografia no modo normal, utilizam-se
éter metil terc-butílico (MTBE), clorofórmio (CHCl3), ou cloreto de metileno
(CH2Cl2) com hexano para ajuste da força cromatográfica.
Figura 2: Triângulo de seletividade para os solventes preferidos em: - fase reversa,

---- fase normal.
Para manter a polaridade da mistura praticamente constante, na troca

de solventes de diferentes seletividades, usa-se o nomógrafo mostrado na
figura 3.
13
Figura 3: Nomógrafo no modo reverso
A acetonitrila (ACN) é a primeira alternativa para início dos testes de

escolha da fase móvel. A mistura ACN/H20 pode ser usada na detecção no
UV, pois absorve a baixos comprimentos de onda (185-210 nm). A mistura
possui também baixa viscosidade, resultando em maior número de pratos
teóricos e em pressões mais baixas na coluna. O próximo melhor solvente
orgânico a ser escolhido é o metanol (MeOH), seguido do tetraidrofurano
(THF). O THF possui algumas desvantagens, tais como absorção em maior
comprimento de onda no UV, forma peróxido na presença de oxigênio e gera
um lento desequilíbrio da coluna quando a fase móvel é modificada,
dificultando seu uso em eluição gradiente.
A seletividade pode ainda ser alterada por troca da fase estacionária,

levando-se em consideração as interações específicas, resultantes de cada
tipo de fase: C18, sílica, aminopropilsílica, ciano, fenil, diol etc. e/ou por
interações com grupos silanóis residuais nas fases quimicamente derivadas.
A otimização do número de pratos teóricos é feita considerando a

equação:
Na equação o número de pratos teóricos (N) é diretamente

proporcional ao tamanho da coluna (L) e inversamente proporcional à altura
dos pratos teóricos (H). Conseqüentemente, mantendo-se os outros
parâmetros constantes, um aumento de L resulta em um aumento de N, e
quanto menor for H, maior será o valor de N. Os fatores que favorecem a
14
obtenção de baixos valores de H são: utilização de colunas de partículas

pequenas, fluxos de fase móvel baixos, fases móveis pouco viscosas, altas
temperaturas de separação e separação de pequenas concentrações de
amostra.
1.1.3- Modos de Separação
A classificação da cromatografia líquida de acordo com as

modificações químicas realizadas na fase estacionária (sílica gel) levou a
uma grande variedade de tipos. A separação em cromatografia líquida pode
ser encontrada explorando a variedade de processos existentes, dos quais
os mais importantes são: cromatografia no modo normal, no modo reverso,
de compostos iônicos, de troca iônica, cromatografia de exclusão e
cromatografia quiral. Neste trabalho foi utilizada a Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência no modo reverso.
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência no modo reverso constitui

a modalidade cromatográfica na qual a fase móvel é mais polar do que a
fase estacionária. Salienta-se ainda que tal processo é o mais utilizado nos
laboratórios de pesquisas industriais e acadêmicas, além do seu amplo
emprego em análises de rotina [30]. A grande utilização desta modalidade
cromatográfica dá-se à existência de uma grande variedade de fases
estacionárias disponíveis comercialmente, que permitem ao usuário alcançar
a seletividade desejada [31]. Ressalta-se ainda que a fase móvel é em
grande parte composta por água, um solvente não tóxico e barato.
O princípio da retenção no modo reverso é a hidrofobia. A separação

no modo reverso se deve principalmente a interações entre a parte não-polar
do soluto e a fase estacionária, isto é, à repulsão desta parte do soluto pela
fase móvel aquosa [24].
Dentro da CLAE no modo reverso, a maioria das fases utilizadas

atualmente são baseados em silanos C8 ou C18 quimicamente ligados à
superfície de sílica. Como fase móvel são utilizados solventes com caráter
15
polar, geralmente uma mistura de água e solventes orgânicos miscíveis com

a água [32].
A força da fase móvel na cromatografia no modo reverso depende do

tipo de solvente orgânico escolhido (solvente B) e sua porcentagem em água
(solvente A). Os solventes orgânicos comumente usados são: acetonitrila
(ACN), metanol (MeOH) e tetraidrofurano (THF) [33].
1.2- EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPE – Solid Phase Extraction)
A extração em fase sólida é uma técnica de extração que tem se

popularizado devido ao fato de ser rápida, consumir menores volumes de
solvente e de amostra e ser de fácil mecanização [34].
Atualmente é muito empregada, sendo utilizada, principalmente, no

pré-tratamento de amostras para análise por CLAE e Cromatografia a Gás
(CG) [35].
A extração em fase sólida emprega sorventes empacotados em

cartuchos, nas formas de barril ou seringa, e os mecanismos de retenção
são idênticos àqueles envolvidos em cromatografia líquida em coluna. Um
cartucho típico é formado por um tubo de polipropileno contendo cerca de 50
a 500 mg de sorvente, com 40-60 µm de tamanho de partícula, retidos no
tubo através de dois filtros [36].
Os materiais de recheio são muito semelhantes às fases estacionárias

das colunas utilizadas na CLAE, porém com tamanho de partícula maior.
Esses materiais são, na sua maioria, à base de sílica modificada com grupos
octadecil (C18), octil (C8), amino (NH2), ciano (CN) ou à base de resinas
poliméricas, carbono grafitizado e alumina [31].
As características de fase sólida podem diferenciar, dependendo do

fabricante, do suporte, do tamanho de partículas, do tamanho de poros e
área superficial levando a uma imensa variedade de materiais disponíveis
comercialmente [36].
16
Beltrame et al. [37] utilizaram a extração em fase sólida para obter um

composto puro do extrato hidroalcoólico da Catuaba. Nesta pesquisa, a
cinchonaína Ib foi isolada pela passagem do extrato em um cartucho C18,
sendo em seguida usado como padrão externo para o desenvolvimento e
validação de um método por CLAE-DAD para quantificação deste composto
em amostras de Catuaba vendidas em todo o Brasil.
Em outro estudo, Genovese et al. [38] relataram a utilização da

extração em fase sólida para a obtenção das isoflavonas, daidzeína e
genisteína, em derivados protéicos de soja e alimentos industrializados.
No nosso trabalho, a extração em fase sólida foi muito útil para o pré-
tratamento dos extratos metanólicos das folhas e caules dos genótipos de
Lippia gracilis para, em seguida, serem analisados por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência.
1.2.1- Etapas da Extração
Existem quatro etapas básicas que devem ser seguidas em um

procedimento de SPE, as quais são descritas abaixo (Figura 4) [34, 39, 40].
1- Condicionamento: esta etapa tem o objetivo de preparar o leito do

sorvente, previamente à extração, para permitir um contato efetivo da
solução líquida da amostra, geralmente polar, com a superfície do sorvente,
geralmente apolar. Esta etapa envolve a passagem de um solvente orgânico
(metanol ou acetonitrila) através do sorvente e depois a remoção do solvente
por um líquido de composição similar a amostra (água);
2- Aplicação da amostra: nesta etapa a amostra é passada através

do sorvente, que é responsável pela extração, com a ajuda de vácuo, no
caso de seringas, cartuchos ou discos. A amostra pode, dependendo de sua
interação com o sorvente, ser constituído de quatro tipos diferentes de
substâncias: o primeiro tipo não tem nenhuma afinidade pelo sorvente e não
interage com este; o segundo tem fraca interação com o sorvente e é
arrastado na etapa de lavagem; o terceiro apresenta uma interação
17
adequada com o sorvente e é eluído na etapa de eluição, o quarto apresenta

uma afinidade muito grande pelo sorvente e permanece retido neste mesmo
após a etapa de eluição;
3- Lavagem: o propósito da lavagem é permitir que algumas

impurezas fracamente retidas sejam eliminadas pela passagem de um
solvente fraco (água);
4- Eluição: na etapa de eluição as espécies de interesse são

removidas do sorvente e retornam para a fase líquida. Normalmente
emprega-se metanol ou acetonitrila.
Figura 4: Esquema do procedimento de SPE; A) Condicionamento do cartucho; B)

Aplicação da amostra; C) Lavagem; D) Eluição.
1.3- ANÁLISE MULTIVARIADA
Os métodos de análise de dados multivariados foram desenvolvidos

por pesquisadores da área de psicometria. A gênese desse método remete
ao século XIX, porém a sua crescente popularidade só se tornou possível
com o advento do computador [41].
Somente a partir dos anos sessenta do século XX é que os métodos

de análise de dados multivariados foram paulatinamente ganhando espaço
nos diferentes campos de pesquisa que tradicionalmente não os usava, em
uma razão que crescia em ritmo semelhante ao do desenvolvimento de
máquinas de processamento de dados cada vez mais potentes [41].
18
Nesse panorama surgiu a quimiometria, que é considerada uma área

da química destinada à análise de dados de natureza multivariada [35,36].
Embora a quimiometria seja uma área relativamente nova, ela já produz um
impacto de tal modo que existem diversos softwares comerciais disponíveis
para o processamento dos mais diversos métodos quimiométricos [42, 43].
O termo só apareceu na década de 1970, na química analítica, como

decorrência dos progressos na instrumentação (que produz dados) e nos
microcomputadores (que permitem processar esses dados) [44].
A quimiometria pode ser definida como uma área da química que usa
métodos matemáticos, estatísticos e de lógica formal para planejar ou
selecionar procedimentos ótimos de medidas e experimentos e extrair o
máximo da informação química relevante, com a análise de dados [45].
Hoje em dia, muitos químicos passaram a ter como objetivo de estudo

e pesquisa, o desenvolvimento e utilização de ferramentas matemáticas e
estatísticas para extrair maior informação dos dados. Isso acabou por gerar
procedimentos e domínios de informações que não seriam possíveis, ou não
teriam sentido sem o conhecimento dessas ferramentas matemáticas para a
análise de dados [46].
Chen et al. [47] demonstraram as vantagens de se utilizar a

cromatografia fingerprint aliado a métodos quimiométricos para controle de
qualidade de plantas medicinais. Nesta pesquisa, amostras de diferentes
regiões na China de Ganoderma lucidum foram analisadas por CLAE e, em
seguida, submetidas à análise quimiométrica. No estudo foi possível
demonstrar as semelhanças e diferenças das espécies, quantificar os
principais marcadores químicos que influenciam nessa diferenciação e
utilizar o método para o controle de qualidade desta espécie.
1.3.1- Análise Exploratória dos Dados
O principal objetivo de uma análise exploratória é extrair o máximo de

informações dos dados experimentais, estabelecendo relações entre objetos
19
e variáveis. Os objetos químicos típicos são as amostras analíticas ou

compostos químicos. As variáveis são, muitas vezes, derivadas das
quantidades de constituintes químicos nos objetos, tais como a
concentração, a intensidade das bandas em perfis cromatográficos,
comprimento de onda em perfis espectroscópicos, etc [46, 48].
A análise exploratória dos dados é usada para determinar algumas

relações gerais entre os dados, agrupando as amostras com características
semelhantes. Esta técnica também auxilia na identificação de amostras que
não seguem o padrão da maioria [49].
Os métodos multivariados de análise de dados podem ser divididos

em dois grupos; a aprendizagem não supervisionada e a aprendizagem
supervisionada.
Na aprendizagem não supervisionada o objetivo é encontrar

agrupamentos naturais das amostras num espaço bidimensional. Os
métodos mais utilizados são a análise de agrupamentos hierárquicos (HCA)
e análise de componentes principais (PCA). Já na aprendizagem
supervisionada o objetivo é desenvolver modelos baseados nas informações
da origem das amostras, para que estas sejam classificadas corretamente e
então aplicar esta regra para amostras de origem desconhecidas visando
sua classificação. Um método muito utilizado para modelagem é o modelo
independente de similaridade utilizando componentes principais (SIMCA)
[41, 50-52].
A seqüência básica da análise de dados multivariados por métodos

quimiométricos está ilustrada na figura 5.
20
Figura 5: Esquema da seqüência usada na análise multivariada de dados

experimentais.
Neste capítulo trataremos somente da PCA, que foi utilizada no

tratamento dos dados a serem apresentados neste trabalho.
1.3.2- Análise dos Componentes Principais (PCA)
A PCA é a base principal de diversos métodos de análise multivariada

e seu grande objetivo é reduzir a dimensão dos dados originais, permitindo a
fácil visualização das informações mais importantes em um número menor
de fatores, ou componentes principais (PC). Desta forma, as principais
vantagens da PCA estão na simplificação, modelamento, detecção de
amostras anômalas, classificação e previsão [53].
21
Um procedimento básico para melhorar a análise de modo a reduzir a

dimensão dos dados é a escolha do número de componentes principais a
serem utilizadas na descrição do sistema. A escolha do número de
componentes principais permite descrever até mais de 90% da variância dos
dados com um número muito menor de fatores do que das variáveis
originais. A escolha das componentes principais a serem utilizadas na
descrição dos dados é feita levando-se em conta a porcentagem de
variância descrita pelas PC‟s e a variância residual [54, 55].
A primeira componente principal, PC1, é a combinação linear de

máxima variância das variáveis originais, ou seja, os auto vetores, num
determinado eixo. A segunda componente, PC2, de segunda maior
variância, é ortogonal a PC1, isto é, não correlacionada a ela. A terceira
apresenta maior variância e é ortogonal às duas primeiras PC, portanto
também não correlacionadas. Como esses eixos são calculados em ordem
decrescente de importância, a informação relevante fica concentrada nas
duas ou três primeiras PC, que podem ser então confrontadas com padrões
de características conhecidas [46, 56].
A partir dos PC‟s são gerados dois novos conjuntos de dados

chamados de scores e loadings. Os scores fornecem a composição das
PC‟s em relação aos objetos (amostras) enquanto os loadings fornecem
essa mesma composição em relação às variáveis. Como as PC‟s são
ortogonais, é possível examinar as relações entre os objetos através dos
gráficos de scores projetados nas primeiras PC‟s, e entre as variáveis
através dos gráficos de loadings [57].
Utilizando a notação matricial, as componentes principais são obtidas

por meio de transformações lineares conforme a equação:
XP = T
em que X é a matriz original do dados, T é a matriz de escores que

contêm as coordenadas das amostras no novo sistema de eixos e P é a
22
matriz dos pesos (loadings) onde os elementos de cada coluna

correspondem aos coeficientes das combinações lineares das variáveis
originais [53].
Os dados originais podem não ter uma distribuição adequada para a

análise, dificultando a extração de informações úteis e interpretação dos
mesmos. Nestes casos, antes de se aplicar a PCA a dados numéricos, é
necessário efetuar um pré-processamento nos dados originais. Os principais
tipos de pré-processamento são o Centrado na média – CM e o
Autoescalonamento – AS [58].
No CM calcula-se a média dos valores experimentais para cada

variável e subtrai-se cada valor experimental do respectivo valor médio.
Autoescalar significa centrar os dados na média e dividi-los pelo respectivo
desvio-padrão, sendo um para cada variável [48].
Gan et al. [12] relataram com êxito a utilização da PCA para avaliar a
similaridade dos cromatogramas fingerprint de Chuanxiong obtidas de três
regiões diferentes da China. Neste estudo foi possível diferenciar as
amostras pelo gráficos de escores (PC1 versus PC2) de Chuanxiong e o
método desenvolvido será útil para o controle de qualidade destas espécies.
1.4 – DOR E NOCICEPÇÃO
A dor é definida pela Associação Internacional para Estudo da Dor

como uma experiência sensorial e emocional desagradável associada com o
dano tecidual real ou potencial, ou descrita em termos de lesão [58]. É
importante salientar que sempre que qualquer tecido estiver lesado, o
organismo reage para desencadear o estímulo doloroso como um
mecanismo de proteção [60, 61].
Entretanto, a dor é uma experiência complexa que não envolve

apenas a transdução do estímulo nociceptivo ambiental, mas também
cognitivo e emocional processado pelo cérebro [62].
23
Em termos de duração, uma sensação dolorosa pode ser transitória,

aguda ou crônica. No tipo transitória, a ativação dos nociceptores é feita na
ausência de qualquer dano tecidual. Na dor aguda, ocorre geralmente lesão
e ativação dos nociceptores no sítio lesado. Já a dor crônica é causada
geralmente por uma lesão ou patologia, sendo que com o passar do tempo,
pode ser perpetuada por fatores que não os causadores iniciais da dor [63-
66].
O componente sensorial da dor denomina-se nocicepção [65]. Assim,

enquanto a dor envolve a percepção de um estímulo aversivo, a nocicepção
refere-se às manifestações neurofisiológicas geradas pelo estímulo nocivo
[65, 66]. A função de alerta da dor reflete a ativação fásica de receptores
denominados nociceptores, os quais são sensibilizados quando o estimulo é
potencialmente perigosos, ou seja, excedem uma determinada faixa
considerada fisiológica [61, 69].
Uma vez que os animais não são capazes de verbalizar os

componentes subjetivos da dor, neles não se avalia dor, mas nocicepção.
Sendo assim, tem sido proposto que os termos dor e analgesia são mais
apropriadamente utilizados para o ser humano, enquanto nocicepção e
antinocicepção são mais adequados para animais [70].
A nocicepção desencadeia no animal comportamentos típicos, como

lamber ou massagear a área lesada, vocalização, ou reflexo de retirar a
parte do corpo agredida do contato com o estímulo nocivo. Tais
comportamentos evidenciam ao experimentar a nocicepção, e são
denominados comportamentos nociceptivos. Portanto, as drogas que
suprimem os comportamentos nociceptivos são denominados
antinociceptivas, e aquelas que induzem o comportamento nociceptivo são
chamada de pró-nociceptivas, ou algogênicas. É importante esclarecer,
contudo, que as drogas antinociceptivas não são, obrigatoriamente,
analgésicas, visto que a supressão do comportamento nociceptivo pode ser
desencadeado por outros fatores, como prejuízo motor e sedação, que
diferem de analgesia [71].
24
1.4.1 – Nociceptores – os receptores da dor
O termo nociceptor é uma abreviatura de „‟nocirreptor‟‟, e denota um

receptor para o estímulo nociceptivo [72]. Os nociceptores estão localizados
na porção distal dos neurônios aferentes sensoriais que estão amplamente
distribuídos na pele, vasos, músculos, articulações e vísceras e são
sensíveis a estímulos térmicos, mecânicos ou químicos [61].
A percepção da dor se inicia na periferia pela estimulação dos

nociceptores, cujos corpos celulares encontram-se nos gânglios das raízes
dorsais e projetam seus axônios até o corno dorsal da medula (Figura 6). Os
nociceptores são inervados pelas fibras aferentes primárias C ou fibras A .
As fibras A são fibras mielinizadas, de condução rápida (2,5 a 36 m/s) e as
fibras C não são mielinizadas e transmitem o estímulo de forma mais lenta
(0,7 a 1,5 m/s) [56, 68-70]. É importante ressaltar que o estímulo, seja ele
térmico, químico ou mecânico, deve exercer um certo limiar para que seja
interpretado pelo sistema sensorial como nociceptivo [76].
Figura 6: Aferências modulares dos nociceptores: corte transversal da medula

espinhal, mostrando sinapses das fibras C e A .
25
As fibras C e A transferem a informação nociceptiva para a lâmina

superficial (lâmina I e II) e para a lâmina profunda (lâmina V e VI) no corno
dorsal, como também para a lâmina circumcanular (lâmina X). Por outro
lado, as fibras A são fibras de maior calibre, mielinizadas e de rápida
conduntância e transmitem a informação de estímulos mecânicos inócuos
para lâmina profunda (III-IV) [77].
As fibras aferentes primárias (PAFs) podem estimular diretamente

neurônios de projeção, os quais retransmitem a mensagem para o cérebro,
ou indiretamente enviam a mensagem para outros neurônios de projeção via
interneurônios excitatórios. Além disso, as PAFs também podem estimular
interneurônios inibitórios os quais interagem com os neurônios de projeção
[77].
Pode-se afirmar que a dor não é uma sensação uniforme, pois o início
das respostas de projeção é determinado por muitos fatores dentro da
medula espinhal e estrutura do cérebro envolvidas na integração e
modificação da sinalização nociceptiva [59].
Neste sentido, existem várias fontes importantes onde os mediadores

que participam da resposta nociceptiva são gerados como: tecido lesado,
sistema vascular, células imunes, tecidos adjacentes, nervos sensoriais e
simpáticos. Esses mediadores atuam em receptores amplamente
distribuídos no organismo. Alguns desses receptores são acoplados a
proteína G e induzem a informação de segundos mensageiros. Outros
receptores são acoplados a canais iônicos que regulam a permeabilidade e
a concentração celular de íons [59].
Alguns desses mediadores que estimulam o tipo químico de dor

incluem: os metabólitos derivados do ácido araquidônico (prostaglandinas -
PGs e leucotrienos), bradicinina (BK), serotonina (5-HT), histamina,
citocinas, íons potássio, óxido nítrico (NO) e enzimas proteolíticas. Além
desses, outros mediadores, tais como os aminoácidos excitatórios
(glutamato, aspartato), acetilcolina e outros que podem ser liberados após a
26
lesão tecidual ou ainda irritantes exógenos (formalina, capsaicina, ácido

acético), são também responsáveis pela multiplicidade de eventos que
ocorrem durante a transmissão da dor, tanto no sistema periférico quanto
central [59, 77].
O modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em

camundongos é descrito como um modelo típico de nocicepção inflamatória
visceral, sendo amplamente utilizado como ferramenta para detecção e
avaliação de novos agentes com propriedades analgésicas e
antiinflamatórias [85]. Os prótons oriundos da dissociação do ácido acético
podem ativar diretamente canais de cátions não seletivos localizados nas
fibras aferentes primárias [61]. Além disso, a injeção de ácido acético na
cavidade peritoneal de camundongos promove a liberação de diversos
mediadores inflamatórios como, por exemplo, PG, BK, os quais estimulam
neurônios aferentes primários, aumentando a liberação de aspartato e
glutamato no fluido cerebroespinhal. Em função disso, este modelo
apresenta uma boa sensibilidade, embora pouca especificidade. Neste
contexto, a nocicepção induzida por ácido acético pode ser prevenida por
agentes antiinflamatórios, analgésicos, relaxantes musculares e sedativos
[85-89].
O teste de formalina é o modelo de dor mais utilizado e é dividido em

duas fases de sensibilidade dolorosa [66, 78]. A primeira fase ocorre durante
os primeiros cinco minutos após a injeção da formalina, na qual resulta de
estímulo químico direto das fibras aferentes nociceptivas mielinizadas e não
mielinizadas, principalmente a fibra C, a qual pode ser suprimido por drogas
analgésicas opióides como a morfina [79-81]. Estudos demonstram que a
substância P e a bradicinina participam da primeira fase [80].
A segunda fase ocorre entre quinze a trinta minutos após a formalina,

na qual os mediadores formados nos tecidos periféricos, como as
prostaglandinas, serotonina, histamina e bradicinina, induzem mudanças
funcionais nos neurônios, do corno dorsal que, ao longo do tempo promove
a facilitação da transmissão em nível espinhal. Esta evidência sugere que o
27
processo de inflamação periférica está envolvido na segunda fase [78, 83,

84].
O gênero Lippia apresenta um grande número de espécies com

atividades farmacológicas comprovadas. Dentre as espécies, a Lippia alba,
L. geminata, L. citriodora, L. dulcis, L. graveolens, L. javanica e L. nodiflora
apresentaram atividade analgésica, antiinflamatória e antipirética [19].
Um estudo realizado por Soares [90] avaliou as atividades

antinociceptivas das soluções extrativas hidroalcoólicas de L. alba a 40% e a
80% obtidas por maceração, sendo que a solução extrativa a 40%
apresentou melhor ação antinociceptiva.
No nosso trabalho, o extrato metanólico das folhas de Lippia gracilis

Schauer foi analisado quanto ao seu efeito antinociceptivo através dos testes
de contorções abdominais induzidas por ácido acético e formalina.
28
Capítulo
29
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- GÊNERO LIPPIA
O uso de plantas com fins terapêuticos é uma tradição milenar

presente nas culturas de várias nações constituindo, ainda hoje, um recurso
alternativo de grande aceitação [92].
Entre as plantas utilizadas como medicinais, destacam-se as espécies

da Família Verbenaceae pertencente à ordem Lamiales. Esta Família
compreende 35 gêneros e 1.035 espécies, muitos exclusivamente
brasileiros, com distribuição tropical e subtropical. Os gêneros mais
representativos em número de espécies são: Verbena, Lippia, Citharexylum,
Stachytarpheta, Glandularia e Duranta [93].
O gênero Lippia, o segundo maior da família Verbenaceae, possui

aproximadamente 200 espécies de ervas, arbustos e pequenas árvores,
cujos maiores centros de dispersão se encontram em países das Américas
do Sul e Central, como também em territórios da África tropical [19, 94].
Os principais centros de diversidade específica do gênero Lippia

estão localizados no Brasil e México. No Brasil, o maior número de espécies
se encontra na Cadeia do Espinhaço, localizada nos estados de Minas
Gerais, Bahia e Goiás [95].
No Brasil encontram-se aproximadamente 120 espécies de Lippia

distribuídas no cerrado e caatinga, onde se destacam por seu aspecto
chamativo no período da floração e por seu aroma forte e geralmente
30
agradável. Destas espécies, a L. alba (Mill.) N. E. Brown (erva cidreira) é a

mais conhecida e utilizada devido as suas propriedades medicinais [96].
No nordeste do país as espécies de Lippia são usadas na medicina

popular para o tratamento de resfriados, gripes, bronquites e tosse. Em
muitos casos, as partes usadas são as folhas e flores na forma de infusão ou
decocto administradas oralmente ou através de emplastos [19, 96].
Inúmeras espécies de Lippia são empregadas na medicina tradicional

no tratamento de patologias diversas e como resultado muitas têm sido
investigadas do ponto de vista farmacológico, revelando importantes
propriedades como ação sedativa, antiespamódica, estomáquica,
antiinflamatória e antipirética da L. alba (Mill.) N. E. Brown [97]; efeito
antisséptico, antiinflamatório e cicatrizante do extrato aquoso de L. sidoides
Cham [96]; ação contra a malária, no tratamento de hipertensão e combate à
sarna da L. multiflora Moldenke [99, 100]; tratamento da tosse e bronquite da
L. dulcis Trevir [101].
Além de suas propriedades medicinais, as folhas da maioria das

espécies são utilizadas na preparação de alimentos [102]. Neste aspecto é
interessante ressaltar a importância da L. dulcis Trevir., cujo principal
componente é a hernandulcina (1), uma molécula 1.000 vezes mais doce
que a sacarose [19, 101, 103].
O
OH
Algumas espécies de Lippia têm sido utilizadas também no

reflorestamento de áreas mineradas. L. origanoides H.B.K., por exemplo,
tem sido usada como espécie pioneira em regiões de minério de ferro que
foram desativadas ou abandonadas na Venezuela [148].
31
Segundo Pascual et al. [19], algumas espécies de Lippia, ao longo

dos anos, tem apresentado problemas de nomenclatura botânica devido à
dificuldade em torno da correta identificação de certas espécies causando a
utilização de diversas sinonímias para uma mesma espécie em artigos
científicos. L. alba (Mill.) N. E. Br., por exemplo, apresenta várias sinonímias
e pode receber o nome de L. geminata, L. microphylla Griseb, L. germinata
H.B.K, L. globiflora Kuntze, L. lantanoides Coult, Lantana alba Mill e Phyla
germinata H.B.K..
Com o propósito de contribuir para uma solução, a sistematização das

informações referentes à denominação botânica de espécies do gênero
Lippia foi realizada pela revisão do registro dessas espécies no INPI (The
International Plant Names Index). Nesta revisão algumas espécies vêm
classificadas, ora como binômio válido, ora como sinonímias. Dentre estas
espécies, a L. gracilis apresentou dois binômios válidos, sendo eles: L.
gracilis Schauer e L. gracilis Phil.
2.2- LIPPIA GRACILIS SCHAUER
Lippia gracilis Schauer é uma planta aromática endêmica do nordeste

brasileiro, próprio da vegetação semi-árido, conhecida popularmente como
‘’alecrim-da-chapada’’ ou ‘’alecrim-de-serrote’’. É encontrada
predominantemente nos estados da Bahia, Sergipe e Piauí [105]. Apresenta-
se como um arbusto de aproximadamente 2,5 cm de altura, bem ramificada,
de folhas pequenas e flores brancas, ambas bastante odoríferas (Figura 7).
32
Figura 7: Lippia gracilis Schauer
As folhas de L. gracilis são ricas em óleo essencial que apresenta

forte atividade antimicrobiana contra fungos e bactérias [106]. Além disso,
elas são bastante usadas nas infecções da garganta e boca, problemas
vaginais, tratamento da acne, panos brancos, impigens, caspa, queimaduras
e feridas [107].
2.3 - CONSTITUINTES QUÍMICOS DO GÊNERO LIPPIA
Os estudos referentes à composição química das espécies de Lippia

evidenciam, principalmente, os constituintes voláteis. Entretanto, outras
substâncias como flavonóides, iridóides e naftoquinonas também são citados
com freqüência [108-111, 112-114].
Alguns alcalóides foram identificados na L. dulcis Trevir, L. geminata

H.B.K., L. nodiflora (L.) Michx e L. turbinata Griseb [115-117] enquanto que
taninos são encontrados na L. alba (Mill.) N.E. Brown [117, 118].
33
Triterpenos e derivados de esteróides, usualmente identificados como

saponinas, foram relatados na L. alba (Mill.) N.E. Brown, L. javanica
(N.L.Burm.) Spreng., L. rehmani H.H.W. Pearson e L. turbinata Griseb [115,
117-120].
Atualmente existe um grande número de estudos fitoquímicos e

farmacológicos da L. alba (Mill.) N.E. Brown e L. multiflora Moldenke, no
entanto para as outras espécies os estudos são poucos no que diz respeito
aos aspectos químicos.
2.3.1 - Óleo essencial
A composição química do óleo essencial de muitas espécies de Lippia

tem sido investigada através de Cromatografia Gasosa e, com base nos
dados publicados, percebe-se que limoneno (2), -cariofileno (3), p-cimeno
(4), cânfora (5), linalool (6), α-pineno (7) e timol (8) são os componentes que
aparecem com maior freqüência [19, 121].
CH3
CH2
H3C
CH3
2 3 4 5
H3C OH
OH
6 7 8
34
Além destes, foi isolado da L. dulcis o (+)-hernandulcina (9), (+)-4- -

hidroxihernandulcina e (-)-epihernandulcina (10) [101, 102]. Outro estudo da
mesma planta relatou a presença de seis novos sesquiterpenos do tipo
bisabolano das partes áreas, o peroxilippidulcinas A-C (11-13),
peroxilippidulcinas B (14), epilippidulcinas B (15) e C (16), lippidulcina A (17)
e epilippidulcina A (18) [122].
O O
OH OH
H H
9 10
O O
OH R OH
H H R1 R2
11: R = OOH 12: R1 = OOH R2 = H

17: R = OH 13: R1 = H R2 = OH
O O
OH OH
OH
H R1 R2
H
14: R1 = OOH R2 = H 18
15: R1 = H R2 = OOH
16: R1 = H R2 = OH
No gênero Lippia, a secreção de óleos essenciais tem sido associada

à presença de tricomas. Normalmente os tricomas secretores são de formas
variadas entre grupos vegetais, mas em geral uniformes dentro de um
mesmo táxon [123].
Os óleos essenciais são muito instáveis a presença de luz, calor e

umidade, conseqüentemente o horário de colheita do material vegetal pode
influenciar direta ou indiretamente os processos do metabolismo secundário
35
que resultam em variações quantitativas e qualitativas do óleo essencial

[123].
A composição química do óleo de L. gracilis Schauer mostra

flutuações quantitativas dos componentes majoritários, provavelmente
devido a condições genéticas, ao local e condições em que a planta é
cultivada.
Neves et al. [124] realizaram por CG e CG/EM a determinação dos

compostos químicos presentes no óleo essencial de L. gracilis Schauer em
dois locais da caatinga de Pernambuco, Buíque e Ouricuri.
O estudo mostrou a presença de carvacrol (19) e p-cimeno como

constituintes principais em Buíque e em Ouricuri a presença de timol, -
terpineno (20) e 4-metoxi-acetofenona (21) como compostos majoritários.
O
OH
CH3O
19 20 21
O óleo essencial de L. gracilis também tem sido investigado em outros

estados do nordeste do Brasil, como Ceará, Piauí e Sergipe. No Ceará o
óleo essencial foi caracterizado por timol (30,6%) e p-cimeno (10,7%) como
componentes majoritários, enquanto que no Piauí tem-se o carvacrol
(47,7%) e o p-cimeno (19,2%) [124] e em Sergipe, carvacrol (23,52%), p-
cimeno (15,82%), -terpineno (14,17%) e mentol (10,97%) (22) [125].
36
OH
22
Os compostos químicos presentes no óleo essencial, principalmente

os monoterpenos carvacrol e timol, das espécies do gênero Lippia tem
apresentado forte ação contra bactérias e fungos. Neste contexto, a L.
origanoides H.B.K. apresentou atividade frente a bactérias como
Staphylococcus aureus meticilino resistente e L. sidoides Cham.contra
Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Salmonela enteritidis, Serratia
marcescens, Candida albicans e Mycobacterium smegmatis [102, 106, 107,
126, 127].
Um estudo realizado por Albuquerque et al. [128] mostrou que o óleo

essencial da L. gracilis Schauer possui atividade antimicrobiana contra
fungos e bactérias endofíticas de helicônias. O óleo apresentou uma inibição
de 100% contra os fungos Geotrichum candidum, Trichoderma viride, Torula
herbarum, Paecillomyces sp, Aspergillus nidulans, Fusicoccum sp,
Aspergillus flavus, Paecillomyces aeruginens; 95,58% contra Curvularia
lunata e de 89,40% contra Aspergillus niger.
As bactérias Salmonela choleraceuis-diarizonae, Enterobacter

asburiae, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilis, Kleibsiella pneumoniae,
Enterobacter hormaechei e Bacillus cereus foram todas inibidas na presença
do óleo essencial. Essa ação foi associada à presença de dois
monoterpenos fenólicos, o carvacrol (41,77%) e o timol (10,13%).
2.3.2 - Fitoconstituintes
Considerando a grande quantidade de trabalhos voltados para a

determinação do óleo essencial das espécies deste gênero, é importante
37
perceber a grande necessidade de trabalhos que enfoquem outras classes

de substâncias.
2.3.2.1 – Flavonóides
Compostos flavonoídicos aparecem com relativa freqüência em

espécies deste gênero. Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos
mais importantes e diversificados entre os produtos de origem vegetal.
Possuem a capacidade de modular a atividade de enzimas e afetar o
comportamento de muitos sistemas celulares, sugerindo que muitas
espécies podem possuir efeitos anti-hepatotóxico, antialérgico,
antiinflamatório, antiosteoporótipo e até antitumoral [129].
A maioria dos flavonóides identificados no gênero Lippia são flavonas.

As mais freqüentes são 6-hidroxiflavonas, metoxiflavonas e alguns sulfatos
de flavonas (mono e disulfatos) [19].
Pascual et al. [19] relataram a presença de duas flavanonas,

naringenina (23) e pinocembrina (24), na espécie L. graveolens. Em 2007
Lin et al. [108] identificaram nove novas flavanonas do extrato MeOH:H2O
(70:30 v/v) das folhas de L. graveolens por LC-DAD-ESI/MSD.
OH
HO O HO O
OH O OH O
23 24
O estudo a respeito dos flavonóides foi realizado principalmente nas

espécies L. citriodora (Ort.) H.B.K. e L. nodiflora (L.) Michx. São
aproximadamente 56 ocorrências de flavonóides no gênero Lippia, sendo 45
com derivados de flavonas (25) e 11 com derivados de flavanonas (26),
como mostrado na tabela 1.
38
3' 3'
2' 4' 2' 4'
8 8
O 5' O 5'
7 7
2 6' 2 6'
6 4 3 6 4 3
5 5
O O
25 26
Tabela 1: Flavonóides isolados de espécies do gênero Lippia
COMPOSTO ESPÉCIES [REFERÊNCIAS]

apigenina L. citriodora 108-110, 112
(5,7,4’-OH flavona) L. graveolens
apigenina-7-O-glicosil L. graveolens 108
apigenina-7-glucoronil-glicosil L. triphylla 130, 131
apigenina-6-OMe-7-metil éter L. sidoides 132
cirsiliol L. citriodora 109, 110, 112
(5,3’,4’-OH-6,7-OMe flavona)
cirsimaritina L. citriodora 109, 110, 112, 122,
(5,4’-OH-6,7-OMe flavona) L. sidoides 132, 133
L. dulcis
crisoeriol L. citriodora 109, 110, 112
(5,7,4’-OH-3-OMe flavona)
diosmetina L. citriodora 109, 110, 112
(5,7,3’-OH-4’-OMe flavona)
diosmetina-7-glucoronil-glicosil L. triphylla 130, 131
eupafolina L. citriodora 109, 110
(5,7,3’,4’-OH-6-OMe flavona)
eupatorina L. citriodora 109, 110, 112, 122
(5,3’-OH-6,7,4’-OMe flavona) L. dulcis
eupatilina L. dulcis 122
(5,7-OH-6,3’,4’-OMe flavona)
galangina L. graveolens 108
(3,5,7-OH flavona)
39
Tabela 1: continuação

metil-galangina L. graveolens 108
jaceosidina L. nodiflora 130
(luteolina-6-OMe-3’-metil éter)
jaceosidina-7-sulfato L. nodiflora 130
jaceosidina-7,4’-disulfato L. nodiflora 130
luteolina L. citriodora 108-110, 112, 132-
(5,7,3’,4’-OH flavona) L. graveolens 134,
L. sidoides
luteolina 6-OH L. citriodora 108-110, 112, 130
L. graveolens
L. nodiflora
luteolina-7-O- -glicosil L. citriodora 108-110, 112
L. graveolens
luteolina-6-OH-6-sulfato L. citriodora 109, 110, 112
luteolina-6-OH-7-sulfato L. citriodora 109, 110, 112
luteolina-6-OH-6,7-disulfato L. citriodora 109, 110, 112
luteolina-6-OH-7-O-hexosil L. graveolens 108
luteolina-6-OH-7-O-ramminosil L. graveolens 108
luteolina-glucoronil-glucosil L. triphylla 130, 131
lippiflorina A L. citriodora 109, 110, 112
(luteolina-6-OH-7-arabinosil)
lippiflorina B L. citriodora 109, 110, 112
(luteolina-6-OH-7-arabinosil-4’–
ramnosil)
luteolina-7-glicosil L. citriodora 109, 110, 112
luteolina-6-OH-7-apiosídeo L. citriodora 109, 110, 112
nepetina L. nodiflora 130
(luteolina-6-OMe)
nepetina-3’,4’-disulfato L. nodiflora 130
nepetina-7-sulfato L. nodiflora 130
nodifloretina L. nodiflora 130
(luteolina-6-OH-3’-metil éter)
nodifloretina-7-sulfato L. nodiflora 130
nodifloretina-6,7-disulfato L. nodiflora 130
40

pectolinarigenina L. citriodora 109, 110, 112, 122
(5,7-OH-6,4’-OMe flavona L. dulcis
salvigenina L. citriodora 109, 110, 112, 122
(5-OH-6,7,4’-OMe flavona) L. dulcis
scutellarein L. graveolens 108
(5,6,7,4’-OH flavona)
scutellarein-7-O-hexosil L. graveolens 108
scutellarein-6-metil L. graveolens 108
scutellarein-6,7-dimetil L. graveolens 108
5-4-OH-6,7- OMe flavona L. sidoides 112, 132, 134
5,3’-OH-6,7,4’,5’-OMe flavona L. dulcis 122
quercetina L. aff. gracilis 108-110, 113, 122,
(3,5,7,3’,4’-OH flavona) L. dulcis 132-134
L. graveolens
L. sidoides
eriodictiol L. graveolens 108
(5,7,3’,4’-OH flavanona)
eriodictiol-7-O-glicosil L. graveolens 108
naringenina L. graveolens 108, 111
(5,7,4’-OH flavanona)
pinocembrina L. graveolens 108, 111
(5,7-OH flavanona)
sakuranetina L. graveolens 108
(5,4’-OH-7-OMe flavanona)
5,6,7,3’,4’-OH flavanona L. graveolens 108
5,6,7,3’,4’-OH-7-O-hexosil flavanona L. graveolens 108
3,5,6,7,4’-OH flavanona L. graveolens 108
3,5,6,7,4’-OH-7-O-hexosil flavanona L. graveolens 108
3,5,6,7,4’-OH-2-O-hexosil flavanona L. graveolens 108
taxifolina L. graveolens 108, 132, 133
(3,5,7,3’,4’-OH flavanona) L. sidoides
41
2.3.2.2 - Naftoquinonas
As naftoquinonas não são freqüentes nas espécies do gênero Lippia.

No entanto, no extrato metanólico das folhas e ramos de L. sidoides foi
isolado o lapachenol (27), isocatalponol e 6-oxo-3,4,4a,5-tetrahidro-3-hidroxi-
2,2-dimetilnafto-1,2-pirano (28) [135]. O lapachenol também foi relatado na
L. graveolans e L. aff. gracilis [111, 113].
OCH3 O
7 6
8 5
H
9
10 4
H 1 3 H
O O 2
OH
27 28
Na L. sidoides também foi isolado uma nova naftoquinona dimérica

prenilada, a lippidoquinona (29) [134].
O O
HO
H
OH
29
Algumas naftoquinonas são antibacterianas e fungicidas, outras

apresentam atividade antiprotozoários e antivirais. Entretanto, nenhuma
42
naftoquinona natural é atualmente utilizada com fins terapêuticos [127, 136,

137].
2.3.2.3 - Iridóides
Outro componente presente em espécies de Lippia são os iridóides

glicosilados. Eles são produtos do metabolismo secundário de alguns grupos
vegetais e desempenham um papel de proteção contra predadores,
principalmente herbívoros, por serem venenosos ou amargos. [19, 138].
Nas plantas os iridóides apresentam uma pronunciada distribuição em

angiospermas notadamente nas Lamiaceae, Verbenaceae,
Scrophulariaceae e Plantataginaceae. Sendo não raro, utilizados como
marcadores taxonômicos a níveis de gênero e subgênero [139].
Inúmeras publicações demonstram as propriedades biológicas dos

iridóides como antiviral, antimicrobiana, antitumoral, hemodinâmica,
vasoconstritora, hepatoprotetora e antiinflamatória [140-144].
Rastrelli et al. [145] investigaram as folhas de L. graveolens da

Guatemala e isolaram dez iridóides, sendo alguns deles secoiridóides
glicosilados. Os menos freqüentes foram secologanina (30), secoxiloganina
(31), dimetilsecologanosida (32), ácido logânico (33), loganina (34), ácido 8-
epi-loganina (35), carioptosida (36) e os majoritários foram 6’-O-caffeoil (37),
6’-O-p-coumaroil (38) e ácido carioptosídico (39).
R COOCH3 COOR COOH
HO HO
O O O
O_Glu O_Glu O_Glu
30: R = CHO 33: R = H 35

31: R = COOH 34: R = CH3
32: R = COOCH3
43
COOH OH
O
R C CH CH OH
HO
O
HO
O_Glu
36 37
O COOH
R C CH CH OH
HO
O OH
O OH
HO
O OH
HO
38 39
Os iridóides teviridosídeo (40) e tevesídeo-Na (41) foram isolados das

espécies L. alba, L. javanica, L. turbinata, L. angustifolia, L. arechavaletae, L.
ramboi e L. thymoides [146, 147].
COOR2
R1
O OH
O OH
H
HO O OH
HO
40: R1 = OH R2 = Na
41: R1 = OH R2 = CH3
Na L. citriodora e L. nodiflora foram identificados genoposídeo (42),

ácido genoposídeo-Na (43) e mussaenosídeo (44). O genoposídeo também
é relatado na L. alba [19].
44
COOR2 COOCH3
R1 H H
H
O OH O OH
O OH O OH
H HO CH H
HO O OH 3 O OH
HO HO
42: R1 = H R2 = CH3 44
43: R1 = H R2 = Na
Em 2006, Barbosa et al. [114], isolaram do decocto das folhas de L.

alba um novo iridóide chamado shanzshida (45). Sena Filho et al. [139]
isolaram da mesma planta o teviridosídeo, mussaenosídeo e gardosídeo
(46).
H COOH COOH
HO H H
HO
O OH O OH
O OH O OH
HO H H
H3C
O OH O OH
HO HO
45 46
45
Capítulo
46
3. OBJETIVOS
3.1- OBJETIVO GERAL
 Controle químico de qualidade de plantas medicinais.
3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Desenvolvimento de método por Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência para diferenciação de genótipos de Lippia gracilis Schauer;
 Isolamento e identificação de marcadores químicos;
47
Capítulo
48
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
4.1 - EQUIPAMENTOS E MATERIAIS
As folhas e caules dos genótipos de Lippia gracilis foram secas em

estufa de circulação, modelo FIC. 0.5 – FAMO®.
O material vegetal foi triturado em moinho de facas da marca

MARCONI®.
Os extratos dos genótipos das folhas foram preparados com metanol

grau P.A. da marca Quimex® e os extratos dos genótipos dos caules foram
preparados com metanol grau HPLC da marca Carlo Erba®.
Os extratos metanólicos foram concentrados em evaporador rotatório

da marca Heidolph®.
As pesagens foram realizadas em balança analítica da marca

OHAUS®.
A acetonitrila utilizada nas análises cromatográficas de alta eficiência

foi de pureza analítica e grau HPLC (JT Baker, Philipsburg, PA, EUA).
O metanol utilizado na preparação das amostras para extração em

fase sólida (SPE) foi de pureza analítica e grau HPLC (Carlo Erba, Duque de
Caxias, RJ, Brasil).
O ácido fórmico (88%) foi grau analítico (JT. Baker, Philipsburg, PA,
EUA).
49
Os solventes utilizados nas análises cromatográficas de alta eficiência

foram previamente filtrados utilizando membrana filtrante da marca MFS de
nylon de 47mm (diâmetro da membrana) e 0,45 µm (diâmetro do poro).
A água deionizada utilizada na composição da fase móvel e no

preparo das amostras para extração em fase sólida (SPE) foi obtida em um
sistema MILLI-Q (Millipore, São Paulo, SP, Brasil).
Para realização das extrações em fase sólida (SPE) foram avaliados e

utilizados cartuchos C18 de 1,0 mL/100 mg de sorvente das marcas Varian®,
Supelco® e JT Baker® .
Nas análises por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência foram

testadas diferentes colunas analíticas para a otimização da separação dos
constituintes dos extratos de Lippia gracilis, sendo elas: coluna C18 LUNA®
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm,
15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-158) e coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x
0,46 cm, Phenomenex).
Nas análises por CLAE semipreparativa foi utilizada coluna hexil-fenil

LUNA® (10 µm, 25,0 x 1,0 cm, Phenomenex).
A cromatografia em coluna foi realizada com resina amberlite XAD-2

da Supelco®.
4.2 - TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
4.2.1 - Sistemas de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Sistema 1: Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU (Kyoto,

Japão), modelo Prominence, para eluição gradiente, composto de uma
bomba LC-20AT, com válvula solenóide de quatro linhas, degaseificador
DGU-20A5, auto injetor SIL-10A, detector UV com arranjo de diodos SPD-
M10Avp ligado a uma interface CBM 20A. O equipamento foi gerenciado
pelo software LC Solution. Aparelho pertencente ao Laboratório de Síntese
Orgânica e CLAE do Departamento de Química da UFSCar.
50
Sistema 2: Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU (Kyoto,

Japão), modelo Prominence, para eluição gradiente, composto de duas
bombas LC-6A, degaseificador DGU-20A3, auto injetor SIL-10A, detector UV
com arranjo de diodos SPD-M20Avp conectado a uma interface CBM 20A. O
equipamento foi gerenciado pelo software LC Solution. Aparelho pertencente
ao Departamento de Química da UFS.
4.3 - MATERIAL VEGETAL
As folhas e caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) da

espécie de Lippia gracilis foram coletados no mês de maio de 2007 no
Campus Rural da Universidade Federal de Sergipe (UFS) e exemplares
foram depositados no herbário da UFS (Tabela 2).
Tabela 2: Dados dos genótipos da espécie Lippia gracilis
CÓDIGO LOCAL ESTADO ESPÉCIE DADOS NÚMERO DO

DE GEOGRÁFICOS HERBÁRIO
ORIGEM (lat; long; alt.) UFS
106 Tomar do SE Lippia 11 19' 16,7'' S; 37 9205
Geru gracilis 55' 09,2'' W; 215 (m)
107 Tomar do SE Lippia 11 19' 20,1" S; 37 9203
Geru gracilis 55' 13,5" W; 214 (m)
108 Tomar do SE Lippia 11 19' 22,4" S; 37 9404
Geru gracilis 55' 12,6" W; 209 (m)
109 Tomar do SE Lippia 11 19' 0,7" S; 37 55' 9207
Geru gracilis 16,9" W; 207 (m)
110 Tomar do SE Lippia 11 19' 1,1" S; 37 55' 9208
Geru gracilis 14,9" W; 205 (m)
201 Rio Real BA Lippia 11 23' 38,7" S; 38 9206
gracilis 00' 54,1" W; 200 (m)
202 Rio Real BA Lippia 11 23' 45,3" S; 38 9209
gracilis 00' 51,3" W; 197 (m)
Após a coleta, as folhas e caules foram separados, secos em estufa

de circulação de ar e, posteriormente, triturados em moinho de facas,
obtendo-se as quantidades descritas na tabela 3.
51
Tabela 3: Quantidade de material vegetal seco e triturado
GENÓTIPO FOLHAS (g) CAULES (g)

106 350,12 645,02
107 557,21 972,39
108 180,37 577,05
109 397,62 1070,66
110 262,57 887,37
201 255,28 801,31
202 478,07 718,63
Os genótipos 106-110 são provenientes do estado de Sergipe,

município de Tomár do Geru, e os genótipos 201 e 202 são provenientes do
estado da Bahia, município de Rio Real. Essas amostras foram coletadas
nestes municípios e cultivadas no Campus Rural da UFS, onde estão sendo
supervisionadas pelo laboratório de Culturas de Tecidos Vegetais e
Melhoramento Vegetal do Departamento de Engenharia Agronômica (DEA)
da UFS, sob coordenação do Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank (Figura 8).
Figura 8: Mudas da espécie de Lippia gracilis no DEA
52
4.4 - PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS
O procedimento de obtenção dos extratos das folhas e caules foi

padronizado. Sobre o material vegetal moído foi adicionado metanol (1:5
p/v), o qual ficou sob maceração por uma semana.
Após este tempo, a mistura foi filtrada a pressão ambiente em papel-

filtro, concentrado em evaporador rotatório sob pressão reduzida a 30°C, até
a completa remoção do solvente, resultando nos respectivos extratos brutos
(Tabela 4). Depois da primeira extração, o procedimento foi repetido por
mais três vezes.
Para a preparação dos extratos das folhas foram utilizadas as

quantidades descritas na tabela 3 e para os caules foram utilizados 200 g.
Tabela 4: Rendimento dos extratos metanólicos das folhas e caules
GENÓTIPO FOLHAS (g) CAULES (g)

106 15,831 6,356
107 18,749 6,740
108 12,146 7,766
109 27,844 6,816
110 19,625 5,597
201 19,356 5,316
202 20,764 5,137
4.5 - PREPARO DAS AMOSTRAS PARA CLAE ANALÍTICA
4.5.1 - Extração em Fase Sólida
A análise cromatográfica de extratos de plantas, em geral, requer um

pré-tratamento da amostra. A extração em fase sólida é umas das
ferramentas mais empregadas para o pré-tratamento de analitos presentes
em matrizes complexas, como extratos de plantas. Essa técnica permite que
a análise dos componentes de interesse se torne possível de forma que se
obtenha uma separação cromatográfica livre de interferentes [149].
53
Visando coletar as amostras dos genótipos de Lippia gracilis isentas

de clorofilas para posterior análise cromatográfica, dois métodos de extração
foram estudados com três marcas de cartuchos C18 (Varian®, Supelco®, JT
Baker®). Todos os passos de otimização foram realizados no extrato
metanólico do genótipo 108 das folhas.
A amostra a ser aplicada no cartucho foi preparada solubilizando 15

mg do extrato metanólico do genótipo 108 em 1 mL de metanol.
No primeiro método, o cartucho foi condicionado com 3 mL de

metanol, seguido de 1mL de água. Posteriormente, foi aplicado 100µL da
amostra a qual foi eluída seqüencialmente com 1 mL de : 5%, 10%, 15%,
20%, 30%, 50%, 60% de MeOH:H2O e 3 mL de 100% MeOH.
No segundo método, o cartucho foi condicionado com 3 mL de

metanol, seguido por 1 mL de água. Posteriormente foi aplicado 100µL da
amostra a qual foi eluída seqüencialmente com 1 mL de solução a 5%
MeOH:H2O e 3 mL de 100% MeOH (Figura 9).
Figura 9: Esquema com as etapas da extração em fase sólida
É importante mencionar que as três marcas de cartuchos testadas

foram submetidas igualmente aos dois métodos de extração.
54
Após análise por CLAE de todas as amostras (discutidas no item 5.1)

foi observado que as melhores condições foram obtidas com a utilização do
segundo método sobre o cartucho da marca JT Baker®, as quais foram
também aplicadas para preparação das amostras oriundas dos outros
genótipos das folhas e caules (106-110, 201 e 202).
Para cada genótipo das folhas e caules foram preparadas

quintuplicatas a partir dos extratos metanólicos, com a repetição completa do
processo de pré-tratamento acima descrito.
Os experimentos foram realizados com o auxílio de um dispositivo de

extração acoplado a uma bomba de vácuo (Figura 10).
Figura 10: Dispositivo para extração em fase sólida
4.6 - CONDIÇÕES ANALÍTICAS DOS CROMATOGRAMAS

FINGERPRINT
As frações obtidas por extração em fase sólida (SPE) foram reunidas,

concentradas em evaporador rotatório e dissolvidas em 500 µL de metanol
para serem, posteriormente, utilizadas nas análises por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência.
Os genótipos das folhas foram analisadas usando um sistema de

eluição que empregou um gradiente de solvente no qual a porcentagem de
acetonitrila (B) e de ácido fórmico 0,5%(v/v) (A) variaram de 15% a 40% (B)
em 50 min, 40% a 70% (B) em 20 min e mantida constante em 70% (B) até
55
75 min. Ao término da corrida cromatográfica empregou-se um gradiente de

volta de 70% a 15% (B) em 5 min e o tempo de espera para
recondicionamento da coluna foi de 30 min. A vazão empregada foi de 0,5
mL/min e em cada análise foram injetados 25 µL da amostra.
Para a análise dos genótipos dos caules, o sistema de eluição

empregou um gradiente de solvente no qual a porcentagem de acetonitrila
(B) e de ácido fórmico 0,5% (v/v) (A) variaram de 15% a 20% (B) em 25 min,
20% a 40% (B) em 45 min e mantida constante em 40% (B) até 75 min. Ao
término da corrida empregou-se um gradiente de volta de 40% a 15% (B) em
5 min e o tempo de espera para recondicionamento da coluna foi de 30 min.
A vazão empregada foi de 0,5 mL/min e em cada análise foram injetados 25
µL da amostra.
4.7 - CROMATOGRAFIA COM RESINA AMBERLITE XAD-2
A resina amberlite XAD-2 (poliestireno-divinil-benzeno) é utilizada em

procedimentos de separação devido às suas propriedades, tais como:
porosidade, alta área superficial, durabilidade e pureza [149]. São muito
úteis na purificação de compostos químicos de origem vegetal,
principalmente flavonóides [150].
Os extratos metanólicos do genótipo 107 das folhas (6,0 g) e caules

(6,0 g) foram submetidos à cromatografia em coluna (35,0 cm x 3,50 cm de
d.i) com resina amberlite XAD-2 (170,0 g).
A resina foi deixada em repouso com metanol e, em seguida, a coluna

foi empacotada cuidadosamente para evitar a formação de bolhas de ar que
interferissem o fluxo da fase móvel na coluna.
A eluição foi feita com 500 mL de MeOH:H2O nas proporções: 5%,

15%, 25%, 35%, 50%, 70%, 85% de MeOH:H2O e 100% MeOH. Foram
coletadas oito frações num volume de 500mL. Todas as frações eluídas da
coluna amberlite XAD-2 foram secas a temperatura ambiente, obtendo-se as
quantidades descritas na tabela 5. Em seguida, as frações foram
56
submetidas à análise por CLAE utilizando as mesmas condições analíticas

dos cromatogramas fingerprint das folhas e caules (item 4.6).
Tabela 5: Rendimento das frações obtidas da coluna amberlite XAD-2
FRAÇÕES FOLHAS (mg) CAULES (mg)

5% MeOH:H2O 450,00 122,90
15% MeOH:H2O 268,70 36,90
25% MeOH:H2O 358,40 60,70
35% MeOH:H2O 365,70 23,70
50% MeOH:H2O 712,10 39,00
70% MeOH:H2O 382,90 48,50
85% MeOH:H2O 133,60 38,50
100% MeOH 162,40 96,90
4.8 - ANÁLISE EM CLAE SEMIPREPARATIVA DAS FOLHAS
Após a obtenção dos cromatogramas fingerprint de todas as frações

obtidas da coluna cromatográfica em resina amberlite XAD-2, foram
selecionadas as frações 50% e 85% MeOH:H2O para o isolamento dos
compostos químicos por CLAE semipreparativa.
Para isso foi usada uma coluna semipreparativa hexil-fenil LUNA®

(25,0 x 1,0 cm, Phenomenex), vazão de 4 mL/min e detecção em 280 nm.
1. Fração 50% MeOH:H2O: Parte da fração 50% MeOH:H2O (200

mg) foi dissolvida em 2 mL de ACN/HCOOH 0,5% 25:75 (v/v) e adicionado
em um vial de 2mL para ser utilizado na análise por CLAE semipreparativa.
O isolamento dos compostos foi obtido utilizando um gradiente de

solvente na qual a porcentagem de acetonitrila (B) e de ácido fórmico 0,5%
(v/v) (A) variaram de 8% a 40% (B) em 50 min. Em cada análise foram
injetadas amostras na concentração de 10 mg/100 µL.
Da análise em CLAE semipreparativa foram obtidas dez amostras

denominadas LGRA 1, LGRA 2, LGRA 3, LGRA 4, LGRA 5, LGRA 6, LGRA
57
7, LGRA 8, LGRA 9 e LGRA 10. Destas amostras, somente a LGRA 1,

LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9 e LGRA 10 foram enviadas para análises por
RMN.
2. Fração 85% MeOH:H2O: Parte da fração 85% MeOH:H2O (100

mg) foi dissolvida em 2 mL de ACN/HCOOH 0,5% 35:65 (v/v) e adicionado
em um vial de 2mL para ser utilizado na análise por CLAE semipreparativa.
O isolamento dos compostos foi obtido utilizando um gradiente de

solvente na qual a porcentagem de acetonitrila (B) e de ácido fórmico 0,5%
(v/v) (A) variaram de 35% a 53% (B) em 15 min. Em cada análise foram
injetadas amostras na concentração de 10 mg/200 µL.
Da análise em CLAE semipreparativa foram obtidas cinco amostras

denominadas LGRA 11, LGRA 12, LGRA 13, LGRA 14, LGRA 15. Destas
amostras, a LGRA 12 e 13 foram enviadas para análise por RMN.
Todas as amostras foram secas a temperatura ambiente, obtendo-se

as quantidades descritas na tabela 6.
Tabela 6: Rendimento das amostras obtidas por CLAE

semipreparativa
AMOSTRAS MASSA (mg)

LGRA 1 7,6
LGRA 2 9,2
LGRA 3 28,2
LGRA 4 3,1
LGRA 5 1,9
LGRA 6 8,0
LGRA 7 3,3
LGRA 8 3,3
LGRA 9 4,3
LGRA 10 7,5
LGRA 11 0,5
LGRA 12 4,9
58
AMOSTRAS MASSA (mg)

LGRA 13 4,8
LGRA 14 2,2
LGRA 15 0,4
4.9 - ANÁLISES POR RMN
A identificação estrutural dos compostos isolados foi realizada através

do uso da técnica de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e
Carbono-13 e por comparação com dados da literatura.
Os espectros de RMN 1H e 13
C foram obtidos em um espectrômetro
BRUKER, modelo DRX400 de 9,4 Tesla (400 MHz para freqüência do
hidrogênio), pertencente ao Departamento de Química da UFSCar. Os
experimentos foram realizados a temperatura ambiente, sendo as amostras
LGRA 1, LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9, LGRA 10 e LGRA 13 solubilizadas em
metanol deuterado e LGRA 12 em DMSO deuterado, utilizando como
referência interna o tetrametilsilano (TMS). Os deslocamentos químicos ( )
são indicados em ppm e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz).
4.10 - ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA
As análises quimiométricas foram realizadas pelo Prof. Dr. Edenir

Rodrigues Pereira Filho, da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar).
empregando o software PIROUETTE®, versão 4.0 (Informetrix).
4.11 - ESTUDO FARMACOLÓGICO DO EXTRATO METANÓLICO

DAS FOLHAS DE LIPPIA GRACILIS
Dois testes farmacológicos foram realizados com o extrato metanólico

das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis para verificar um possível efeito
antiinflamatório do extrato, uma vez que existem indicações desta atividade
em outras espécies de Lippia como, por exemplo, na L. dulcis [151].
59
4.11.1 - Animais
Foram 80 camundongos (Mus musculus) Swiss, machos, albinos

pesando de 25 - 33 gramas, oriundos do Biotério Central da Universidade
Federal de Sergipe (UFS). Todos os animais foram mantidos até o dia dos
experimentos em gaiolas de polipropileno, com temperatura ambiente de 23
± 2 ºC e ciclo claro-escuro de 12:00 horas, sendo que a fase de luz tinha
início às 6:00 e término às 18:00 horas. Os animais tiveram livre acesso a
alimentação do tipo "pellets" (Labina) e água, disponível em frascos de vidro
com bicos apropriados, até 60 minutos antes dos experimentos.
O projeto foi submetido ao Comitê de Ética em pesquisa com Animal

para avaliação sob o protocolo de número 07/09. Vale ressaltar que todos os
protocolos experimentais propostos respeitam os critérios éticos de
experimentação animal preconizados pelo Colégio Brasileiro em
Experimentação Animal (COBEA).
4.11.2 – Drogas
- Extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis

(EMLG);
- Tween (Sigma, USA);
- Formaldeído 37% (Reagen, Brasil);
- Ácido acetilsalicílico (Sigma, USA);
- Solução de cloreto de sódio, 0.9% (Merck, Brasil);
- Ácido acético glacial PA (Synth, Brasil).
4.11.3 – Avaliação da Atividade Antinociceptiva
4.11.3.1 - Teste de contorção abdominal induzida pelo ácido

acético a 0,85%
Esta metodologia foi realizada com camundongos (n=8/grupo) que

receberam o pré-tratamento com veículo (solução salina/Tween), EMLG
(100, 200 e 400 mg/Kg, v.o.) e ácido acetilsalicílico (200 mg/Kg). Após 60
60
minutos todos os animais foram tratados com solução de ácido acético a

0,85%, pela via intraperitoneal (i.p.). Posteriormente, os animais foram
observados individualmente quanto à apresentação de contorções
abdominais seguidas de extensões dos membros posteriores, durante um
período de 15 minutos [152].
4.11.3.2 - Formalina
O comportamento espontâneo indicativo de nocicepção foi

quantificado após a administração subcutânea de 20 l/animal de uma
solução de formalina a 1,5% no dorso da pata traseira direita do animal
[152]. Para tanto, camundongos foram divididos em 5 grupos de 8 animais
(n=8) e pré-tratados com o veículo (solução salina/Tween), EMLG (100, 200
e 400 mg/Kg, v.o.) e ácido acetilsalicílico (200 mg/Kg, i.p.). A resposta
nociceptiva foi avaliada através da quantificação do tempo que o animal
executou o ato de lamber a pata que recebeu o estímulo, em dois períodos.
O primeiro deles, entre 0-10 minutos e o segundo período de observação, de
20-40 minutos [153, 154].
Os percentuais de inibição foram determinados através da fórmula

seguinte [155]:
% Inibição = 100. (controle - experimental)

controle
61
Capítulo
62
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 - DESENVOLVIMENTO DOS CROMATOGRAMAS FINGERPRINT
5.1.1 - Otimização do procedimento de pré-tratamento
Devido à alta concentração de clorofila nos extratos brutos de Lippia

gracilis, inviabilizando as análises por cromatografia líquida, foi necessário
realizar um pré-tratamento por SPE nos extratos para posterior análise
cromatográfica.
Desta forma, foram testados dois métodos de extração em fase sólida

com o extrato metanólico das folhas do genótipo 108, descrito no item 4.5.1.
Os cartuchos de fase C18 de diferentes marcas (Varian®, Supelco® e JT
Baker®) foram avaliados quanto ao seu poder de retenção da clorofila
(visualmente) na fase sólida e, principalmente, com relação à recuperação
dos metabólitos de interesse presentes na amostra.
O primeiro método utilizado para o pré-tratamento foi testado nas três

marcas de cartuchos. Durante o procedimento do método percebeu-se que
as clorofilas ficavam retidas no cartucho enquanto as substâncias de
interesse eram eluídas e coletadas em tubos de ensaio.
A análise visual permitiu constatar a melhor retenção da clorofila pelo

cartucho da marca JT Baker . Também foi realizada a análise por
cromatografia líquida para verificar a composição química das frações
extraídas por SPE nas três marcas de cartuchos. Para estas análises foi
utilizada uma coluna C18 LUNA® de 10 µm (15,0 x 0,46 cm d.i).
63
As frações 5% de MeOH:H2O e 100% de MeOH extraídas dos três

cartuchos foram analisadas separadamente no cromatógrafo líquido de alta
eficiência (CLAE) da marca SHIMADZU acoplado a um detector UV com
arranjo de diodos pertencente ao Laboratório de Síntese Orgânica e CLAE
do Departamento de Química da UFSCar (Sistema 1 - item 4.2.1), utilizando
um gradiente exploratório linear de ACN (B) e H2O (A), nas condições de 5%
a 100% (B) por 60 min e mantida constante em 100% (B) até 65 min, vazão
de 1 mL/min, volume de injeção de 50 µL, detecção em = 280nm em
coluna C18 LUNA® de 10 µm (15,0 x 0,46 cm d.i) (Figuras 11, 12 e 13).
Figura 11: Cromatograma da fração (a) 5% MeOH:água e (b) 100% MeOH após
tratamento por extração em fase sólida (Varian ). Condições cromatográficas: gradiente
linear de 5% a 100% de ACN (B) em 60 min, vazão = 1mL/min, =280nm, Vinj.= 50µL.
tratamento por extração em fase sólida (Supelco ). Condições cromatográficas: gradiente
64
tratamento por extração em fase sólida (JT Baker ). Condições cromatográficas: gradiente
Analisando os cromatogramas é possível perceber claramente a

diferença entre o perfil químico das frações do cartucho da Supelco® e os
perfis químicos das frações dos cartuchos da Varian® e JT Baker®. Isso
demonstra que a maioria dos constituintes químicos não eluíram com a
passagem da solução 5% de MeOH:H2O e 100% de MeOH no cartucho da
Supelco®.
Diante do exposto, optou-se por realizar o restante das análises com

o cartucho da marca JT Baker®, uma vez que nele houve uma melhor
retenção das clorofilas na fase estacionária e uma boa resposta nas análises
cromatográficas das frações.
Além da análise anterior, foi avaliada a composição química dos

extratos reunindo-se as frações de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50% e 60%
de MeOH:H2O e 100% de MeOH coletadas no SPE, com o objetivo de
comparar os compostos presentes nas frações isoladas de 5% MeOH:H2O e
100% MeOH realizadas anteriormente (Figuras 10 a 12). Para isso, repetiu-
se o mesmo processo de eluição de gradiente exploratório linear de ACN (B)
e H2O (A), nas condições de 5% a 100% (B) por 60 min, vazão de 1 mL/min,
volume de injeção de 50 µL, detecção em =280nm em coluna C18 LUNA®
de 10 µm (15,0 x 0,46 cm d.i). O cromatograma pode ser visualizado na
figura 14.
65
mAU
125
100
75
50
25
0 10 20 30 40 min
Figura 14: Cromatograma das frações reunidas de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%
e 60% MeOH:H2O e 100% MeOH após tratamento por extração em fase sólida (JT Baker®).
Analisando o cromatograma da figura 14 foi possível observar que

ele apresenta um perfil cromatográfico similar ao cromatograma (a) da
figura 13. Isto comprova que os compostos eluíram apenas com a
passagem da solução de 5% MeOH:H2O e 100% MeOH no cartucho. O
cromatograma da figura 15 evidencia esta observação, pois trata-se de um
cromatograma obtido pela análise das frações reunidas de 5% MeOH:H2O e
100% MeOH.
66
Figura 15: Cromatograma das frações reunidas 5% MeOH:água e 100% MeOH

após tratamento por extração em fase sólida (JT Baker®). Condições cromatográficas:
gradiente linear de 5% a 100% de ACN (B) em 60 min, vazão 1mL/min, =280nm, Vinj.=
50µL.
Desta forma, o segundo método para o pré-tratamento dos extratos

brutos das folhas e caules dos genótipos de L. gracilis foi selecionado, na
qual o cartucho C18 da marca JT Baker® é condicionado com 3 mL de
metanol, seguido por 1 mL de água. Posteriormente, é aplicado 100µL da
amostra a qual é eluída seqüencialmente com 1 mL de solução a 5%
MeOH:H2O e 3 mL de 100% MeOH.
5.1.2 – Cromatograma fingerprint das folhas de Lippia gracilis
As condições cromatográficas foram otimizadas utilizando-se a

amostra obtida após a extração em fase sólida. Para a otimização das
condições de análise foram avaliados os efeitos dos seguintes fatores:
natureza do modificador orgânico (ACN ou MeOH), fase estacionária, vazão,
volume de injeção e condições de eluição gradiente.
Todas as análises para a obtenção do cromatograma fingerprint das

folhas de Lippia gracilis foram realizadas no Cromatógrafo líquido da marca
67
SHIMADZU (Kyoto, Japão) pertencente ao Laboratório de Síntese Orgânica

e CLAE do Departamento de Química da UFSCar (Sistema 1 – item 4.2.1).
O uso da eluição gradiente em condições de ampla faixa de força da

fase móvel é tido como exploratório e pode ser usado de modo a fornecer
um cromatograma fingerprint (impressão digital) da amostra em análise.
SYNDER e DOLAN relatam que a mistura ACN:H2O como fase móvel é
menos viscosa e permite a utilização de valores baixos de comprimento de
onda no UV para detecção de compostos [29].
O primeiro passo do trabalho foi a realização de um gradiente

exploratório para visualizar a complexidade da amostra e identificar a fase
móvel mais eficiente para separação dos componentes da amostra.
Inicialmente, foi empregado um gradiente exploratório binário usando

a mistura ACN (B) e H2O (A) como solventes, em uma coluna analítica C18
LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex). Foi variada a concentração
do modificador orgânico (ACN) de 5% a 100% durante 60 minutos, com
vazão de 1mL/min, acompanhado pelo detector UV-Vis com arranjo de
diodos.
A figura 16 mostra o cromatograma na qual a maioria dos compostos

eluíram entre 6 a 34 min.
68
mAU
125
100
75
50
25
0 10 20 30 40 min
Figura 16: Cromatograma do extrato metanólico da Lippia gracillis. Condições

cromatográficas: gradiente linear de 5% a 100% de ACN (B) em 60 min, vazão 1mL/min,
=280nm, Vinj.= 50µL.
A análise cromatográfica permitiu verificar que os compostos

presentes na amostra apresentavam baixa interação com a fase
estacionária, além disso não foi possível obter uma adequada separação
das bandas cromatográficas.
Através deste cromatograma fingerprint foi possível determinar a

inclinação do gradiente (%B/min) e correlacionar a afinidade dos
constituintes presentes na amostra com as fases móvel e estacionária
empregadas através da seguinte fórmula:
% B/min = Δ%B = 95 = 1,58%B/min

tg 60
%B/min = variação do solvente B por tempo (inclinação do gradiente)

Δ%B = diferença entre a % de B final e inicial
tg = tempo de gradiente
69
Desta forma, diferentes otimizações de condições de separação foram

testadas variando os fatores inicialmente mencionados com o intuito de
melhorar a separação dos compostos. Estas diferentes condições são
demonstradas com seus respectivos perfis cromatográficos na tabela 7 e
nas figuras 17.
Tabela 7: Condições cromatográficas avaliadas para separação dos

compostos químicos, com detecção em = 280 nm.
Condição Eluição Solventes Coluna Vazão Vol. de %B/min

gradiente cromatográfica (mL/min) injeção
(B) (15,0 x 0,46 cm) (µL)
1 5-60% por ACN:H2O C18 LUNA® 1,0 50,0 0,92
60min (Phenomenex)
2 5-60% por ACN:HCOOH C18 LUNA® 1,0 50,0 0,92
60min 0,5% (v/v) (Phenomenex)
3 5-90% por MeOH:HCOOH C18 LUNA® 1,0 50,0 1,42
60min 0,5% (v/v) (Phenomenex)
4 15-90% MeOH:HCOOH C18 LUNA® 0,5 50,0 1,25
por 60min 0,5% (v/v) (Phenomenex)
5 5-100% MeOH: H2O C18 LUNA® 1,0 50,0 1,58
por 60min (Phenomenex)
6 5-100% MeOH: H2O Hexil-fenil LUNA® 1,0 50,0 1,58
por 60min (QC-UFSCar-
158)
7 20-100% MeOH:HCOOH Hexil-fenil LUNA® 0,5 25,0 1,33
por 60min 0,5% (v/v) (QC-UFSCar-
158)
8 35-85% MeOH:HCOOH Hexil-fenil LUNA® 0,5 25,0 0,83
por 60min 0,5% (v/v) (QC-UFSCar-
158)
9 5-90% por ACN: HCOOH Hexil-fenil LUNA® 0,5 25,0 1,42
60 min 0,5% (v/v) (QC-UFSCar-
158)
70

(B) (15,0 x 0,46 cm) (µL)
10 1) 20-40% ACN: Hexil-fenil 0,5 25,0 1) 0,5
por 40min; HCOOH LUNA® (QC- 2) 1,5
2) 40-70% 0,5% (v/v) UFSCar-158)
por 20min
11 1) 10-30% ACN: Hexil-fenil 0,5 25,0 1) 0,5
2) 30-70% 0,5% (v/v) UFSCar-158)
por 25min
12 1) 15-40% ACN: Hexil-fenil 0,5 25,0 1) 0,5
2) 40-70% 0,5% (v/v) UFSCar-158)
por 20min
71
Figura 17: Cromatogramas para seleção de condições para o método em CLAE. Os

números correspondem às condições apresentadas na tabela 3.
Observando os cromatogramas das figuras 17, nota-se que não

houve uma boa separação das bandas cromatográficas utilizando as
misturas MeOH:H2O ou MeOH:solução de ácido fórmico (HCOOH) 0,5%
(v/v) com a coluna de fase estacionária C18, apresentando muitas bandas
em co-eluição (condições cromatográficas de 1 a 5).
72
A mudança da coluna de fase estacionária C18 para uma de fase hexil-

fenil utilizando as misturas MeOH:H2O ou MeOH:solução de ácido fórmico
(HCOOH) 0,5% (v/v) permitiu obter uma melhor separação das bandas
cromatográficas (condições cromatográficas 6 a 8); no entanto, ainda foi
observado sobreposição de bandas.
Contudo, ao variar o modificador orgânico de MeOH para ACN e

também as condições de eluição gradiente, pôde-se obter cromatogramas
com melhor separação das bandas cromatográficas (condições
cromatográficas 9 a 12).
Dentre as condições testadas, a condição 12 foi a que apresentou o

melhor cromatograma. Tanto a composição da fase móvel ACN: solução de
HCOOH 0,5% (v/v), quanto à fase estacionária hexil-fenil LUNA® (10 µm,
15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-158) foram eficazes na separação dos
compostos presentes no extrato metanólico (Figura 18).
mAU
250
200
150
100
50
10 20 30 40 50 60 70 min
Figura 18: Cromatograma obtido com a condição de eluição gradiente: 15-40%

ACN (B):solução de 0,5% HCOOH (A) em 50 min; 40-70% (B) em 20 min, vazão 0,5 ml/min,
=280nm, Vinj.= 25µL, coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-158).
As análises posteriores deste trabalho foram realizadas no

Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU (Kyoto, Japão) pertencente ao
73
Departamento de Química da UFS (Sistema 2 – item 4.2.1). A coluna

cromatográfica que passou a ser utilizada nas análises foi uma hexil-fenil
LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), uma coluna comercial e não
mais manufaturada como a anterior.
Após a otimização do gradiente, na qual se obteve a melhor condição

cromatográfica para separação dos compostos químicos, foi realizado a
análise cromatográfica nas mesmas condições com os extratos metanólicos
das folhas dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis,
utilizando coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex),
volume de injeção 25 µL, vazão 0,5 mL/ min e detecção em 280 nm. Os
cromatogramas podem ser visualizados na figura 19.
Figura 19: Cromatogramas fingerprint das folhas dos sete genótipos (106-110, 201
e 202) de Lippia gracilis.
Observando os perfis cromatográficos dos sete genótipos (106-110,

201 e 202) expostos na figura 19, é possível perceber que os tempos de
retenção das bandas cromatográficas não são os mesmos quando
comparados com os tempos de retenção do cromatograma da figura 18.
Além disso, as bandas cromatográficas correspondentes aos tempos de
74
retenção 58,91 e 60,00 minutos, presentes no cromatograma da figura 18,

não são visualizados nos cromatogramas da figura 19.
Isto se deve ao fato de que, provavelmente, a mudança de uma

coluna manufaturada hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, QC-UFSCar-
158) para uma coluna comercial hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm,
Phenomenex) e a utilização de outro aparelho de Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência devem ter influenciado a separação dos compostos químicos.
Após as análises, fez-se a seleção do comprimento de onda através

da projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra do genótipo
108 de Lippia gracilis, conforme apresentado na figura 20. O comprimento
de onda de 280 nm foi selecionado por apresentar uma absorção máxima
dos compostos presentes na amostra.
Figura 20: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra das folhas do
genótipo 108 de Lippia gracilis.
Na Figura 22 são apresentados os espectros de UV das principais

bandas cromatográficas, numeradas no cromatograma fingerprint da figura
21, do genótipo 108 de Lippia gracilis.
75
Figura 21: Cromatograma da amostra do genótipo 108 das folhas de Lippia gracilis.
Numeração referente aos picos registrados no espectro de UV-Vis (CLAE-DAD) da figura
22.
76

correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura 20, da amostra do
Na Figura 23 estão apresentados os cromatogramas das folhas dos

sete genótipos de Lippia gracilis realizados em quintuplicata para serem
utilizados na análise quimiométrica.
77
Figura 23: Cromatogramas dos sete genótipos das folhas de Lippia gracilis em
quintuplicata.
78
5.1.3 – Cromatograma fingerprint dos caules de Lippia gracilis
Similarmente ao que foi feito com as análises por CLAE dos genótipos
das folhas de Lippia gracilis, também foram realizados estudos com os
caules com o objetivo da aquisição de um cromatograma fingerprint ou
‘’impressão digital’’ que o caracterizasse quimicamente.
A primeira etapa foi realizar o pré-tratamento dos extratos metanólicos

dos caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202), utilizando a extração
em fase sólida com cartucho C18 da marca JT Baker®, descrito no item 4.5.1.
Em seguida, foi efetuada a análise utilizando as mesmas condições

de eluição gradiente do cromatograma fingerprint das folhas de Lippia
gracilis (figura 21) com o objetivo de conhecer o perfil químico do extrato
metanólico dos caules.
Para essas análises foi empregado o gradiente de eluição linear

constituído pela mistura ACN (B) e solução de HCOOH 0,5% (A) como
solventes em uma coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm,
Phenomenex). Foi variada a concentração do modificador orgânico (ACN) de
15-40% durante 50 min; 40-70% (B) durante 20 min; 70% (B) por 5 min, 70-
15% (B) para o retorno do gradiente, isocrático em 15% (B) para o
recondicioamento da coluna, vazão de 0,5 mL/min, volume de injeção de
25µL e detecção em =280nm. O cromatograma pode ser visualizado na
figura 24 (a).
A análise foi realizada no Cromatógrafo líquido da marca SHIMADZU

(Kyoto, Japão) pertencente ao Departamento de Química da UFS (Sistema
2 – item 4.2.1).
79
Figura 24: Cromatograma (a) extrato metanólico dos caules do genótipo 108 da
Lippia gracilis e (b) extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis.
Condições cromatográficas: eluição gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de
HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70% (B) por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.=
25µL.
Comparando-se o cromatograma do extrato metanólico das folhas do

genótipo 108, figura 24 (a), com o cromatograma do caule genótipo 108,
figura 24 (b), verifica-se que os perfis cromatográficos apresentam-se de
forma distinta, o que leva a inferir que a os constituintes químicos dos caules
apresentam características mais polares do que os constituintes das folhas,
pois eluíram nos vinte minutos iniciais da corrida cromatográfica.
Essa condição inicial não foi adequada para se obter o cromatograma

fingerprint do caule, pois apresentou co-eluição de algumas bandas
cromatográficas.
Para obtermos uma melhor separação das bandas, diferentes

otimizações de gradiente foram testadas variando somente o percentual do
modificador orgânico (alteração na inclinação do gradiente), como mostrado
na tabela 8 e nas figuras 25.
80
Tabela 8: Condições cromatográficas para otimização do gradiente

com detecção em = 280 nm.
(B) (15,0 x 0,46 cm) (µL)
®
1 15-36% em ACN: Hexil-fenil LUNA 0,5 25,0 0,35
60 min HCOOH (Phenomenex)
0,5% (v/v)
2 1) 15-25% ACN: Hexil-fenil LUNA® 0,5 25,0 1) 0,33
em 30 min; HCOOH (Phenomenex) 2) 0,50
2) 25-40% 0,5% (v/v)
em 30 min
2) 25-40% 0,5% (v/v)
em 30 min
2) 23-38% 0,5% (v/v)
em 50 min
2) 23-40% 0,5% (v/v)
em 25 min
2) 25-40% 0,5% (v/v)
em 25 min
2) 20-23% 0,5% (v/v) 3) 0,68
em 30 min
3) 23-40%
em 25 min
2) 20-40% 0,5% (v/v)
em 45 min
81
Figura 25: Cromatogramas para seleção de condições cromatográficos para análise

dos extratos dos caules de Lippia gracilis. Os números correspondem às condições
apresentadas na tabela 8.
Dentre as condições cromatográficas testadas, a condição 8 foi a que

apresentou a separação mais adequada dos constituintes do caule de Lippia
gracilis.
Após a otimização do gradiente na qual se obteve a melhor condição

cromatográfica para separação dos compostos químicos, foi realizado a
análise cromatográfica nas mesmas condições com os extratos metanólicos
dos caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis,
utilizando coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex),
volume de injeção 25 µL, vazão 0,5 mL/ min e detecção em 280 nm. Os
cromatogramas podem ser visualizado na figura 26.
82
Figura 26: Cromatogramas fingerprint dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de
Lippia gracilis.
Após as análises fez-se a seleção do comprimento de onda através

da projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra do genótipo
108 de Lippia gracilis, conforme apresentado na figura 27. O comprimento
de onda de 280 nm foi selecionado por apresentar uma absorção máxima
dos compostos presentes na amostra.
Figura 27: Projeção tridimensional obtido por CLAE-DAD da amostra dos caules do
83
Na figura 29 são apresentados os espectros de UV das principais

bandas cromatográficas, numeradas no cromatograma fingerprint da figura
28, do genótipo 108 de Lippia gracilis.
Figura 28: Cromatograma da amostra do genótipo 108 dos caules de Lippia gracilis.
Numeração referente aos picos registrados no espectro de UV-Vis da figura 29.
84

correspondentes aos picos assinalados no cromatograma da figura 28, da amostra do
Na figura 30 estão apresentados os cromatogramas dos caules dos

sete genótipos de Lippia gracilis realizados em quintuplicata para serem
utilizados na análise quimiométrica.
85
Figura 30: Cromatogramas dos sete genótipos dos caules de Lippia gracilis em
quintuplicata.
86
5.2 - ISOLAMENTO DOS MARCADORES QUÍMICOS
5.2.1 – Fracionamento do extrato das folhas do genótipo 107 de

Lippia gracilis com Amberlite XAD-2
Após a obtenção dos cromatogramas fingerprint dos sete genótipos

de Lippia gracilis iniciou-se a etapa de isolamento dos marcadores químicos.
Havendo a possibilidade de existir flavonóides no extrato, devido à presença
comum destes compostos em espécies do gênero Lippia, optou-se por usar
a resina amberlite XAD-2 por ser um polímero orgânico não-iônico, apolar,
hidrofóbico e muito utilizado no isolamento de compostos fenólicos, como
flavonóides.
Lianda et al. [156], por exemplo, relataram o isolamento de um

flavonol, a morina (47), a partir do fracionamento do mel de Apis melifera em
coluna amberlite XAD-2 com metanol.
47
HO OH
HO O
OH
OH O
Desta forma, o extrato metanólico das folhas do genótipo 107 de

Lippia gracilis foi submetido à cromatografia em coluna com a resina
amberlite XAD-2. Esse extrato foi escolhido por ser um dos genótipos com
maior rendimento para realizar o fracionamento.
Para a cromatografia em coluna com a resina amberlite XAD-2 foram

utilizados 6,0g do extrato metanólico do genótipo 107 das folhas, o qual foi
eluído com 500 mL de MeOH:H2O nas proporções: 5%, 15%, 25%, 35%,
50%, 70%, 85% de MeOH:H2O e 100% MeOH, obtendo-se oito frações que
foram analisados por CLAE-DAD, utilizando uma coluna hexil-fenil LUNA®
87
(10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), volume de injeção 25µL, vazão 0,5
mL/min e detecção em 280 nm.
Nas análises das frações foram empregadas as mesmas condições

dos cromatogramas fingerprint das folhas, na qual foi utilizado um sistema
de eluição gradiente de solvente onde a porcentagem de ACN (B) e solução
de HCOOH 0,5%(v/v) (A) variaram de 15% a 40% (B) em 50 min, 40% a
70% (B) em 20 min, obtendo-se os cromatogramas mostrados na figura 31.
88
Figura 31: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite XAD-2: a) 5%

MeOH:H2O; b) 15% MeOH:H2O; c) 25% MeOH:H2O; d) 35% MeOH:H2O; e) 50%
MeOH:H2O; f) 70% MeOH:H2O; g) 85% MeOH:H2O. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70% (B)
por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.= 25µL.
Observando os cromatogramas da figura 31, verifica-se que os

compostos químicos com características polares eluíram nas frações 5%,
89
15%, 25%, 35%, 50% MeOH:H2O e foram detectados na primeira rampa de

eluição gradiente de 15% a 40% de ACN:solução de HCOOH 0,5% (v/v) por
50 min.
A fração 70% MeOH:H2O apresentou compostos químicos que

eluíram em toda a corrida cromatográfica, enquanto que a fração 85%
MeOH:H2O mostrou os compostos de mais baixa polaridade, pois eluíram na
segunda rampa de eluição gradiente de 40% a 70% de ACN: solução de
HCOOH 0,5% (v/v) por 20 min.
É importante mencionar que as clorofilas ficaram retidas na resina

durante quase todo o fracionamento, com exceção do momento em que
MeOH foi adicionado no final, provocando o arraste das clorofilas e, por isso,
impossibilitando a análise desta fração no cromatógafo líquido.
As frações 50% e 85% MeOH:H2O obtidas da coluna com a resina

amberlite XAD-2 foram escolhidas para a análise por CLAE semipreparativa
por apresentarem constituintes polares e de baixa polaridade divididos em
ambas as frações.
5.2.2 – Fracionamento do extrato dos caules do genótipo 107 de

Lippia gracilis com Amberlite XAD-2
Seguindo o mesmo objetivo exposto para o fracionamento do extrato

das folhas de Lippia gracilis, o extrato metanólico dos caules do genótipo
107 também foi submetido à cromatografia em coluna com a resina
amberlite XAD-2 para a obtenção de frações a serem utilizadas no
isolamento dos marcadores químicos.
As oito frações (5%, 15%, 25%, 35%, 50%, 70%, 85% MeOH:H2O e
100% MeOH) obtidas do fracionamento do extrato com a resina foram
analisadas por CLAE-DAD, utilizando uma coluna hexil-fenil LUNA® (10 µm,
15,0 x 0,46 cm, Phenomenex), volume de injeção 25µL, vazão 0,5 mL/min e
detecção em 280 nm.
90
As condições utilizadas para a análise foram as mesmas dos

cromatogramas fingerprint dos caules, na qual utilizou um sistema de eluição
gradiente de solvente onde a porcentagem de ACN (B) e solução de
HCOOH 0,5% (v/v) (A) variaram de 15% a 20% (B) em 25 min, 20% a 40%
(B) em 45 min, obtendo-se os cromatogramas da figura 32.
91
Figura 32: Cromatogramas das frações obtidas da coluna amberlite XAD-2: a) 5%

MeOH:H2O; b) 15% MeOH:H2O; c) 25% MeOH:H2O; d) 35% MeOH:H2O; e) 50%
MeOH:H2O; f) 70% MeOH:H2O; g) 85% MeOH:H2O. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 15% a 40% de ACN (B): solução de HCOOH 0,5% (v/v) em 50 min, 40-70% (B)
por 20 min, vazão 0,5 mL/min, =280nm, Vinj.= 25µL.
92
Nos cromatogramas das frações é possível verificar que a eluição dos

compostos químicos ocorreram basicamente nas frações 50%, 70% e 85%
MeOH:H2O.
A etapa de isolamento dos marcadores químicos utilizando as frações

obtidas da coluna amberlite XAD-2 não foi realizado, uma vez que o
rendimento das frações foram insuficientes para serem utilizadas no
isolamento dos compostos químicos.
5.2.3 – CLAE semipreparativa das frações 50% e 85% MeOH:H2O

das folhas de Lippia gracilis
Uma vez conhecidos os perfis cromatográficos das frações 50% e

85% MeOH:H2O, iniciou-se a etapa de isolamento dos marcadores químicos
empregando-se um procedimento cromatográfico (CLAE) em escala
semipreparativa. Para a realização deste estudo, as condições
cromatográficas estabelecidas para a separação analítica foram
escalonados.
O escalonamento tem por finalidade os ajustes dos parâmetros

cromatográficos (diâmetro e comprimento da coluna, fase estacionária
empregada, dimensões das partículas de sílica, vazão) de forma a conseguir
reproduzir em escala preparativa ou semipreparativa os resultados obtidos
em escala analítica.
Desta forma, a transferência do método analítico para o semi-

preparativo foi feito basicamente ajustando as condições em que a coluna
semipreparativa (maior dimensão) seria submetida. Na prática isto significa
ajustar a vazão da fase móvel e a carga que seria injetada por análise
(concentração da amostra) utilizando a fórmula:
S = R2p. Lp : (1,00 cm)2 . 25 cm = 7,87

R2a. La (0,46 cm)2 . 15 cm
Rp : diâmetro das coluna preparativa ou semipreparativa
93
Ra: diâmetro da coluna analítica

Lp: comprimento da coluna preparativa ou semipreparativa
La: comprimento da coluna analítica
S: fator de escalonamento
A vazão a ser utilizada na CLAE semipreparativa foi definida

multiplicando o fator de escalonamento pela vazão utilizado na CLAE
analítica.
Definida a vazão a ser empregada na separação semipreparativa,

iniciou-se o isolamento dos compostos químicos das frações 50% e 85%
MeOH:H2O obtidas da coluna cromatográfica com resina amberlite XAD-2.
A fração 50% MeOH:H2O foi submetida a isolamento dos compostos

químicos utilizando coluna de fase estacionária hexil-fenil LUNA® de 10 µm
(25,0 x 1,0 cm, Phenomenex), nas seguintes condições: vazão 4 mL/ min,
volume de injeção 100 µL, eluição gradiente no modo reverso utilizando
ACN (B) e solução de HCOOH 0,5% (v/v) (A) de 8% a 40% (B) por 50 min.
A detecção foi acompanhada pelo detector UV-Vis com arranjo de diodos em
280 nm. Em cada análise foram injetados 10 mg/ 100 µL e um total de doze
injeções. Os compostos que eluíram em 20 a 36 minutos foram coletados e
denominados LGRA 1 a LGRA 10, conforme a figura 33.
94
Figura 33: Cromatograma da fração 50% MeOH:H2O para isolamento dos

compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 8% a 40% de ACN (B) em 50 min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, Vinj.= 100 µL,
minj = 10 mg.
As amostras LGRA 1, LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9 e LGRA 10 foram

enviadas para análise por Ressonância Magnética Nuclear.
Depois do isolamento dos compostos químicos presentes na fração

50% MeOH:H2O iniciou-se o estudo com a fração 85% MeOH:H2O.
A fração 85% MeOH:H2O foi submetida ao isolamento dos

compostos químicos utilizando coluna de fase estacionária hexil-fenil LUNA®
de 10 µm (25,0 x 1,0 cm, Phenomenex), nas seguintes condições: vazão 4
mL/ min, volume de injeção 200 µL, eluição gradiente no modo reverso
utilizando ACN (B) e solução de HCOOH 0,5% (v/v) (A) de 35% a 53% (B)
por 15 min. A detecção foi acompanhada pelo detector UV-Vis com arranjo
de diodos em 280 nm. Em cada análise foram injetados 10 mg/ 200 µL e um
total de doze injeções. Os compostos que eluíram em 9 a 14 minutos foram
coletados e denominados LGRA 11 a LGRA 15, figura 34.
95
Figura 34: Cromatograma da fração 85% MeOH:H2O para isolamento dos

compostos químicos por CLAE semipreparativa. Condições cromatográficas: eluição
gradiente de 35% a 53% de ACN (B) em 50 min, vazão 4,0 mL/min, =280nm, Vinj.= 200 µL,
minj = 10 mg.
As amostras LGRA 12 e LGRA 13 foram enviadas para análise por

Ressonância Magnética Nuclear.
5.3 – IDENTIFICAÇÃO ESTRUTURAL
Sete amostras (LGRA 1, LGRA 2, LGRA 6, LGRA 9, LGRA 10, LGRA

12 e LGRA 13) foram isoladas por CLAE semipreparativa e enviadas para
análise por Ressonância Magnética Nuclear. Destas amostras, somente a
LGRA 12 teve a sua estrutura elucidada e as outras ainda estão em
processo de identificação estrutural.
5.3.1 – Identificação da substância LGRA 12
A substância LGRA 12 foi isolado através de CLAE semipreparativa

da fração 85% MeOH:H2O obtida do fracionamento com resina amberlite
XAD-2 do extrato metanólico das folhas do genótipo 107 de Lippia gracilis. A
substância possui aspecto de cristal e apresenta coloração amarela. A
96
identificação foi baseada na análise dos dados espectrais de RMN 1H e 13

C
e por comparação com os dados da literatura [157].
O espectro de RMN 1H e 13
C para LGRA 12, realizado em DMSO-d6,
apresentou sinais compatíveis para um flavonóide. Com base nesses
espectros foi possível sugerir a presença da flavanona naringenina (48)
(5,7,4’-triidroxiflavanona).
48
3'
OH
2'
4'
8
HO 7 9 O 5'
1'
2 6'
6 4 3
10
5
OH O
1
No espectro de RMN H (Espectros 1 e 2) foi observado,
primeiramente, a presença de dois singletos em 12,16 (1H) e 8,36 (1H),
que são característicos dos hidrogênios das hidroxilas em C-5 e C-4’,
respectivamente.
97
Espectro 1: Espectro de RMN 1H da amostra LGRA 12 (400 MHz)
98
Espectro 2: Espectro de RMN 1H da amostra LGRA 12 (400 MHz). Ampliação da

região entre 12,45 ppm e 11,7 ppm.
Ao ampliarmos a região entre 7,60 e 6,37 ppm, espectro 3,

observamos a presença de dois dubletos, um em 7,31 (2H; d; J = 8,53 Hz;
H-2’ e H-6’) e outro em 6,78 (2H; d; J = 8,53 Hz; H-3’ e H-5’) que
comprovam a presença de um anel B para-substituído por uma hidroxila.
99

Em 5,84 foi observado a presença de dois dubletos com um

acoplamento meta (J = 2,04 Hz), atribuídos aos dois hidrogênios aromáticos
pertencentes ao anel A, H-6 e H-8 (Espectro 4).
100

A presença de três duplos dubletos em 5,42 (1H; dd; J = 2,98 e

12,84 Hz), 3,24 (1H; dd; J = 12,84 e 17,10 Hz) e 2,66 (1H; dd; J = 2,98 e
17,10 Hz) indicam a estrutura de uma flavanona, sendo o primeiro duplo
dubleto atribuído ao H-2 e os outros dois duplos dubletos aos hidrogênios H-
3ax e H-3eq do anel C (Espectro 4 e 5).
H3ax
H3eq
O O
H2
Conformação preferida do anel C de flavanonas
101

O esqueleto de uma flavanona foi também confirmado pelo espectro

de 13C (Espectro 6) pelos sinais em C 78,4 (CH), C 41,9 (CH2) e 195,9 (Co)
relativos, respectivamente aos carbonos C-2, C-3 e C-4 do anel C. Os sinais
em C 95,8 (CH) e C 95,0 (CH) são atribuídos aos carbonos C-6 e C-8 do
anel A; C 128,2 (2CH) e C 115,0 (2CH) relativos, respectivamente aos
carbonos C-2’/C-6’ e C-3’/C-5’ do anel B.
13
O espectro de RMN de C também auxiliou na confirmação dos
sinais dos carbonos quarternários em C 195,9 (C=O), 163,4 (C-5), 167,4 (C-
7), 162,8 (C-9), 101,4 (C-10), 128,8 (C-1’) e 157,6 (C-4’).
102
Espectro 6: Espectro de RMN 13C da amostra LGRA 12 (400 MHz)
Pelos dados acima apresentados, confirma-se para LGRA 12 a

estrutura de uma 5,7,4’-triidroxiflavanona, também conhecida como
naringenina. Os dados de RMN de 1H e 13
C são coincidentes com os dados
da literatura [157], apresentados na tabela 9.
103
Tabela 9: Correlações observadas no espectro de RMN 1H e 13

C da
substância LGRA 12 e dados da naringenina da literatura [157].
H/C c LGRA 12 H LGRA 12 (ppm) c Lit. H Lit. (ppm)

(ppm) (mult., int, J=Hz) (ppm) (mult., int, J=Hz)
2 78,2 5,42 (dd, 1H, 2,98 e 79,0 5,43 (dd, 1H, 4,00 e
12,84 Hz) 13,00 Hz)
3 eq 41,9 2,66 (dd, 1H, 2,98 e 42,6 2,70 (dd, 1H, 2,80 e
17,10 Hz) 17,00 Hz)
3 axial - 3,24 (dd, 1H, 12,84 e - 3,20 (m, 1H)
17,10 Hz)
4 195,9 - 196,4 -
5 163,4 - 163,7 -
6 95,8 5,84 (d, 2,04 Hz) 96,4 5,88 (s,1H)
7 167,4 166,9
8 95,0 5,84 (d, 2,04 Hz) 95,5 5,88 (s,1H)
9 162,8 - 163,3 -
10 101,4 - 102,3 -
1' 128,8 - 129,4 -
2' 128,2 7,31 (d, 1H, 8,53 Hz) 128,7 7,32 (d, 1H, 9,00 Hz)
3' 115,0 6,78 (d, 1H, 8,53 Hz) 115,7 6,79 (d, 1H, 9,00 Hz)
4' 157,6 - 158,1 -
5' 115,0 6,78 (d, 1H, 8,53 Hz) 115,7 6,79 (d, 1H, 9,00 Hz)
6' 128,2 7,31 (d, 1H,8,53 Hz) 128,7 7,32 (d, 1H, 9,00 Hz)
5-OH - 12,16 (s, 1H) - 12,14 (s, 1H)
7-OH - - - 10,82 (s, 1H)
OH-4’ - 8,36 (s, 1H) - 9,60 (s, 1H)
No gênero Lippia a naringenina foi isolada pela primeira vez na L.

graveolens por Dominguez et al. [111].
Em 2007, Lin et al. [108] relataram a identificação e quantificação da

naringenina e de outros flavonóides do extrato hidroalcoólico da L.
graveolens (70:30 v/v) através da técnica de LC-DAD-ESI/EM.
104
O nosso trabalho traz o primeiro estudo sobre os constituintes fixos da

espécie Lippia gracilis, sendo a naringenina o primeiro composto a ser
identificado nesta espécie.
5.4 - ANÁLISE QUIMIOMÉTRICA
Como os cromatogramas fingerprint são muito semelhantes, é difícil

identificar diferenças entre as amostras baseando-se em uma simples
análise visual. Desta forma, o emprego de técnicas quimiométricas de
análise multivariada tem auxiliado na interpretação dos resultados obtidos.
A base fundamental da maioria dos métodos modernos para

interpretação de dados multivariados é a Análise de Componentes Principais
– PCA, que consiste numa transformação da matriz de dados originais com
o objetivo de avaliar semelhanças e diferenças entre as amostras pela
projeção das mesmas em gráficos bidimensionais elaborados a partir de
cálculos de novos eixos denominados Componentes Principais (PC’s) [55].
Esta técnica tem sido utilizada com êxito, por exemplo, na

discriminação de espécies vegetais de Phyllanthus, conhecida popularmente
como ‘’quebra-pedra’’. MARTINS et al. [158] empregaram a Análise de
Componentes Principais para interpretar os cromatogramas fingerprint,
obtidos por CLAE-DAD de seis diferentes espécies de Phyllanthus, com o
objetivo de construir um modelo de classificação que pode ser utilizado para
verificar a autenticidade de amostras comerciais de ‘’quebra-pedra’’.
No nosso caso, a utilização desta técnica irá nos auxiliar na

diferenciação dos cromatogramas fingerprint dos extratos das folhas e
caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis obtidos por
CLAE-DAD. Para a análise quimiométrica foram utilizados os dados dos
cromatogramas fngerprint realizados em quintuplicata de cada um dos sete
genótipos com o objetivo de obtermos um maior número de amostras para a
análise. Os cromatogramas podem ser visualizados nas figuras 23 e 30.
105
É importante lembrar que os genótipos 106-110 são provenientes do

estado de Sergipe, município de Tomar do Geru, e os genótipos 201 e 202
são provenientes do estado da Bahia, município de Rio Real. Essas
amostras foram coletadas nestes municípios e cultivadas no Campus Rural
da UFS.
5.4.1 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint das

folhas
Os cromatogramas foram transformados em uma matriz numérica de

dados, contendo 35 linhas (amostras) e 2188 variáveis (tempos de
retenção), que foram alinhados utilizando o algoritmo ‘’Correlation Optimised
Warping’’ (COW) [159]. A figura 35 mostra uma parte do cromatograma
antes e após o alinhamento, podendo-se perceber a grande necessidade de
se realizar o alinhamento antes da aplicação da análise quimiométrica.
Figura 35: Parte do cromatograma das folhas: a) antes do alinhamento, b) após o

alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation Optimised Warping’’ (COW)
O método de análise exploratória utilizado foi a PCA. Antes de

empregar a PCA foi necessário um pré-processamento dos dados originais.
106
Os métodos de pré-processamento mais utilizados consistem basicamente

em centrar na média ou auto-escalar os dados. Neste caso, os dados foram
centrados na média, isto é, calculou-se a média dos valores experimentais
para cada variável e subtraiu-se cada valor experimental do respectivo valor
médio, o que está representado no gráfico de pré-processamento na figura
36.
Figura 36: Gráfico de pré-processamento centrado na média
Pela Análise dos Componentes Principais observou-se que 93,9% da

variância total dos dados foram explicados nas duas primeiras componentes
principais, tabela 10. A PC1 contém 89,2% e a PC2 contém 4,63% da
variância dos dados originais. As demais PC’s (de 3 a 10) não foram
consideradas para a interpretação de tendências dos dados. A figura 37,
mostra um gráfico da variância explicada em cada PC. Nesta figura pode-se
observar que, a partir da PC2, não há uma variação muito grande da
variância explicada, ou seja, ao se aplicar a PCA, foi possível reduzir a
dimensão dos dados de 2188 para 2 (2PC’s).
107
De acordo com Ferreira et al. [8], a primeira Componente Principal

PC1, tem uma direção tal que descreve o máximo de variabilidade das
amostras, mais que qualquer uma das variáveis originais, como apresentado
na tabela 10 e na figura 37.

calculadas para os dados da matriz original centrados na média
Componente Principal % de Variância % de Variância Acumulada

PC1 89,2 89,2
PC2 4,63 93,9
PC3 2,04 95,9
PC4 1,15 97,1
PC5 0,91 97,9
PC6 0,53 98,5
PC7 0,45 98,9
PC8 0,34 99,3
PC9 0,24 99,5
PC10 0,16 99,7
Figura 37: Variância explicada (%) para cada componente principal (PC’s)
108
Na figura 38 é apresentado o gráfico de escores de PC1 versus PC2.

O gráfico de escores traz informações sobre as amostras. Nesta figura é
possível notar que a PC1 separa as amostras 107 e 201 em valores de
escores positivos, da amostra 108 em valores de escores negativos e as
demais amostras apresentam valores próximos de zero. A PC2 por sua vez
consegue separar as amostras 201 e 202 em valores de escores negativos
das amostras 106, 110 e 107 em valores de escores positivos e as amostras
108 e 109 em valores próximos de zero. Percebe-se que a amostra 109
apresenta valor próximo de zero tanto no eixo da PC1 como PC2.
Figura 38: Gráfico de escores (PC1 versus PC2)
É possível observar a nítida separação das amostras e formação de

grupos coesos para os subtipos 107, 108, 109 e 202; as amostras 106 e 110
não apresentaram distinção entre si, porém se diferenciam das demais
amostras. Essa diferenciação entre as amostras pode ser explicada
observando o gráfico de loading (Figura 39) que demonstra a importância
(peso) que cada variável teve na construção de cada componente principal
e, conseqüentemente, na projeção das amostras pelos escores.
109
Figura 39: Gráfico de loading das folhas de Lippia gracilis
No gráfico de loading (Figura 39) a PC1 está representada pela cor

vermelha e a PC2 pela cor verde. É possível perceber, no gráfico acima, na
PC1 e PC2 algumas bandas cromatográficas que se destacam com valores
de loading positivo e outras com valores de loading negativos. Somente a
PC2 apresenta valores de loadings positivos e negativos, a outra PC só tem
valores positivos.
Os loadings da PC1 apresentam as bandas cromatográficas que

contém maior peso/influência na projeção das amostras, e só contém
variáveis com valores positivos. Sendo assim, as amostras que apresentam
as bandas cromatográficas mais intensas nas regiões com valores positivos
de loadings apresentarão valores positivos nos escores da PC1, como
ocorre com as amostras 107 e 201. Essas bandas cromatográficas
correspondem aos tempos de retenção 15,3; 19,8; 32,3; 33,0; 34,7 e 36,4
minutos (Figura 40).
110
Figura 40: Cromatogramas fingerprint sobrepostos das folhas dos sete genótipos
(106-110, 201 e 202) de Lippia gracillis.
A amostra 108 é muito distinta das demais, pois apresenta valores de

escores negativos e nenhuma banda cromatográfica intensa apresentada no
gráfico de loadings.
Os loadings da PC2 contêm variáveis com valores positivos e

negativos. Sendo assim, as amostras que apresentam as bandas
cromatográficas mais intensas nas regiões com valores negativos de
loadings apresentarão valores negativos nos escores da PC2, como ocorre
com as amostras 201 e 202, que correspondem aos tempos de retenção
30,4; 32,3; 33,0; 36,4; 47,7; 50,5; 55,4; 57,1 e 59,9 minutos. Já as amostras
que apresentam bandas cromatográficas mais intensas nas regiões de
loadings positivos, apresentarão valores positivos nos escores da PC2,
como ocorre com as amostras 106, 107 e 110. Essas bandas
cromatográficas correspondem aos tempos de retenção 15,3; 19,8 e 33,0
minutos, conforme apresentado na figura 40.
As amostras 108 e 109 apresentam variáveis com pesos próximos a

zero, isto significa que estas amostras não apresentam bandas
cromatográficos intensas no gráfico de loadings.
111
Como os valores da PC2 no gráfico de escores são negativos para as

amostras 201 e 202, procedentes do Rio Real (Bahia), e positivos ou
próximos de zero para as amostras 106-110, procedentes de Tomar do Geru
(Sergipe), foi possível através da análise quimiométrica diferenciar os
genótipos pelas suas procedências.
Desta forma, através da análise quimiométrica foi possível diferenciar

os cromatogramas fingerprint dos extratos das folhas dos sete genótipos de
Lippia gracilis e, principalmente, observar a dissimilaridade das amostras
procedentes de Tomar do Geru (106-110) das amostras procedentes do Rio
Real (201 e 202).
5.4.2 – Análise quimiométrica dos cromatogramas fingerprint dos

caules
Os cromatogramas foram convertidos em uma matriz de 35 linhas

(amostras) e 2188 colunas (variáveis: tempos de retenção). Os
cromatogramas foram alinhados utilizando o algoritmo ‘’Correlation
Optimised Warping’’ antes da análise quimiométrica [156]. A figura 41
mostra uma parte do cromatograma antes e após o alinhamento.
Figura 41: Parte do cromatograma dos caules: a) antes do alinhamento, b) após o

alinhamento utilizando o algoritmo ‘’Correlation Optimised Warping’’ (COW)
112
Em seguida, os valores foram submetidos a um pré-processamento.

Como apresentado na figura 42, os dados originais foram centrados na
média.
Figura 42: Gráfico de pré-processamento centrado na média
Pela Análise dos Componentes Principais (PCA), tabela 11,

observou-se que 96,2% da variância dos dados foram explicados nas três
primeiras componentes principais. A PC1 contém cerca de 77,2% da
variância dos dados originais e as PC’s 2 e 3 explicam 12,2% e 6,89%,
respectivamente. A figura 43 mostra um gráfico da variância explicada em
cada PC. Nesta figura pode-se observar que, a partir da PC3, não há uma
quantidade significativa de variância explicada.
113

calculadas para os dados da matriz original centrados na média.
Componente Principal % de Variância % de Variância Acumulada

PC1 77,2 77,2
PC2 12,2 89,4
PC3 6,89 96,2
PC4 1,96 98,2
PC5 0,68 98,9
PC6 0,35 99,2
PC7 0,29 99,5
PC8 0,15 99,7
PC9 0,12 99,8
Figura 43: Variância explicada (%) para cada componente principal (PC’s)
Na figura 44 é apresentado o gráfico de escores de PC1 versus PC3.

Nesta figura é possível visualizar a separação das sete amostras, sendo que
PC1 separa as amostras 201 e 202 em valores de escores negativos das
amostras 106-108 em valores de escores positivos e as amostras 109 e 110
com valores próximos de zero. A PC3, por sua vez, consegue separar as
114
amostras 108, 109 e 110 em valores de escores negativos das amostras

106, 107, 201 e 202 em valores de escores positivos. A projeção das
amostras pode ser explicada analisando o gráfico de loading.
Figura 44: Gráfico de escores (PC1 versus PC3)
O gráfico de loading mostra a importância de cada banda

cromatográfica na projeção e diferenciação das amostras. No gráfico da
figura 45, a PC1 está representada pela cor azul e a PC3 pela cor vermelha.
A análise do gráfico demonstra que na PC1 algumas bandas
cromatográficas se destacam com valores de loading positivos e outras com
valores de loading negativos. A PC3 só apresenta valores de loading
positivos.
115
Figura 45: Gráfico de loading dos caules de Lippia gracilis
Os loadings da PC1 representam as bandas cromatográficas que

contém maior peso/influência na projeção das amostras, e contém variáveis
com valores positivos e negativos. Sendo assim, as amostras que
apresentam as bandas cromatográficas mais intensas nas regiões com
valores negativos de loadings apresentarão valores negativos nos escores
da PC1, como ocorre com as amostras 201 e 202, que corresponde ao
tempo de retenção 34,74 minutos. Já as amostras que apresentam bandas
cromatográficas mais intensas nas regiões de loadings positivos,
apresentarão valores positivos nos escores da PC1, como ocorre com as
amostras 106, 107, 108. Essas bandas cromatográficas correspondem aos
tempos de retenção 21,2; 25,4; 27,7; 36,6 e 62,8 minutos, conforme
apresentado na figura 46.
Os loadings da PC3 contêm variáveis com valores positivos. Sendo

assim, as amostras que apresentam as bandas cromatográficas mais
intensas nas regiões com valores positivos de loadings apresentarão valores
positivos nos escores da PC3, como ocorre com as amostras 106, 107 e
116
201. Essas bandas cromatográficas correspondem aos tempos de retenção

31,6; 36,6; 50,9; 53,9 minutos (Figura 46).
As amostras 108 e 109 apresentam valores de escores negativos e

nenhuma banda cromatográfica intensa apresentada no gráfico de loadings.
Figura 46: Cromatogramas fingerprint sobrepostos dos caules dos sete genótipos
(106-110, 201 e 202) de Lippia gracilis.
Como os valores da PC1 no gráfico de escores são negativos para as

amostras 201 e 202, procedentes do Rio Real (Bahia), e positivos ou
próximos de zero para as amostras 106-110, procedentes de Tomar do Geru
(Sergipe), foi possível através da análise quimiométrica diferenciar os
genótipos pelas suas procedências.
Desta forma, através da análise quimiométrica foi possível diferenciar

os cromatogramas fingerprint dos extratos dos caules dos sete genótipos de
Lippia gracilis e, assim como nos resultados da análise quimiométrica das
folhas, observar a dissimilaridades entre as amostras procedentes de Tomar
do Geru (106-110) das amostras procedentes do Rio Real (201 e 202).
117
Além disso, estas análises quimiométricas mostraram que os

cromatogramas fingerprint dos caules, quando comparado com as folhas,
apresentaram uma melhor diferenciação entre os genótipos das
procedências, visto que no gráfico de escores (Figura 44) esta diferenciação
se dá pela PC1, a qual apresenta 77,2% da variância dos dados originais.
5.5 – ATIVIDADE ANTINOCICEPTIVA
Para a análise da possível atividade antinociceptiva do extrato

metanólico das folhas de Lippia gracilis (EMLG) realizou-se o teste das
contorções abdominais induzidas por ácido acético a 85%. Este protocolo é
o teste mais utilizado na triagem de substâncias com atividade
antinociceptiva [160].
Neste método, o ácido acético atua indiretamente no fluido do

peritônio, provocando a liberação de mediadores como, por exemplo, PGE2
e PGF2 , que sensibilizam e estimulam as terminações neuronais da região.
Drogas analgésicas, geralmente, reduzem ou até mesmo inibem este
comportamento, assim como antiinflamatórios não esteróides e anti-
histamínicos, o que demonstra a baixa especificidade deste teste [152]. O
tratamento dos animais com EMLG reduziu, de maneira dose dependente, a
resposta nociceptiva quando comparado com o controle, como mostrado na
figura 47.
118
Figura 47: Efeito do EMLG sobre as contorções abdominais induzidas por ácido
acético. Cada valor representa a média ± D.P.M. Os asteriscos denotam a significância
estatística, * p < 0,05 e ** p < 0,001 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8.
A fim de verificar qual a via de inibição da nocicepção do EMLG, foi

realizado o teste da formalina, que consiste na estimulação de nociceptores
pela formalina.
Esse protocolo é um modelo de dor persistente que se caracteriza por

apresentar um comportamento bifásico indicativo de dor, sendo que nos
primeiros 5 minutos após a administração, é observada a primeira fase
(Fase 1) pela estimulação direta dos nociceptores; a inibição desta fase é
um indicativo de drogas analgésicas que atuam em nível central.
Após um intervalo de 10 minutos, ocorre a segunda fase (Fase 2) que

dura 20 minutos, caracterizada tanto pelo estímulo dos nociceptores como
pela liberação de mediadores inflamatórios, que encontram a medula
espinhal num estado de hiperexitabilidade, induzida pela fase 1 [153].
O tratamento com o EMLG inibiu a nocicepção mediada por

mecanismos centrais (Fase1), de forma significativa, apenas na dose de
400mg/Kg (p < 0,05), sugerindo uma possível atividade antinociceptiva pela
via central (Figura 48). Na Fase 2, houve uma inibição, de maneira dose
dependente, da resposta nociceptiva (p < 0,001), em todas as doses,
119
demonstrando que este extrato é capaz de inibir a produção de mediadores

inflamatórios, principalmente aqueles derivados da metabolização do ácido
araquidônico (Figura 49) [153, 161].
Figura 48: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da pata, na 1ª

fase do teste da formalina. Cada valor representa a média ± D.P.M. O asterisco denota a
significância estatística, * p < 0,05 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8.
Figura 49: Efeito do EMLG sobre a resposta nociceptiva, lambida da pata, na 2ª

fase do teste da formalina. Cada valor representa a média ± D.P.M. O asterisco denota a
significância estatística, * p < 0,001 (ANOVA e teste de Dunnett), n = 8.
120
A análise dos constituintes químicos do extrato metanólico das folhas

de Lippia gracilis revelou a presença de um flavonóide, a naringenina. Um
estudo realizado por Fang et al. [162], demonstrou que a naringenina
apresenta atividade antiinflamatória, antioxidante e possui a capacidade de
inibir a proliferação de células cancerosas. Com isso, é possível afirmar que
a presença desse composto no extrato pode estar auxiliando na resposta
antiinflamatória conseguida neste trabalho. Além disso, existe a
possibilidade de outros flavonóides estarem presentes no extrato
contribuindo com essa atividade.
Desta forma, pode-se sugerir que o tratamento com EMLG, nas doses
testadas, apresenta atividade antinociceptiva provavelmente mediada pela
inibição de fatores pró-inflamatórios (via das ciclooxigenase). A presença de
flavonóides presentes no extrato, como a naringenina, pode estar
contribuindo com esse efeito. Outros estudos são requeridos para melhor
compreensão dos mecanismos celulares envolvidos nessa resposta.
121
Capítulo
122
6. CONCLUSÕES
Através das análises por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

acoplada ao detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) foi possível obter,
pela primeira vez, os cromatogramas fingerprint dos extratos metanólicos
das folhas e caules dos sete genótipos (106-110, 201 e 202) de Lippia
gracilis Schauer.
As análises quimiométricas de PCA foram essenciais para a

diferenciação dos cromatogramas fingerprint das folhas e caules dos sete
genótipos estudados, pois permitiram a separação das amostras conforme
as características apresentadas nos cromatogramas (dados químicos), o que
não seria possível apenas pela análise visual dos cromatogramas, bem
como permitiu a diferenciação dos genótipos das procedências de Tomar de
Geru (106-110) dos genótipos do Rio Real (201 e 202).
Além disso, as análises quimiométricas mostraram que os

cromatogramas fingerprint dos caules apresentaram uma melhor
diferenciação entre os genótipos das procedências.
Como o método analítico desenvolvido por CLAE-DAD mostrou

dissimilaridades entre os cromatogramas fingerprint das folhas e caules dos
sete genótipos, ele pode ser utilizado para o controle de qualidade desta
espécie.
A cromatografia líquida semipreparativa foi útil para o isolamento do

primeiro constituinte fixo das folhas de Lippia gracilis, a 5,7,4’-
triidroxiflavanona conhecida como naringenina, isolada da fração 85%
MeOH:H2O.
123
O extrato metanólico das folhas do genótipo 108 de Lippia gracilis

apresentou atividade antinociceptiva através dos testes de contorções
abdominais induzidas por ácido acético e formalina, inédito para esta
espécie.
124
Capítulo
125
7. REFERÊNCIAS
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139
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

Desenvolvimento de método por Cromatografia

SÃO CRISTÓVÃO - SERGIPE

Silvana Vieira Floresta Gomes

Orientadora: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes

Gomes, Silvana Vieira Floresta

Dissertação (Mestrado em Química) - Universidade Federal de

Orientador: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes

1. Lippia gracilis. 2. Genótipos. 3. Fingerprint. 4. Cromatografia -

meu esposo, Anderson,

meus pais, Salomão e Aurora,

minhas irmãs, Fernanda e Luciana.

Ao Anderson, meu esposo, pelo amor, compreensão, estímulo, ajuda

À minha mãe e pai, Aurora e Salomão, pelas orações, força e pelo

Às minhas irmãs, Fernanda e Luciana, pelo carinho, orações e por ter

Ao meu amigo, Djalma, pela força e ajuda neste trabalho.

A minha amiga, Maria da Paz, pelo apoio e incentivo para fazer o

À profª Drª Valéria Regina de Souza Moraes, pelo companheirismo,

À Universidade Federal de Sergipe pela concessão da bolsa de

Ao Prof. Dr. Paulo César de Lima Nogueira por sua colaboração no

À Profª Drª Samísia Maria F. Machado pela ajuda e amizade.

Ao prof. Dr. Sandro Navickiene pela contribuição e por disponibilizar

Ao prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank pela identificação da espécie Lippia

À prof. Drª Quézia Bezerra Cass do Departamento de Química da

Ao prof. Dr. Edenir Rodrigues Pereira-Filho do Departamento de

Ao prof. Dr. Antonio G. Ferreira do Departamento de Química da

À Drª Lúcia Regina Rocha Martins pelos ensinamentos em

Ao prof. Dr. Lucindo José Quintans Júnior do Departamento de

Ao prof. Dr. Geraldo Humberto Silva pelos ensinamentos e

Ao prof. Dr. Sócrates Cabral de Holanda Cavalcante do Departamento

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

Aos meus amigos do laboratório METABIO, Alan, Daniele, Pablo,

As minhas amigas do laboratório LAPEC, Adriana Gibara e Mônica,

A todos os amigos e funcionários do Departamento de Química –

Nome: Silvana Vieira Floresta Gomes

Nome em citações bibliográficas: Gomes, S. V. F. ou Floresta, S. V.

Data de Nascimento: 13/10/1980

Universidade Federal de Sergipe, UFS. Ano de conclusão: 2009.

Farmácia Habilitação Clínica Industrial, Universidade Federal de

Química Orgânica, Química de Produtos Naturais

3.1 – Trabalhos em eventos

1. Machado, S. M. F.; Guimarães, A. G.; Gomes, S. V. F.; Moraes, V.

3. Gomes, S. V. F.; Santos dos, A. D. C.; Viana, M. D.; Moraes, V. R.

4. Guimarães, A. G.; Machado, S. M. F.; Gomes, S. V. F.; Moraes, V.

5. Bragança, R. B.; Moraes, V. R. S.; Nogueira, P. C. L.; Gomes, S. V.

6. Santos dos, A. D. C.; Nogueira, P. C. L.; Gomes, S. V. F.; Moraes,

7. Gomes, S. V. F.; Santos dos, A. D. C.; Viana, M. D.; Moraes, V. R.

8. Moreno, M. P. N.; Ptak, D. M.; Krempser, R. R.; Krempser, M. R.;

9. Moreira, Ítalo; Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Antoniolli, A. R.;

10. Marçal, R. M.; Ptak, D. M.; Krempser, R. R.; Krempser, M. R.;

12. Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Fernandes, J. B.; Cavalcanti, S.

14. Floresta, S. V.; Moreno, M. P. N.; Cavalcanti, S. C. H. Triagem

Figura 1: Componentes básicos de um cromatógrafo líquido de alta

Figura 2: Triângulo de seletividade para os solventes preferidos em: -

Figura 3: Nomógrafo no modo reverso .................................................. 14

Figura 4: Esquema do procedimento de SPE; A) Condicionamento do

Figura 5: Esquema da seqüência usada na análise multivariada de

Figura 6: Aferências modulares dos nociceptores: corte transversal da

Figura 7: Lippia gracilis Schauer ........................................................... 33

Figura 8: Mudas da espécie de Lippia gracilis no DEA ......................... 52

Figura 9: Esquema com as etapas da extração em fase sólida ............ 54

Figura 10: Dispositivo para extração em fase sólida ............................. 55