Tese Samia Nogueira Brilhante PDF

Universidade Estadual do Ceará
Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante
Caracterização fenotípica e genotípica de

Microsporum canis oriundos de cães e gatos como
um possível clone fúngico
Fortaleza-Ceará
2005
1
Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante
Caracterização fenotípica e genotípica de

Microsporum canis oriundos de cães e gatos como
um possível clone fúngico
Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial para a
obtenção de título de Doutor em Ciências
Veterinárias.
Área de concentração: Reprodução e Sanidade
Animal
Orientador: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha
Rocha
Fortaleza-CE
2005
2
B857c
Brilhante, Raimunda Sâmia Nogueira
Caracterização fenotípica e genotípica de Microsporum canis oriundos de cães e
gatos como um possível clone fúngico/ Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante- –
Fortaleza, 2005.
119p. ; il.
Orientador: Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha.
Tese (Doutorado em Ciências Veterinárias) – Universidade Estadual do Ceará,
Faculdade de Veterinária.
1. Genotipagem 2. Fenotipagem. 3. Sensibilidade antifúngica. 4.
Microsporum canis. I. Universidade Estadual do Ceará. Faculdade de
Veterinária.
CDD: 636.089
3
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa
Faculdade de Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Título do Trabalho: Caracterização fenotípica e genotípica de Microsporum canis

oriundos de cães e gatos como um possível clone fúngico
Autora: Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante
Defesa em ____/ ____/ _________ Conceito:
Nota:
Banca Examinadora
________________________________________________
Marcos Fábio Gadelha Rocha, Prof. Dr.
Orientador (UECE)
_____________________________ ______________________________
José Júlio Costa Sidrim, Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo, Prof. Dr.
Co-Orientador /Examinador (UFC) Examinador (UNIFESP)
______________________________ _______________________________
Nilberto Robson F. do Nascimento, Prof. Dr. Vânia Maria Maciel Melo, Profa. Dra.
Examinador (UECE) Examinadora (UFC)
4
Dedico esta tese aos meus filhos Átila, Luna, Hana e ao meu futuro bebê
5
AGRADECIMENTOS
Agradecer é uma das tarefas mais difíceis para todos os autores, porém
tentarei em simples palavras expressar minha enorme alegria.
A Deus, pela minha saúde e força de trabalho.
Aos meus estimados pais Raimundo Brilhante e Divanir Brilhante, que são e
sempre serão o meu amparo seguro. Espero sempre honrá-los.
Aos meus irmãos, Mônica Brilhante e Roberto Brilhante, presentes em toda

minha jornada de vida profissional e amorosa.
Ao Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, orientador do mestrado e

doutorado, exemplo de bom humor, disciplina e responsabilidade. Professor
considerado uma verdadeira utopia para todos que querem percorrer o mundo
acadêmico.
Ao Prof. Dr. José Júlio Costa Sidrim, orientador durante toda a minha vida
universitária, sendo hoje considerado para mim um eterno mestre e amigo, em quem
posso depositar toda a minha admiração e confiança.
Aos Professores, Dr. Zoilo Pires de Camargo, Dr. Nilberto Robson F. do

Nascimento e Dra. Vânia Maria Maciel Melo, por terem aceitado participar da minha
banca examinadora.
Ao Professor João Vianney Campos de Mesquita, pela revisão estilística e

gramatical deste trabalho.
Ao Prof. Dr. André Jalles Monteiro, do Departamento de Estatística e

Matemática Aplicada da Universidade Federal do Ceará, estatístico do trabalho e
após todas as análises científicas, meu marido.
6
Aos Professores do Departamento de Patologia e Medicina Legal, da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará.
Aos amigos, Olavo Moraes, Terezinha Santos, Ivanclébio Pires, Carlos

Teixeira, Jéssica Medrano por quem nutro um carinho e consideração enorme.
Aos professores e aos colegas do PPGCV, em especial Isaac Neto, Regiane

Santos, Emanuelle Figueiredo, que durante o meu mestrado e doutorado no PPGCV
tornaram-se meus amigos.
Às minhas queridas amigas biólogas, Rossana Cordeiro, Ana Beatriz Duarte e

Renata Felix, a quem dedico uma amizade sincera e certamente duradoura.
À coordenadora do PPGCV, Prof.a Dr.a Maria Fátima da Silva Teixeira, meu

agradecimento pela constante co-orientação e às secretárias Alzenira de Andrade
Ferreira e Adriana Maria Sales Albuquerque, que são muito mais do que secretárias
da Coordenação, são pessoas por quem possuo um enorme carinho.
Aos médicos veterinários Lúcio Jackson Queiroz Chaves, José Maurício

Fonteles Gomes, Maria Nilza dos Reis Saraiva, Marilac Maria Arnaldo Alencar, pelo
apoio na clínica veterinária.
As Clínicas Veterinárias Pró-Saúde Animal, Amigo Meu, São Francisco,

Mascote, Vira Lata e Policlínica Veterinária de Fortaleza, bem como seus
profissionais altamente engajados e dispostos a contribuírem com a pesquisa e
saúde dos pequenos animais.
Ao Centro Especializado em Micologia Médica da Universidade Federal do

Ceará, pelo qual tenho uma enorme afeição e é em razão dele que tenho toda a
minha formação profissional.
7
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade
Estadual do Ceará, pela minha pós-graduação.
À CAPES, pela concessão de bolsa de pesquisa.
8
RESUMO
Os dermatófitos formam um grupo de fungos que possuem a capacidade de invadir

tecidos ricos em queratina, tanto do homem quanto de animais. Este estudo
investigou a possível correlação entre a fenotipagem, sensibilidade antifúngica e as
características genotípicas de cepas de Microsporum canis isoladas de cães e gatos
no Nordeste do Brasil. O estudo micológico fenotípico de 20 cepas foi conduzido por
exame microscópico direto, análise macro e micromorfológica e provas bioquímicas.
A sensibilidade antifúngica foi realizada em 22 cepas de M. canis mediante
microdiluição em caldo, utilizando a griseofulvina, cetoconazol, itraconazol e
fluconazol. A genotipagem foi estabelecida por meio de RAPD com seis primers:
OPA 01 (5'-CAGGCCCTTC-3'); OPA 02 (5'-TGCCGAGCTG-3'); OPA 03(5'-
AGTCAGCCAC-3'); OPA 04 (5'-AATCGGGCTG-3'); OPA 05 (5'-AGGGGTCTTG-3')
OPK-17 (5´-CCCAGCTGTG-3`), bem como, através de PCR-REA das regiões ITS-1
e ITS-2, utilizando os primers (5´-TTCGTAGGTGAACCTGC-3´) e ITS-4 (5´-
TCCTCCGCTTATTGATAT-3´), Na reação de PCR-REA, os “amplicons” de cada
amostra foram diluídos na proporção de 1:10 em água ultrapura estéril e digeridos
com as endonucleases: Rsa I, Sau 3A, Dde I e Eco RI. A análise morfológica
demonstrou quatro tipos de colônias, bem como diferenças morfológicas de conídios
analisados em ágar batata, ágar Sabouraud, ágar arroz e ágar lactrimel, apesar das
cepas de M. canis terem sido isoladas nas mesmas condições. As cepas de M canis
foram sensíveis a griseofulvina (0,25 µg/ml ≤ MIC ≤ 1µg/ml), cetoconazol (0,25 µg/ml
≤ MIC ≤ 2 µg/ml), itraconazol (0,25 µg/ml ≤ MIC ≤ 1µg/ml) e fluconazol (1 µg/ml ≤
MIC ≤ 16 µg/ml). Ao contrário do observado na fenotipagem, a análise molecular por
PCR-REA e RAPD demonstrou similaridades genéticas das cepas. Apesar de as
cepas de M. canis analisadas apresentarem diversificado espectro de variações
morfológicas e sensibilidade antifúngica, há grande estabilidade genotípica.
Portanto, estes dados permitem que se especule que estes microrganismos,
provavelmente, são clones extremamente adaptados a região metropolitana de
Fortaleza, localizada no Nordeste do Brasil.
9
ABSTRACT
Dermatophytes are a group of fungi that have are capable of invading keratinized
tissues of humans and animals. This study investigated the possible correlation
between the phenotypical, antifungal susceptibility and genotypical characteristics of
M. canis isolated from cats and dogs in Northeast Brazil. The mycological study was
conducted in 20 strains of M. canis by direct microscopic examination, culture
macromorphology and micromorphology and biochemical tests: The antifungal
susceptibility was determined by the broth microdilution test in 22 strains of M. canis
with griseofulvine, ketoconazole, itraconazole and fluconazole. The genotypical
analysis was done by the RAPD, using six primers [OPA 01 (5'-CAGGCCCTTC-3');
OPA 02 (5'-TGCCGAGCTG-3'); OPA 03(5'-AGTCAGCCAC-3'); OPA 04 (5'-
AATCGGGCTG-3'); OPA 05 (5'-AGGGGTCTTG-3') OPK-17 (5´-CCCAGCTGTG-3`)]
and by PCR-REA method with amplification using ITS-1 (5´-
TTCGTAGGTGAACCTGC-3´) e ITS-4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATAT-3´). Some of
the amplified products were diluted in water (1:10) for the endo-nuclease digestion
assays with four different restriction enzymes (Rsa I, Sau 3A, Dde I and Eco RI). The
morphological analysis showed a considerable diversity of colonies as well as
different morphologies of conidia, despite the M. canis strains having been isolated
under the same conditions.The antifungal susceptibility analysis showed that all the
strains of M canis analyzed (n=20) were sensitive to griseofulvine (0.25 µg/ml ≤ MIC
≤ 1µg/ml), ketoconazole (0.25 µg/ml ≤ MIC ≤ 2 µg/ml), itraconazole (0.25 µg/ml ≤ MIC
≤ 1µg/ml) and fluconazole (1 µg/ml ≤ MIC ≤ 16 µg/ml). However, the molecular
analysis by PCR-REA and RAPD showed that all analyzed strains are genetically
similar. This study, based on phenotypical and molecular analysis, evidences a wide
spectrum of phenotypical variations in M. canis in contrast to the stable genotypes of
such dermatophytes. The findings of this study indicate that Microsporum canis
isolated from cats and dogs with dermatophytosis in Fortaleza – Ceará (Northeast
Brazil) may be clones, well adapted to the conditions of this region.
10
LISTA DE FIGURAS
1 Microcultivo em lâmina 30
2 Macroconídio de M. canis medido por meio de retículo acoplado à objetiva 31

de 40x de aumento
3 Provas de requerimentos vitamínicos 31
4 Extração de DNA. A – Micélio de cepas de M. canis após lavagem com 33

solução salina. B – Adição de GHWHUJHQWH&7$%H-mercaptoetanol
5 Extração de proteínas através de solventes orgânicos A: Fase aquosa 33

contendo DNA. B – Proteínas em interface
6 Aplicação da amostra em gel de poliacrilamida 36
7 Técnica de microdiluição em placa. A - Distribuição de RPMI e drogas 39

antifúngicas em diferentes concentrações; B – Microdiluição em caldo. A seta
demonstra a limpidez do poço, o qual detecta a parada de crescimento
fúngico
8 Exame direto do pêlo com KOH 30% mostrando artroconídios microspóricos 41
9 Macroscopia da colônia de M. canis. A - Colônia de textura algodonosa 42

baixa; B - Colônia de textura algodonosa alta; C - Colônia com pigmento
amarelo-canário no reverso; D - Colônia sem pigmento no reverso.
10 Quantificação de macroconídios. A – Cepa com hifas estéreis; B – Cepa 43

com 0-10 macroconídios; C – Cepa com 10-50 macroconídios; D – Cepa com
> 50 macroconídios.
11 Mensuração de macroconídios. A – Comprimento de macroconídios 44

P%– Largura de macroconídio (17,5P
11
12 RAPD com OPA 1 em cepas de M. canis isoladas de cães e gatos no 47
Nordeste do Brasil
13 RAPD com OPK 17 em cepas de M. canis isoladas de cães e gatos no 48

Nordeste do Brasil
14 Gel de poliacrilamida de M. canis exemplificando a reação de PCR-REA de 50

ITS 1(Internal Transcribed Spacers) e ITS 2 digerido com Dde I
12
LISTA DE TABELAS
1 Cepas de M. canis utilizadas na fenotipagem, PCR-REA e RAPD utilizando 27

o primer OPK- 17
2 Cepas de M. canis (n=22) utilizadas nos testes de sensibilidade in vitro a 28

drogas e RAPD utilizando os primers OPA 01; OPA 02; OPA 03; OPA 04;
OPA 05
3 Reagentes e concentrações utilizados na reação de RAPD 34
4 Reagentes e concentrações utilizados na reação de PCR 37
5 Drogas antifúngicas e concentrações em RPMI utilizadas na pesquisa 39
6 Macromorfologia e quantificação de macro e microconídio de M. canis em 45

diferentes meios de cultura
7 Morfologia,largura e tamanho de macroconídios de M. canis analisados 46

em diferentes meios de cultura
8 Padrões de restrição ITS de M. canis 49
9 Comportamento das cepas de M. canis frente aos derivados azólicos e 52

griseofulvina
10 Perfil de sensibilidade antifúngica das cepas de M. canis. 53
13
SUMÁRIO
01
1 INTRODUÇÃO
02
2 REVISÃO DE LITERATURA
02
2.1 Dermatofitose
02
2.1.1 Aspectos históricos
03
2.1.2 Taxonomia do gênero Microsporum
04
2.1.3 Aspectos epidemiológicos
06
2.1.4 Patogenia
10
2.1.5 Métodos empregados no diagnóstico das dermatofitoses
12
2.1.6 Sensibilidade dos dermatófitos frente às drogas antifúngicas in
vivo.
14
2.1.7 Tratamento das infecções dermatofíticas humanas e animais
18
2.2 Resistência fúngica
20
2.3. Biologia Molecular como importante ferramenta da Micologia
3. OBJETIVOS 25
3.1Objetivo geral 25
3.2 Objetivos específicos 25
4 METODOLOGIA 26
4.1 Seleção das amostras e etapas da pesquisa 26
14
4.2 Identificação de dermatófitos 29
4.2.1 Exame direto 29
4.2.2 Caracterização fenotípica – Macro e micromorfologia 29
4.2.3 Diferenciação microscópica das colônias 29
4.2.4 Prova de requerimentos vitamínicos 31
4.3 Estocagem e Recuperação das cepas da micoteca para testes 32

genotípicos
4.4 Extração de DNA genômico 32
4.5 Quantificação de DNA 34
4.6 Reação de RAPD 34
4.7 Eletroforese em gel de poliacrilamida 35
4.8 Reação de PCR - REA 39
4.9 Teste de sensibilidade antimicrobiana in vitro 38
4.10 Análise estatística 40
5 RESULTADOS 41
5.1 Análise macro e micromorfológica 41
5.2 Análise genotípica 47
15
5.2.1 RAPD 47
5.2.2 PCR-REA 49
5.3 Teste de sensibilidade antimicrobiana in vitro 50
6 DISCUSSÃO 54
7 CONCLUSÕES GERAIS 64
65
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANEXOS 84
Artigo 1 Phenotypical and molecular characterization of Microsporum 85

canis strains in northeast Brazil
Periódico: Journal of Applied Microbiology (Artigo aceito)
Artigo 2 Antifungal susceptibility and genotypical pattern of 106

Microsporum canis strains
Periódico: Canadian Journal Microbiology (Artigo aceito)
16
LISTA DE ABREVIATURAS
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism - Polimorfismos de tamanho dos

fragmentos de restrição
ATCC Americal Type Culture Collection – Coleção Americana de Culturas Tipo
BHI Brain Heart Infusion – Infusão de cérebro e coração
CIM Concentração inibitória mínima
CTAB Brometo de cetiltrimetilamônio
DMSO Dimetil-sulfóxido
DNAse Desoxirribonuclease
DNTP Desoxinucleotídeo trifosfato
DTM Dermatophyte Test Medium – Meio teste para dermatófitos
EDTA Ácido etileno diamino-tetracético
HCl Àcido clorídrico
ITS Internal Transcribed Spacer – Espaço interno transcrito
MgCl2 Cloreto de magnésio
KCl Cloreto de potássio
MOPS Ácido 3 (N-morfolino) propanossulfônico
PAGE Eletroforese em Gel de Poliacrilamida
PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis – Eletroforese em campo pulsado
PCR Polymerase Chain Reaction - Reação da cadeia polimerase
RAPD Random Amplification DNA Polymorphism - Amplificação aleatória de DNA
polimorfico
REA Restriction Enzyme Analysis – Análise de Enzimas de Restrição
RNAse Ribonuclease
RPMI Solução nutritiva desenvolvido no Instituto Roswell Park Memorial
Tris Tris-(hidroximetil)-aminometano
UFC/mL Unidades formadoras de colônia por mililitro
17
1 INTRODUÇÃO
Os fungos, objeto de estudo da Micologia humana e veterinária, são agentes

de processos infecciosos denominados micoses bem como agentes de quadros de
hipersensibilidade imediata e tardia, micotoxicoses e micetismo (SIDRIM & ROCHA,
2004).
As micoses podem ser classificadas clinicamente, de acordo com o local de

instalação do agente infeccioso, em superficiais (estritas e dermatofitoses),
subcutâneas (cromoblastomicoses, esporotricoses, feohifomicoses, micetomas,
hialohifomicoses, zigomicoses e doença de Jorge Lobo) e sistêmicas.
(histoplasmose, paracoccidioidomicose, blastomicose e coccidioidomicose) (SIDRIM
& ROCHA, 2004).
As dermatofitoses, dentre todas as micoses, consistem nas mais freqüentes

manifestações clínicas que acometem o homem e os animais. Apesar do número de
casos de dermatofitoses em todo o mundo, poucos estudos são realizados com
animais domésticos que apresentam doenças dermatofíticas. No Brasil, dados
clínico-epidemiológicos, fenotípicos e genéticos de cepas de M. canis, oriundos de
pequenos animais ainda, são muito pouco explorados (VIANI et al., 2001; MAIA et
al., 2001; BRILHANTE et al., 2003; CAVALCANTI et al., 2003).
O Microsporum canis é o principal agente implicado nas dermatofitoses de

cães e gatos (BRILHANTE et al., 2003), sendo também o mais freqüente dermatófito
zoofílico de humanos na cidade de Fortaleza-CE (BRILHANTE et al., 2004b).
Brilhante et al., 2004a, em estudos de estocagem de cepas de M. canis, observaram
uma diversidade morfológica nas cepas dermatofíticas, sendo destacadas as
diferenças fenotípicas das macrocolônias, em meios de cultura clássicos utilizados
em Micologia, bem como alterações nas estruturas de reprodução assexuada que,
muitas vezes, não apresentaram características típicas que pudessem ser utilizadas
na identificação destes microrganismos. Por conseguinte, estes fatos aventaram a
hipótese de que possivelmente haveria uma correlação destas diferenças fenotípicas
com a diversidade genotípica das cepas de M. canis.
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Dermatofitoses
2.1.1 Aspectos históricos
O estudo das dermatofitoses teve início juntamente com a história da

Micologia Médica. Remak, em 1835, fez as primeiras observações, entretanto, de
estruturas microscópicas em lesões fávicas. Tais observações, entretanto, nunca
foram publicadas, sendo creditadas a natureza micótica das estruturas a
Schoenleini. Posteriomente, Remak, em 1839, elucidou a etiologia do favus,
classificando-o como Achorion schoenleinii, em homenagem ao mentor da
descoberta inicial (SCHOENLEINI, 1839; REMAK, 1845). No ramo da Micologia
Veterinária, provavelmente, a primeira descrição de dermatofitose como zoonose
surgiu em 1820, quando foi descrito o acometimento de uma criança após o contato
com bovinos (SMITH et al., 1992).
David Gruby, em 1842, redescobriu o agente etiológico do favus, reafirmando

a etiologia de todas as tinhas (SIDRIM & ROCHA, 2004). Gruby também descreveu
o parasitismo do tipo ectotrix encontrado em cepas de Microsporum audoinii, bem
como a aparência das lesões microspóricas no couro cabeludo de crianças
(WEITZMAN & SUMMERBELL, 1995).
Quase um século depois, os dermatófitos foram consagrados por um brilhante

dermatologista francês de nome Raymond Jacques Andrien Sabouraud. Este mestre
dentro dos estudos da Micologia, publicou, um livro que se tornou clássico, na
tentativa de normalizar o conhecimento vigente na época. No seu tratado,
denominado Les teignes, os dermatófitos foram enquadrados em quatro gêneros:
Achorion, Trichophyton, Epidermophyton e Microsporum, sendo esta classificação
baseada nos dados clínicos da doença, aliado às observações dos aspectos macro
e micromorfológicos em meio peptonado (SABOURAUD, 1910).
19
Em 1928, Devèze e Margarot observaram cabelos de humanos parasitados
por algumas espécies de dermatófitos, quando expostos à luz ultravioleta (lâmpada
de Wood), destacando a fluorescência das cepas, fato este que, até os dias atuais, é
utilizado como ferramenta diagnóstica.
Em 1934, Emmons revalidou a taxonomia assexuada dos dermatófitos, e, a

partir de observações microscópicas dos conídios em meios com grãos de cereais,
extinguiu o gênero Achorion, ficando os dermatófitos classificados nos três gêneros
restantes, até os dias de hoje.
Hoje existe uma infinidade de fungos pertencentes aos gêneros Trichophyton,

Epidermophyton e Microsporum. A denominação dermatófito, entretanto, é
consagrada para fungos pertencentes a esses gêneros que são queratinofílicos e
capazes de causar enfermidades em humanos e animais, ficando as demais
espécies incorporadas a um grupamento correlacionado, não sendo considerados
dermatófitos. Pode ser citado como espécie incorporada a esse grupamento
correlato o Epidermophyton stockdalaeae, o qual pertence ao gênero
Epidermophyton, encontrado exclusivamente no solo, não causador de
dermatofitose, e portanto, não-dermatofítico (SIDRIM & ROCHA, 2004).
2.1.2 Taxonomia do Gênero Microsporum
O gênero Microsporum caracteriza-se pela grande quantidade de

macroconídios de parede rugosa, com eventuais microconídios, sendo enquadrados
no reino Fungi (Eumycota), divisão Ascomycotina, Classe Euascomycetes, Ordem
Onygenales, Família Arthorodermatacea e Gênero Arthroderma (DE HOOG et al.,
2000). Dentre os dermatófitos, o gênero Microsporum tem sido considerado um
grupamento fúngico zoofílico que parasita primariamente os animais. Inúmeras
espécies do gênero podem ser isoladas das pelagens de animais sadios, bem como,
oriundas de lesões de pele de mamíferos, podendo ser citados: M. equinum (em
cavalos), M. nanum (acometendo suínos), entre outros, sendo o M. canis o mais
descrito em cães e gatos (GRASER et al., 2000; BRILHANTE et al., 2003).
20
2.1.3 Aspectos epidemiológicos
Nos animais domésticos, as dermatofitoses possuem grande interesse pelo

seu potencial zoonótico, cosmopolita podendo ser transmitida de uma espécie
animal para outra, bem como do animal para o homem, ou, ainda, ocasionalmente,
do homem para os animais (RICHARD et al., 1994). No meio urbano, 20% das
infecções fúngicas humanas, acometendo pele glabra, são de origem animal, em
decorrência do contato próximo com animais de estimação, como, cães e gatos, por
exemplo (GARCIA & BLANCO, 2000; CRESPO et al., 2000)
De acordo com Cabañes (1997), os animais são considerados como um

reservatório de dermatófitos zoofílicos, sendo a sua incidência variável de acordo
com o clima e com o habitat do reservatório. Logo, o padrão de espécies
dermatofíticas deve ser diferente nas diversas condições geográficas, tanto em
humanos como em animais, podendo aumentar de acordo com a aproximação dos
animais com o ser humano.
Estudos sobre a incidência das dermatofitoses em animais têm apresentado

diferentes resultados, podendo variar de 7% a 40%, em cães, e de 9% a 54,8 %, em
gatos, de acordo com vários autores europeus e da América do Norte (PEPIN, 1968;
AHO, 1980; FAGGI, 1987; LEWIS, 1991; SPARKERS, 1993; SPARKERS, 1994;
CABAÑES, 2000; MANCIANTI et al., 2002; KHOSRAVI & MAHMOUDI, 2003).
Brilhante et al., 2003, em análise envolvendo 189 cães e 38 gatos com lesões
sugestivas de dermatofitoses, na cidade de Fortaleza - CE, demonstraram que estes
animais foram acometidos em 14,3% e 36,8%, respectivamente, por diferentes
espécies de dermatófitos. Estes dados são importantes, visto que, as dermatofitoses
vem sendo consideradas preocupantes em países tropicais e subtropicais.
O M. canis é o responsável pela maioria de casos de micoses em cães e

gatos e o mais freqüente dermatófito zoofílico de humanos, em diversas áreas
urbanas da Europa (MARCHISIO 1995; SYMPANYA & BAXTER 1996; CABAÑES,
2000; BRAJAC et al., 2004; CAFARCHIA et al., 2004; KOUSSIDOU-EREMONDI et
al., 2005), na América do Norte (RIPPON, 1988; MORIELLO & DEBOER, 1991) e na
21
América Latina (SILVA et al., 2003) sendo incluída nestas análises as regiões
brasileiras (GAMBALE 1987; BRILHANTE et al., 2003)
No Brasil, em dados da região Sudeste, o M. canis foi o fungo mais isolado

em dermatofitoses de pequenos animais, seguido de Trichophyton mentagrophytes
e M. gypseum (LARSSON, 1980, GAMBALE, 1987, GAMBALE, 1993). Em
Pernambuco, em análise realizada na região rural do Estado, os dermatófitos
acometeram 13,16% dos cães e 27,27% dos gatos avaliados na pesquisa, sendo o
gênero Microsporum o mais isolado (CAVALCANTI et al., 2003). Estes dados não
diferem do diagnóstico humano, onde Chinelli et al., 2003 e Brilhante et al., 2004b,
apontam o M. canis como o zoofílico mais isolado em Tinea capitis na cidade de São
Paulo e Fortaleza, respectivamente.
Quanto à idade mais favorável para infecções por fungos dermatofíticos, em

pequenos animais, inúmeros relatos indicam que cães e gatos de menos de um ano
de idade são os mais sensíveis. Este fato pode ser justificado pela falta de
maturidade imunológica, pela baixa produção de ácidos graxos de cadeia saturada,
dentre outros fatores (CABAÑES, 2000; SILVA et al., 2003; BRILHANTE et al., 2003,
CAFARCHIA et al., 2004).
Em relação às raças, pode ser observada maior prevalência em cães da raça

Yorkshire Terrier e gatos da raça Persa (CABAÑES, 1997; CABAÑES, 2000; LEWIS,
1991; SPARKER, 1993; BRILHANTE et al., 2003, CAFARCHIA et al., 2004). As
razões para a predisposição de tais raças, ainda, não são bem claras.
Possivelmente os pelos alongados facilitam as condições ótimas de temperatura e
umidade para que as estruturas fúngicas fiquem protegidas contra a dissecação,
favorecendo assim a sua propagação (SPARKES et al., 1993). Esta hipótese se
contradiz com o trabalho de Kanwar & Belhaj, (1987), em dermatofitose humana,
onde discutem que pêlos mais curtos, em casos de Tinea capitis, beneficiariam a
implantação e instalação de artroconídios.
A respeito da sazonalidade das espécies fúngicas, muitos dados são

contraditórios, pois autores, como Baxter (1973), não descrevem dados de
mudanças da flora dermatofítica de acordo com as estações anuais. Por outro lado,
22
autores como Lewis (1991) postulam diferenças entre o aumento da freqüência de
M. gypseum em períodos de verão. Estes concordam com trabalho de Kaplan &
Ivens (1961), onde estes autores reportaram que a freqüência de M. gypseum, nos
Estados Unidos da América, é mais evidente em zonas mais quentes do sul do País
do que em regiões do norte. Mancianti et al., (2002), em estudo desenvolvido
durante 15 anos na Itália, observaram que houve uma distribuição anual das
dermatofitoses em cães, onde o M. gypseum se destacou em temperaturas mais
quentes como as do verão, enquanto o M. canis, em gatos, foi mais isolado no
outono e inverno. Já o T. mentagrophytes não demonstrou predileção por nenhuma
estação do ano (MANCIANTI et al., 2002).
Em meio as dermatofitoses em cães e gatos, vários autores relatam ainda a

importância dos animais assintomáticos, como portadores sadios de fungos
dermatofíticos, uma vez que podem albergar o microrganismo como parte da sua
microbiota normal, dificultando, assim, o rompimento do ciclo epidemiológico da
doença (SIMPAYA & BAXTER, 1996; KHOSRAVI, 1996; ROMANO, 1997;
CABAÑES, 1997). Segundo Sparkers (1994), a prevalência de animais carreadores
assintomáticos pode variar de 0 a 88%. Tais dados parecem estar correlacionados
como uma boa adaptação de M. canis aos pêlos e pele dos animais (Moriello &
Deboer, 1991). Silva et al., (2003), em análises de 120 cães saudáveis, indicaram
um total de 5% de isolamentos de M. canis, sendo tais animais, por conseguinte,
considerados portadores assintomáticos.
2.1.4. Patogenia
A estrutura física e química da pele representa a maior barreira de defesa do

hospedeiro contra fungos patogênicos. A pele, em geral, é uma superfície inóspita
para o crescimento fúngico em virtude da exposição dos raios UV, de constante
renovação das células epiteliais, pela queratinização, bem como, pela competição
da própria microbiota normal contra os demais microrganismos invasores
(MORIELLO, 2004). Um dos fatores que poderia ser considerado favorável para os
fungos dermatofíticos é que, estes, diferentes de outros fungos, se nutrem da
23
queratina que é o principal constituinte do stratum corneum de homens e animais
(SIDRIM & ROCHA, 2004).
A instalação do processo infeccioso primário clássico está relacionada,

principalmente, a enzimas produzidas pelo dermatófito e, em segundo plano, a
forças mecânicas. Viani et al., (2001), em estudos da atividade enzimática em cepas
de M. canis, analisaram queratinases, lípases, elastases e DNAses e demonstraram
que a enzima queratinase está correlacionada diretamente com o desenvolvimento
dos sintomas das lesões dermatofíticas, não sendo observada tal situação com as
demais enzimas.
Segundo Brouta et al., (2002), a caracterização de queratinases parece ser

um grande passo para o melhor entendimento da patogênese das dermatofitoses e
subseqüentemente para o esclarecimento da relação parasito-hospedeiro. Alguns
autores, como Mignon et al., (1998), e Brouta et al., (2001), têm purificado e
caracterizado queratinases de M. canis, sendo descritas uma protease de 31kDa e
uma metaloprotease de 43,5 kDa.
Apesar da protease ter sido produzida, in vivo, em gatos, esta não parece ser
o principal antígeno encontrado em infecções por M. canis, visto que, a
metaloprotease foi encontrada também em hospedeiros naturais, bem como sua
produção foi exacerbada pela presença de queratina. Tais evidências apontam a
metaloprotease como uma forte candidata para estudos imunológicos, incluindo em
vacinas (BROUTA et al., 2001). Brouta et al., (2002), em estudos moleculares,
isolaram três genes codificadores de metaloprotease (meps) em cepas de M. canis,
demonstrando que o gene mep3 é o codificador da 43,5KDa.
Quanto à lesão clínica, os dermatófitos desenvolvem-se crescendo do centro

da lesão para as bordas, resultando, ao final de alguns dias, em lesões circulares
discretas, com áreas de alopecia, bordos eritematosos e vesiculares, que
circunscrevem uma parte central descamativa. Possuem intensa descamação
associada ou não à resposta inflamatória, resultante da atividade queratinolítica
24
Os pêlos quando parasitados, por dermatófitos, sempre são secundariamente
à infecção da pele. Tal infecção é encontrada na região do folículo piloso, invadindo
assim a camada córnea da epiderme, que se aprofunda em direção ao infundíbulo
piloso. O dermatófito em contato com a queratina remove a cutícula e retoma o pêlo.
Ao chegar nesse estágio da infecção pilosa, cada espécie fúngica expressa suas
particularidades na dependência do hospedeiro. Foi sobre esses diversos aspectos
parasitários que Sabouraud descreveu cinco tipos de parasitismos pilosos, citados a
seguir: parasitismo endotrix, megaspórico ectotrix, micróide ectotrix, microspórico e
fávico. Dentro desta classificação, o M. canis, se mantêm no pêlo com parasitismo
do tipo microspórico (SIDRIM & ROCHA, 2004).
A dermatofitose em cães e em gatos é uma doença folicular e os sinais

clínicos são essencialmente um reflexo da foliculite do pêlo e posterior inflamação,
sendo o prurido variável em intensidade. Esta micose é menos comum em cães do
que em gatos, sendo muitas vezes indistinguível quando comparada com quadros
de demodicose ou ainda com a piodermite bacteriana (MORIELLO, 2004).
Em cães, as lesões dermatofíticas podem consistir de combinações de

pápulas, pústulas, com alopecia focal ou dispersa, apresentando zonas
eritematosas, descamação e crostas. Reações de Kérion podem ser visualizadas
geralmente na face, podendo muitas vezes mimetizar piodermites ou furunculoses
(FOIL, 1998).
Nos gatos, as lesões são representadas com descamação e crostas com e

sem alopecia. A alopecia pode ser focal, difusa ou ainda generalizada. A
dermatofitose pode ainda provocar uma hiperpigmentação da pele dos felinos,
sendo esta característica também encontrada em outras doenças de pele. São
outros problemas decorrentes desta infecção a constipação, em virtude da ingestão
constante de pêlos, resultando em anorexia, perda de peso e vômitos. Os gatos são
ainda susceptíveis ao desenvolvimento de kérions, micetomas na pele e tecidos
subcutâneos, apesar de tais apresentações serem consideradas raras (FOIL, 1998;
SCOTT et al., 2001, MORIELLO, 2004).
25
Os animais portadores assintomáticos de fungos dermatofíticos, quando
mantidos em ambientes livres de estruturas fúngicas, podem manter-se com exames
micológicos negativos, provando assim que o animal nada mais é do que um reflexo
do seu ambiente ou de suas condições de manejo (MORIELLO & DEBOER, 1991;
SPARKES et al., 1994).
Logo, para determinar se um animal está com infecção por fungos

dermatofíticos, impõe-se tanto que o exame direto seja positivo, como o fungo seja
isolado em culturas primárias, sendo tais dados correlacionados com as
manifestações clínicas. Caso não sejam observadas as lesões dermatofíticas, o
animal poderá ser considerado apenas como assintomático (PÍER & MORIELLO,
1998). Vale salientar que os artroconídios dermatofíticos podem manter-se viáveis
por 12-18 meses no ambiente, levando muitas vezes ao isolamento deste
microrganismo da pelagem do animal, sem, contudo, o animal apresentar a infecção
(SPARKES et al., 1994).
Ainda que seja controverso o papel exato do animal nas infecções humanas
causadas por fungos zoofílicos, de fato, a ausência de um reservatório pode
inviabilizar a capacidade de infecção do fungo zoofílico, visto que cepas de M. canis
podem perder a virulência após quatro passagens de transmissão homem a homem,
sendo necessário que o microrganismo retorne ao animal, para que se mantenha a
virulência da cepa (RIPPON, 1985).
As dermatofitoses, pela sua própria localização, geralmente não provocam

alterações humorais ou celulares no hospedeiro, a não ser em casos de
dermatofítides. Nas dermatofitoses crônicas e nos kérions, anticorpos precipitantes
foram demonstrados mediante técnicas de imunoeletroforese. Tais anticorpos se
apresentam principalmente nos pacientes com processos inflamatórios mais agudos
ou crônicos, sendo este último caso exemplificado por cepas de T. rubrum.
Geralmente, os dermatófitos zoofílicos provocam reações mais inflamatórias no
homem, com posterior produção de anticorpos, muitas vezes curadas
espontaneamente com resistência posterior a reinfecção (LACAZ et al., 2002).
26
2.1.5 Métodos empregados no diagnóstico das dermatofitoses
Um dos passos iniciais importantes para o diagnóstico das dermatofitoses é o

uso da lâmpada de Wood, a qual fluoresce o pêlo, quando parasitado com algumas
espécies de dermatófitos. Esta característica permite avaliar a extensão do
acometimento cutâneo. Cepas de M. canis se apresentam fluorescentes, em virtude
de uma substância protéica denominada coproporfirina, responsável pelo fenômeno.
O uso da lâmpada de Wood é interessante no momento da escolha adequada dos
pêlos, para posterior análise no exame micológico (MORIELLO, 2004).
O exame direto, primeiro procedimento laboratorial empregado no diagnóstico

das dermatofitoses, é realizado por microscopia óptica em preparações com lâmina
e lamínula do espécime clínico. O material é tratado com KOH a 10, 20 ou 30%
(MORIELLO, 2004). O KOH facilita a visualização fúngica, visto que, clareia as
células queratinizadas de escamas de pele e pêlo (FOIL, 1998). O exame direto é
indispensável no diagnóstico, visto que quando feito por micologistas experientes,
acarretará maior rapidez no diagnóstico, bem como maior agilidade no tratamento
A cultura primária, ou seja, a distribuição do espécime clínico em meio de

cultura artificial, é o passo que segue o exame direto. O isolamento primário pode
ser feito em ágar Sabouraud, bem como no mesmo acrescido a antimicrobianos, tais
como ao cloranfenicol e a cicloheximida. O cloranfenicol e a cicloheximida, quando
associados ao ágar Sabouraud, inibem o crescimento de bactérias contaminantes e
fungos saprófitas, respectivamente (SIDRIM & ROCHA, 2004). Outro meio, menos
freqüentemente utilizado, mas que também pode ser usado na identificação de
fungos dermatofíticos é o DTM (Dermatophyte Test Medium), conforme
recomendado por Guillot et al., 2001.
Após o isolamento primário, segue a caracterização da macro e

micromorfologia da colônia fúngica. Estes achados devem ser considerados sempre
em conjunto, visto que a colônia fúngica pode sugerir a espécie fúngica em questão,
mas são os achados micromorfológicos que irão garantir a caracterização e o
diagnóstico preciso. O estudo micromorfológico é feito a partir do isolamento
27
primário, sendo uma pequena alíquota da colônia retirada do ágar e montada entre
lâmina e lamínula com corante lactofenol azul-algodão. A montagem é observada
em microscopia óptica em objetiva de 40X. Nestas preparações, podem ser
visualizadas estruturas de reprodução, bem como estruturas de ornamentação.
Apesar das observações micromorfológicas serem de extrema relevância, muitas
vezes, o micologista ainda lança mão das características nutricionais do fungo, que
em muitas ocasiões são de extrema valia no diagnóstico final desses
microrganismos (SIDRIM & ROCHA, 2004).
Segundo Graser et al., 2000, atenção especial deve ser dada ao diagnóstico
laboratorial de cepas transmitidas por animais, em especial, as do gênero
Microsporum, visto que as características morfológicas variam consideravelmente ao
longo de poucas transferências de hospedeiros. Tais mudanças levam a uma grande
diversidade de colônias, bem como de metabólitos produzidos pelo fungo. Diante de
tais fatos, pesquisadores despertaram as atenções para um refinamento do
diagnóstico micológico, recorrendo inevitavelmente às técnicas de Biologia Molecular
em tais situações (FAGGI et al., 2001)
Recentemente, as características do gênero Microsporum vêm sendo

avaliadas por meio de perfis fenotípicos (morfológicos e fisiológicos) e moleculares
(sequenciamento de regiões ITS, PCR de tRNA e AFLP dos fragmentos de PCR).
Com tais análises, Graser et al., 2000, avaliaram sete espécies do gênero
Microsporum, sendo as cepas de. M. distortum reclassificada como sinônimo de M.
canis. Cepas de M. equinum, por sua vez, são consideradas por muitos autores
idênticas ao M. canis, entretanto, Graser et al., 2000, não puderam concluir esta
evidência, sendo estes fungos considerados estreitamente correlacionados entre si.
Vale salientar que as técnicas de Biologia Molecular não se limitam, entretanto, a
reclassificações, podendo ainda auxiliar no diagnóstico das dermatofitoses a partir
de pele e tecidos, por meio de PCR e ensaios com enzimas, como a quitina
sintetase (FAGGI et al., 2001; KANO et al., 2001).
2.1.6 Sensibilidade dos dermatófitos frente às drogas antifúngicas in vitro

Os testes de sensibilidade, in vitro, são estabelecidos por um subcomitê de
peritos vinculados ao National Comittee for Clinical Laboratory Standarts (NCCLS), o
28
qual desenvolve inúmeros métodos de análise para detectar a menor concentração
de droga capaz de inibir o crescimento fúngico in vitro (CIM). O NCCLS já
padronizou os métodos de sensibilidade, in vitro, para fungos leveduriformes e
fungos filamentosos de crescimento rápido. Os dermatófitos, entretanto, não foram
apreciados, provavelmente em razão da grande diversidade morfológica
encontradas nos três gêneros do grupo (KONTOYIANNIS & LEWIS, 2002).
Com base aos dados fornecidos pelos peritos do NCCLS, por meio de
estudos multicêntricos, em 1992, foi estabelecido o documento M-27A para
leveduras. Este protocolo estabeleceu os seguintes parâmetros: a metodologia
utilizada pode ser a de macrodiluição ou microdiluição. O meio utilizado é o RPMI
1640 sem L- glutamina, tamponado com MOPS, sendo o inóculo de 0,5 – 2,5 x 103
células/ ml, na temperatura de 35oC com período de incubação de 48 horas para
Candida sp e de 72 horas para Cryptococcus neoformans. O critério de leitura para
drogas como a anfotericina B é de inibição total. Posteriormente, em 1998, foi
estabelecido outro documento, denominado de M-38P do NCCLS para fungos
filamentosos de crescimento rápido, tais como Aspergillus flavus, A. fumigatus,
Fusarium solani, F. oxysporum, Rhizopus arrhizus. Alguns detalhes diferiram do
documento M-27A, onde o inóculo é de 0,4-5,0 x 104 células/ ml, com tempo de
incubação de 21-26 horas para Rhizopus sp, 46-50 horas para Aspergillus e
Fusarium, sendo a leitura para anfotericina B a inibição total do inóculo e dos
azólicos com 50% de inibição comparada com o tubo-controle. O controle de
qualidade é avaliado a partir de cepas ATCC (COLOMBO & ALVES, 2004).
Alguns autores, como Perea et al., (2001), e Barchiesi et al., (2001), têm
utilizado os métodos de macrodiluição em caldo para análise da sensibilidade
antifúngica em dermatófitos através do documento M27A. Perea et al., (2001), em
análises com 19 espécies dermatofíticas, frente ao voriconazol, demonstraram que
esta droga é mais potente do que o cetoconazol, griseofulvina e fluconazol, sendo
menos ativa comparada ao itraconazol e terbinafina. Barchiesi et al., (2001),
analisaram a atividade do posaconazol frente a 30 isolados dermatofíticos de 6
espécies diferentes. Esta droga se mostrou potente, quanto a sua atividade
fungicida, comparada ao itraconazol no gênero Microsporum. Apesar da
macrodiluição em tubos representar uma boa reprodutibilidade, ainda é, considerada
29
uma metodologia laboriosa e de difícil execução em rotina laboratorial (COLOMBO &
ALVES, 2004).
Jessup et al., (2000), analisaram 43 cepas dermatofíticas através de

microdiluição in vitro, sendo a metodologia seguida de acordo com o documento
M27A do NCCLS. Em tais análises, os autores mostraram que, estando o RPMI
1640 incubado a 35 oC, em tempo de incubação de 4 dias, com inóculo de 103
conídios/ml, estas eram condições excelentes para testes de sensibilidade
antifúngica em dermatófitos.
Fernandez Torres et al., (2002a), analisando 60 cepas dermatofíticas, em

estudo multicêntrico, estabeleceram procedimentos na tentativa de definir condições
ideais para os testes de microdiluição, in vitro, para este grupo fúngico. Drogas como
clotrimazol, itraconazol e terbinafina foram avaliadas, sendo estabelecidas algumas
condições ótimas de experimentação, tais como a concentração de inóculo de 104
UFC/ml, a incubação durante sete dias, com temperatura de 28 oC, sendo o endpoint
(parada de crescimento) de 100% de inibição de crescimento.
Favre et al., (2003), por sua vez, em estudo minucioso da atividade, in vitro,
de 17 antifúngicos contra 20 dermatófitos, usando o documento M38-P do NCCLS,
demonstraram algumas dificuldades na tentativa de padronização de tais testes.
Quanto à quantidade de inóculo, foi demonstrado que tanto os conídios, bem como a
associação destes com o micélio, não influenciam no endpoint dos diversos
antifúngicos analisados. A incubação ideal, bem como o tempo de espera para a
leitura, ainda era considerado um impasse, pois cepas de M. canis e E. floccosum
cresciam pobremente a 35 oC, sendo esta temperatura diminuída para 30 oC para as
duas espécies referidas, e a leitura feita após 4 ou 5 dias de incubação. O endpoint
foi determinado como inibição de 80% do inóculo para as drogas analisadas, sendo
seis delas consideradas as mais potentes (cetoconazol, fluconazol, itraconazol,
voriconazol, terbinafina e griseofulvina). Estas análises propuseram que a
microdiluição, em ensaios dermatofíticos, poderia ser conveniente e reprodutível.
Outros parâmetros, entretanto, deveriam ser bem delimitados, tais como a
temperatura, podendo variar de espécie para espécie em fungos dermatofíticos.
30
Estudo comparativo sobre microdiluição em caldo e discos de difusão em
ágar demonstraram resultados similares em cepas dermatofíticas. Um total de 56
cepas dermatofíticas frente a 10 antifúngicos, baseado no documento (M38-P) do
NCCLS, apresentou resultados reprodutíveis, sendo considerado hoje como uma
valiosa sugestão alternativa para os testes de sensibilidade in vitro. Nesse estudo, a
terbinafina e o itraconazol foram os antifúngicos mais ativos, sendo o fluconazol o
menos ativo (KARACA E KOÇ, 2004). O teste de sensibilidade com discos de
difusão é um método fácil e econômico que oferece boa reprodutibilidade e acurácia
podendo ser facilmente aplicado a rotina micológica de diagnóstico.
2.1.7 Tratamento das infecções dermatofíticas humanas e animais
Há três principais classes de drogas antifúngicas utilizadas na conduta

terapêutica contemporânea das dermatofitoses de cães e gatos: griseofulvina,
derivados azólicos e alilaminas (ROCHA & SIDRIM, 2001).
A griseofulvina foi isolada a partir do Penicillium griseofulvum, em 1939, no

entanto, sua aplicação clínica só foi viabilizada em 1958, após a realização de uma
pesquisa que investigou sua eficácia, por via oral, numa dermatofitose experimental,
em cobaia. Assim, tem sido desde então a droga de primeira escolha no tratamento
das dermatofitoses (HEIT & RIVIERE, 1995; MORIELLO & DEBOER, 1995).
O mecanismo de ação da griseofulvina ocorre por meio da sua penetração na

célula fúngica, por um processo energia-dependente. Por conseguinte, interage com
os microtúbulos, desfazendo o fuso mitótico, provocando uma inibição no processo
de mitose fúngica e conseqüentemente na multiplicação do microrganismo (HEIT &
RIVIERE, 1995; KNASMMULLER et al., 1997; COSTA & GÓRNIAK, 1999).
A griseofulvina mostra uma atividade fungistática importante sobre espécies

de fungos dos gêneros Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton. Sendo,
portanto, utilizada exclusivamente em infecções dermatofíticas (HEIT & RIVIERE,
1995; COSTA & GÓRNIAK, 1999).
31
Os distúrbios gastrintestinais, como náuseas, vômitos e diarréia, têm sido
seus efeitos indesejados mais freqüentemente relatados. A griseofulvina pode
causar, ainda, hepatotoxicidade e atividade teratogênica (PLUMB, 1995; HEIT &
RIVIERE, 1995; KNASMMULLER et al., 1997).
Na micologia veterinária, alguns autores descrevem a eficácia da griseofulvina

associada ou não a drogas de uso tópico. Balda et al., 2002, em estudo com 9 cães
e 3 gatos com dermatofitose, utilizando a griseofulvina durante 41 dias obtiveram
100% de cura.
Alguns estudos foram desenvolvidos com a griseofulvina em associação com

outras drogas de uso tópico, tais como, enilconazol, miconazol, clorexidina e
lufenuron (droga inibidora da quitina sintetase) [SPARKER et al., (2000), GUILLOT et
al., (2002)]. Sparkes et al., (2000) associaram a griseofulvina ao miconazol 2% e
clorexidina, no tratamento de felinos com lesões dermatofíticas causadas por M.
canis, sendo os gatos curados após 42 dias de tratamento. Guillot et al., (2002), em
descrição do tratamento de 100 felinos, demonstraram que a combinação da
griseofulvina com enilconazol ou lufenuron não acarretavam na cura dos animais
após cinco semanas de tratamento. Segundo os autores, a falha terapêutica foi
justificada pela ausência de controle sanitário do local no qual os gatos estavam
instalados, e não pela ineficácia da griseofulvina em associação.
Os derivados azólicos formam um grupo de compostos sintéticos, com

estrutura química semelhante e com amplo espectro de atividade antifúngica. A
investigação da atividade antifúngica destes compostos iniciou-se com o
benzimidazol e, a partir daí, surgiram os derivados imidazólicos e triazólicos, que são
os antifúngicos de maior expressão dentro da Micologia Médica humana e
Veterinária. Os derivados imidazólicos, em uso clínico, são representados pelo
clotrimazol, miconazol, econazol, bifonazol, isoconazol, tioconazol, oxiconazol,
sertaconazol, terconazol e cetoconazol etc. Os derivados triazólicos (fluconazol,
itraconazol e voriconazol, ravuconazol) são antifúngicos com largo espectro de
atividade, eficazes tanto em micoses sistêmicas como em superficiais. Vale salientar
que o itraconazol é a nova alternativa para o tratamento das dermatofitoses,
refratária à griseofulvina (PLUMB, 1995; HEIT & RIVIERE, 1995; COSTA &
32
GÓRNIAK, 1999; ROCHA & SIDRIM, 2001). Pode ser utilizado satisfatoriamente em
dermatofitoses felina (COLOMBO et al., 2001; MANCIANTI et al., 1998)
Os derivados azólicos interferem na síntese do ergosterol, bloqueando a

enzima 14-.-demetilase, do citocromo P-450 do fungo, e, por conseguinte,
impedindo a demetilação do precursor lanosterol em ergosterol (ROCHA & SIDRIM,
2001). Esta propriedade dos azóis prejudica a função da membrana celular,
aumentando a sua permeabilidade (PLUMB, 1995; HEIT & RIVIERE, 1995; COSTA
& GÓRNIAK, 1999).
O cetoconazol apresenta um espectro de atividade contra vários fungos

causadores de micoses profundas, bem como é eficaz para várias espécies de
Candida e dermatófitos. O uso dos imidazóis tópicos, como clotrimazol, econazol,
bifonazol, isoconazol, oxiconazol, sertaconazol etc., restringe-se às micoses
superficiais, em especial as dermatofitoses. O itraconazol tem sido utilizado com
sucesso no tratamento de dermatofitoses refratárias (HEIT & RIVIERE, 1995;
COSTA & GÓRNIAK, 1999; ROCHA & SIDRIM, 2001).
Distúrbios no trato gastrintestinal, tais como anorexia, náuseas, vômitos,

diarréia e hepatotoxicidade, podem aparecer durante a terapia com o cetoconazol.
Seus efeitos endócrinos, do tipo ginecomastia, diminuição da libido, impotência,
oligospermia etc, resultam do bloqueio na síntese dos esteróides androgênicos. A
exemplo do que ocorre com imidazóis de uso tópico, como clotrimazol, isoconazol,
oxiconazol, sertaconazol etc., o cetoconazol, quando administrado topicamente,
pode apresentar reações adversas apenas localmente, como irritação, eritema e
prurido. O surgimento dos efeitos colaterais com itraconazol não é comum,
entretanto, alguns pacientes podem apresentar náuseas, vômitos, diarréia e
distúrbios hepáticos. Ademais, diferentemente do observado com o cetoconazol, o
itraconazol, não interfere na síntese de esteróides do hospedeiro (HEIT & RIVIERE,
1995; COSTA & GÓRNIAK, 1999; ROCHA & SIDRIM, 2001).
Na Micologia Veterinária, estudos em gatos utilizando itraconazol, com

infecção experimental, reportaram cura micológica recebendo dosagem de 10mg/kg
33
após 56 dias de tratamento (MORIELLO & DEBOER 1995). COLOMBO et al., 2001,
utilizando pulsoterapia de itraconazol associada com terapia continua, demonstraram
a cura de 100 % dos animais em até 70 dias de tratamento. Manciatti et al., 1998,
descreveram dermatofitose em 15 gatos que ficaram curados com dosagens de 1,5-
3,0 mg/kg após 15 dias de terapia. Alguns autores citam o fluconazol como efetivo
no tratamento de infecções micóticas. Esses relatos, entretanto, resumem-se a
aspergiloses, criptococcose ou ainda blastomicoses em cães, ou seja, são
freqüentemente utilizados em micoses profundas (BOSSCHE et al., 2003). Nagino et
al., 2000, por sua vez, em estudos comparativos da eficácia de itraconazol e
fluconazol em quadros de dermatofitoses, utilizando cobaias como modelo, sugerem
que o fluconazol poderá ser utilizado em tinhas causadas por T. mentagrophytes,
visto que, as dosagens utilizadas de itraconazol e fluconazol foram aproximadas e
eficazes.
As alilaminas, representadas pela terbinafina e naftifina, atuam inibindo a

biossíntese do ergosterol e têm se mostrado bastante eficazes no tratamento tópico
das dermatofitoses e candidíases. A terbinafina é um composto sintético, análogo da
naftifina, que desempenha uma atividade fungicida ou fungistática, dependendo do
microrganismo envolvido no processo mórbido (HEIT & RIVIERE, 1995; ABDEL-
RAHMAN & NAHATA, 1997).
As alilaminas inibem a enzima fúngica esqualeno epoxidase e, por

conseguinte, bloqueiam a biossíntese do ergosterol; bem como, induzem o acúmulo
tóxico de esqualeno na parede da célula fúngica (HEIT & RIVIERE, 1995; ABDEL-
RAHMAN & NAHATA, 1997).
A terbinafina, geralmente, é bem tolerada após administração tópica ou oral.

Em estudos comparativos, a incidência de efeitos adversos associados ao uso de
terbinafina, por via oral, foi inferior àquela observada com a griseofulvina e
semelhante ao itraconazol. Assim, suas manifestações indesejadas, mais comuns,
estão ligadas ao trato gastrintestinal, tais como: anorexia, náuseas, diarréia e
hepatotoxicidade. Em decorrência de sua baixa absorção sistêmica, os efeitos
34
colaterais da naftifina são mínimos, podendo surgir dermatite de contato, prurido,
vermelhidão e sensibilidade cutânea (ABDEL-RAHMAN & NAHATA, 1997).
A terbinafina surgiu como uma nova opção terapêutica para dermatofitoses

tanto em humanos como em animais (MILLANTA et al., 2000). Aste & Pau, (2004),
em estudos de efeito e tolerabilidade da terbinafina contra cepas de M. canis em 26
pacientes humanos durante 12 semanas, descreveram a cura em 84,6% dos
pacientes, sendo a tolerabilidade excelente, não demonstrando resultados anormais
no plano sanguíneo.
Na Micologia Veterinária, a terbinafina vem sendo usada, satisfatoriamente,

em experimentos em gatos com dermatofitose por M. canis, sendo os animais
curados ao longo do tratamento (MILLANTA et al., 2000; KOTNIK et al., 2001;
KOTNIK, 2002). Mancianti et al., (1999), trataram gatos com dermatofitose por M.
canis com terbinafina oral na dosagem de 30mg/kg por um período de duas
semanas, obtendo a cura micológica. Após três meses da parada de tratamento, 11
dos 12 gatos apresentaram a cura completa. Em outro estudo, utilizando baixas
doses de terbinafina (8,25mg/kg/dia por 21 dias), esta foi efetiva contra cepas de M.
canis da pelagem de gatos assintomáticos (CASTONON – OLIVARES et al., 2001).
2.2 Resistência fúngica
Diante do pequeno arsenal antifúngico associado à má aplicação dos

medicamentos, especialmente na medicina veterinária, vêm sendo relatados na
literatura casos de possíveis mecanismos de resistência dos fungos. A resistência a
drogas é considerada o principal fator responsável pela dificuldade de erradicação
de tais infecções (FACHIN et al., 1996, BRADLEY et al., 1999, FACHIN et al., 2001).
Sidrim & Rocha, (2004), por sua vez, relataram que a refratariedade ao tratamento
pode estar associada à grande adaptação do fungo ao hospedeiro, o que se reflete
na sua capacidade de burlar a ação da droga.
A resistência a drogas antifúngicas pode ser induzida, in vitro, por vários

agentes mutagênicos (FACHIN et al., 1996, FACHIN et al., 2001). Adicionalmente,
algumas drogas podem induzir resistência, in vivo, por meio da administração de
35
sub-dosagens com seleção de linhagens resistentes, contribuindo, assim, para a
persistência da infecção fúngica (BRADLEY et al., 1999).
A ocorrência de dermatofitoses refratárias também pode estar associada ao

tratamento inadequadamente empregado. Dentre os principais fatores concorrentes
para uma resposta terapêutica falha, destacam-se: (1) não-adesão ao tratamento;
(2) absorção inadequada da droga; (3) degradação da droga por enzimas
microssomais; (4) antagonismo farmacológico; e (5) baixa concentração da droga no
estrato córneo (JONES, 1990).
Mukherjee et al., (2003), relataram a resistência de cepas de T. rubrum a

terbinafina, bem como, a outras drogas inibidoras da enzima esqualeno epoxidase,
tais como naftifina e butenafina. Os autores concluíram que tais cepas haviam
desenvolvido um mecanismo de resistência que envolvia mutações no gene que
codifica a enzima esqualeno epoxidase, visto que tais cepas eram sensíveis a
griseofulvina e a derivados azólicos.
A resistência a drogas antifúngicas tem estimulado a introdução de triazólicos

em triagens clínicas. Muitas drogas como posaconazol e ravuconazol, têm se
mostrado ativas em ensaios in vivo e in vitro, contra cepas leveduriformes e
filamentosas, resistentes a itraconazol e fluconazol. Estas drogas de uma maneira
ou outra, entretanto, vão agir sempre no mesmo sítio, ou seja, na enzima 14-.
demetilase. Diante disto, pesquisas são desenvolvidas com equinocandina
(caspofungina, micafungina e V-equinocandinas), as quais atuariam na inibição da
síntese da parede celular, sendo sua ação resultante da inibição da enzima glucan
VLQWHWDVH $ DWLYLGDGH GHVWDV GURJDV HP PRGHORV DQLPDLV H HP WULDJHQV
clínicas sugere que estas não seriam tóxicas e poderiam ser administradas
parenteralmente, engrandecendo cada vez mais o armamento antifúngico
(KONTOYIANNIS & LEWIS, 2002).
A maioria dos autores concorda, entretanto, com a idéia de que a indução de

variantes resistentes a antifúngicos é um fenômeno raro, quando comparado à
dinâmica bacteriana. Tais dados podem ser justificados pelo tipo de reprodução
assexuada encontrada em tais microrganismos, não sendo relatada a presença de
36
elementos genéticos, que codifiquem resistência, que possam ser transferidos de um
individuo a outro. Finalmente, a maioria das drogas atua na síntese da membrana
plasmática ou diretamente nesta, sendo possível que mutações que interfiram na
interação da droga também acarretem alterações no crescimento fúngico ou na sua
própria patogenicidade (COLOMBO & ALVES, 2004).
2.3 Biologia Molecular como importante ferramenta da Micologia
Há uma ou duas décadas, quando os métodos de Genética Molecular já

estavam sendo vigorosamente aplicados ao estudo de vírus, de patógenos
bacterianos e de parasitas eucarióticos, parecia haver uma lentidão na sua utilização
no estudo de fungos patogênicos. Desde então, ocorreram muitas mudanças e
atualmente assistimos à sua aplicação crescente na área de micologia. De modo
aparentemente irreversível, implanta-se uma verdadeira micologia molecular na
busca de respostas a questões pertinentes em todos os grandes tópicos de
taxonomia, diagnóstico, subtipagem e epidemiologia, desenvolvimento de novas
drogas e, ainda mais recentemente, assistimos à aplicação de abordagens
moleculares ao estudo da patogênese em fungos infecciosos (CISALPINO
&TRAVASSOS, 2002)
Na Micologia, a incorporação de técnicas de Biologia Molecular ocorreu

inicialmente na década 1960, com o propósito de entendimento de mecanismos
genéticos básicos em organismos “modelos”, tais como Saccharomyces cerevisiae e
Schizosaccharomyces pombe (BECHET et al, 1965; BOSTOCK, 1969). O progresso
inicial desses estudos estimulou a aplicação de técnicas moleculares em diversos
campos da Micologia, principalmente na área médica, em virtude da sua ligação
direta com os problemas de saúde-pública. O despertar de novas estratégias de
estudo de problemas até então insolúveis, relacionados basicamente ao
entendimento dos vários aspectos da relação parasito-hospedeiro, permitiu, também,
melhorias no diagnóstico laboratorial das micoses.
Diversos estudos ressaltam a importância da análise genética entre os

isolados de uma mesma espécie, a fim de melhor entender a dinâmica do processo
infeccioso e monitorar a emergência de linhagens resistentes a drogas (SOLL,
37
2000). Dentre esses estudos, as análises de fingerprints são relevantes para
fornecerem informações sobre as diferenças e semelhanças genômicas que podem
ser utilizadas também em estudos envolvidos com a caracterização de cepas,
linhagens, entre outras. Dentre as diversas técnicas de Biologia Molecular
empregadas na obtenção de fingerprinting genômicos de várias espécies fúngicas,
destacam-se: cariotipagem por eletroforese em campo pulsatil – PFGE; análise do
polimorfismo de tamanho dos fragmentos de restrição - PCR-REA; e amplificação
aleatória de DNAs polimórficos – RAPD (BRADLEY et al., 1999, CALIGIORNE et al.,
1999; SOLL, 2000, GUPTA et al., 2001, SHIN et al., 2001; JIN et al., 2004). Tanto a
PCR-REA como RAPD tem reação em cadeia da polimerase (PCR) como ponto de
partida.
A introdução da técnica de PCR revolucionou a pesquisa acadêmica e o

diagnóstico laboratorial das micoses. A identificação de patógenos pode ser
realizada independentemente do cultivo, abreviando, assim, o tempo de liberação do
exame e diminuindo resultados falso-negativos. Diversos artigos mostraram a
aplicação da técnica para a identificação de patógenos implicados em micoses
superficiais estritas, subcutâneas e dermatofitoses por meio da técnica de PCR
(MAKIMURA et al., 1994; TURIN et al., 2000; FAGGI et al., 2001)
Faggi et al., 2001, utilizando a técnica de PCR com único primer (GACA)4,
amplificaram o DNA de cepas dermatofíticas (M. canis, M. gypseum, T. ajelloi e
Epidermophyton floccosum) e caracterizaram os perfis, não observando diferenças
intra-específicas. Ademais, foram identificados três perfis genotípicos para as
diferentes variedades de T. mentagrophytes nesse estudo. Nessa análise, foram
examinadas 53 cepas de M. canis isoladas de cães, gatos e humanos, com e sem
presença de lesões clínicas, sendo observado o mesmo perfil genotípico
independentemente de qualquer situação.
Na técnica de PCR-REA, segundo Ferreira & Grattapaglia (1998), regiões

do genoma com tamanho entre 500 e 3000 pares de bases, correspondendo a
seqüências gênicas completas ou parciais, são inicialmente amplificadas mediante
reações de PCR. Em seguida, sítios específicos de 4 a 8 pares de bases, presentes
nos “amplicons”, são reconhecidos e clivados enzimaticamente por endonucleases
38
de restrição. A presença ou ausência desses sítios pode variar entre espécies
diferentes de microrganismos, gerando, assim, polimorfismos de tamanho dos
fragmentos de restrição (GUILLOT et al., 2000; GUPTA et al., 2000).
Dessa maneira, a análise de restrição dos fragmentos amplificados pela

técnica de PCR permite evidenciar variações genéticas entre populações diferentes,
e, até mesmo, entre indivíduos de uma mesma população. Pelo fato de revelar
polimorfismos, a técnica tem sido escolhida para diferenciação de espécies fúngicas
que compartilham grande homologia genética e morfológica. Um bom exemplo são
as sete espécies do gênero Malassezia, que compreendem organismos de laboriosa
identificação laboratorial identificadas por PCR e utilização de enzimas de restrição
(GUILLOT et al., 2000; GUPTA et al., 2000).
Velegraki et al.(1999), demonstraram que por meio de PCR-REA dos ITS

1 e 4, foi possível diferenciar cepas de Candida albicans de C. tropicalis, bem como
Cryiptococcus neoformans de Cryptococcus não neoformans (ambas após
tratamento do amplicon com enzima de restrição MspI) e diferenciação de cepas de
Penicillium e Aspergillus (com enzima de restrição Eco RI). Esses resultados foram
considerados valiosos, visto que esses fungos podem ser identificados a partir de
espécimes clínicos, levando a uma rapidez maior no diagnóstico, principalmente em
micoses profundas.
Makimura et al., (1999), utilizando as regiões ITS 1 de fungos dermatofíticos,

sequenciaram estas regiões, diferenciando assim cepas de T. rubrum, M. canis, T.
tonsurans, T. mentagrophytes e T. violaceum que morfologicamente não foram
possíveis de identificação, pois possuíam características atípicas. Esta técnica além
de esclarecer dúvidas impossíveis de desvendar por fenotipagem, ainda foi
desenvolvida com extrema rapidez, em torno de 2 a 3 dias.
A técnica de RAPD, por sua vez, é considerada o método de fingerprinting –

(impressão digital) genético mais utilizado em estudos com fungos patogênicos
(SOLL, 2000). Casos de dermatofitoses crônicas ou recidivantes podem estar
associadas a re-infecções com diferentes linhagens de microrganismos (BRADLEY
et al., 1999; ELLIS et al., 2000).
39
A técnica de RAPD foi inicialmente desenvolvida por Williams et al., (1990), e
baseia-se na detecção de polimorfismos genéticos, possuindo o padrão de herança
mendeliana. São utilizados diferentes oligonucleotídeos com poucos pares de bases
e seqüência arbitrária em reações de PCR de baixa estringência, formando um
padrão reprodutível de bandas amplificadas específicas para cada indivíduo. A
RAPD é utilizada em distintas abordagens, incluindo mapeamento genético,
detecção a diversidade genética entre linhagens de mesma espécie, epidemiologia
molecular e análise de relações taxonômicas (WELSH et al., 1995; SOLL, 2000). O
sucesso da ampla utilização da técnica de RAPD reside na sua simplicidade e
rapidez de execução, utilização de quantidades mínimas de DNA e necessidade de
poucos equipamentos e reagentes usuais em laboratórios de Biologia Molecular
(CALIGIORNE et al., 1999)
A RAPD foi utilizada com sucesso no estudo de diversos fungos de

importância médica, tais como: Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C.
krusei, Aspergillus fumigatus, A. flavus, Cryptococcus neoformans, Histoplasma
capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis (SOARES et al.,
1995; DE MEDEIROS et al., 2001; RATH et al., 2002; DASANAYAKE &
SAMARANAYAKE, 2003; BOLDO et al., 2003; HAHN et al., 2003).
Caligiorne et al., (1999), em estudos com fungos demáceos causadores de

cromoblastomicose e feohifomicose oriundas de regiões geográficas diferentes, por
intermédio de RAPD, demonstraram que cepas antes classificadas em diferentes
espécies, tais como a Fonsecaea pedrosoi e F. compacta, possuíam padrões
genéticos muito semelhantes, levantando hipóteses de que tais fungos poderiam ser
variantes de uma mesma espécie. Kim et al., (1999), por sua vez, analisando cepas
de T. tonsurans de diferentes regiões geográficas demonstraram que tais cepas
eram geneticamente homólogas, por meio de RAPD utilizando o primer (OPAO-15)
independentemente das características morfológicas e fisiológicas que
apresentaram. Jin et al., (2004), analisando geneticamente cepas de M. canis
isoladas de crianças com Tinea capitis e do meio ambiente no qual conviviam,
através de sequenciamento da região ITS 1 e ITS 2 do rDNA, RAPD (com primers
OPI 07 e OPK 20) e amplificação da região NTS do rDNA, demonstraram
40
similaridades genéticas nos isolados, sendo considerados provavelmente de mesma
origem.
Kim et al., (2001), analisando cepas de T. mentagrophytes de origem humana

e de animal, por meio de RAPD e fenotipagem, demonstraram que, em diferentes
macromorfológias (algodonosas, pulverulentas e persicolor), as cepas apresentaram
idênticos padrões genéticos. Por sua vez, as que possuíam colônias granulares
apresentaram um perfil diferente, comparado com os anteriores. Já os isolados
animais apresentaram cinco diferentes padrões, sendo justificados, por não serem
oriundos de isolamento primário, e sim de estoques de microrganismos, interferindo
diretamente na grande diversidade genética dos mesmos. Os autores observaram
também padrões de bandas que possibilitavam a diferenciação de cepas animais e
humanas.
41
3 OBJETIVOS
As dermatofitoses consistem de importantes manifestações clínicas que

acometem homens e animais. Apesar do aumento do número de casos de
dermatofitoses em todo o mundo, poucos estudos são realizados com animais
domésticos que apresentam doenças dermatofíticas. No Brasil, dados sobre a
incidência e características clínicas de tais infecções, bem como estudos fenotípicos
e genéticos de cepas de M. canis são praticamente inexistentes. Nesta tese, por
meio da fenotipagem, de testes de sensibilidade e genotipagem de cepas de M.
canis, foram investigadas características peculiares desse microrganismo, visto que,
tais cepas são de grande importância nas dermatofitoses em cães e gatos.
3.1 Objetivo geral

Avaliar as características fenotípicas e padrões gênicos de cepas de M. canis
isoladas de cães e gatos.
3. 2 Objetivos específicos
1 Descrever as características fenotípicas, com base em estudos de

macromorfologia e micromorfologia de M. canis em isolamentos primários;
2 analisar o perfil genético dos vários isolados de M. canis pela técnica de

RAPD (Random Amplification DNA Polymorphism);
3 evidenciar, mediante PCR-REA (Polymerase Chain Reaction – Restriction

Enzyme Analysis), algum tipo de variação genética entre as cepas de M. canis;
4 realizar testes de susceptibilidade, por meio do teste de microdiluição em

caldo, em cepas de M. canis frente a griseofulvina, cetoconazol, itraconazol e
fluconazol;
5 correlacionar o padrão de sensibilidade antimicrobiano das cepas de M.

canis, com suas características fenotípicas e genotípicas.
42
4 METODOLOGIA
4.1. Seleção das amostras e etapas da pesquisa
A presente pesquisa foi desenvolvida em quatro etapas. A primeira consistiu

da fenotipagem das cepas de M. canis isoladas de cães e gatos com quadros
clínicos sugestivos de dermatofitose da região Metropolitana de Fortaleza. A
fenotipagem foi delineada através de exame direto, descrição da macro e
micromorfologia da colônia fúngica, em diversos meios de cultura, sendo finalizada
com a utilização de provas bioquímicas. A segunda etapa foi a análise das referidas
cepas através da técnica de PCR-REA utilizando quatro endonucleases e RAPD
com o primer OPK 17. Vale salientar que nestas duas etapas foram incluídas 20
cepas de M. canis, as quais podem ser visualizadas, na tabela 1, que aponta as
características do hospedeiro e o número de coleção de cada cepa. Na tabela
2 podem ser visualizadas, com detalhes, as 22 cepas de M. canis utilizadas nos
testes de sensibilidade antifúngica (terceira etapa deste estudo). Por fim, a quarta
etapa consistiu da seleção aleatória de 10 cepas, para análise por RAPD com os
primers OPA 01; OPA 02; OPA 03; OPA 04; OPA 05 (tabela 2). Para a melhor
compreensão, todas estas etapas serão detalhadamente discutidas a partir do item
4.2.
43
TABELA 1: Cepas de M. canis utilizadas na fenotipagem, PCR-REA e RAPD
utilizando o primer OPK- 17
sexo espécie raça idade Número de coleção

M humana 33a CEMM 01-3-156
F canina doberman 1a6m CEMM 01-3-162
F felina siamesa 2m CEMM 01-3-163
F felina siamesa 1a 2m CEMM 01-3-166
M felina SRD ?? CEMM 01-3-168
F canina poodle 11 m CEMM 01-3-171
F canina sheepdog 8m CEMM 01-3-173
F felina SRD 5m CEMM 01-3-172
F felina persa 11m CEMM 01-3-174
M canina yorkshire 6a CEMM 01-3-175
F canina poodle 2a 4m CEMM 01-3-177
F canina yorkshire 1a CEMM 01-3-178
M canina cocker 2a CEMM 01-3-179
M canina rottweiller 2a 4m CEMM 01-3-180
F canina schinauzer 5m CEMM 01-4-101
M felina persa 6m CEMM 01-4-110
F canina pinscher 4a CEMM 01-4-111
* As cepas em negrito foram isoladas de um mesmo animal em diferentes épocas

* a = anos; m =: meses
* SRD: Sem raça definida
44
TABELA 2: Cepas de M. canis (n=22) utilizadas nos testes de sensibilidade in vitro a
drogas e RAPD utilizando os primers OPA 01; OPA 02; OPA 03; OPA 04; OPA 05
sexo espécie raça idade Número de coleção

M felina SRD ?? CEMM 01-3-168
M canina yorkshire 2a 4m CEMM 01-3-169
F canina poodle 1a CEMM 01-3-170
F canina poodle 11 m CEMM 01-3-171
F felina SRD 5m CEMM 01-3-172
F canina sheepdog 8m CEMM 01-3-173
F felina persa 11m CEMM 01-3-174
F canina poodle 2a 4m CEMM 01-3-177
F canina yorkshire 1a CEMM 01-3-178
M canina cocker 2a CEMM 01-3-179
F canina SRD 3a CEMM 01-4-102
F canina yorkshire 1a 1m CEMM 01-4-104
F canina poodle 6a CEMM 01-4-106
M canina poodle 6m CEMM 01-4-109
F canina pinscher 4a CEMM 01-4-111
M felina SRD 2a 5m CEMM 01-4-112
F canina yorkshire 13a 6m CEMM 01-4-113
M felina SRD 1a7m CEMM 01-4-115
*As 10 cepas em negrito foram escolhidas aleatoriamente para os testes de RAPD

* a = anos; m =: meses
* SRD: Sem raça definida
45
4.2 Identificação de dermatófitos
4.2.1 Exame direto
Para análise do exame direto, utilizou-se hidróxido de potássio (KOH) em

concentração de 30%, sendo sua interpretação feita a partir da ausência ou
presença de elementos fúngicos. Em caso de parasitismos, em pele e unha, por
dermatófitos, a presença de hifas artroconidiadas fundamentava o diagnóstico. Em
relação ao pêlo, o parasitismo foi descrito a partir do tamanho do artroconídio e se
estava por dentro ou por fora do pêlo.
4.2.2 Caracterização fenotípica – Macro e micromorfologia
Esta foi preparada simultaneamente ao exame direto, em que alíquotas de

pêlos e escamas de pele foram semeadas nos meios de cultura. Depois de
semeados, os tubos foram incubados, entre 25ºC e 30ºC, durante 10 dias. No
momento em que as macrocolônias foram detectadas, seguiu-se para a análise das
características macromorfológicas, sendo levados em consideração o relevo e a
textura, bem como a presença ou ausência de pigmento.
Durante a presente análise, a macromorfologia de M. canis foi analisada em

ágar Sabouraud dextrose e em ágar batata dextrose, após 10 dias de incubação. A
textura e o relevo das colônias foram relatados conforme Sidrim & Rocha, 2004, bem
como a presença e ausência de pigmento foram descritas.
4.2.3 Diferenciação microscópica das colônias
O estudo micromorfológico foi feito em três etapas: 1) a partir do isolamento

primário em ágar Sabouraud dextrose; 2) a partir de colônias crescidas em ágar
arroz e ágar lactrimel; 3) Microcultivo em ágar batata. As duas primeiras etapas
foram preparadas com uma pequena alíquota da colônia retirada do ágar e montada
entre lâmina e lamínula com corante lactofenol azul-algodão. A montagem foi
observada em microscopia óptica em objetiva de 40X. Nestas preparações, podem
ser visualizadas estruturas de reprodução (macroconídios e microconídios)
produzidas em meios utilizados em rotina micológica, tais como o ágar Sabouraud, e
46
em meio enriquecido com mel e farinha de trigo (ágar lactrimel) e em meio
preparado com grãos de arroz cozidos (ágar arroz). Tais meios foram escolhidos
com o intuito de avaliar o comportamento das cepas de M. canis nos diversos meios
de cultura. A terceira etapa cumprida foi padronizada por Kern e Blevins (1997). Esta
técnica foi preparada em placas de Petri esterilizadas, contendo montagem com três
lâminas, na qual se deposita um pequeno bloco de ágar batata dextrose de 1cm x
1cm. Nas extremidades desse bloco, foram semeadas alíquotas de colônias do
fungo e delicadamente cobriu-se essa montagem com lamínula estéril, mantendo-se
este preparado em ambiente úmido, durante sete dias (Figura 1). Após o período de
incubação, a temperatura ambiente, a lamínula foi retirada com o auxílio de uma
pinça e montada com lactofenol azul-algodão em lâmina, sendo, posteriormente,
observada em microscopia óptica na objetiva de 40X. Tais preparações foram de
fundamental importância para promover o estudo microscópico da disposição das
estruturas de ornamentação e ao longo da hifa.
Figura 1: Microcultivo em lâmina
A quantificação dos macrocondios e microconídios de M. canis foi feita de

acordo com a descrição a seguir: no caso das cepas estéreis, ou seja, isenta de
macro e microconídios, a análise era finalizada. Por outro lado, quando eram
visualizados macroconídios, estes eram quantificados em 0 - 10, 10 - 50 ou > 50
macroconídios por 10 campos na objetiva de 10x. A quantificação de microconídios
seguiu a mesma regra estabelecida para os macroconídios.
Após a quantificação de macroconídios, estes foram mensurados com

retículo, quanto ao tamanho, podendo variar de 0 µm – 50 µm ou > 50 µm, assim
como quanto a largura variando de 0 µm – 12.5 µm ou > 12.5 µm. Todas essas
características foram visualizadas na magnitude de 40x (Figura 2).
47
Figura 2: Macroconídio de M. canis medido por meio de retículo acoplado à objetiva
de 40x de aumento
4.2.4 Prova de requerimentos vitamínicos
A prova de requerimentos vitamínicos foi realizada no intuito de descrever as

exigências nutricionais das diversas cepas de M. canis, para posterior comparação
destas com a literatura. Os meios de cultura utilizados foram enriquecidos com ácido
nicotínico, tiamina, histidina e inositol, sendo a base do ágar T1 ao T5 a caseína e
do ágar T6 e T7 o nitrato de amônia. Tais meios serão detalhados a seguir: T1 (ágar
base caseína), T2 (ágar base caseína com inositol), T3 (ágar base caseína com
tiamina e histidina), T4 (ágar base caseína com tiamina), T5 (ágar base caseína com
ácido nicotínico), T6 (ágar base nitrato de amônia) e T7 (ágar base nitrato de amônia
com histidina) (Figura 3).
Figura 3: Provas de requerimentos vitamínicos
48
4.3 Estocagem e recuperação das cepas da micoteca para testes
genotípicos
Após a análise macro e micromorfológica, as cepas foram posteriormente

estocadas segundo metodologia de Brilhante et al., 2004b, em ágar batata dextrose ,
acrescido com DMSO 10% à -20ºC, e em salina com óleo mineral a 25ºC, fazendo
parte da Micoteca do Centro Especializado em Micologia Médica da UFC. A
estocagem é feita rotineiramente, sendo necessária para manter as células viáveis
sem contaminação para posteriormente serem submetidas à extração do DNA.
A recuperação das cepas ocorreu após três meses de estocagem, onde as

cepas de M. canis que se encontravam em ágar batata dextrose acrescido com
DMSO 10% à -20º C foram descongeladas e um pequeno fragmento da colônia foi
repicado para tubos de ensaio contendo ágar batata dextrose.
4.4 Extração de DNA genômico
A extração de DNA foi realizada, segundo Talbot, (2001), de culturas fúngicas

retiradas de ágar batata dextrose e incubadas em caldo BHI por aproximadamente
10 dias, a 28ºC. Após esse período, a massa miceliana foi lavada com solução
salina 0,9% para remoções do meio de cultura e metabólitos extracelulares (Figura
4A).
O material obtido foi incubado com tampão CTAB (CTAB 2%, Tris 100mM,
('7$ P0 1D&O 0 -Mercaptoetanol 0,2%) na proporção 1:10 (p/v) por 2
horas a 65°C (Fig. 4B). Em seguida, a agitação do material foi feita por um período
de aproximadamente 12 horas. O protocolo de extração de DNA, com CTAB, baseia-
se na solubilização das membranas celulares, com formação de um complexo
CTAB-DNA, o qual possibilita sua posterior precipitação diferencial. O EDTA, por sua
+2
vez, foi utilizado como agente quelante de cátions como Mg e Ca+2, inibindo a
ação de DNAases, as quais usam esses metais como co-fatores. Por fim, o -
Mercaptoetanol foi utilizado por ser considerado um potente agente redutor que
desnatura peroxidases e polifenoloxidases, impedindo a ação danosa dessas
enzimas sobre o DNA (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998)
49
A B
Figura 4: Extração de DNA. A – Micélio de cepas de M. canis após lavagem com

solução salina. B – Adição de detergente CTAB e -mercaptoetanol .
Após esse período, a mistura foi submetida a uma extração de proteínas por
meio de solventes orgânicos. A purificação foi feita com uma solução de clorofórmio
e álcool iso-amílico (24:1 v/v) e, após centrifugação (5000 rpm por 20 minutos), foi
feita a separação da fase aquosa da fase orgânica. Esses solventes desnaturam
proteínas que ficam na interface, enquanto o DNA, RNAs e carboidratos, se mantêm
na fase aquosa. Logo, a fase superior aquosa contendo DNA foi transferida para
tubos de polipropileno estéreis (Figura 5).
Figura 5: Extração de proteínas através de solventes orgânicos A: Fase aquosa

contendo DNA. B – Proteínas em interface.
Após a etapa de extração de proteínas, o DNA foi precipitado com

isopropanol, separando-o dos RNAs e carboidratos. O complexo CTAB-DNA foi
precipitado com isopropanol (2/3 vol) com incubação a -20ºC, por aproximadamente
50
12 horas. Após centrifugação por 15 minutos a 1500 rpm, o precipitado obtido foi
ressuspendido em NaCl (3M) para dissociação do complexo DNA-CTAB.
Logo após, o material foi precipitado com etanol (70%) para remoção de sais
que co-precipitam com o DNA. O DNA precipitado e seco de cada amostra foi
dissolvido em água destilada ultrapura (200O H HVWRFDGR D -20ºC para análises
posteriores.
4.5 Quantificação do DNA
As amostras de DNA foram quantificadas por espectofotometria. As leituras

foram feitas em comprimento de onda de 260nm e 280nm. A determinação da
concentração foi baseada na relação de absorbância a 260nm, pelo inverso da
diluição utilizada, sendo 1DO260 = 50ng/µl (SAMBROOK et al., 1989). A
quantificação era considerada satisfatória quando a leitura fornecia valores de
aproximadamente 1.8 e 2.0, visto que esta quantificação era relativa à pureza dos
ácidos nucléicos.
4.6 Reação de RAPD
As reações de RAPD foram realizadas de acordo com Bradley et al., 1999,

seguindo a tabela 3.
TABELA 3: Reagentes e concentrações utilizados na reação de RAPD
Reagentes Concentração Final

Tampão Tris-HCl pH 8,3 (Promega, WI, USA) 10 mM L-1
KCl (Promega, WI, USA) 50 mM L-1
MgCl2 (Promega, WI, USA) 2 mM
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (Invitrogen, SP, Brazil) 0,5 mM
Primer 10 pmol
Taq polimerase (Promega, WI, USA) 1U
Os primers utilizados foram oriundos da empresa Invitrogen, SP, Brasil na
concentração de 10pmol. Foram utilizados seis primers: OPA 01 (5'-CAGGCCCTTC-
3'); OPA 02 (5'-TGCCGAGCTG-3'); OPA 03(5'-AGTCAGCCAC-3'); OPA 04 (5'-
51
AATCGGGCTG-3'); OPA 05 (5'-AGGGGTCTTG-3') OPK-17 (5´-CCCAGCTGTG-3`),
sendo as reações feitas em volumes de 10µL.
Foram adicionados aos microtubos de reação, contendo 10 O O GH '1$
genômico de cada amostra, na concentração de 20 ng/O&RPRFRQWUROHSRVLWLYRGH
cada reação, foi utilizado o DNA genômico de uma amostra de M. canis pertencente
a culturas oriundas de humanos.
As reações de amplificação foram realizadas em termociclador automático

nas seguintes condições:
(1) desnaturação inicial: 94 ºC – 4 minutos;

(2) desnaturação 94 ºC – 20 segundos;
(3) anelamento: 35 ºC – 1 minuto;
(4) extensão: 72 ºC – 1 minuto;
(5) repetição das etapas (2), (3), (4) por 45 vezes;
(6) extensão final: 72 ºC – 10 minutos.
Os amplicons obtidos foram visualizados em géis poliacrilamida a 6% e em

seguida, estocados a 4ºC.
4.7 Eletroforese em gel de poliacrilamida
Os produtos das reações de RAPD foram analisados em géis de

poliacrilamida {estoque: acrilamida / bis-acrilamida 30%} a 6% em TBE 1X (Fig. 6).
Alíquotas de 3 OGHFDGD amplicon foram misturadDVD OGHWDPSão de amostra
então submetido a eletroforese a 100 V por aproximadamente 1 hora. Foi utilizado
marcador de peso molecular de 100 pb (Ladder DNA 100 pb – Amersham
Biosciences- USA).
52
Figura 6: Aplicação da amostra em gel de poliacrilamida
A visualização do material separado por eletroforese foi realizada de acordo

com método descrito por Sanguinetti et al., 1994, relatado na seqüência:
O gel de poliacrilamida foi suavemente lavado com a solução fixadora (etanol 15%,
ácido acético 0,5%) – por 5 minutos sob agitação; posteriormente, o gel foi
cuidadosamente retirado da solução fixadora e mergulhado na solução oxidante
(nitrato de prata 0,2% em solução fixadora) – por 10 minutos sob agitação; após este
intervalo, o gel foi lavado em água destilada por 10 segundos; finalmente, o gel foi
mergulhado em solução reveladora (NaOH 0,75M, formaldeído 0,1M) até
visualização das bandas.
4.8 Reação de PCR e REA
A amplificação de ITS 1 e ITS 2 das regiões ribossomais foi feita a partir

de iniciadores ITS-1 (5´-TTCGTAGGTGAACCTGC-3´) e ITS-4 (5´-
TCCTCCGCTTATTGATAT-3´). A reação foi feita em mistura de 25 µl, sendo
amplificado fragmento único, correspondendo às regiões hipervariáveis ITS1 e ITS2,
além da subunidade ribossômica 5,8S do rDNA, as quais possuem uma relativa
conservação da seqüência nucleotídica em fungos. Esta reação foi realizada de
acordo com o protocolo descrito por White et al., 1990.
Inicialmente, foi obtida uma mistura livre de DNA, denominada pré-mix,

contendo água ultrapura estéril, tampão de amplificação 10X, solução estoque de
dNTP, oligonucleotídeos iniciadores e a enzima Taq polimerase. Alíquotas do pré-
mix, sem DNA, submetidas às mesmas condições descritas acima, foram utilizadas
53
como controle negativo da reação. As concentrações e volumes dos reagentes
utilizados estão discriminados abaixo na tabela 4:
Tabela 4: Reagentes e concentrações utilizadas na reação de PCR

Reagentes Concentração Final
Tampão Tris-HCl pH 8,3 (Promega, WI, 10 mM L-1
USA)
MgCl2 (Promega, WI, USA) 1.5 mM
dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 250 µM
Primers (Invitrogen, SP, Brazil) 2 pmol
Taq polimerase (Promega, WI, USA) 1U
Fonte: White et al.,1990
Aos tubos de reação foram adicionados 3O GH '1$ JHQ ômico de cada
amostra, na concentração de 10 ng/O &RPR FRQWUROH SRVLWLYR GH FDGD UHDção foi
utilizado o DNA genômico de uma amostra de M. canis pertencente a culturas
oriundas de humanos.
As reações de amplificação foram realizadas em termociclador automático
nas seguintes condições:
desnaturação inicial: 94 ºC – 4 minutos;
desnaturação 94 ºC – 1 minuto;
anelamento: 56 ºC – 30 segundos;
extensão: 72 ºC – 1 minuto;
repetição das etapas (2), (3), (4) por 35 vezes; e
extensão final: 72 ºC – 5 minutos.
O material amplificado foi visualizado em géis de poliacrilamida a 6% para
verificação da reação e posteriormente estocado a 4°C.
A reação de PCR-REA foi feita de acordo com protocolo descrito por

Caligiorne et al.,1999. Os “amplicons” de cada amostra foram diluídos na proporção
de 1:10 em água ultrapura estéril e digeridos com as seguintes endonucleases: Rsa
I, Sau 3A, Dde I e Eco RI (Gibco- BRL, Grand Island, NY, USA). Os tubos de reação
encerraram 0,5 µl de cada enzima (0,3 unidades /µl), 2 µl do tampão de reação e 10
54
µl do DNA previamente diluído. Cada reação foi incubada a 37°C por 3 horas; as
amostras digeridas foram analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6%.
4.9 Teste de sensibilidade antimicrobiana in vitro
O teste de sensibilidade in vitro analisou a atividade dos antifúngicos:

griseofuvina, cetoconazol, itraconazol e fluconazol. Este procedimento foi realizado
de acordo com a preconização do National Committee for Clinical Laboratory
Standards (NCCLS), baseado no documento M38-P segundo Fernandez-Torres et
al., 2002a, tendo sido utilizada a técnica de microdiluição, com algumas
modificações, tais como, a solução estoque de fluconazol foi diluída em água
destilada, a leitura da transmitância por especfotometria foi de 95%, bem como a
incubação foi feita à 35ºC.
O teste antimicrobiano foi seguido por meio do protocolo segundo Jessup et

al. (2000) e Fernandez-Torres et al. (2002a). A Candida parapsilosis (ATCC 22019)
e C. krusei (ATCC 6528) foram incluídas como controles de qualidade.
Após o repique das cepas de M. canis em ágar batata dextrose (meio que
favorece a produção de conídios), os tubos foram incubados por período de 10 dias
a temperatura de 28ºC. Após esse período, as culturas foram cobertas com 2 ml de
salina e com auxílio de pipeta de Pasteur foram feitas suspensões das mesmas. As
suspensões foram agitadas em vortex por 15s e lidas em 530 nm a transmitância de
95%. As suspensões contendo conídios e fragmentos de hifas foram diluídas com
RPMI 1640 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), ajustadas com MOPS - SIGMA
(Ácido 2- [N-morfolino] propanossulfônico) na diluição de 1: 5 - (Meio RPMI 1640
com L-glutamina, sem bicarbonato de sódio, pH: 7,0 com MOPS 0,165M). Ao final
desse procedimento, foi obtido um inóculo de, aproximadamente 5 x 104 UFC/ml
(JESSUP et al. ,2000; FERNANDEZ-TORRES et al., 2002a)
Após limpeza do fluxo laminar com álcool a 70% e manutenção de luz

ultravioleta por 15 minutos, as placas de microdiluição foram cuidadosamente
manipuladas. Estas placas tinham um controle estéril, ou seja, poços livres de
inóculo e de drogas. Estes poços tinham 200 µl de RPMI 1640 (Figura 7). Poços
55
com controle positivo, ou seja, com 100 µl de inóculo acrescidos de 100 µl de RPMI
1640 e, finalmente, poços para avaliação da sensibilidade, ou seja, com 100 µl de
RPMI 1640, acrescidos de drogas em diferentes concentrações e 100 µl inóculo
fúngico.
A B
Figura 7: Técnica de microdiluição em placa. A - Distribuição de RPMI e drogas

antifúngicas em diferentes concentrações; B – Microdiluição em caldo. A seta
demonstra a limpidez do poço, o qual detecta a parada de crescimento fúngico
As preparações das drogas e diluições foram feitas de acordo com protocolo de

Perea et al., (2001), sendo relatadas na tabela a seguir:
Tabela 5: Drogas antifúngicas e concentrações em RPMI utilizadas na pesquisa
Drogas Concentração estoque Concentrações em RPMI

Griseofulvina 3.200 µg/ml (diluído em DMSO 0,03 a 8 µg/ml
100%)
Cetoconazol 1.600 µg/ml (diluído em DMSO 0,03 a 16 µg/ml
100%)
Fluconazol 2.000 µg/ml (diluído em H2O 0,125 a 64 µg/ml
destilada)
Itraconazol 5.000 µg/ml (diluído em DMSO – 0,015 a 8 µg/ml
100%)
56
O teste foi feito em placas de 96 poços e incubados em estufa à 35ºC, sendo
a leitura feita após quatro dias, como recomendado por Jessup et al. (2000): Todas
as leituras foram visualmente feitas em duplicata, sendo os resultados analisados
estatisticamente.
A leitura da CIM foi feita com 80% de redução de turbidez comparada ao

tubo-controle livre de droga para cetoconazol, itraconazol e fluconazol e ausência de
crescimento (sem turbidez) para griseofulvina, conforme preconizado por Jessup et
al., 2000.
4.10 Análise Estatística
O estudo foi conduzido utilizando os testes não-paramétricos de Wilcoxon e

Friedman, adaptados para o uso de variáveis ordinais. O valor de p <0.05 foi
considerado significativo.
57
5. RESULTADOS
5.1. Análise macro e micromorfológica
Quanto ao exame direto, os espécimes clínicos positivos demonstraram o
parasitismo do tipo microspórico, bem como apresentavam artroconídios de
dimensão entre 3 a 7 µm. Do total de 20 amostras analisadas na fenotipagem, onze
se mostraram positivas na microscopia(Fig .8).
Figura 8: Exame direto do pêlo com KOH 30% mostrando artroconídios

microspóricos.
A partir da análise macromorfológica das 20 cepas analisadas em ágar

Sabouraud dextrose e em ágar batata dextrose, foram identificados quatro tipos de
colônias. As colônias foram classificadas como colônias: do tipo I - algodonosas
baixas, apiculadas com pigmento no reverso; tipo II - colônias algodonosas baixas,
apiculadas sem pigmento no reverso; tipo III - colônias algodonosas altas com
pigmento no reverso; e tipo IV - algodonosas altas sem pigmento no reverso. Na
figura 9 pode ser observada colônia de textura algodonosa baixa; colônia de textura
algodonosa alta; colônia com pigmento amarelo-canário no reverso e colônia sem
pigmento no reverso.
58
Não foi visualizada nenhuma cepa com colônia do tipo I em ágar Sabouraud,
sendo, contudo, encontradas 7, 3 e 10 cepas do tipo II, III e IV, respectivamente. Por
outro lado no ágar batata dextrose, foram identificadas 4, 7, 2 e 7 cepas dos tipos I,
II, III e IV, respectivamente (Tabela 6).
C
A
B
D
Figura 9: Macroscopia da colônia de M. canis. A - Colônia de textura

algodonosa baixa; B - Colônia de textura algodonosa alta; C - Colônia com pigmento
amarelo-canário no reverso; D - Colônia sem pigmento no reverso.
A menor quantificação de macroconídios (0-10) foi observada em ágar arroz e
ágar lactrimel, perfazendo um total de 9 e 6 cepas, respectivamente. O ágar lactrimel
foi o mais favorável para maior produção de macroconídios (>50), perfazendo um
total de 11 cepas (p<0,05). Quanto ao ágar Sabouraud dextrose, este não estimulou
a produção de macroconídios (p<0,05), tendo um total de 13 cepas com hifas
estéreis (Tabela 6).
A escala de 0-10 microconídios foi observada em 8 cepas no ágar arroz e 14 cepas

no ágar batata dextrose. O ágar lactrimel foi mais favorável para produção de
microconídios no intervalo de 0-10, perfazendo um total de 19 cepas. O ágar
59
Sabouraud manteve-se estável na produção de cepas com hifas estéreis (n=13)
(p<0,05) (Tabela 6) (Figura 10)
A C
B D
Figura 10: Quantificação de macroconídios. A – Cepa com hifas estéreis; B – Cepa

com 0-10 macroconídios; C – Cepa com 10-50 macroconídios; D – Cepa com > 50
macroconídios.
A morfologia de macroconídios considerada clássica, ou seja, fusiforme de
parede grossa, de M. canis foi visualizada em 4, 10, 15, 18 cepas em ágar
Sabouraud dextrose, ágar batata dextrose, ágar arroz e ágar lactrimel,
respectivamente. A morfologia de macroconídios anômalos não foi visualizada em
nenhuma cepa quando repicada em ágar arroz, sendo, contudo, observada em 5, 3
e 1 cepas em ágar batata dextrose, ágar Sabouraud dextrose e ágar lactrimel,
respectivamente (Tabela 7).
60
Macroconídios com dimensão maior do que 50 µm foram visualizados em 5,
14, 15 e 19 cepas em ágar Sabouraud dextrose, ágar arroz, ágar batata dextrose e
ágar lactrimel, respectivamente. Quanto à largura, o ágar batata, ágar arroz e ágar
lactrimel produziram maior quantidade de macroconídios maior que 12,5 µm
(p<0,05), perfazendo um total de 13, 15 e 18 cepas, respectivamente. O ágar
Sabouraud (p<0,05), além de favorecer a formação de hifas estéreis, produziu maior
quantidade de macroconídios menor que 12,5 µm, totalizando 6 cepas (Tabela 7)
(Fig. 11)
A B
Figura 11: Mensuração de macroconídios. A – Comprimento de

macroconídios (75P%– Largura de macroconídio (17,5P
Quanto às características fisiológicas, 100% das cepas foram positivas para
perfuração de pêlo in vitro, crescendo satisfatoriamente em meios suplementados
com tiamina, ácido nicotínico, inositol e histidina. A prova da urease foi positiva em
16 cepas do total de 20.
61
Tabela 6: Macromorfologia e quantificação de macro e microconídio de M. canis em diferentes meios de cultura
Macromorfologia Macroconídio por 10 campos em objetiva de 40x Microconídio por 10 campos em objetiva de 40x
Número de ágar ágar ágar ágar ágar ágar ágar ágar ágar Agar
coleção batata Sabouraud arroz batata Sabouraud Lactrimel arroz batata Sabouraud Lactrimel
01-3-156 I II 0-10 0 0 > 50 0-10 0-10 0 0-10
01-3-162 II IV 11-50 0-10 0-10 > 50 0-10 > 50 0-10 0-10
01-3-163 IV IV 0 0 0 0-10 0 0 0 0-10
01-3-164 IV IV 0-10 0-10 0 > 50 0-10 0-10 0 0-10
01-3-166 IV IV 0 0 0 0-10 11-50 0-10 0 0-10
01-3-167 IV IV 0-10 0-10 0 > 50 0-10 0-10 0 0-10
01-3-168 IV IV 0-10 0-10 0-10 0-10 0 11-50 0-10 0-10
01-3-171 III III 0 0 0 0-10 0 0 0 0-10
01-3-172 II II 0-10 0-10 0-10 0-10 0-10 0-10 0-10 0-10
01-3-173 I IV 0-10 11-50 0-10 > 50 0 0-10 0-10 0-10
01-3-174 II IV > 50 0-10 0-10 > 50 0-10 0-10 0-10 0-10
01-3-175 III III 0-10 0-10 11-50 0-10 > 50 > 50 0 0-10
01-3-176 I III 0 0 0 0 0 0 0 0
01-3-177 II IV 0-10 0-10 11-50 > 50 0 0-10 0-10 0-10
01-3-178 IV II 11-50 0-10 0 11-50 11-50 0-10 0 0-10
01-3-179 IV IV 11-50 0-10 0 > 50 0-10 0-10 0 0-10
01-3-180 II II > 50 0-10 0 > 50 0 0-10 11-50 0-10
01-4-101 I II 0 0-10 0 11-50 0 0-10 0 0-10
01-4-110 II II 0-10 0-10 0 > 50 11-50 0-10 0 0-10
01-4-111 II II > 50 11-50 0 > 50 0-10 0-10 0 0-10
Legenda: Tipo I- algodonosas baixas, apiculadas com pigmento; tipo II- colônias algodonosas baixas, apiculadas
sem pigmento; tipo III- colônias algodonosas altas com pigmento; e tipo IV- algodonosas altas sem pigmento
45
TABELA 7: Morfologia,largura e tamanho de macroconídios de M. canis analisados em diferentes meios de cultura
Morfologia de macroconídios Largura de macroconídios (P Tamanho de macroconídiosP
ágar ágar ágar ágar ágar ágar ágar ágar ágar ágar ágar ágar
Número de coleção arroz batata Sabouraud Lactrimel arroz batata Sabouraud Lactrimel Arroz batata Sabouraud Lactrimel
01-3-156 1 0 0 1 > 12,5 - - > 12,5 > 50 - - > 50
01-3-162 1 2 1 1 > 12,5 < 12,5 < 12,5 > 12,5 > 50 > 50 > 50 > 50
01-3-163 0 0 0 2 - - - > 12,5 - - - > 50
01-3-164 1 2 0 1 > 12,5 > 12,5 - > 12,5 > 50 > 50 - > 50
01-3-166 0 0 0 1 - - - > 12,5 - - - > 50
01-3-167 1 2 0 1 > 12,5 > 12,5 - > 12,5 > 50 > 50 - > 50
01-3-168 1 1 2 1 > 12,5 > 12,5 < 12,5 > 12,5 > 50 > 50 < 50 > 50
01-3-171 0 0 0 1 - - - > 12,5 - - - > 50
01-3-172 1 2 1 1 > 12,5 < 12,5 < 12,5 > 12,5 > 50 > 50 > 50 > 50
01-3-173 1 1 2 1 > 12,5 > 12,5 < 12,5 > 12,5 > 50 > 50 > 50 > 50
01-3-174 1 1 2 1 > 12,5 > 12,5 > 12,5 > 12,5 > 50 > 50 > 50 > 50
01-3-175 1 1 1 1 > 12,5 > 12,5 < 12,5 < 12,5 < 50 > 50 - > 50
01-3-176 0 0 0 0 - - - - - - - -
01-3-177 1 1 1 1 > 12,5 > 12,5 > 12,5 > 12,5 > 50 > 50 > 50 > 50
01-3-178 1 2 0 1 > 12,5 > 12,5 - > 12,5 > 50 > 50 - > 50
01-3-179 1 1 0 1 > 12,5 > 12,5 - > 12,5 > 50 > 50 - > 50
01-3-180 1 1 0 1 > 12,5 > 12,5 - > 12,5 > 50 > 50 - > 50
01-4-101 0 1 0 1 - > 12,5 - > 12,5 - > 50 - > 50
01-4-110 1 1 0 1 > 12,5 > 12,5 - > 12,5 > 50 > 50 - > 50
01-4-111 1 1 0 1 > 12,5 > 12,5 - > 12,5 > 50 > 50 - > 50
Legenda: (0) cepa estéril; (1) Macroconidio clássico de M. canis (fusiforme de parede grossa e rugosa); (2) Macroconidio anômalo.
46
5.2 Análise genotipica
5.2.1 RAPD
As reações de RAPD com os primers OPK 17; OPA 01; OPA 02; OPA 03; OPA
04 e OPA 05 não detectaram polimorfismo nas cepas de M. canis analisadas. A figura
12 exemplifica o perfil das 10 cepas analisadas. As reações foram feitas em duplicata,
sendo observado o mesmo perfil genotípico para todas as cepas de M. canis (6 cepas
de cães, 4 de gatos) Foram observadas bandas que variaram de 200 pb a bandas de
mais de 800 pb para todos os OPAs testados.
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9
500pb
400pb
300pb
200pb
100pb
FIGURA 12: RAPD com OPA 1 em cepas de M. canis isoladas de cães e gatos no
Nordeste do Brasil
Linhas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 (cepas de M. canis); PM: Marcador de peso molecular de
100pb
Na figura acima, foi exemplificada apenas o RAPD do primer OPA 1. Não foram
discriminados, por sua vez, os perfis dos RAPDs dos primers OPA 2, OPA 3, OPA 4,
47
OPA 5 pois não foram observados polimorfismos das cepas em nenhuma das amostras
analisadas.
Na figura 13, é demonstrado o perfil genotípico do OPK 17. Somente oito cepas
de M. canis são visualizadas nesta corrida eletroforética, visto que o perfil das 20 cepas
analisadas não demonstrou polimorfismos
9 8 7 6 5 4 3 2 1 PM
500pb
400pb
300pb
200pb
100pb
FIGURA 13: RAPD com OPK 17 em cepas de M. canis isoladas de cães e gatos no
Nordeste do Brasil
Legenda: linha 2 (branco); linhas 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 (cepas de M. canis). PM:
Marcador de peso molecular de 100pb
48
5.2.2 PCR-REA
A PCR das regiões hipervariáveis ITS1 e ITS2 e subunidade 5,8S do rDNA
revelaram que as 20 cepas apresentaram amplicons de mesmo tamanho, medindo
aproximadamente 750pb. As enzimas Sau 3A; Dde I, Eco RI forneceram perfis de
restrição diferenciados. As enzimas Sau 3A e Dde I cortaram em 3 e 4 bandas as
regiões dos amplicons, sendo os fragmentos de 80pb; 300pb; 370pb e 90pb, 190pb,
230, 260pb, respectivamente. A figura 14 mostra o perfil de restrição dos amplicons
com Dde I. Somente nove cepas de M. canis são visualizadas nesta corrida
eletroforética, visto que o perfil das 20 cepas analisadas não mostrou diferenciação. A
enzima Eco RI, por sua vez, cortou os amplicons apenas em duas bandas, com
fragmentos de 350pb e 420pb, respectivamente. Apesar dos diferentes perfis de cortes
entre as enzimas, não foi observado polimorfismo das cepas. A enzima Rsa I, por sua
vez, não apresentou sítios de corte para o amplicon analisado (Tabela 8).
TABELA 8 – Padrões de restrição de ITS de M. canis

Sitios de restrição de Tamanho aproximado
Enzimas
M. canis das bandas (pb)
Eco RI presente 350; 420
Dde I presente 90; 190; 230; 260
Sau 3A I presente 80; 300; 370
Rsa I ausente 750
49
Figura 14: Gel de poliacrilamida de M. canis exemplificando a reação de PCR-REA de
ITS 1(Internal Transcribed Spacers) e ITS 2 digerido com Dde I
Linhas 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e 20 (cepas de M. canis); PM: Marcador de peso
molecular de 100pb.
Na figura acima, foi exemplificada apenas a restrição da enzima Dde I. Não
foram discriminados, por sua vez, os perfis das enzimas Sau 3A e Eco RI, pois não
foram observados polimorfismos das cepas.
5.3 Teste de Sensibilidade
Todas as cepas de M. canis analisadas foram sensíveis a griseofulvina. As CIMs
se encontravam nos seguintes intervalos: CIM ≤ 0,JPOQ JPO&,0≤
JPOQ HJPO&,0≤JPOQ 7DEHOD
50
O cetoconazol apresentou os seguintes intervalos de CIM frente as cepas de M.
canis: CIM ≤JPOQ JPO&,0≤JPOQ JPOCIM ≤ 1
JPO Q H JPO &,0 ≤ JPO Q 2V GHULYDGRV WULD]ólicos, itraconazol e
fluconazol, apresentaram CIMs bem distantes um do outro; os intervalos de CIM para
itraconazol foram: CIM ≤ JPO Q JPO&,0≤ JPOQ H 0,5
JPO &,0 ≤ JPO Q (QTXDQWR LVVR SDUD R IOXFRQD]RO IRUDP HQFRQWUDGRV RV
seguintes resultados: CIM ≤ JPO Q JPO &,0 ≤ JPO Q JPO
CIM ≤JPOQ JPO&,0≤JPOQ HJPO&,0≤JPOQ
(Tabela 9).
Com a utilização do teste não paramétrico de Friedman foi comprovado que as
drogas apresentam valores de CIMs diferentes (p=0,000). Comparando-se as drogas
por intermédio do teste não paramétrico de Wilcoxon, pode-se dizer que: itraconazol
apresentou CIMs menores do que griseofulvina (p=0,004), que, por sua vez, apresentou
CIMs menores do que cetoconazol (p=0,047) e este último apresentou CIM's menores
do que fluconazol (p=0,000).
51
Tabela 9 – Comportamento das cepas de M. canis frente aos derivados azólicos e
griseofulvina.
Drogas antifúngicas
Número de Griseofulvina Cetoconazol Fluconazol Itraconazol
coleção &,0JPO
CEMM 01-3-164 ≤ 0,5 ≤2 ≤16 ≤ 0,25

CEMM 01-3-165 ≤1 ≤2 ≤8 ≤ 0,25
CEMM 01-3-166 ≤ 0,5 ≤1 ≤16 ≤ 0,25
CEMM 01-3-168 ≤ 0,25 ≤1 ≤8 ≤ 0,25
CEMM 01-3-169 ≤1 ≤0,5 ≤4 ≤ 0,25
CEMM 01-3-170 ≤1 ≤1 ≤8 ≤ 0,25
CEMM 01-3-171 ≤1 ≤1 ≤8 ≤ 0,25
CEMM 01-3-172 ≤ 0,5 ≤0,5 ≤4 ≤ 0,5
CEMM 01-3-173 ≤1 ≤1 ≤8 ≤ 0,25
CEMM 01-3-174 ≤1 ≤1 ≤8 ≤1
CEMM 01-3-176 ≤ 0,5 ≤1 ≤8 ≤ 0,25
CEMM 01-3-177 ≤1 ≤1 ≤8 ≤ 0,5
CEMM 01-3-178- ≤ 0,5 ≤1 ≤8 ≤ 0,5
CEMM 01-3-179 ≤1 ≤1 ≤4 ≤1
CEMM 01-4-102 ≤ 0,5 ≤1 ≤1 ≤ 0,25
CEMM 01-4-104 ≤1 ≤0,125 ≤4 ≤ 0,25
CEMM 01-4-106 ≤ 0,5 ≤1 ≤4 ≤ 025
CEMM 01-4-109 ≤1 ≤1 ≤16 ≤ 0,25
CEMM 01-4-111 ≤1 ≤1 ≤2 ≤ 0,25
CEMM 01-4-112 ≤ 0,5 ≤1 ≤4 ≤ 0,25
CEMM 01-4-113 ≤1 ≤1 ≤8 ≤ 0,5
CEMM 01-4-115 ≤ 0,5 ≤1 ≤2 ≤ 0,25
52
A dose resposta foi feita segundo Collett (1991), onde ensaios deste tipo são
aqueles em que uma determinada droga é administrada em diferentes diluições,
obtendo-se como resposta, após um período especificado, microrganismos que são
inibidos ou mortos. O principal objetivo desse tipo de modelo foi estabelecer um
relacionamento funcional entre as diferentes dosagens aplicadas e a proporção de
indivíduos que foram inibidos ou morreram. Algumas dosagens particulares foram
descriminadas, tais como: a dosagem que é suficiente para inibir 50% dos indivíduos
(MIC-50) e a dosagem que foi suficiente para inibir 90% dos indivíduos (MIC-90)
(Tabela 10).
Tabela 10–Perfil de sensibilidade antifúngica das cepas de M. canis.

&,0JPO
Drogas Média
antifúngicas Variação 50% 90% Geométrica
Griseofulvina 0,25 - 1 0,52 0,88 0,707
Cetoconazol 0,125 - 1 0,47 1,11 0,91
Fluconazol 1 - 16 4,08 10,3 5,838
Itraconazol 0,25 - 1 0,09 0,55 0,322
53
6 DISCUSSÃO
Os dermatófitos são fungos extremamente bem adaptados às condições de

tecidos queratinizados, tais como, unhas, pêlos e stratum corneum de homens e
animais. Esta adaptação decorre da capacidade de utilizar a queratina como fonte de
nutrientes. As dermatofitoses causadas por M. canis são as micoses mais incidentes
em cães e gatos no mundo inteiro (BRILHANTE et al., 2003; KHOSRAVI &
MAHMOUNDI, 2003).
Segundo Liu et al. (2000), as características morfológicas e fisiológicas dos

dermatófitos podem freqüentemente apresentar variações, que, muitas vezes, dificultam
o diagnóstico. Estas alterações podem ser influenciadas por inúmeros fatores, tais
como: temperatura de incubação, meio de cultura empregado, uso de medicamentos,
etc.
O procedimento de identificação de M. canis é usualmente baseado em análises

fenotípicas das macro e micromorfologias, bem como, através das características
bioquímicas e nutricionais (SIDRIM & ROCHA, 2004).
A rotina para identificação de M. canis baseia-se na análise da macromorfologia,

utilizando-se parâmetros, como: pigmentação, relevo e textura. Segundo De Hoog et al.
(2000) e Evans and Richardson (1989), as colônias de M. canis, em geral, apresentam -
se macromorfologicamente com textura lanosa, rala, extremamente radiada com
tonalidades esbranquiçadas no verso e reverso, variando de ocráceo a amarelo. Na
presente pesquisa, as colônias foram analisadas em ágar Sabouraud dextrose e ágar
batata dextrose, sendo identificadas as seguintes colônias: 1) colônias algodonosas
baixas, apiculadas com pigmento; 2) colônias algodonosas baixas, apiculadas sem
pigmento; 3) colônias algodonosas altas com pigmento; e 4) colônias algodonosas altas
sem pigmento. Provavelmente, esta diversidade de morfologias decorreu da tentativa
de adaptação da cepa ao meio.
54
Diante desta grande variação fenotípica das colônias, fatalmente ocorrem
dificuldades na identificação das cepas fúngicas, justificando cada vez mais a
importância de estudos aprofundados da macro e micromorfologia, bem como a
implementação de técnicas moleculares, para que tais peculiaridades sejam
devidamente descritas, driblando, assim, erros no diagnóstico laboratorial (GRASER et
al., 2000).
A quantificação de macro e microconídios foi desenvolvida em quatro meios de

cultura distintos, sendo o ágar arroz e o ágar batata responsáveis pela menor
quantidade de estruturas de reprodução analisadas. Tais resultados são contrários a
alguns dados reportados na literatura, onde o ágar arroz (DE HOOG et al., 2000) e o
ágar batata (JESSUP et al., 2000) são utilizados para estimular maior produção de
conídios. O ágar Sabouraud, o qual possui 2% de glicose e peptona, não estimulou a
conidiogênese, sendo visualizada maior quantidade de hifas estéreis. A pouca
conidiação em cepas de Microsporum canis observadas em ágar batata, ágar arroz e
ágar Sabouraud pode ser justificada pela grande quantidade de substâncias disponíveis
no meio de cultura, passíveis de metabolização e não estimulantes de estresse que
favoreça a produção de estruturas de reprodução.
Por outro lado, o ágar lactrimel foi o mais estimulador na produção de

macroconídios, provavelmente por ser um meio, em que as substâncias nutritivas não
são facilmente metabolizadas pelo fungo, estimulando assim um estresse, e
posteriormente, a produção exacerbada de estruturas de frutificação para perpetuação
da espécie. Esta evidência tem sido relatada em cepas de M. canis após diferentes
períodos de estocagem (BRILHANTE et al., 2004b).
No caso da micromorfologia são descritas as estruturas de reprodução e

ornamentação, levando-se sempre em conta o tamanho e formato das estruturas
assexuadas. Segundo De Hoog et al (2000), o M. canis possui macroconídios que
variam de 35-110 µm de comprimento e 12-25 µm de largura. No presente ensaio,
quanto à morfologia dos macroconídios, os meios ágar arroz e ágar batata, apesar de
55
possuírem baixa quantificação de estruturas de reprodução, estas, quando presentes,
estavam enquadradas entre as descrições de macroconídios clássicos de M. canis. O
ágar Sabouraud não foi satisfatório nem na quantificação nem na análise da morfologia
dos macroconídios, visto que, quando estes eram produzidos, não estavam
enquadrados na morfologia esperada. Já o ágar lactrimel foi extremamente satisfatório,
porquanto, estimulou a produção de numerosos macroconídios com características
típicas das cepas. Segundo Marchisio et al. (1995), em estudos envolvendo cepas de
M. canis, o ágar lactrimel é um meio capaz de estimular a produção de macroconídios
em cepas produtoras de hifas estéreis, sendo tais dados compatíveis com os resultados
encontrados nesta investigação.
A partir dos dados, foram apontadas algumas dificuldades na caracterização

fenotípica de M. canis, pois, o subcultivo das cepas em ágar Sabouraud, ágar
Sabouraud acrescido de cloranfenicol e ágar Mycosel não se mostraram favoráveis à
produção de características típicas deste dermatófito. Segundo Raven et al. (1999), o
processo adaptativo de uma espécie pode estar associado a variações bióticas e
abióticas em seu habitat, sem obrigatoriamente possuir variações gênicas. Diante disto,
as técnicas de Biologia Molecular (PCR-REA e RAPD) foram necessárias na tentativa
de correlacionar a fenotipagem com algum tipo de polimorfismo das cepas de M. canis
isoladas de cães e gatos na presente pesquisa. Kawai, (2003), analisando cepas
dermatofíticas, descreve a dificuldade de identificação destas por meio de provas
fenotípicas, visto que, em muitos casos, este grupamento de fungos mostra culturas
atípicas, acarretando assim a procura por técnicas de Biologia Molecular. Em suas
análises, foram descritas técnicas como o RAPD e restrição de fragmentos por enzimas
de restrição como ferramentas adicionais no diagnóstico de tais infecções.
Segundo Faggi et al. (2001), os dermatófitos em cultura podem facilmente perder

suas clássicas características morfológicas compatíveis com a classificação do gênero
e espécie, sendo esta observação relatada por alguns autores (Makimura et al., 1999)
No presente estudo, a técnica de PCR-REA não detectou polimorfismo entre as cepas
de M. canis. Na reação foram amplificadas as regiões de ITS1, ITS2 e subunidade 5,8S
56
do rDNA. Segundo Mitchell et al., (1995), os genes do DNA ribossomal em eucariotos
estão organizadas em regiões codificantes e não codificantes. O gene 5,8S está
localizado entre as duas regiões ITS 1 e ITS 2, estes espaçadores, não são essenciais
a estrutura final das subunidades ribossômicas, sendo considerados regiões
hipervariáveis úteis para estudos de polimorfismos com organismos de espécies
diferentes ou até mesmo, populações de uma mesma espécie.
A partir da reação de PCR-REA, foram visualizados amplicons e perfis de

restrição idênticos quando tratados com as enzimas Sau 3A; Dde I, Eco RI e Rsa I. Tais
resultados concordam com dados de Faggi et al. (2001), que analisaram por PCR
fingerprinting, 53 cepas de M. canis isoladas a partir de cães e gatos (assintomáticos ou
não), bem como de humanos com dermatofitose. Faggi et al. (2001) não observaram
nenhum tipo de polimorfismo entre as cepas isoladas, apesar de todas as cepas
oriundas de cães e gatos não produzirem conídios e apresentarem-se com colônias de
reverso alaranjado.
Makimura et al. (1999), analisando cepas dermatofíticas de Epidermophyton,

Trichophyton e Microsporum, relataram a heterogeneidade neste grupo de fungos em
análise intraespecífica, demonstrando a aplicabilidade na identificação de tais
microrganismos mediante regiões ITS, em cepas que possuíam características
morfológicas atípicas.
Em outras análises com fungos dermatofíticos, Mochizuki et al., (1999) utilizaram

as seqüências das regiões ITS 1 de cepas com fenotipagem atípica para identificação
das espécies, previamente analisadas através de RAPD e RFLP. Os autores
reportaram que os dados do ITS 1 demonstraram melhor reprodutibilidade quando
comparados aos obtidos com RAPD e RFLP.
57
El Fari et al. (2000), em estudos na Alemanha, utilizando o uso de seqüências de
regiões ITS para identificar cepas de Trichophyton tonsurans oriundos de lesões de
Tinea capitis, avaliaram 46 isolados, destes, 15 cepas não foram identificadas através
das características fenotípicas convencionais. Posteriormente, todas as cepas não
identificadas foram classificadas através dos ITS, não sendo visualizado polimorfismos
na região analisada, sugerindo então, uma possível população com reprodução clonal
nesta espécie.
Jin et al. (2004), utilizando o método de sequenciamento de regiões ITS do

rDNA, não demonstraram diferenças entre isolados de cepas de M. canis de pacientes
com Tinea capitis e de isolados do meio ambiente, onde os pacientes tinham contato,
sugerindo que tais cepas possuem a mesma seqüência de DNA nas regiões ITS com
pequenas variâncias intra-específicas.
Na presente pesquisa, a amplificação das regiões ITS 1 e ITS 2, além da

subunidade ribossômica 5,8S do rDNA, se mostraram idênticas em todas as cepas de
M. canis independente da origem. Provavelmente, tais cepas podem ser constituídas de
reprodução estritamente clonal, sendo possivelmente a grande diversidade morfológica
explicada por uma adaptação da cepa ao meio ambiente que se encontra.
Quanto à análise de RAPD com os primers OPK 17, OPA1, OPA2, OPA3, OPA4,
OPA5, não foram observadas, neste estudo, diferenças na amplificação dos isolados.
Faggi et al. (2001), em análise de PCR fingerprint em 6 cepas de M. canis de humanos,
oito cepas de cães e em 4 oriundas de gatos, também evidenciaram similaridades nos
padrões eletroforéticos. Jin et al. (2004), utilizando primers OPI 07 e OPK 20 em RAPD,
apresentaram idênticas amplificações em todas as cepas de M. canis,
independentemente do local de origem da cepa.
58
Sabine Alphies (2001) analisou 40 cepas de M. canis oriundas de diferentes
regiões da Alemanha, através de RAPD, justificando suas análises pelas dificuldades
de identificação deste dermatófito devido à ausência de estabilidade fenotípica deste
fungo. A autora utilizou uma metodologia semelhante aquela empregada no nosso
estudo, com quantificação tanto de macroconídios, microconídios, clamidoconídios e
hifas. Portanto corroborando a importância desta metodologia para a caracterização de
cepas de M. canis.
Sabine Alphies (2001) encontrou poucas variações intraespecíficas em M. canis

através do RAPD (com a utilização dos primers AC10, T3B e M13), pressupondo uma
possível reprodução clonal das cepas avaliadas. A autora considera que a reprodução
clonal desta cepa foi apontada pelo fato da fase teleomórfica (A. otae - mating type +)
do M. canis ser isolada apenas em algumas regiões do Japão.
Segundo Bradley et al. (1999), o primer OPK 17 mostrou polimorfismos em cepas

de T. rubrum, quando comparadas com cepas ATCC. Em suas análises, foram,
contudo, observadas variações morfológicas das colônias, sem, no entanto,
apresentarem diferenças nos padrões de RAPD. A técnica de RAPD é simples, fácil de
ser processada e rápida, sendo, entretanto, baixa sua reprodutibilidade. Por tal razão,
nesta pesquisa, as reações foram feitas em duplicata, onde o padrão de bandas se
manteve idêntico em todo o estudo.
De Biévre et al. (1987), por sua vez, foram capazes de estabelecer diferenças de
duas variantes de cepas de T. rubrum, utilizando técnicas mais apuradas, como a
análise do DNA mitocondrial.
Em 1983, o National Comittee for Clinical Laboratory Standarts (NCCLS) no

documento M27A, propôs uma metodologia para análise dos testes de sensibilidade, in
vitro, a drogas antifúngicas em fungos leveduriformes de importância clínica (NCCLS
1992). Mais recentemente, o método de referência foi adaptado para fungos
59
filamentosos através do documento M-38P. Os fungos dermatofíticos, entretanto, não
foram contemplados neste estudo (GUPTA & KOHLI, 2003).
A partir dos documentos supracitados, a comunidade cientifica vem tentando

desenvolver ou adaptar tais testes para cepas dermatofíticas. Fernandez-Torres et al.
(2002a), por exemplo, propõem para avaliação in vitro dos testes de sensibilidade de
dermatófitos a incubação de sete dias a 28 ºC, com inóculo de 104 CFU/ml e endpoint
de 100% de inibição para todas as drogas. Ademais, destacam a importância de mais
análises para que sejam apontados testes que possam ser correlacionados com a
clínica, para que os profissionais da área da saúde possam ter sucessos terapêuticos a
partir de dados laboratoriais.
Por conseguinte, no presente trabalho, os testes de sensibilidade para este

grupamento de fungos foram baseados nos artigos de Jessup et al (2000) e Fernandez-
Torres et al. (2002a). Neste ensaio, quatro drogas antifúngicas foram analisadas
frente 22 cepas de M. canis, tendo sido utilizadas como controles de qualidade para os
derivados azólicos uma cepa de C. parapsilosis (ATCC 22019) e uma de C. krusei
(ATCC 6528).
Dentre as drogas analisadas, a griseofulvina foi escolhida por possuir atividade

contra fungos dermatofíticos, sendo considerada padrão-ouro, acrescido o fato de ser
rotineiramente utilizada na clínica de pequenos animais na região onde se realizou o
estudo. A CIM desta droga situou-se entre 0,25 - 1µg/ml, dados estes que concordam
com relatos de Perea et al. (2001) e Jessup et al. (2000), que encontraram CIMs de 0,5
- 1µg/ml e 0,25 - 1µg/ml para 6 e 8 cepas de M. canis, respectivamente. Ademais, a
resistência de dermatófitos para griseofulvina é considerada rara, sendo relatada em
cepas de T. rubrum (KORTING et al.,1995).
Hofbauer et al, (2002), analisando 300 cepas de dermatófitos (92% destas eram
M. canis) frente a terbinafina e griseofulvina, detectaram menos atividade de
griseofulvina comparada a terbinafina, entretanto, a griseofulvina demonstrou atividade
60
letal em 40% das cepas. Durante a análise de sensibilidade in vitro, os autores
coletaram espécimes clínicos dos animais durante o tratamento in vivo, monitorando
assim os CIM das cepas isoladas. Posteriormente, os autores alertaram para o aumento
da CIM ao longo do tratamento, levantando a hipótese de uma possível resistência
adquirida da griseofulvina durante o desenvolvimento da terapia (HOFBAUER et al,
2002).
Mukherjee et al., (2003), relataram a resistência de cepas dermatofíticas a

terbinafina, bem como a outras drogas inibidoras da enzima esqualeno epoxidase, tais
como naftifina e butenafina. Os autores concluíram que tais cepas haviam desenvolvido
um mecanismo de resistência que envolvia mutações no gene que codificava a enzima
esqualeno epoxidase, pois, tais cepas eram sensíveis a griseofulvina e aos derivados
azólicos (MUKHERJEE et al., 2003)
A segunda droga analisada foi o imidazol cetoconazol. Esta droga, a exemplo da

griseofulvina, é utilizada de rotina em clínica de pequenos animais na região Nordeste.
A CIM encontrada para as cepas de M. canis foi de 0,125 - 2 µg/ml. Fernandes-Torrez
et al. (2001) demonstraram uma excelente atividade deste antifúngico contra cepas
dermatofíticas, dentre elas, cepas de M. canis, que apresentaram CIMs em torno de
0,25 µg/ml. Perea et al. (2001) relataram CIMs entre 0,5-4 µg/ml. Favre et al. (2003),
por sua vez, relataram CIMs de 1 µg/ml para todas as cepas de M. canis analisadas.
Por outro lado, Maia et al. (2001), em seus experimentos, identificaram na cidade de
São Paulo (Brasil), 6(20%) cepas de M. canis resistentes ao cetoconazol com CIM =
32µg/ml. Esta evidência decorre, provavelmente, do tipo de metodologia utilizada (E-
Test), pois, certamente, a droga não se difundiu adequadamente, acarretando assim
aumento das CIMs encontradas.
Quanto aos derivados triazólicos, itraconazol e fluconazol, os CIM encontrados

variaram de 0,25 - 1µg/ml e de 1 - 16µg/ml, respectivamente. Barchiesi et al. (2001),
analisando 16 cepas de M. canis, frente ao itraconazol, encontraram resultados
idênticos aos da presente pesquisa. Perea et al. (2001), por sua vez, demonstraram
61
CIM de 0,03-1 µg/ml para itraconazol e de 2-64 µg/ml para fluconazol. De acordo com
Frave et al. (2003), em 4 cepas de M. canis, foram encontrados CIMs de 0,25-0,50
µg/ml para itraconazol e de 16-32 µg/ml para fluconazol. Fernandez-Torres et al. (2001),
demonstraram CIMs de 0,125-0,5 µg/ml para itraconazol e CIMs de 8-16µg/ml para
fluconazol.
Maia et al. (2001) mostraram CIM < 32 µg/ml para fluconazol, não detectando,
assim, nenhuma cepa resistente. Estes pesquisadores, no entanto, observaram que
97% das cepas avaliadas eram resistentes ao itraconazol com CIM = 32 µg/ml.
Fernandez-Torres et al. (2003), em um estudo comparativo de sensibilidade em 30
cepas dermatofíticas, referiram que os CIMs geralmente encontrados em técnicas em
ágar, conforme descrito por Maia et al., (2001), são maiores de que os produzidos em
ensaios em caldos, sendo justificados muitas vezes pela inexperiência na leitura das
paradas de crescimento, contribuindo assim, na baixa reprodutibilidade dos resultados.
Diante do exposto, pode-se observar uma grande variação dos CIMs

encontrados para cepas de M. canis sensíveis a griseofulvina, cetoconazol, itraconazol
e fluconazol. Esta variação pode ser explicada pelas diferentes metodologias
empregadas, onde encontramos variações no inóculo, meio de cultura, temperatura de
incubação e tempo de leitura dos isolados (GUARRO et al., 1997; MANAVATHU et al.,
1999; PUJOL et al., 1997).
Apesar de ter sido observada uma grande diversidade fenotípica e perfil de

sensibilidade variado nas cepas de M. canis, a análise genotípica, pelo menos, através
dos métodos empregados não detectou a presença de polimorfismos nestes
microrganismos. Dessa forma, tais evidências nos levam a crer que as cepas de M.
canis isoladas na cidade de Fortaleza-CE apresentam reprodução clonal.
Por fim, acreditamos ter dado uma contribuição científica para o melhor
conhecimento de M. canis isolados de cães e gatos, haja vista que o enfoque deste
62
trabalho foi pioneiro no território brasileiro, podendo, assim, servir como frente de
consulta e compreensão para pesquisas inter-regionais posteriores.
63
7. CONCLUSÕES GERAIS
1 - A análise macromorfológica das cepas de M. canis demonstrou uma grande

diversidade de colônias, podendo ser visualizadas colônias algodonosas baixas
apiculadas com pigmento; colônias algodonosas baixas apiculadas sem pigmento;
colônias algodonosas altas com pigmento; e algodonosas altas sem pigmento;
2 –. Macroconídios com dimensão maior que 50 µm e com largura maior que

12.5 µm foram mais encontrados em ágar lactrimel, sendo o ágar Sabouraud o meio
mais propício para a formação de hifas estéreis;
3 - Nos resultados da PCR, os amplicons se mostraram semelhantes, medindo

aproximadamente 750pb. As enzimas Sau 3A; Dde I, Eco RI forneceram perfis de
restrição diferenciados sem, entretanto, detectar diferenças genotípicas entre as cepas;
4 - As reações de RAPD com os primers OPK 17; OPA 01; OPA 02; OPA 03;
OPA 04 e OPA 05, a exemplo da PCR-REA, não detectaram nenhum tipo de
polimorfismo nas cepas de M. canis;
5 – Apesar dos M. canis apresentarem uma grande diversidade fenotípica, as

drogas antifúngicas griseofulvina, cetoconazol, itraconazol e fluconazol foram efetivas
frente a todas as cepas analisadas.
64
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83
ANEXOS
Artigo 1: PHENOTYPICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF

MICROSPORUM CANIS STRAINS IN NORTHEAST BRAZIL
Periódico: Journal of Applied Microbiology (Artigo aceito)
Artigo 2: ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY AND GENOTYPICAL PATTERN OF

MICROSPORUM CANIS STRAINS
Periódico: Canadian Journal Microbiology (Artigo aceito)
84
JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY
Phenotypical and Molecular Characterization of Microsporum canis Strains in

Northeast Brazil
R.S.N. Brilhante1,2, M.F.G. Rocha2,1, R.A. Cordeiro3,1, S.H.B. Rabenhorst1, T. B.

Granjeiro4, A.J. Monteiro5 And J.J.C. Sidrim1
1
Veterinary Faculty, Post-Graduation Program in Veterinary Science, State University of
Ceará. Fortaleza - CE, Brazil.
2
Department of Pathology and Legal Medicine, Faculty of Medicine, Medical Mycology
Specialized Center, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
3
Department of Biology, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
4
Department of Biology, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
5
Department of Statistics and Applied Mathematics, Federal University of Ceará,
Fortaleza-CE, Brazil.
Author for correspondence: R. S. N. BRILHANTE. Rua Barão de Canindé, 210;
Montese. CEP: 60.425-540. Fortaleza, CE, Brazil. Phone: 55 (85) 214-2853. Fax: 55
(85) 295-1736. E. mail: samiamic@yahoo.com.br
85
ABSTRACT
Aims: This study investigated the possible correlation between the phenotypical and
genotypical characteristics of M. canis isolated from cats and dogs in Northeast Brazil.
Methods and Results: The mycological study was conducted by direct microscopic
examination and by fungal culture. PCR-REA and RAPD techniques were used for the
genotypical analysis. The morphological analysis showed a considerable diversity of
colonies as well as different morphologies of conidia, despite the M. canis strains having
been isolated under the same conditions. However, the molecular analysis showed that
all analyzed strains are genetically similar.
Conclusions: This study, based on phenotypical and molecular analysis, evidences the
wide spectrum of phenotypical variations in M. canis in contrast to the stable genotypes
of such dermatophytes.
Significance and Impact of the Study: The findings of this study indicate that
Microsporum canis isolated from cats and dogs with dermatophytosis in Northeast Brazil
may be clones, well adapted to the conditions of this region, despite M. canis showing
different morphological features.
Key Words: Dogs, cats, dermatophytosis, Microsporum canis, phenotype and
genotype.
86
INTRODUCTION
Dermatophytosis is the most common fungal disease in veterinary clinics that
treat cats and dogs (Cabañes 2000; Khosravi & Mahmoundi 2003). Corroborating this
data, Brilhante et al. (2003) demonstrated that Microsporum canis is the most frequent
etiologic agent of canine and feline dermatophytosis in Northeast Brazil.
The identification of M. canis is based mainly on its morphological and

physiological features (McGinnis 1980). However, the intra-specific morphological
differentiation of this specie has not been entirely determined. There is, therefore, a
need for more refined procedures to be developed (Maia et al. 2001).
Gräser et al. (1998) and Liu et al. (2000) demonstrated that the genotypic
characteristics were useful for solving taxonomic problems regarding dermatophytes.
Many molecular techniques have been used for the identification of these fungi, such as:
restriction fragment length polymorphism analysis of mitochondrial (Kawasaki et al.
1996), random amplification of polymorphic DNA (RAPD) (Mochizuki et al. 1997) and
PCR fingerprint (Faggi et al. 2001).
Analysis involving DNA and RNA has been used in clinical microbiology to help in
the classification as well as in the identification of many microorganisms, including
dermatophytes (Versalovic et al., 1996; Kawasaki et al., 1996). rDNA genes have been
useful for the separation of both genera and species (Gutel et al. 1985). Molecular
analysis has been used in veterinary mycology for identification of M. canis and M.
gypseum (Kano et al. 1998).
The organization of the rDNA gene complex in fungi includes a sequence coding
for 18S rDNA gene, an internal transcribed spacer region ITS 1, the 5.8S rDNA gene
coding region, another ITS region (called ITS2) and the sequence coding for the 28S
rDNA gene (Mitchell et al. 1995). The sequence homology within the rDNA genes of
fungi (18S, 5.8S and 28S genes) and differences within the spacer regions (ITS 1 and
87
ITS 2) are the genetic basis for the organization of fungi into taxonomic groups (White et
al. 1990).
Kaszubiak et al. (2004) elaborated concepts of speciation in dermatophytes using

the M. canis complex. The group consists of a cluster of phylogenetically closely related
anamorphs: M. audouinii, M. ferrugineum and M. canis . This study was done using
intergenic spacer, non-translated regions of genes as well as hypervariable
microsatellite markers. Based on this investigation, it was suggested that sympatric
speciation took place already during the period where mating ability. Thus, that strictly
clonal fungal species emerged and led to genetically isolated clonal species elsewhere.
The purpose of this study was to investigate a possible correlation between the
phenotypical and genotypical characteristics of M. canis isolated from cats and dogs
with dermatophytosis in Northeast Brazil.
88
MATERIAL AND METHODS
Isolates
A total of nineteen strains of M. canis previously isolated from small animals (11
dogs and 8 cats) and one human strain were analyzed in the Medical Mycology
Specialized Center (MMSC) at the Faculty of Medicine at the Federal University of
Ceará, Brazil. The strains were maintained in saline (0.9% (w/v); NaCl), at room
temperature (25°C), and in potato dextrose agar (DIFCO, Detroit, USA) added to
dimethyl-sulfoxide (10% (w/v); DMSO); at -20oC. At the time of the analysis, a small
fragment of the colony or an aliquot of the solution was taken and inoculated into
Sabouraud dextrose agar (SANOFI, France) and into potato dextrose agar, and then
incubated at 25°C for ten days.
Phenotypical analysis
The macromorphology of M. canis was analyzed in Sabouraud dextrose agar and

in potato dextrose agar, after 10 days of incubation. Texture and surface of the colony
and the presence or absence of pigmentation were analyzed.
The micromorphology of M. canis, as recommended by Sidrim & Rocha (2004),

was observed in rice agar, lactrimel agar, Sabouraud dextrose agar and potato agar. A
small portion of the M. canis colonies was stained by lactophenol cotton blue and then
ten fields were observed by optic microscopy, with a magnification of 40x. The
quantification and analysis of the macroconidia morphologies were conducted as
follows: Initially, observations were made to identify whether or not macroconidia was
produced by M. canis. If the M. canis strain did not show fructification structures the
analysis was concluded. The number of macroconidia, when present, was quantified as
0 - 10, 11 - 50 or > 50 macroconidia per field. The quantification of the microconidia
followed the same standardization.
After the quantification, the macroconidia were randomly selected and measured
with a reticule for length, which varied in scale from 0 µm – 50 µm or > 50 µm; and for
89
width, which varied from 0 µm – 12.5 µm or > 12.5 µm. These features were observed
with a magnification of 40x.
Biochemical and nutritional characteristics of M. canis were evaluated as

described by Brilhante et al. (2003). The following tests were conducted: nutritional
(thiamine, nicotinic acid, inositol and histidine), in vitro hair perforation and urease test.
Genotypical analysis
DNA extraction
All strains of M. canis were grown in BHI broth (Brain Heart Infusion) (DIFCO;
Detroit, MI, USA), in a volume of 50 ml, and rotated at 70-90 rpm, at 28ºC, for five days.
Rotation was performed in order to encourage formation of a mycelial mat rather than a
hyphal ball. After this procedure, the mycelial mat was washed with saline 0.9% (w/v)
and then transferred to Falcon tubes with CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide
(1:10 w/v; CTAB 2% w/v), Tris (100mM), EDTA (10mM), NaCl (0.7M) and ß-
mercaptoethanol (0.2 % [v/v]). The mycelia were then incubated at 60ºC, for one hour.
And again incubated, rotating at 70-90 rpm for 12h, at 28ºC. They were then collected
by centrifugal force, and approximately 2g (wet weight) were submitted to a
chloroform/isoamyl alcohol extraction (24:1, v/v) and separated by centrifugal force at
5000 rpm for 20 min. The supernatant was mixed with 0.54 vol. of isopropanol and left
on ice for 2 hours, and separated by centrifugal force as described above. After that, the
pellet was washed with 2 ml of NaCl (3M), precipitated in 3 ml of 70% v/v ethanol and
separated by centrifugal forceat 5000 rpm, for 20 min The DNA pellet was dried,
resuspended in deionized water and frozen at –20°C.
Polymerase chain reaction (PCR)
The PCR amplification of the ITS 1 and ITS 2 ribosomal regions was achieved by
using the primer-pairs, ITS-1 (5´-TTCGTAGGTGAACCTGC-3´) and ITS-4 (5´-
TCCTCCGCTTA TTGATAT-3´). The reaction was induced in an appropriate mixture (25
µl) containing: KCl (50 mM), Tris-HCl (10mM), Triton X-100 (0.1%), MgCl2 (1.5mM), 250
90
µM of each de-oxy-nucleoside tri-phosphate, two pmol of each primer, one unit of Taq
DNA polymerase (Promega, WI, USA) and genomic DNA (10 ng). The amplification was
performed for 35 cycles in a DNA thermal cycler with 1 min of denaturation at 94°C, 30 s
of annealing at 56°C, 1 min of extension at 72°C and then, a final extension for 5 min at
72°C. To observe the amplified fragments, 3 µl of each PCR reaction were mixed with
2µl of sample buffer and than electrophoresed in 6% polyacrilamide gels in 0.5X TBE
(Tris-borate [0.045 M] and EDTA [0.001 M] in 100V, for approximately 30 min, and then
silver stained as described by Sanguinetti et al. (1994).
Restriction Enzyme Analysis (REA)
Some of the amplified products were diluted in water (1:10) for the endo-nuclease
digestion assays with four different restriction enzymes (Rsa I, Sau 3A, Dde I and Eco
RI) (Gibco- BRL, Grand Island, NY, USA). These enzymes were used according to the
manufacturer’s instructions. The restriction endo-nucleases reactions were performed,
for 3h at 37ºC, and the results were observed in 6% polyacrilamide gels.
Random amplified polymorphic DNA (RAPD)
DNA typing of the strains by RAPD assay was performed, as suggested by

Bradley et al. (1999), with the informative random primer OPK-17 (5´-CCCAGCTGTG-
3`) (Invitrogen, SP, Brazil). RAPD reactions were induced in reaction buffer (10l)
containing 0.5 mM of each dATP, dGTP, dCTP and dTTP (Perkin Elme, Branchburg,
NJ, USA); OPK-17 primer (10 pmol); 1 U of Taq DNA polymerase (Promega, WI, USA)
and genomic-DNA (20 ng). The amplification parameters consisted of one cycle of 1 min
of denaturation at 94°C, 45 cycles of 20 s at 94°C of denaturation, primer annealing for 1
min at 35°C and extension for 1 min at 72°C; and one final extension step at 72°C for 10
min The fingerprints were produced by 2 µl of each amplicon in electrophorese in 6%
polyacrilamide gels in 0.5X TBE buffer (Tris-borate [0.045 M] and EDTA [0.001 M]) in
100V for approximately 30 min, and silver stained as described by Sanguinetti et al.
(1994).
91
STATISTICAL ANALYSIS
The study was conducted utilizing the Wilcoxon Friedman tests, adapted for use
in ordinal variables. The quantifying and measuring variables were observed in groups
of values, to obtain a more precise classification and then treated as ordinal variables. A
p value of <0.05 was considered significant.
RESULTS
Based on the macromorphological analysis in Sabouraud dextrose agar and

potato agar, four types of colonies were identified, as follows: type I- low cottony,
apiculated with pigment; type II- low cottony, apiculated without pigment; type III- high
cottony with pigment and type IV- high cottony without pigment. No strain had type I
colony in Sabouraud agar, although 7, 3 and 10 strains showed colonies of types II, III
and IV, respectively. In potato agar, 4, 7, 2 and 7 strains had colonies of types I, II, III
and IV, respectively (Table 1).
The lowest quantity of macroconidia (0-10) was observed in rice agar and
lactrimel agar, amounting to a total of 9 and 6 strains, respectively. The quantification
11-50 macroconidia was observed in 3, 2, 2, 2 strains in rice agar, potato agar,
Sabouraud agar and lactrimel agar respectively. Lactrimel agar was the most favorable
(P<0.05) for the production of macroconidia (>50 macroconidia per field), totaling 11
strains. The medium Sabouraud agar, particularly stimulated (P<0.05) the production of
sterile hyphae; a total of 13 strains having such characteristics. In addition, sterile
hyphae was identified in 5, 5 and 1 strain in rice agar, potato agar, and lactrimel agar,
respectively (Table 1).
The scale of 0-10 microconidia per field was observed in 8 and 14 strains in rice
and potato agar, respectively. Lactrimel agar was the most favorable medium for the
production of microconidia between 0 and 10, totaling 19 strains, However, the medium
Sabouraud agar, induced a greater (P<0.05) production of strains with sterile hyphae
92
(n=13). The quantification 11-50 microconidia was observed in 3, 1, 1 strains in rice
agar, potato agar, Sabouraud agar respectively. More than 50 microconidia per field
were observed in 1 and 2 strains in rice agar and potato agar, respectively (Table 1).
Classical macroconidia morphology of M. canis was found in 4, 10,15 and 18

strains in Sabouraud agar, potato agar , rice agar, and lactrimel agar, respectively.
Anomalous macroconidia was not seen in any strains when rice agar was used.
However, it was found in 5, 3 and 1 strains of M. canis from potato agar, Sabouraud
agar and lactrimel agar, respectively (Table 2).
Macroconidia longer than 50 µm were seen in 5, 14, 15 and 19 strains in

Sabouraud agar, rice agar, potato agar, and lactrimel agar, respectively. Thus,
Sabouraud agar produces macroconidia smaller (P<0.05) than those induced in rice
agar, potato agar and lactrimel agar. Macroconidia wider than 12.5 µm (P<0.05), totaling
15, 13 and 18 strains, were produced in rice agar, potato agar and lactrimel,
respectively. In the Sabouraud agar, a greater (P<0.05) number of macroconidia smaller
than 12.5 µm were produced (n=6). One strain with macroconidia >12.5 µm and thirteen
strains without macroconidia were also observed in this medium (Table 2).
Regarding the physiological features of the M. canis, 100% of strains were

positive for hair perforation in vitro as well as having satisfactorily growth in medium
supplied with thyamin, nicotinic acid, inositol and histidine. However, sixteen strains
(80%) were urease positive.
The PCR results showed that, after amplification of hyper-variable regions (ITS1,
ITS2 and subunit 5.8S of rDNA), the amplicons proved to be equal, with approximately
770pb. The restriction profiles of the regions analyzed are presented in Table 3.
The enzymes Sau 3A, Dde I and Eco RI digested the amplified regions and cut
the amplicon regions into 2, 3 or 4 segments with the following fragments: 350pb, 420pb
for Eco RI; 300pb, 370pb, 80pb for Sau 3A and 90pb, 190pb, 230, 260pb for Dde I.
93
Despite the differing section profiles among the enzymes, the phenomena of
polymorphism was not observed in any of the samples (Table 3).
Finally, the reaction of RAPD with OPK17 primer did not detect any kind of
polymorphism in the analyzed strains of M. canis (Figure 1).
DISCUSSION
According to Liu et al. (2000), the morphological and physiological characteristics

of dermatophytes may frequently show variations, which often complicate the diagnosis.
These alterations may be influenced by many factors, such as environment, incubation
temperature, culture technique and the use of medicine.
The procedure for the identification of M. canis is usually based on phenotypical

analysis by its macro and micromorphological features, as well as by its biochemical and
nutritional characteristics (Brilhante et al., 2004).
According to Evans & Richardson (1989) and De Hoog et al. (2000) colonies of
M. canis, in general, are apiculated with low cottony texture and present pigment varying
from canary yellow pigment to ochre. In the present study, the morphology of M. canis
colonies was analyzed in Sabouraud agar and potato agar, the following colonies being
identified: 1) low cottony, apiculated with pigment; 2) low cottony, apiculated without
pigment; 3) high cottony with pigment; and 4) high cottony without pigment. This
diversity of morphologies was probably due to an attempt at adapting the strain to the
different environment conditions. This data shows that the colony features are not
pathognomonic of M. canis.
The quantification of macro and microconidia was developed in four different

culture media, of which rice agar and potato agar induced a small quantity of
reproductive structures. Such results conflict with some data previous reported, whereby
rice agar (De Hogg et al. 2000) and potato agar (Jessup et al. 2000) were used to
94
stimulate a greater production of conidia. Sabouraud dextrose agar, failed to stimulate
an adequate conidiogenesis, producing a greater quantity of sterile hyphae. This
evidence was noted in M. canis strains after different time and storage procedures
(Brilhante et al., 2004).
Lactrimel agar was the greatest producer of micro and macroconidia, probably
due to its rich carbohydrate composition, which maintains the fungus in a favorable
situation for its vast growth and consequently induces a great production of reproduction
structures.
The reproductive and ornamentation structures are always described, in

accordance with their size and shape. In the present study, the macroconidia produced
in the media rice agar and potato agar were categorized according to De Hoog et al.
(2000) as a classical macroconidia from M. canis, in spite of low quantities of
reproductive structures being induced. Sabouraud agar was an unsatisfactory medium
for the quantification and analysis of the macroconidium morphology, because it did not
always show its classical morphology.
Lactrimel agar was extremely satisfactory, stimulating production of several

macroconidia with typical characteristics of M. canis. Corroborating these data,
Marchisio et al. (1995) showed that lactrimel agar is the best medium to induce the
production of macroconidia by M. canis strains.
The hair perforation test, in vitro, and urease test are considered important
additional tools for the identification of M. canis (Sidrim & Rocha, 2004). In addition, De
Hoog et al. (2000) and Brilhante et al. (2003) refer to abundant growth of M. canis in
vitamin-enriched environments. Corroborating this information, it was observed in this
research that 100% of the strains were positive for hair perforation in vitro as well as
having a satisfactorily growth in medium supplied with thyamin, nicotinic acid, inositol
and histidine. Only eighty per cent of the strains were urease positive.
95
It was noted in the present investigation, that there was some difficulty in
establishing the phenotypic characterization of M. canis. Consequently, molecular
biology techniques were employed as an attempt to correlate an ample phenotypic
variation of the M. canis strains as a possible polymorphous phenomenon.
According to many authors (Makimura et al. 1999; Faggi et al. 2001; Brilhante et
al. 2003; Sidrim & Rocha, 2004), dermatophytes in culture may easily lose their classical
morphological features. According to Raven et al (1999), the adaptive process of the
specie may be associated to biotic and/or abiotic variations in its habitat, without there
necessarily being genetic variations.
In the present study, the PCR-REA technique did not detect polymorphism
among the analyzed M. canis strains. In the reaction, regions of ITS1, ITS2 and subunit
5.8S of rDNA were amplified. Based on the reaction, identical amplicons and profiles
were seen when treated with enzymes Sau 3A; Dde I, Eco RI e Rsa I. Such data are in
agreement with Faggi et al. (2001), where PCR fingerprinting was used to analyze M.
canis strains isolated from dogs, cats and humans. These researchers did not observe
any kind of polymorphism among the strains, in spite of having an ample phenotypic
variation, as seen in the present investigation.
Makimura et al. (1999), analyzing strains of Epidermophyton, Trichophyton and

Microsporum, reported heterogeneity in this group of fungi, demonstrating applicability in
the identification of such microorganisms through ITS regions, in strains which had
atypical morphological characteristics.
Jin et al. (2004) using the method of sequencing of ITS regions of rDNA, did not
demonstrate any differences among M. canis strains from patients with Tinea capitis or
from the environment, where the patients had contact. They suggested that such strains
have the same DNA sequence in ITS regions with small intra-specific variations.
96
In a similar way to Jin et al. (2004), in the present study, all M. canis strains from
cats and dogs and the one human strain were considered genetically identical. Such
microorganisms may be constituted through strictly clonal reproduction. The vast
morphological diversity could be explained by its adaptation to the environment
conditions
In the present study, RAPD with the primer OPK 17 did not detect any intra-
specific differences in the strains of M. canis analyzed. According to Bradley et al.
(1999), the primer OPK 17 is capable of identifying polymorphism in strains of T. rubrum.
In their analysis, no differences in the standards of RAPD were evidenced in spite of
variations in the colonies having been seen. Jin et al. (2004), analyzing the standard of
the strains with primers OPI 07 e OPK 20 demonstrated similar results to those found in
the present study, where the standards of the strains of M. canis were identical.
Based on phenotypical and molecular analysis, we suggest that M. canis strains

from dogs, cats and from humans are genetically identical, therefore, these strains may
be clones
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101
TABLE 1: Macromorphology and quantification of macro and microconidia of M. canis strains in different culture media
Macromorphology
Macroconidia Per Microscopy Field Microconidia Per Microscopy Field
Collection Potato Sabouraud Rice Potato Sabouraud Lactrimel Rice Potato Sabouraud Lactrimel
number agar agar agar agar agar agar agar agar agar agar
01-3-156 I II 0-10 0 0 > 50 0-10 0-10 0 0-10
01-3-162 II IV 11-50 0-10 0-10 > 50 0-10 > 50 0-10 0-10
01-3-163 IV IV 0 0 0 0-10 0 0 0 0-10
01-3-164 IV IV 0-10 0-10 0 > 50 0-10 0-10 0 0-10
01-3-166 IV IV 0 0 0 0-10 11-50 0-10 0 0-10
01-3-167 IV IV 0-10 0-10 0 > 50 0-10 0-10 0 0-10
01-3-168 IV IV 0-10 0-10 0-10 0-10 0 11-50 0-10 0-10
01-3-171 III III 0 0 0 0-10 0 0 0 0-10
01-3-172 II II 0-10 0-10 0-10 0-10 0-10 0-10 0-10 0-10
01-3-173 I IV 0-10 11-50 0-10 > 50 0 0-10 0-10 0-10
01-3-174 II IV > 50 0-10 0-10 > 50 0-10 0-10 0-10 0-10
01-3-175 III III 0-10 0-10 11-50 0-10 > 50 > 50 0 0-10
01-3-176 I III 0 0 0 0 0 0 0 0
01-3-177 II IV 0-10 0-10 11-50 > 50 0 0-10 0-10 0-10
01-3-178 IV II 11-50 0-10 0 11-50 11-50 0-10 0 0-10
01-3-179 IV IV 11-50 0-10 0 > 50 0-10 0-10 0 0-10
01-3-180 II II > 50 0-10 0 > 50 0 0-10 11-50 0-10
01-4-101 I II 0 0-10 0 11-50 0 0-10 0 0-10
01-4-110 II II 0-10 0-10 0 > 50 11-50 0-10 0 0-10
01-4-111 II II > 50 11-50 0 > 50 0-10 0-10 0 0-10
Legend: I) low cottony apiculated colony with pigment; II) low cottony apiculated colony without pigment; III) high cottony colony with pigment and IV) high
cottony colony without pigment.
102
TABLE 2: Morphology, width and size of macroconidia from M. canis strains analyzed in different culture mediums.
Macroconidia morfology Width of macroconidia ( P Size of macroconidia ( P
Collection Rice Potato Sabouraud Lactrimel Rice Potato Sabourau Lactrimel Rice Potato Sabouraud Lactrimel
number agar agar agar agar agar agar d agar agar agar agar agar agar
01-3-156 1 0 0 1 > 12.5 - - > 12.5 > 50 - - > 50
01-3-162 1 2 1 1 > 12.5 < 12.5 < 12.5 > 12.5 > 50 > 50 > 50 > 50
01-3-163 0 0 0 2 - - - > 12.5 - - - > 50
01-3-164 1 2 0 1 > 12.5 > 12.5 - > 12.5 > 50 > 50 - > 50
01-3-166 0 0 0 1 - - - > 12.5 - - - > 50
01-3-167 1 2 0 1 > 12.5 > 12.5 - > 12.5 > 50 > 50 - > 50
01-3-168 1 1 2 1 > 12.5 > 12.5 < 12.5 > 12.5 > 50 > 50 < 50 > 50
01-3-171 0 0 0 1 - - - > 12.5 - - - > 50
01-3-172 1 2 1 1 > 12.5 < 12.5 < 12.5 > 12.5 > 50 > 50 > 50 > 50
01-3-173 1 1 2 1 > 12.5 > 12.5 < 12.5 > 12.5 > 50 > 50 > 50 > 50
01-3-174 1 1 2 1 > 12.5 > 12.5 > 12.5 > 12.5 > 50 > 50 > 50 > 50
01-3-175 1 1 1 1 > 12.5 > 12.5 < 12.5 < 12.5 < 50 > 50 - > 50
01-3-176 0 0 0 0 - - - - - - - -
01-3-177 1 1 1 1 > 12.5 > 12.5 > 12.5 > 12.5 > 50 > 50 > 50 > 50
01-3-178 1 2 0 1 > 12.5 > 12.5 - > 12.5 > 50 > 50 - > 50
01-3-179 1 1 0 1 > 12.5 > 12.5 - > 12.5 > 50 > 50 - > 50
01-3-180 1 1 0 1 > 12.5 > 12.5 - > 12.5 > 50 > 50 - > 50
01-4-101 0 1 0 1 - > 12.5 - > 12.5 - > 50 - > 50
01-4-110 1 1 0 1 > 12.5 > 12.5 - > 12.5 > 50 > 50 - > 50
01-4-111 1 1 0 1 > 12.5 > 12.5 - > 12.5 > 50 > 50 - > 50
Legend : (0) Sterile strain; (1) Classical Macroconidia of M. canis; (2) Anomalous Macroconidia
103
TABLE 3 – Patterns of restriction of the ITS domain from M. canis strains.
Site of restriction in
Enzymes
M. canis Width of bands
(bp)
Eco RI present 350pb; 420pb
90pb; 190pb; 260pb;

Dde I present 230pb
Sau 3A I present 300pb; 370pb; 80pb
Rsa I absent 750pb
FIGURE 1: Profiles of RAPD from M. canis strains isolated from dogs and cats in
Northeast Brazil.
104
Legend: Line 2 (White control); lines 1,3,4,5,6,7,8 and 9 (M. canis srains)
105
CANADIAN JOURNAL MICROBIOLOGY
ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY AND GENOTYPICAL PATTERN OF

MICROSPORUM CANIS STRAINS
R. S. N. BRILHANTE1,2, R. A. CORDEIRO2,3, D.J.A.MEDRANO2, A.J.

MONTEIRO 4, J. J. C. SIDRIM2, M. F. G. ROCHA1,3
1
Faculty of Veterinary, Post-Graduation Program in Veterinary Science, State
University of Ceará. Fortaleza - CE, Brazil.
2
Department of Pathology and Legal Medicine, Faculty of Medicine, Medical
Mycology Specialized Center, Federal University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
3
Department of Biology, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
4
Department of Statistics and Applied Mathematics, Federal University of Ceará,
Fortaleza-CE, Brazil.
Author for correspondence: R. S. N. BRILHANTE. Rua Barão de Canindé, 210;
Montese. CEP: 60.425-540. Fortaleza, CE, Brazil. Phone: 55 (85) 214-2853. Fax: 55
(85) 295-1736. E. mail: samiamic@yahoo.com.br
106
ABSTRACT
Dermatophytes are a group of fungi that have are capable of invading keratinized
tissues of humans and animals. Antifungal susceptibility analysis and genetic studies
by Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD), have been used to detect
polymorphism as well as determining the possible resistance of dermatophytes to
antifungals. The aim of this study was to evaluate the possible correlation between
the antifungal susceptibility and genotypical pattern of M. canis strains isolated in
dogs and cats with dermatophytosis in Northeast Brazil. The antifungal susceptibility
study was conducted by using the broth microdilution test with griseofulvine,
ketoconazole, itraconazole and fluconazole. The genotypical analysis was done by
the RAPD method. The antifungal susceptibility analysis showed that all the strains of
M canis analyzed (n=22) were sensitive to griseofulvine (0.25 µg/ml ≤ MIC ≤ 1µg/ml),
ketoconazole (0.25 µg/ml ≤ MIC ≤ 2 µg/ml), itraconazole (0.25 µg/ml ≤ MIC ≤ 1µg/ml)
and fluconazole (1 µg/ml ≤ MIC ≤ 16 µg/ml). The RAPD testing evidenced that all
analyzed strains are genetically similar. Thus, based on antifungal susceptibility
analysis and RAPD data, a possible correlation can be shown between the antifungal
susceptibility and the genotypical pattern of the strains of M. canis from Northeast -
Brazil.
Key Words: Microsporum canis, antifungal susceptibility testing and genotypical

pattern.
107
RÉSUMÉ
Les dermathophytes sont um groupe de champignons qui ont la capacité d'envahir

des tissus kératinisés d'humain et d'animaux. L’analyse de la sensibilité in vitro à des
antifongiques et des étude génétiques par Amplification Aléatoire de DNA
Polymorphique (RAPD) ont été utilisés pour détecter un polymorphisme ainsi que
pour mettre en évidence une possible résistance des dermatophytes aux
antifongiques. L’objectif cette étude a été d'évaluer la possible corrélation entre la
sensibilité aux antifongiques et le pattern génotypique de souches de M. canis
isolées de chiens et de chats atteints de dermatophytose, au nord-est du Brésil.
L'étude de la sensibilité aux antifongiques a été réalisée en utilisant le test de la
microdilution avec 4 drogues antifongiques: fluconazole, itraconazole, cetoconazole
et griseofulvine. L’analyse génétique de M. canis a été réalisée par la technique de
RAPD. L’analyse de la sensibilité aux antifongiques a démontré que toutes les
souches de M. canis analysées (n=22) étaient sensibles à la griseofulvine (0.25
µg/ml ≤ MIC ≤ 1µg/ml), au ketoconazole (0.25 µg/ml ≤ MIC ≤ 2 µg/ml), à
l'itraconazole (0.25 µg/ml ≤ MIC ≤ 1µg/ml) et au fluconazole (1 µg/ml ≤ MIC ≤ 16
µg/ml). D'autre part, ;la technique de RAPD a mis en évidence que toutes les
souches analysées étaient génétiquement similaires. Sur base de ces données, une
possible corrélation entre la sensibilité aux antifongiques et le pattern génotypique de
souches de M. canis provenant du nord-est du Brésil a pu être mise en évidence.
Mots-clés: M. canis, tests de sensibilité, RAPD.
108
Dermatophytes are a group of fungi that have are capable of invading
keratinized tissues of humans and animals (Weitzman & Summerbell 1995). The
microorganisms belong to three genera of fungi, Trichophyton, Microsporum and
Epidermophyton (De Hoog et al. 2000; Sidrim & Rocha 2004). Among the
dermatophytes, Microsporum canis constitutes the main species involved in
infections of cats and dogs (Cabañes 2000; Brilhante et al. 2003).
Over the last few years, effective antifungal drugs have been introduced into
clinical practice. Among them, terbinafine and azoles, such as itraconazole,
fluconazole and more recently voriconazole, albaconazole, sertaconazole and
eberconazole have been reported to have substantial activity, in vitro, against a
significant number of dermatophyte strains (Barchiesi et al., 2001, Bossche 2003,
Carrillo-Munoz et al. 2003, Fernandez-Torres et al., 2001, Fernandez-Torres et al.,
2003, Favre et al. 2003, Karaca and Koç 2004). Griseofulvine (Sparkes et al. 2000),
terbinafine (Chen 2000), ketoconazole (Carlotti & Couprie 1998) and itraconazole
(Colombo et al. 2001) have been reported to be an effective antifungal in the
treatment of dermatophytosis in dogs and cats.
The establishment of a in vitro reference antifungal susceptibility test may
allow the veterinarian to select the appropriate therapy for the treatment of infections
caused by dermatophytes. Broth dilution and agar-diffusion methods are the most
common techniques for antifungal testing (Pfaller et al. 2000; Fernandez-Torres et
al., 2002b, Favre et al. 2003; Karaca and Koç 2004). Antifungal susceptibilities and
genetic relationship of fungi, using the Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
method, have been described by some authors to detect polymorphism in fungal
strains as well as determinig the possible reason for antifungal resistance (Bradley et
al. 1999; Mukherjee et al. 2003).
The purpose of this study was to evaluate the possible correlation between the
antifungal susceptibility and genotypical pattern of M. canis strains isolated in dogs
and cats with dermatophytosis in Northeast Brazil.
The strains were obtained from the fungal collection of the Medical Mycology
Specialized Center (MMSC) of the Faculty of Medicine at the Federal University of
Ceará, Brazil. The strains were maintained in saline (0.9% NaCl), at 28°C, until used.
At the time of the analysis, an aliquot of the solution was taken and inoculated into
potato dextrose agar (Difco, Detroit, USA), and then incubated at 28°C for ten days.
109
A total of twenty-two strains of M. canis were analyzed by the antifungal sensibility
test. Ten strains were chosen at random for the genotypical analysis.
The broth microdilution assay for antifungal susceptibility testing was

performed as described by Jessup et al. (2000) and Fernandez-Torres et al. (2002a),
based on the M38-P method, in accordance with the Commitee for Clinical
Laboratory Standards (NCCLS). Candida parapsilosis (ATCC 22019) and C. krusei
(ATCC 6528) were included as quality controls. A standardized inoculum (5 x 104
CFU/ml) was prepared by turbidimetry. Stock inocula were prepared from 10-day
cultures grown on potato dextrose agar at 28°C. Sterile normal saline (0.9%) was
added to the agar slant, and the cultures were gently swabbed to dislodge the
conidia from the hyphal mat. The suspension of conidia and hyphal fragments was
transferred to a sterile tube, and the volume adjusted to 4 ml with sterile normal
saline. The resulting suspension was allowed to settle for 5 min at 28 ºC, and its
density was read at 530 nm and adjusted to 95% transmitance. The suspensions
containing conidia and hyphal fragments were diluted 1:5 with RPMI 1640 medium
with L-glutamine, without sodium bicarbonate (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.),
buffered at pH 7.0 with 0.165M morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) (Sigma
Chemical Co., St. Louis, Mo.) to obtain the inoculum size of approximately 5 x 104
CFU/ml. Fluconazole stock solution was prepared in sterile distilled water;
itraconazole (Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgium), griseofulvine (Sigma
Chemical Co., St. Louis, Mo.) and ketoconazole were dissolved in 100% dimethyl
sulfoxide. Drug dilutions were prepared at 10 times the final concentration, followed
by further dilutions (1:50) in RPMI 1640 medium to yield twice the final concentration
required for the test.
The microdilution assay was performed in 96-well microdilution plates. Growth

and sterility control wells were included for each isolate tested. The microplates were
incubated at 35°C and were read visually after 4 days, as recommended by Jessup
et al. (2000). All isolates were run in duplicate and repeated at least twice. The study
was analyzed utilizing the Wilcoxon test and the Friedman test. A p value of <0.05
was considered significant.
The MIC of itraconazole, fluconazole and ketoconazole was defined as the

concentration at which the growth of the organism was inhibited by approximately
110
80% compared with the growth in the positive control, as recommended by Jessup et
al. (2000). For griseofulvine, the MIC was considered to be the lowest concentration
of the drug at which there is no fungal growth.
Fungal DNA was extracted according to the procedure described by Talbot

(2001), with modifications. Briefly, ten strains of M. canis were grown in Brain Heart
Infusion Broth (Difco, Detroit, MI, USA) for 10 days, at 28°C, under shaking
conditions (70 rpm). The mycelium was collected by centrifugation, and
approximately 2 grams (wet weight) were treated with cetyltrimethyl ammonium
bromide (CTAB) extraction buffer (0.7 M NaCl, 2% CTAB, 100 mM Tris, 10 mM
EDTA, 1% 2-mercaptoethanol), and incubated for at least 2 hours at 65°C, followed
by chloroform/isoamyl alcohol (24:1, v/v) extraction and centrifugation at 5000 rpm for
20 minutes. The supernatant was mixed with 0.54 vol of isopropanol, left on ice for 2
hours and then centrifuged as describe above. The pellet was then washed with 2
mL of 3 M NaCl, precipitated in 3 mL of 70% ethanol and centrifuged at 5000 rpm for
20 minutes. The DNA pellet was dried, resuspended in deionized water and frozen at
–20°C .
RAPD assays were performed with the following random primers: OPA 01 (5'-
CAGGCCCTTC-3'); OPA 02 (5'-TGCCGAGCTG-3'); OPA 03(5'-AGTCAGCCAC-3');
OPA 04 (5'-AATCGGGCTG-3'); OPA 05 (5'-AGGGGTCTTG-3') (Invitrogen, SP,
Brazil). The reactions were performed in 10 µL volumes containing the following:
reaction buffer (50 mM L-1 KCl, 10mM L-1 Tris-HCl (pH 9.0), 0.1% Triton X-100); 2 mM
MgCl2; 0.5 mM of each deoxynucleoside triphosphates (Perkin Elmer, Branchburg,
NJ, USA); 10 pmol of OPA’s primer; 1 U of Taq DNA polymerase (Promega,
Madison, WI); and 20 ng of genomic DNA. The amplification parameters consisted of
one cycle of 4 minutes of denaturation at 94°C, 45 cycles of 20 s at 94°C of
denaturation, primer annealing for 1 minute at 35°C and extension for 1 minute at
72°C; with one final extension step at 72°C for 10 minutes. The fingerprints were
produced by electrophoresis (2 µl of each amplicon) in 6% polyacrilamide gels in
0.5X TBE buffer (Tris-borate [0.045 M] and EDTA [0.001 M]) at 100V for
approximately 30 minutes, and silver stained as described by Sanguinetti et al.
(1994).
The results for the in vitro susceptibility of the four drugs tested are summarized
in Table 1. In general, all drugs showed good activity, although fluconazole displayed
111
the broadest MIC range (1 to 16 µg/ml). Using Friedman’s non-parametric test, it was
determined that the drugs showed different MICs values (p=0.000). Comparing the
drugs using Wilcoxon’s non-parametric test, it was noted that itraconazole showed MICs
smaller than griseofulvine (p=0.004) which showed MICs smaller than ketoconazole
(p=0.047) which in turn presented MICs smaller than fluconazole (p=0.000).
RAPD analyses were done in duplicate and the same genotypical profile was
observed for all analysed M. canis, independent of the origin of the strain (dog or
cat). Fingerprintings revealed bands from 200 bp to more than 800 bp for all random
primer pairs the tested (data not show)
The National Comittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 1997), by
way of document M27A, proposed a methodology to analyze, in vitro, the antifungal
susceptibility of yeast with clinical importance (NCCLS - 1997). More recently, the
broth microdiluition reference method (NCCLS document M-38P) was adapted for
filamentous fungi. However, dermatophyte fungi were not included (Gupta & Kohli
2003). Consequently, the susceptibility tests for this group of fungi in this paper were
based on the studies of Jessup et al. (2000) and Fernandez-Torres et al. (2002a).
In this research, four antifungal drugs were analysed in 22 strains of M. canis;
azoles were also tested against C. parapsilosis (ATCC 22019) and C. krusei (ATCC
6528). The results agreed with those seen by several authors, despite some
variations that can be explained by differences in the proportion of the inoculum,
culture medium used, temperature and incubation time (Guarro et al. 1997;
Manavathu et al. 1999; Pujol et al. 1997).
Griseofulvine is considered the drug of choice and it is usually used in the
small animal clinics in the region where the study was conducted. The MIC of this
drug ranged from 0.25 to 1µg/ml. These data agree with the reports from Jessup et
al. (2000), who found MICs of 0.25 - 1µg/ml for 8 strains of M. canis. Moreover, the
resistance of dermatophytes to griseofulvine is considered to be rare, being reported
only in strains of T. rubrum (Korting et al. 1995).
Ketoconazole, like griseofulvine, is also used in small animal clinics in the
region. The MIC found in the strains of M. canis varied from 0.125 to 2 µg/ml.
Fernandes-Torrez et al. (2001) showed that there is excellent activity of this
antifungal drug against dermatophyte strains, among them M. canis, with MICs
around 0.25 µg/ml. However, Maia et al. (2001), in their trials in São Paulo City
112
(Brazil), found 6 (20%) strains of M. canis resistant to ketoconazole with MIC =
32µg/ml. Fernandez-Torres et al. (2003), in a comparative study of susceptibility
testing of 30 strains of dermatophytes, reported that MICs generated from agar-
based techniques tended to be higher than those produced by broth assays, and
inexperienced reading of MIC end points can contribute to poor reproducibility of
results.
Regarding itraconazole, our results agree with those of Barchiesi et al. (2001),
who analyzed 16 strains of M. canis. The MIC range obtained in this study was the
same seen by as these authors (0.25 - 1µg/ml). Fernandez-Torres et al. (2001) and
Favre et al. (2003), also demonstrated itraconazole MICs < 0.5 for M. canis strains.
Although fluconazole displayed the broadest MIC range (1 to 16 µg/ml), our results
agree with literature findings (Fernandez-Torres et al. 2001, Maia et al. 2001, Favre
et al. 2003).
The analysis by RAPD with OPA random primer pairs showed no differences
in the fingerprint patterns of M. canis strains. Faggi et al. (2001), in their analysis of
PCR fingerprints in 6 strains of M. canis from humans, 8 strains from dogs and 4
strains from cats, also showed similarities in the electrophoretic patterns. Jin et al.
(2004), using primers OPI 07 and OPK 20 in RAPD, found identical pattern in all the
strains of M. canis, independent of the origin of the strain. Alphies (2001) found the
same patterns in M. canis isolated from different geographical origins, suggesting
primary clonal origin of M. canis. It is possible that more discriminatory primers or a
genetic analysis based on mitochondrial DNA, as suggested for the dermatophyte
Trichophyton rubrum (de Briéve et al., 1987), could detect different M. canis
genotypes.
The present study showed that that all of the antifungal drugs were effective
on the strains of M. canis tested. In this study, using RAPD analysis, no differences in
the fingerprint patterns among any of the isolates could be detected. The strains
showed similar genotype and susceptibility pattern but no conclusions can be drawn
about this correlation. Further studies, with a larger number of samples, need to be
undertaken in order to detect polymorphisms among the isolates of M. canis,
indicative of interspecific genotypical variation.
113
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118
Table 1 – In vitro antifungal susceptibilities of 22 isolates of Microsporum canis,
determined by the microdiluition test broth.
MIC (ug/ml)
Antifungal agent
Range Geometric mean 50% 90%
Griseofulvine 0.25 -1 0.707 0.52 0.88

Ketoconazole 0.125 - 1 0.91 0.47 1.11
Fluconazole 1 - 16 5.838 4.08 10.3
Itraconazole 0.25 - 1 0.322 0.09 0.55
119

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Universidade Estadual do Ceará

Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante

Caracterização fenotípica e genotípica de

Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante

Caracterização fenotípica e genotípica de

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Título do Trabalho: Caracterização fenotípica e genotípica de Microsporum canis

Autora: Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante

Defesa em ____/ ____/ _________ Conceito:

Marcos Fábio Gadelha Rocha, Prof. Dr.

Co-Orientador /Examinador (UFC) Examinador (UNIFESP)

Examinador (UECE) Examinadora (UFC)

A Deus, pela minha saúde e força de trabalho.

Aos meus irmãos, Mônica Brilhante e Roberto Brilhante, presentes em toda

Ao Prof. Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, orientador do mestrado e

Aos Professores, Dr. Zoilo Pires de Camargo, Dr. Nilberto Robson F. do

Ao Professor João Vianney Campos de Mesquita, pela revisão estilística e

Ao Prof. Dr. André Jalles Monteiro, do Departamento de Estatística e

Aos amigos, Olavo Moraes, Terezinha Santos, Ivanclébio Pires, Carlos

Aos professores e aos colegas do PPGCV, em especial Isaac Neto, Regiane

Às minhas queridas amigas biólogas, Rossana Cordeiro, Ana Beatriz Duarte e

À coordenadora do PPGCV, Prof.a Dr.a Maria Fátima da Silva Teixeira, meu

Aos médicos veterinários Lúcio Jackson Queiroz Chaves, José Maurício

As Clínicas Veterinárias Pró-Saúde Animal, Amigo Meu, São Francisco,

Ao Centro Especializado em Micologia Médica da Universidade Federal do

À CAPES, pela concessão de bolsa de pesquisa.

Os dermatófitos formam um grupo de fungos que possuem a capacidade de invadir

2 Macroconídio de M. canis medido por meio de retículo acoplado à objetiva 31

3 Provas de requerimentos vitamínicos 31

4 Extração de DNA. A – Micélio de cepas de M. canis após lavagem com 33

5 Extração de proteínas através de solventes orgânicos A: Fase aquosa 33

6 Aplicação da amostra em gel de poliacrilamida 36

7 Técnica de microdiluição em placa. A - Distribuição de RPMI e drogas 39

8 Exame direto do pêlo com KOH 30% mostrando artroconídios microspóricos 41

9 Macroscopia da colônia de M. canis. A - Colônia de textura algodonosa 42

10 Quantificação de macroconídios. A – Cepa com hifas estéreis; B – Cepa 43

11 Mensuração de macroconídios. A – Comprimento de macroconídios 44

13 RAPD com OPK 17 em cepas de M. canis isoladas de cães e gatos no 48

14 Gel de poliacrilamida de M. canis exemplificando a reação de PCR-REA de 50

1 Cepas de M. canis utilizadas na fenotipagem, PCR-REA e RAPD utilizando 27

2 Cepas de M. canis (n=22) utilizadas nos testes de sensibilidade in vitro a 28

3 Reagentes e concentrações utilizados na reação de RAPD 34

4 Reagentes e concentrações utilizados na reação de PCR 37

5 Drogas antifúngicas e concentrações em RPMI utilizadas na pesquisa 39

6 Macromorfologia e quantificação de macro e microconídio de M. canis em 45

7 Morfologia,largura e tamanho de macroconídios de M. canis analisados 46

8 Padrões de restrição ITS de M. canis 49

9 Comportamento das cepas de M. canis frente aos derivados azólicos e 52

10 Perfil de sensibilidade antifúngica das cepas de M. canis. 53

3.2 Objetivos específicos 25

4.1 Seleção das amostras e etapas da pesquisa 26

4.2.1 Exame direto 29

4.2.2 Caracterização fenotípica – Macro e micromorfologia 29

4.2.3 Diferenciação microscópica das colônias 29

4.2.4 Prova de requerimentos vitamínicos 31

4.3 Estocagem e Recuperação das cepas da micoteca para testes 32

4.4 Extração de DNA genômico 32

4.5 Quantificação de DNA 34

4.6 Reação de RAPD 34

4.7 Eletroforese em gel de poliacrilamida 35

4.8 Reação de PCR - REA 39

4.9 Teste de sensibilidade antimicrobiana in vitro 38

4.10 Análise estatística 40

Defesa em / / _____ Conceito: