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Biorremediação de solos contaminados-PAH com fungos - Do

laboratório para a escala de campo

Artigo dentro Internacional Biodeterioração & Biodegradação · jan 2014

DOI: 10.1016 / j.ibiod.2013.09.012

CITAÇÕES LÊ

46 885

10 autores , Incluindo:

Eija Schultz

Finlandês Instituto do Ambiente Finlandês Instituto do Ambiente

35 PUBLICAÇÕES 491 CITAÇÕES 52 PUBLICAÇÕES 1.028 CITAÇÕES

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Markus Antero Räsänen Kalle Salonen

Universidade Aalto Universidade Aalto

7 PUBLICAÇÕES 55 CITAÇÕES 16 PUBLICAÇÕES 251 CITAÇÕES

marinhos subarctic (OILRES) Ver projeto Katarina Björklöf

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Internacional Biodeterioração & Biodegradação

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Biorremediação de solo contaminado com fungos-HAP e Do laboratório para a fi escala

eld

Erika Winquist uma , * , Katarina Björklöf b , Eija Schultz b , Markus Räsänen uma , Kalle Salonen uma ,
Festus Anasonye c , A MA s Cajthaml d , Kari T. Steffen c , Kirsten S. Jørgensen b ,
Marja Tuomela c
uma Departamento de Biotecnologia e Tecnologia Química, Escola Superior de Tecnologia Química da Universidade Aalto, PO Box 16100, FI-00076 Aalto, na Finlândia
b Finlandês Instituto do Ambiente, PO Box 140, FI-00251 Helsinki, Finlândia
c Departamento de Ciências Ambientais Alimentação e da Universidade de Helsinki, PO Box 56, FI-00014 Helsinki, Finlândia
d Laboratório de Biotecnologia Ambiental, Instituto de Microbiologia, Academia de Ciências da República Checa, Vide nska 1083, CZ-14220 Prague 4, República Checa

articleinfo abstrato

Historia do artigo: O objectivo deste estudo foi desenvolver um método de biorremediação fúngica que poderia ser usado para solos fortemente contaminados
Recebido 15 de maio de 2013 com compostos orgânicos persistentes, como os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH). serração solo, contaminado com HAP, foi
Recebido em forma revisada 16 de
misturado com o lixo verde compostagem (1: 1) e incubadas com ou sem inoculo de fungos. Os tratamentos foram realizados no laboratório e fi escalas
setembro, 2013
ELD. No tratamento escala de laboratório (concentração a partir de 3500 mg kg 1, soma de 16 PAH) PAH de elevado peso molecular foram
Aceito 17 de setembro de 2013 Disponível on-line
degradados signi fi cativamente mais nos microcosmos inoculados-fúngicos do que nos não inoculadas. Nos microcosmos inoculados com Phanerochaete
13 de novembro, 2013
velutina, 96% de HAP 4-anel e 39% de 5- e 6-anel HPAs foram removidos em três meses. Nos microcosmos não inoculadas, 55% de 4-anel
HAP e apenas 7% de 5- e 6-anel HPAs foram degradados. No entanto, durante o fi escala de campo (2 t) experimento no menor concentração
Palavras-chave:
de partida (1400 mg kg 1, soma de 16 PAH) a degradação% foi semelhante em ambos o
biorremediação
Fungos
Phanerochaete velutina
hidrocarbonetos poliaromáticos P. velutina- inoculadas e não inoculadas os tratamentos: 94% dos 16 HPAs foram degradados em três meses. No fi experimento em escala campo
creosoto do número de cópias de bactérias gram-positivas genes de hidroxilação dioxigenase HAP de anel verificou-se aumento de 1000 vezes, indicando
Solo contaminado que a degradação bacteriana HAP também desempenhado um papel importante.

2013 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.

1. Introdução
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP), são resistentes a degradação microbiana devido
à sua baixa solubilidade em água e estrutura complexa, com dois ou mais anéis de benzeno fundidos
( Antizar-Ladislao et al., 2004 ). Uma vez que muitos PAHs são tóxicos e cancerígenos, sua
acumulação no ambiente é de grande preocupação. A fonte típica de contaminação HAP no solo é
creosoto de alcatrão de hulha, whichwas comumente usado para preservar e dormentes
impermeáveis ​e postes da linha de energia. Particularmente na Finlândia, antigos locais de serraria
constituem um grande problema. Além de HAP, tais sujidades podem conter clorofenóis, dibenzo-
policlorados p dioxinas e -furans (PCDD / F), e metais pesados ​( Kitunen et al., 1987 ).
As bactérias degradam compostos PAH por um processo de assimilação onde eles ganho de
carbono e de energia para o crescimento, que tipicamente
leva a mineralização do composto ( Kästner et al., 1994; Haderlein et al., 2006 ). As bactérias
geralmente usam enzimas dioxigenase intracelulares para a degradação de HAP ( Johnsen et al.,
2005 ). A degradação bacteriana aeróbia de compostos de HAP é iniciada por uma oxigenação da
estrutura do anel para formar um cis diidrodiol seguido por uma desidrogenação para formar
intermediários dihidroxilado. A via enzimática da degradação HAP e os genes que codificam para as
enzimas correspondentes são bem conhecidos. Uma ampla gama de bactérias tanto gram-positivas
e gram-negativos são conhecidos por degradar HAP, e seus genes são um pouco diferentes ( Cebron
et al., 2008 ). bactérias gram-negativas, tais como a Burkholderia ( b- Proteobacteria), pode facilmente
degradar 2- ou 3-anel HAP, enquanto que as bactérias gram-positivas, tais como Mycobacterium, são
mais ef fi caz na degradação de HAP anel superior ( Johnsen et al., 2005 ). fungos ligninolíticas
também são capazes de degradar PAHs e eles podem até mesmo ser mais ef fi degradadores cientes
do que as bactérias ( Davis et al., 1993 ). Ao crescer sobre madeira ou maca, fungos degradar lenhina
com enzimas oxidantes extracelulares em um processo de co-metabólica ( Hatakka,

* Autor correspondente. Tel .: º 358 50 573 1529.

Endereço de e-mail: erika.winquist@aalto. fi ( E. Winquist).

0964-8305 / $ e ver a matéria frente 2013 Elsevier Ltd. Todos os direitos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.ibiod.2013.09.012
 E. Winquist et al. / Internacional Biodeterioração & Biodegradação 86 (2014) 238 e 247 239

2001 ). Estas enzimas ligninolíticas são não-especí fi c e função através de reacções de radicais. Além
de lignina, eles são capazes de degradar compostos com semelhanças estruturais com lenhina, tais
como diversos produtos químicos orgânicos, por exemplo, xenobióticos (HAP Tuomela e Hatakka de
2011 ). enzimas ligninolíticas de fungos pode ter um papel importante no ataque inicial sobre
elevadas HAP peso molecular no solo ( Sack et al., 1997; Harms et al., 2011 ). Uma vez que as
enzimas ligninolíticas são extracelular, eles são capazes de se difundir de forma eficaz aos imóveis
altamente elevados HAP peso molecular. Os metabolitos resultantes são mais solúveis em água, e,
portanto, mais biodisponível. Os compostos formados podem ser substratos para muitas bactérias ( Sack
et al., 1997 ), Mas theymay também ser adicionalmente degradados por enzimas intracelulares
fúngicas,
tal como citocromo P-450 monooxigenase
( Pozdnyakova de 2012 ). Quando a degradação de vários PAH por
Irpex lacteus foi estudado, as estruturas de alguns dos metabolitos envolvimento de ambas as
enzimas ligninolíticas e do citocromo P-450 monooxigenase (sugeridas Cajthaml et al., 2002a, 2006 ).
Além de mineralização, um signi fi fracção de escala de HAP é incorporada em substâncias húmicas
durante biorremediação ( Kästner et al., 1994, 1999 ).
solo contaminado com óleo pode ef fi cientemente ser remediada por compostagem ( Jørgensen
et al., 2000 ). Muitas vezes, estes solos contêm também compostos PAH. HAP de baixo peso
molecular contendo dois ou três anéis de benzeno são degradados durante um processo de
compostagem bem otimizado ( Antizar-Ladislao et al., 2004 ). Ao contrário do óleo de petróleo, óleo de
creosoto consiste principalmente de HAP. Várias estratégias de biorremediação de solo contaminado
com HAP têm sido investigadas, tais como alteração com vários tipos de composto ( Semple et al.,
2001; Antizar-Ladislao et al., 2004 ) E bioaumentação com várias espécies de fungos ( Pozdnyakova
de 2012 ). Scienti fi c investigação apoia a base da elevada diversidade de biorremediação e tem
mostrado que inóculo fúngico complementa positivamente as comunidades bacterianas no solo e em
muitos aspectos, estimula a degradação de contaminantes ( Kohlmeier et al., 2005; Snajdr et al,
2011.; Furuno et al, 2012.; , Lladó et al. 2012 ). No entanto, poucos estudos têm relatado up-scaling
de tratamento fúngico ( Steffen e Tuomela de 2010 ).
acção de enzimas degradativas extracelulares, que não requerem a penetração nas células e são
muitas vezes negligenciado ( Leonardi et al., 2007; Covino et al., 2010 ). Particularmente, elevados
HAP peso molecular têm solubilidade lowwater e taxa de distribuição de alta sólido / água. Em solo
contaminado envelhecido, eles podem não ser porque bioaccessible de sorção (adsorção a
superfícies sólidas, a absorção em matéria orgânica), aprisionamento físico (imobilização em
microporos) e ligação covalente (acoplamento oxidativo de compostos fenólicos) ( Kästner et al., 1999 ).
Este trabalho examina a adição de ambos inoculo de fungos e greenwaste compostagem para
um solo serraria contaminados com HAP em dois ambientes: um laboratório e uma fi escala campo.
O creosoto envelhecido contaminado solo, utilizado em ambas as escalas de tratamento, continham
quantidades consideráveis ​de fl uoranthene (35% de 16 PAH) e pireno (18% de 16 PAH), que contêm
quatro anéis de benzeno. Até mesmo alguns fi Ve- para PAH seis anel estavam presentes e a
quantidade total de 16 PAH (listada pela Agência de Protecção Ambiental dos Estados Unidos) foi
elevada (6000 mg kg 1). Estudou-se a capacidade dos fungos ligninolíticas seleccionados a crescer no
solo, produzem enzimas oxidantes extracelulares, e degradam-se compostos de HAP. A adição de
resíduos compostados verde melhorada a estrutura do solo para uma melhor arejamento e
capacidade de retenção de água, e desde que a matéria orgânica como uma fonte de carbono e
energia para fungos ( Semple et al., 2001 ). Para determinar o papel da degradação PAH bacteriana
nos tratamentos, nós quanti fi ed HAP genes de degradação por PCR quantitativa. Além disso, para
prever a fracção bioaccessible de PAH em solo, supercrítico fl foi usada extracção uid (SFE) ( Cajthaml
e Sa sek, 2005 ). Os resultados foram comparados com biodegradação da fracção bioaccessible.
Uma vez que alguns dos metabolitos formados durante biorremediação dos compostos de HAP pode
ser mais tóxico do que os compostos parentais ( Lundstedt et al., 2007 ), O solo foi também testado
para a ecotoxicidade antes e após o tratamento.

2. Materiais e métodos

2.1. Solos e propriedades do solo

O objectivo deste estudo foi desenvolver um método de biorremediação que poderia ser usado
para solos fortemente contaminados com compostos orgânicos persistentes, como os altos HAP
peso molecular. Biorremediação oferece uma alternativa sustentável para outros métodos de
tratamento, tais como tratamento térmico e estabilização betume ( Khan et al., 2004 ). Biorremediação
requer muito menos energia do que o tratamento térmico. Além disso, a matéria-prima para a
estabilização de betume é derivado de petróleo e a solução não pode ser considerada como fi nal
porque os contaminantes não são degradados mas apenas ligado à matriz. O Regulamento n.º
850/2004 dada pela Comunidade Europeia (2004) declara: “ O teor de poluentes orgânicos
persistentes nos resíduos é para ser destruído ou irreversivelmente transformadas em substâncias
que não apresentem características semelhantes, a não ser que outras operações são preferíveis em
termos ambientais. ” Portanto, métodos de tratamento que realmente destroem os contaminantes
deve ser sempre o fi escolha primeiro.
Pesadamente contaminada de solo em HAP (6000 mg kg 1) a partir de um ex serração foi
utilizada nas experiências ( tabela 1 ). Uma pilha estoque dos mesmos originwas utilizado para a fi experimento
em escala campo, após o armazenamento do solo escavado ao ar livre por um ano. Comercialmente
disponível compostagem de resíduos verdes (Helsinki Região Serviços Ambientais Autoridade,
Finlândia) foi utilizado para diluir o solo contaminado-PAH. A matéria seca do solo foi determinado
por secagem do solo fresco a 105 C durante 16 h e o teor de matéria orgânica como perda na ignição
(% em massa de dm) depois de 4 h a 550 C. O pH do solo foi medida em 1 mol L 1 solução de KCl
com uma relao de suspens de 1: 2,5 (w / v).
concentração de HAP foi medida como a soma de 16 PAH nomeadamente: naftaleno,
acenaftileno, acenafteno,
fl uorene, fenantreno, antraceno, fl uoranthene, pireno, benzo (a) antraceno,
chrysene, benzo (b) fl uoranthene, benzo- (k)

Para um processo de biorremediação para ser bem sucedido os microrganismos ou as suas

tabela 1
enzimas, precisa de estar em contacto físico com o contaminante orgânico. Ambas as propriedades
Propriedades dos solos utilizados nos experimentos de laboratório.
do solo e o tipo de contaminante a determinar a biodisponibilidade e a biodisponibilidade ( Harms de
2011 ). Biodisponibilidade representa a fracção que é absorvido pelas células, e pode causar efeitos Solo Matéria seca A matéria orgânica (% concentração de PAH pH,
(%) dm) soma de 16 PAH (mg
tóxicos, ou podem ser biodegradado por mecanismos intracelulares. O termo biodisponibilidade,
kg 1)
muitas vezes também chamado de disponibilidade do ambiente, considera a fração que é
potencialmente disponível para biota no solo. A partir do ponto de avaliação do risco de vista este PAH contaminado 93 2 uma 4 5,8 6000
solo
fenómeno é mais importante do que a concentração total, porque os efeitos tóxicos podem ser
Diluído 76 2 10 6,6 3500
atribuídas a um contaminante apenas quando é acessível ( cvan carova et al., 2013 ). Isto também é
HAP-solo (1: 1)
verdade para os fenômenos de biodegradação que incluem o verde compostagem 59 2 16 7.4 nd b
desperdício

uma valor médio de três réplicas SD.

b nd ¼ não determinado.
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fl uoranthene, o benzo (a) pireno, indeno- (1,2,3-cd) pireno, diben-
zo (a, h) antraceno e perileno benzo (g, h, i). Para a determinação quantitativa de PAH, as amostras
de solo foram extraídos utilizando o método de ultra-sons de acordo com a método EPA 3550C .
Cerca de 8 g de solo (peso húmido) foram colocados num banho de ultra-sons em hermeticamente
fechado
fl peça com 30 ml de acetona durante 30 min. Em seguida, o conteúdo de solvente dos vasos de
extracção foram centrifugadas (5000 g;
10 min). Alíquotas (1 ml) foram transferidas para frascos de 2 mL amostrador automático e 100
solução padrão interna-deuterada foi adicionado (naftaleno-D8,
acenafteno-D10, fenantreno-D10,
criseno-D12, perileno-D13) para cada amostra. As amostras foram depois analisadas usando o
sistema de espectrometria de massa-cromatografia gasosa (5977A Series GC / MSD, Agilent, EUA).
As amostras foram analisadas usando grupo / splitless método de injecção, após a norma ISO
18287: 2006 ( Organização Internacional de Normalização de 2006 ) (SGS Inspection Services Oy,
Finlândia). Os HAP individuais foram monitorizadas com o método de monitorização de iões único
(SIM) usando especi fi c iões dos respectivos representantes HAP. Os pesos secos das amostras de
solo extraídos foram determinados de acordo com a norma ISO 11465: 1993 ( Organização
Internacional de Normalização, 1993 ). Além de HAP, metais pesados ​(As, Cd, Cr, Cu, Ni, Pb, Zn, Hg)
foram analisados ​a partir do solo (SGS Inspecção Oy, Finlândia). A concentração de arsénio (28 mg
kg 1) era ligeiramente mais elevado do que as concentrações naturais (0,1 e 25 mg kg 1) em solos
finlandeses, mas as concentrações dos outros metais pesados ​foram em níveis que ocorre
naturalmente (resultados não apresentados).
2.2. Biodisponibilidade de compostos PAH
A análise bioacessibilidade HAP foi realizada utilizando um extrator de SFE (Labio como,
República Checa). As amostras de solo (1 g) foram colocados na parte inferior de uma célula de
extracção de 2 ml e o volume morto era fi encheram com sulfato de sódio. As amostras foram
extraídas por uma corrente descendente de dióxido de carbono a 50 C e 200 bar. o fl taxa de fluxo foi
ajustada por um restritor manual para 1 ml min 1. Os analitos de HAP foram recolhidas em sílica
octadecil a 20 C e eluiu-se com 12 ml de acetona a 20 C. As extracções foram realizadas em três
corridas paralelas e os compostos foram recolhidas após 5, 10, 20, 40,
60, 80, 120, 160 e 200 intervalos mínimo. Os extractos de acetona foram analisados ​por HPLC
(Waters 2695) equipado com um sistema de díodos (Waters 2996) e um fl detectores de fluorescência
(Waters 2475) ( Covino et al., 2010 ).
Os dessorção curvas cinéticas das PAHs individuais foram modelados com um modelo de dois
locais empírica ( Williamson et al., 1998 ):
S t ¼ FS 0 exp ð? k 1 t Þ þ ð 1 F º S 0 exp ð? k 2 t º;
Onde S t é a concentração dos poluentes que ficam no solo depois da extracção usando SFE em vez t;
F é a fracção de produto químico de libertação rápida; S 0 é a concentração original do poluente no
solo (a concentração total extraído por Accelerated Solvent Extractor, ASE); e k 1 e k 2 são as fi constantes de fosfato de sódio (pH 6,5), e a suspensão foi misturada continuamente (33 rpm) em um misturador
de velocidade de primeira ordem. o parâmetro F ( fracção rápido) representa fracção bioaccessible de
cada HAP e foi a média das três determinações independentes. O valor varia de 0 a 1, em que 1
representa 100% de biodisponibilidade. O valor depois de extracção por solvente acelerada analítica
exaustiva foi considerado como a concentração total (100%) de cada HAP ( cvan carova et al., 2013 ).
2.3. estirpes fúngicas
cepas fúngicas foram obtidos a partir da coleção de fungos Biotecnologia Cultura (FBCC) do
Departamento de Alimentos e Ciências Ambientais, Universidade de Helsinki. Com base em um
estudo anterior
com extenso rastreio de 147 estirpes de fungos ( Valentin et al., 2009 ), Dez estirpes foram
seleccionados para experiências de rastreio: Agrocybe dura FBCC478 (MW71-2), Agrocybe praecox FBCC587
(K163),
Gymnopilus luteofolius FBCC466 (X9), Irpex lacteus FBCC1012 (CCBAS617), Mycena galericulata FBCC598
(K175), Phanerochaete velutina FBCC941 (T244), Physisporinus rivulosus FBCC939 (T241i),
Stropharia aeruginosa FBCC521 (K47), Stropharia rugosoannulata
m l de FBCC475 (11372) e Trametes ochracea FBCC1011 (HAM9) (número de idade estirpe entre
parênteses). As estirpes weremaintained onmalt placas de agar de extracto em º 4 C e sub-cultivadas,
pelo menos, a cada 3 meses.
2.4. As experiências laboratoriais
2.4.1. inoculo fúngico crescido em líquido
inoculo líquido foi preparado por corte de quatro (5 mm 5 mm) rolhões de agar a partir de placas
de agar de extracto de malte. Estes foram extrudidas através de uma seringa para o liquidmedium
estéril em Erlenmeyer de 500 ml
fl pede extracto containing200mlmalt (2% w / v). Fungiwere cultivada durante 6 e 7 dias a 25 C com
agitação contínua (100 e 150 rpm).
2.4.2. inoculo de fungos cultivados em casca
pinheiro silvestre ( Pinus sylvestris) casca é um substrato muito promissor para o cultivo de
inóculo fúngico ( Valentin et al., 2010 ). É um subproduto da pasta de papel, produção de papel e
madeira. casca de pinheiro é composta principalmente de lignocelulose e fornece nutrientes para os
fungos. É também um substrato de crescimento selectivo, uma vez que contém extractivos fenólicos
com propriedades antimicrobianas.
Os fungos foram cultivados em casca em sacos de polietileno de alta densidade (HDPE). Bark
foi fi primeiro embebidas em água durante a noite e, em seguida, drenado. casca molhada, 1 kg em
cada saco de plástico, foi autoclavado (30 min, 121 C) e a casca arrefecida foi inoculado com 200 ml
de inoculo líquido. Os sacos foram incubadas à temperatura ambiente (21 C) e gaseificado
continuamente com ar hidratada (1 l min 1).
O tempo de incubação variou de três a fi ve semanas até que a superfície da casca foi totalmente
coberta com micélio fúngico. A matéria orgânica e de matéria conteúdos secos médios do “ pronto
para usar ” casca inoculumwere 30% e 95% ( Alén de 2011 ), Respectivamente. Para estudar a
actividade da enzima do inoculo de fungos, culturas foram realizadas em pequenos frascos de
plástico (100 g de casca molhado em cada frasco de plástico), em condições semelhantes como na
escala de 1 kg. inoculo líquido (20 ml) foi homogeneizada a 17500 rpm durante 10 s (UltraTurrax
T25, IKA-Werke, Alemanha) e misturado com 100 g de casca molhado. Um frasco representado um
exemplo. Dez amostras (com três repetições) foram colhidas para medições da actividade da
enzima, a partir de 7 a 42 dias após a inoculação, com três a quatro dias de intervalo.
2.4.3. análise de actividade enzima
peroxidase de manganês (MnP) e lacase actividades foram determinadas a partir de casca com
crescimento fúngico. Vinte- fi ve gramas de casca fresca foi suspenso em 50 ml de 50 mM de tampão
de rolos durante 1 h à temperatura ambiente. Posteriormente, foi fi filtradas através de um pano de
nylon, eo fi ltrate foi centrifugado a 4300 g por 15min. A actividade enzimática foi determinada a partir
do sobrenadante. actividade de lacase foi determinada com 2,2 0- azino-
bis( 3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) como o substrato, de acordo com o método de Niku-Paavola
e outros. (1988) . As medições foram realizadas em tampão de succinato de sódio 25 mM (pH
4.5) com um espectrofotômetro (Shimadzu UV-2100, Japão) em 436 nm ( ε 436 ¼ 29300 M- 1 cm 1). actividade
de MnP foi medida a 270 nm, seguindo a formação de Mn (III), complexos de malonato como
descrito por Wariishi et al. (1992) e modi fi ed pela Hofrichter et ai. (1998) ( ε 270 ¼ 11590 M- 1 cm 1). As
actividades estão expressas como mU g- 1 dm da casca.
 E. Winquist et al. / Internacional Biodeterioração & Biodegradação 86 (2014) 238 e 247 241

2.4.4. Rastreio de estirpes de fungos
Os experimentos de triagem foram feitas com fi ve meios de crescimento diferentes: 1)
PAHcontaminated solo, 2) diluída solo PAHcontaminated (1: 1), 3) os resíduos compostados verde ( tabela as células em crescimento, mas não os esporos. No segundo dia, os esporos, que sobreviveu ao
1 ), 4) do solo arenoso contaminado com principalmente hidrocarbonetos de petróleo e 5) do solo
orgânico ligeiramente contaminada. Nestes dois últimos solos a concentração de hidrocarbonetos de
petróleo (C5 e C40) foi de 30.000 mg kg 1 e 140 mg kg PAHs 1 em solo arenoso, e 2300mg kg 1 e 220
mg kg 1
respectivamente em solo orgânico (não incluído no tabela 1 ). Uma placa de Petri foi fi encheram com
solo não estéril, humedecido, se necessário, e 2,5 g de casca de pinheiro com micélio fúngico foi
colocado no topo do solo. O crescimento fúngico foi examinada visualmente durante 30 dias de
incubação à temperatura ambiente no escuro. O teor de umidade do solo foi mantido constante por
adição de água quando necessário.
90 C durante 1 h, o armário foi, em seguida, deixada a arrefecer durante a noite, e vapor foi repetido
no dia seguinte. Este tipo de tratamento térmico é chamado tindalização. o fi primeiro vapor vai matar
fi primeiro vapor, germinaram em células em crescimento. Estas células serão mortos pelo segundo
vapor.
A casca (3,5 kg) em cada carrinho de cultura foi inoculado com 400 ml de inoculo líquido ( P.
velutina) e o fungo foi cultivado durante fi ve semanas à temperatura ambiente (21 C). O ar húmido foi
circulada para o armário de cultivo (30 L min 1). No final da cultura, a superfície da casca foi totalmente
coberta com micélio fúngico.
2.5.2. experimento em escala de campo em pilhas de solo gaseificadas

2.4.5. experiências de degradação em garrafas gaseificadas
Nenhum dos fungos mostraram crescimento visível rastreados em solo contaminado com HAP
não diluído. Portanto, Em outras experiências PAH-
solo contaminado foi misturado com os resíduos compostados verde (1: 1, numa base de massa
húmida) e peneirado através de 5 mmmesh antes da utilização para experiências de laboratório
(concentração a partir de 3500 mg kg 1).
Dois litros garrafas de vidro eram fi encheram com uma camada de argila expandida (150 g), na parte
inferior, seguida por camadas de solo húmido (400 g), inoculo de fungos em crescimento na casca
(100 g), e uma camada superior de solo húmido (400 g). garrafas de controlo continha apenas argila
expandida (150 g) e o solo (800 g) sem inoculo de fungos. Todos os frascos foram arejadas com ar
húmido (0,5 l min 1). O tubo de entrada de ar foi colocado à camada de argila expandida na parte
inferior, de modo que o ar iria ser espalhado uniformemente e mover-se através de todas as
camadas. O dióxido de carbono (CO 2) foi medida on-line a partir do ar de exaustão por CO 2 analisador
(custom made instrumento baseado na medição de absorção IR, eLabs Oy Engenharia, Finlândia).
CO 2 produção durante a experiência foi calculado subtraindo de entrada de ar CO 2 concentração
de escape CO 2 concentração, e depois disso calcular o CO cumulativa 2 produção, quando os ratewas
aeração mantida constante. Como a quantidade de matéria orgânica total (incluindo a casca) afeta o
HAP solo contaminado foi misturado com greenwaste compostados (1: 1) em base de peso
húmido (a concentração inicial de 1400 mg kg 1).
No total, quatro toneladas de mistura de solo de compostagem foram divididos em duas pilhas. O
inoculo de fungos (70 kg) foi adicionada a uma pilha de duas camadas: a camada inferior continha 42
kg de inoculo e as superiores a 28 kg de inoculo. A outra pilha foi deixado sem inóculo. O
comprimento de uma pilha foi de 2,0 m e a altura máxima foi de 0,6 m. Ambas as pilhas foram
arejadas com ar húmido (70 L min 1) e coberto com uma lona para evitar a secagem do solo. Durante
a incubação, registadores de dados medidos temperatura oito vezes por dia, dentro e fora das pilhas.
o fi experimento em escala campo foi levado a cabo numa instalação de tratamento do solo em uma
sala não aquecido com um betão fl oor.
2.5.3. Amostragem e análises
Duas amostras de solo compostas paralelas foram tiradas com uma verruma Edelman
(Eijkelkamp Agrisearch Equipment BV, Países Baixos) uma vez por mês a partir de ambas as pilhas.
Uma amostra composta consistiu em quatro sub-amostras tomadas a 0,3 m de profundidade. As
sub-amostras foram misturados em conjunto e peneirados através de malha de 8 mm. As amostras
foram analisadas por matéria seca, de matéria orgânica, o pH ea concentração de PAH. Além disso,
o P. velutina O seu número de cópias de ADN da região, o ADNr 16S bacteriano número e quanti
copiar fi foram determinados catião de genes envolvidas na degradação da dioxigenase HAP. o fi amostras

CO 2 evolução, o CO 2 primeiros e últimos foram executados para testes ecotoxicológicos.

a produção foi apresentada como g por 100 g de matéria orgânica (perda de ignição).

2.6. As análises microbiológicas

2.5. experimento em escala de campo

2.5.1. inoculo de fungos para o fi experimento em escala campo
Produção de inóculo do fungo na casca foi escalado para o
fi experimento campo ( Steffen e Tuomela de 2010 ). Dois armários foram construídas a partir de folhas de
aço inoxidável e 12 cestas máquina de lavar louça de plástico (comprimento 50 cm, largura 50 cm, altura
de 10 cm) foram colocadas dentro de ambos os armários como prateleiras. A capacidade de um cesto foi
de 3,5 kg de casca de árvore molhada, portanto, a capacidade total de dois armários foi de 84 kg.
Úmido casca de pinheiro foi superfície esterilizada com vapor, que foi realizada no gabinete
cultivo do fundo e levou através das cestas. A temperatura do armário foi mantida ao longo
A quantidade total de bactérias indígenas foi estimada por meio da análise do número de genes
16S rDNA na amostra de solo. Todas as células procariotas conter, em média, de quatro cópias
desse gene. O potencial de degradação HAP por bactérias gram-positivas e gram-negativas foi
estimada por análise do número de anel de hidroxilação dioxigenase (RHD) genes de ambas as
classes de bactérias ( Cebron et al., 2008 ). O crescimento de P. velutina também foi avaliada por uma
quanti ADN fi método catiónica utilizando especi fi c iniciadores concebidos para a região de este fungo
(ITS Snajdr et al., 2011 ). Uma vez que não são geralmente mais do que uma região ITS em uma
célula fúngica, o número de células de
P. velutina não é comparablewith directamente a quantidade de regiões ITS

mesa 2
Sequências, as temperaturas de recozimento (TA) e temperaturas para as medições de fl uorescência (FimT) para os iniciadores utilizados em quanti gene fi cação para este estudo.

Alvo cartilha Sequence 5 0- 3 ' uma Ta ( C) FimT ( C) Referência

P. velutina região ITS PVF AAC GCA CCT TGC GCT CCC T 69, 1 min 75 Snajdr et al., 2011
PVR CTT CAC GAC CAC GGC GCA GA
genes de PAH em gram-negativos PAH-GNF GAG ATG CAT ACC ACG TKG GTT GGA 57 80 Cebron et al., 2008
PAH-GNR AGC TGT TGT TCG GGA AGA YWG TGC MGT T
genes de PAH em gram-positivos PAH-GPF CGG CGC CGA CAA YTT YGT NGG 54 80 Cebron et al., 2008
PAH-GPr GGG GAA CAC GGT GCC RTG DAT RAA
ADNr 16S bacteriano Eub338 ACT CCT ACG GGA GCG AGC AG 53 80 pista 1991
Eub518 ATT ACC GCG GCT GCT GG Muyzer et al., 1993

uma K ¼ G ou T; Y ¼ C ou T; W ¼ A ou T, H ¼ A ou C, R ¼ Um ou G, N ¼ A ou C ou G ou T, D ¼ G ou A ou T.
242 E. Winquist et al. / Internacional Biodeterioração & Biodegradação 86 (2014) 238 e 247
numa amostra. No entanto, as comparações podem ser feitas como o P. velutina
Seu número de cópias de ADN região está mudando ao longo do tempo.
P. velutina Região ITS, 16S bacterianas ADNr, e HAP-anel de hidroxilação dioxigenase (RHD)
números de cópias do gene foram estimadas usando métodos quantitativos de PCR (qPCR) ( mesa 2 ).
quanti fi-
cação foi feito comparando o fl fluorescência de amostras para amostras padrão contendo
quantidades conhecidas dos mesmos genes clonados em plasmídeos TOPO TA utilizando kits de
clonagem (Invitrogen). Para qPCR o Maxima SYBR Green / ROX qPCR 2 mistura principal foi usada
(Fermentas, Thermo Fisher Scienti fi c), excepto para 16S qPCR onde Quantitect SYBR Green PCR
dois mistura principal foi usada (Qiagen). Todas as análises foram realizadas em 25 m l volumes de
reacção, utilizando um Bioscience 7300 Tempo real PCR System Aplicada (CA, EUA). A
concentração dos iniciadores foi de 0,3 m H, excepto P. velutina qPCR
0,6 m M. Em P. velutina qPCR, serumalbumin bovino (BSA) foi utilizada a uma concentração de 0,45 m
g m eu 1. o fi passo qPCR primeira era sempre um passo de desnaturação (95 C durante 10 min),
afterwhich o ciclo seguinte foi repetido quarenta vezes: 95 C durante 15 s, hibridação a
especificidade iniciador fi temperaturas C durante 30 s, de alongamento a 72 C durante 30 s, e a
medição de fl fluorescência em qPCR especi fi c temperaturas FimT. Controlos sem molde adicionado
foram rotineiramente utilizados como controlos negativos.
2.7. ensaios ecotoxicológicos
2.7.1. Os testes de germinação
Agrião de jardim ( Lepidium sativum) e o trevo vermelho ( Trifolium pratense) foram utilizadas para
testes de germinação. O método é uma modi fi cação
ISO 17126: 2008 ( Internacional estandardização
Organização, 2008d ) E ISO 11269-2: 2008 ( Organização Internacional de Normalização, 2008c ).
Três amostras replicadas e 6 controlos foram ensaiados utilizando 40 sementes para uma placa de
Petri (O14 cm). Cem gramas de solo experimental, ou areia limpa (tamanho de partícula 0,3 e 0,9
milímetros) para os controlos, foi colocado sobre o prato de água ultrapura e foi adicionado para
atingir aproximadamente 85% de capacidade de retenção de água. As sementes foram colocadas no
material de teste húmido, coberto com 90 g de areia de quartzo (tamanho de partícula 0,7 e 1,2
milímetros) e incubou-se a 20 2 C. O tempo total de incubação foi de 5 d para o agrião de jardim e 6
d para o trevo vermelho. Incubationwas começou com um período escuro de 48 h e continuou com
ciclo de luz / escuro (16/8 h, 4300 430 lux) até ao final da incubação. No final do teste, o número de
plântulas que emergiram foi contado. O resultado foi calculada como uma percentagem de inibição
em comparação com a germinação das sementes em controlos.
2.7.2. Teste com minhocas
Earthworm ( Eisenia fetida) os testes foram realizados como uma modi fi-
cação das normas ISO 11268-1: 2008 e ISO 11268-2: 2008 ( Organização Internacional de
Normalização, 2008a, b ). Os testes agudos e de reprodução foram combinadas em um único
protocolo: sobrevivência foi registada depois de 4 semanas ' de exposição, as minhocas adultos
foram, em seguida, removido, e o ensaio foi continuado durante 4 semanas adicionais para
determinar os efeitos na reprodução. Uma mistura de volumes iguais de arti fi solo cial e terra de
jardim comercial foi utilizado como o controle do solo em testes de minhoca. Foi adicionada água
para atingir 50% da capacidade de retenção de água antes de adicionar as minhocas. Quatro
amostras replicadas, contendo 300 g de solo e 10 minhocas por vaso, foram preparadas para os
ensaios. O número dos juvenis foi contado no fim da incubação a 20 C.
3. Resultados
3.1. As experiências laboratoriais
A capacidade de dez estirpes de fungos seleccionados a crescer no solo, competir contra
micro-organismos indígenas, e a tolerar
Figura 1. número total de bactérias indígenas (copiar 16S ADNr números) e genes hidroxilação dioxigenase HAP-anel
envolvidas na degradação da HAP em bactérias gram-positivas e gram-negativas em solo na experiência de
laboratório (SDS são apresentados com barras de erro). HAP solo contaminado diluída com resíduos verdes
compostagem (1: 1) foi incubada 3 meses, com ou sem inoculo de fungos.
contaminantes foi exibido. Com base na triagem, P. velutina,
S. rugosoannulata e G. luteofolius Foram seleccionados para experiências laboratoriais de
degradação (resultados não mostrados). Nenhum dos fungos mostraram crescimento visível no solo
contaminado-HAP original na concentração de PAH 6000 mg kg 1. Além disso rastreio foi realizado em
solo contaminado com HAP, que foi diluído com greenwaste compostados (1: 1). Este solo estava
ainda parcialmente tóxico tomost dos fungos, única P. velutina mostrou crescimento máximo visível
no solo contaminado-HAP diluída. solo contaminado com óleo inibiu o crescimento de todos os
fungos experimentais. No entanto, o crescimento menor foi observado com as espécies fúngicas
seleccionadas em placas com o solo oilcontaminated.
As atividades de lacase e MnP foram determinadas a partir do inoculo de fungos cultivados em
casca. As atividades lacase foram muito baixos (<100 mU g- 1 dm, resultados não apresentados).
Pelo contrário,
P. velutina e S. rugosoannulata MnP actividades elevadas produzidas. As actividades máximas foram
MnP 2300 1100 mU g- 1 dm para
P. velutina ( após 21 d de cultivo), 900 800 mU g- 1 dm para
S. rugosoannulata ( após 35 d de cultivo) e 140 90mU g- 1 dm para G. luteofolius ( após 24 d de
cultivo). A produção da enzima apareceu em conjunto com o crescimento dos fungos. O tempo de
incubação variou de três a fi ve semanas, após o que a superfície da casca foi totalmente cobertos
com micélio fúngico. Com G. luteofolius e
P. velutina a fungos inoculumwas pronto para uso após três semanas e com S. rugosoannulata depois
de fi cinco semanas de cultivo em estado sólido.
solo PAH-contaminada e, particularmente, compostagem de resíduos verdes, continham
microrganismos indígenas. A quantidade total de bactérias foi quase a mesma em todas as amostras
( Figura 1 ). Quando o inoculo fúngico foi adicionado ao solo, o potencial de degradação de PAH por
bactérias gram-positivas e ligeiramente aumentada por bactérias Gram-negativas ligeiramente
diminuída.
Durante o crescimento microbiano, casca e matéria orgânica do solo estão degradados e CO 2 é
produzido. o CO 2 produção triplicou em frascos com inoculo de fungos, quando comparadas com o
controlo sem inulo ( Figura 2 ). O tratamento com S. rugosoannulata inoculo produzido em 3 meses,
aproximadamente, 10% mais CO 2 do que os outros tratamentos de fungos. Além disso, num estudo
anterior S. rugosoannulata produzido mais CO 2 do que P. velutina e G. luteofolius quando crescer no
solo ( Winquist et al., 2009 ).
Quando o inoculo fúngico foi adicionado ao solo, 95 e 96% de HAP totais foram degradados ( Figura
2 ). compostos PAH foram degradados, mesmo na garrafa sem controlo do inoculo de fungos a
menos do que um terço da concentração original. No entanto, a degradação de compostos de HAP
individuais mostraram que 4-anel ou mesmo maior
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corredor experiência variou entre 6 e 23 C C, e entre 2 C e 30 C, respectivamente. Aeração com ar

úmido funcionou bem e cobrindo as pilhas ajudou a manter a umidade adequada no solo. matéria
seca (66 e 71%) e matéria orgânica (13 e 16% de MS) das duas pilhas variaram apenas pouco. O pH
diminuiu ligeiramente durante a experiência em ambas as pilhas: na pilha de tratamento de 7,2 a
fúngica

6.8 e na pilha controlo 7,3-7,0. No fi experimento campo 94% de HAP totais foram degradados em
ambas as pilhas já em três meses, embora o fi experimento campo foi continuada durante fi cinco
meses ( A Fig. 3 ). compostos PAH foram degradados em ambas as pilhas igualmente: 92% de 3-anel
HAP, 95% de HAP 4-anel e 33% de 5- e HAP 6ring. Casca adsorvido 0,2% de HAP. micélio fúngico
era claramente visível na superfície da pilha depois de três meses de incubação. O crescimento
visuais correspondeu bem com o P. velutina

Figura 2. CO 2 produção por 100 g de matéria orgânica (colunas claras) e concentração de PAH em solo (colunas
escuras) antes da incubação (solo não tratado) e depois de 3 meses de incubação na experiência de laboratório (valor
médio de três réplicas, o SDS são apresentados com barras de erro). HAP solo contaminado diluída com resíduos
verdes compostagem (1: 1) foi incubada 3 meses, com ou sem inoculo de fungos.
moléculas de HAP foram degradados signi fi cativamente mais quando o inoculo fúngico foi utilizado
do que por micróbios indígenas sozinho ( Tabela 3 ). A maior degradação de elevado peso molecular
PAHs foi alcançado quando P. velutina inoculo foi adicionado. Este tratamento ( P. velutina em
conjunto com os micróbios indígenas) foi capaz de degradar 96% de HAP 4-anel e 39% de 5- e
6-anel HAP. Nos frascos de controlo foram degradados 55% de HAP 4-anel e apenas 7% de 5- e
6-anel HAP. Quando os resultados de biodegradação com a adição de
O seu número de cópias de ADN da região ( A Fig. 4 ), Que foi de aproximadamente mil vezes mais
elevada na maioria das amostras tomadas a partir da pilha de tratamento dos fungos do que a partir da
pilha de controlo.
A quantidade total de bactérias indígenas foi estimada com número de cópia bacteriana 16S
ADNr. Foi constante durante o fi experimento campo em ambas as pilhas. O nero de cias foi
equivalente para experiências de laboratório (10 10 cópias g- 1 dm). Além disso, os genes envolvidos
na degradação de dioxigenase HAP foram medidos. Embora a quantidade de genes de dioxigenase
nas duas pilhas (inoculo versus nenhum inoculo) não variou, o número de genes em bactérias
dioxigenase gramnegative e Gram-positivas diferem grandemente ( A Fig. 5 ). Enquanto o número de
cópias de bactérias gram-negativas foi quase a mesma durante todo o fi experimento campo, o
número de cópias de bactérias gram-positivas aumento mil vezes (de 10 5 a 10 8 cópias g- 1 dm)
durante o fi mês primeiro do experimento.

P. velutina inoculumwere em comparação com a fracção bioaccessible, pode ser notado que
theywere muito próximos uns dos outros. Assim, pode-se concluir que a fração bioaccessible todo foi
degradada pela P. velutina juntamente com micróbios indígenas. Em solo controle aproximadamente
metade dos PAH 4-anel bioaccessible andmost dos PAH bioaccessible 5- e 6-anel ainda estavam
presentes depois de três meses de incubação.
A toxicidade do solo foi determinado pela sobrevivência de minhocas e a inibição da germinação
de sementes ( tabela 4 ). No início do fi eld experimentar o solo diluiu-se com os resíduos compostados
verde ainda foi muito tóxico e todas as minhocas morreu no prazo de três dias a partir do início da
incubação. Depois de fi experimento campo, no entanto, a toxicidade aguda tinha quase desaparecido
e reprodução em solo tratado foi ainda maior do que no controlo do solo. Além disso, a toxicidade do
solo no início do fi experimento campo inibiu a germinação das sementes mesmo que o efeito não foi
tão forte como com as minhocas. A toxicidade do solo diminuiu durante o fi experimento campo

3.2. experimento em escala de campo também como medido pelos testes de germinação das sementes ( tabela 4 ).

o fi experimento campo foi realizado durante a temporada de verão na Finlândia (a partir do início
de junho até o final de outubro). Durante este tempo, a temperatura no interior das pilhas e o solo

Tabela 3
As concentrações de PAH, degradação e biodisponibilidade em experiências de laboratório com o solo contaminado com HAP diluída com resíduos verdes compostagem (1: 1).

composto HAP solo sem tratamento uma solo aerado uma P. velutina tratamento uma

(N ° de anéis) Conc. (Mg kg 1 dm) BioAccess. Fracção (%) Conc. (Mg kg 1 dm) Degradação (%) Conc. (Mg kg 1 dm) Degradação (%)

Naftaleno (2) < 0,2 nf c < 0,2 < 0,2

Acenaphtylene (3) 10 96 5 51 3,5 65
Acenafteno (3) 297 nf 9,8 97 0,4 100
Fluoreno (3) 208 96 4,6 98 0,8 100
Fenantreno (3) 735 96 4.8 99 0,7 100
Antraceno (3) 62 95 8 87 5.6 91
Fluoranteno (4) 1279 95 345 73 22 98
Pireno (4) 720 95 535 26 41 94
Benzo (a) antraceno (4) 53 84 31 42 6,6 88
Criseno (4) 59 83 39 34 14 76
Benzo (b) fl uoranthene (5) 15 30 15 1 10 33
Benzo (k) fl uoranthene (5) 13 44 11 15 6.8 47
Benzo (a) pireno (5) 8,9 nf 8,7 3 5,9 34
Dibenzo (a, h) antraceno (5) 1.5 nf 1,6 0 1.1 30
Indeno (1,2,3-cd) pireno (6) 4,5 54 4.0 12 2.6 41
Benzo (g, h, i) perileno (6) 2,7 43 2,5 10 1,4 47
Soma de 16 PAH 3469 140 b 1025 4 123 11

uma solo sem tratamento: no incubação, arejada solo: tempo de incubação de 3 meses, P. velutina tratamento: tempo de incubação de 3 meses.
b valor médio de três réplicas SD.
c nf ¼ não fi tting o modelo.
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Fig. 3. A concentração de PAH durante o fi experimento campo com ou sem inoculo de fungos (valor médio de duas Fig. 5. Quantidade de genes de dioxigenase envolvidas na degradação da HAP em bactérias gram-negativas e
repetições, a gama de variações são barras de erro shownwith). (: 1 1) foi usado solo diluiu-se com os resíduos gram-positivas no solo durante o fi experimento campo com ou sem inoculo de fungos (SD: 0,02 e 0,42 log, não
verdes compostado HAP-contaminada. mostrado na fi gura). (: 1 1) foi usado solo diluiu-se com os resíduos verdes compostado HAP-contaminada.

4. Discussão
O mais ef fi ciente biorremediação fungo em nosso estudo foi
P. velutina. O tratamento, onde P. velutina inoculumwas adicionado ao solo, foi capaz de degradar
toda a fracção bioaccessible dos compostos PAH na experiência de laboratório: 96% de HAP totais
foram degradados em três meses. Covino et al. (2010) determinada fracção bioaccessible por SFE
como no nosso trabalho, e observaram que o tratamento com Pleurotus ostreatus degradados 80%
do total de PAH em solo contaminado creosoto não-estéril, que foi de aproximadamente toda a
fracção bioaccessible (82%) ( tabela 5 ). Na nossa experiência, os compostos PAH foram degradadas
também no solo de controlo sem o inoculo de fungos por micro-organismos indígenas. A adição de
resíduos compostados verde resultou em um elevado número de bactérias indígenas, bem como
genes envolvidos na degradação de bactérias gram-positivas HAP e gram-negativas. Em escala
laboratorial, quase todos os HAP-3 do anel e, aproximadamente, metade do anel 4-HPAs foram
degradados, mas a quantidade de 5- e 6-anel HAP permaneceu quase o mesmo. HAP de elevado
peso molecular não são facilmente degradados por bactérias, porque a solubilidade em água diminui
com o aumento da massa molecular.
No fi eld, P. velutina cresceu extensivamente para a pilha de tratamento fúngica, ainda foi
encontrada a quantidade total de bactérias indígenas a ser elevada, tanto na pilha tratamento de
fungos e na pilha de controlo. o
diluição de solo contaminado com resíduos verdes compostagem em fl influenciadas a actividade
microbiana de três maneiras: 1) concentração de HAP foi diluído e o solo foi menos tóxico, 2) a
composição do solo foi alterada para favorecer o crescimento microbiano e 3) os resíduos
compostados verde si funcionaram como um forte inoculante microbiano. Aproximadamente 94% de
HAP totais foram degradadas em duas pilhas dentro de três meses. O uso de inoculo de fungos não
aumentou a degradação de HPA como nas experiências laboratoriais. razão possível para esta era
uma menor concentração de PAH antes do tratamento em fi escala campo (1400 mg kg 1) comparada
com a escala em laboratório (3500 mg kg 1). Uma vez que o solo foi menos tóxico, a microbiana
indígena activitywas superior e bioremediationwas melhorada. Mais trabalho é necessário para fi nd
para fora quando a adição de micélio fúngico é bene fi cial. Durante o fi eld experimentar o número de
genes de dioxigenase em bactérias gram-positivo cresceu mil vezes (de 10 5 a 10 8 cópias g- 1 dm) em
ambas as pilhas. Portanto, pode-se concluir que, no fi experimento campo com resíduos verdes
compostagem, as bactérias gram-positivas provavelmente tinha um signi fi papel de escala em
degradação HAP. Num estudo anterior, onde as bactérias foram isoladas de PAHcontaminated solo,
a maioria das espécies que poderiam utilizar HAP como única fonte de carbono foram actinobactéria
gram-positivas ( Kästner et al., 1994 ). Também micobactérias gram-positivas são conhecidos por
serem capazes de ef fi cientemente degradar particularmente 4-anel HAP ( Lopez et al., 2008 ).
resíduos verdes compostagem provavelmente continha também fungos indígenas, embora a sua
presença não era diretamente quanti fi ed. Contudo, P. velutina o número de cópias de ADN na pilha
de controle sem o fúngica inoculumwas elevada, indicando que os primers não foram completamente
especi fi c e que os fungos, relacionada com P. velutina, estavam

tabela 4
Ensaios de ecotoxicidade com minhocas, agrião de jardim e trevo vermelho, amostras tiradas antes (iniciar) ou depois
(inoculo / não inoculo) a fi experimento campo com PAHcontaminated solo misturado com o lixo verde compostagem
(1: 1).

Solo taxa de mortalidade Reprodução de A inibição com A inibição com o

aguda de minhocas minhocas agrião de jardim trevo vermelho

(%) (%) (%)

solo controle 0 218 41 uma 0 0

(limpar \ limpo)

Começar 100 0 24 19
Sem inóculo 3 312 32 0 2
(5 meses)
Fig. 4. o P. velutina Seu número de cópias de ADN região no solo durante o fi experimento campo com e sem inoculo de
inóculo 0 343 34 8 12
fungos (nível de detecção é mostrada como uma linha a preto, o SDS são marcados com barras de erro). (: 1 1) foi usado
(5 meses)
solo diluiu-se com os resíduos verdes compostado HAP-contaminada.
uma valor médio de quatro repetições SD.
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tabela 5 temperatura segue, mas os microrganismos indígenas são activados por condições de crescimento
Comparação da reparação escala laboratorial com fungos do solo não estéril contaminada-HAP a partir de várias
mais favoráveis. Cajthaml et al. (2002b) e Sa sek et al. (2003) aplicada cogumelo de compostagem,
estações de tratamento de madeira.
um
Eggen 1999 Covino et al., 2010 Este trabalho “ pronto para usar ” mistura de composto sem inoculo de fungos ( tabela 6 ). Depois de se misturar o

concentração de PAH 1900 2300 3500 composto ao solo de um processo de compostagem propriamente dita começou com um aumento
antes rápido da temperatura. Estas experiências podem ser comparados para a pilha de controlo como nos
o tratamento (mg kg 1) incubadas solo com adubo greenwaste madura, mas sem um grande aumento na temperatura.
Obteve-se uma maior degradação dos HAP totais com uma taxa de diluição mais baixa. No entanto,
Fungo Pleurotus Pleurotus Phanerochaete
ostreatus ostreatus velutina
a comparação é dif fi culto vez que as propriedades de ambos o solo e os contaminantes afectar o
escala de Trabalho (g) 3000 25 800 processo de biorremediação. Todos os solos nestes experimentos foram a partir de uma origem
Degradação diferente: a partir de uma planta tar a produção ( Cajthaml et al., 2002b ), Uma planta de gás fabricado
(Bioaccessible): Total
( Sa sek et al., 2003 ) E uma serraria (este trabalho). No entanto, também o processo de
PAHs (%) 86 80 (82) uma 96 (94)
biorremediação tem um efeito importante sobre a degradação HAP. Haderlein et al. (2006) notado que
3-anel HAP (%) 89 99 (96) 99 (96)
4-anel HAP (%) 87 71 (77) 96 (94) a degradação pireno foi mais ef fi caz no ambiente do que a alta (55 C) temperatura. À temperatura
5- / 6-anel HAP (%) 48 51 (28) 39 (39) ambiente, uma maior diversidade de microrganismos estão presentes, e Proteobacteria,
tempo de incubação (d) 49 60 90 actinobactéria, e fungos podem trabalhar em cooperação ( Antizar-Ladislao et al., 2004 ). Além disso,
uma fracção bioaccessible em parênteses após a fracção degradada. pyrenemineralizationwas superiores reachedwithmature composto thanwith composto fresco ( Haderlein
et al., 2006 ). De acordo com os testes ecotoxicológicos, uma melhoria dramática na qualidade do
solo ocorreu durante o fi tratamento campo escala. A sobrevivência e a reprodução de minhocas
presente. Fungos afetam a degradação PAH também com outros mecanismos que o metabolismo demonstrado que o solo foi adequado como um habitat para estes animais após o tratamento,
direta. fungos saprotrophic decompõem a matéria orgânica do solo com a ajuda de enzimas de enquanto que o solo antes do tratamento foi gravemente tóxico. Isto está de acordo com resultados
hidrólise extracelular. Desde pequenos nutrientes massa molecular são liberadas fora da célula que de Cvan carova et al. (2013) que documentou que as minhocas são muito sensíveis em relação a
estão disponíveis para ambos os seus produtores e outros microrganismos do solo. Snajdr et al. PAHs bioaccessible. teste de germinação de sementes não era tão bom indicador de como o teste
(2011) encontrado nos seus estudos de uma correlação positiva entre a biomassa bacteriana e minhoca, mas a tendência foi a mesma. Isto não é surpreendente, uma vez que é sabido que testes
fúngica. Fungos também aumentar a biodisponibilidade de HAP imóveis e distribuídos de forma de germinação não são tão sensíveis a contaminantes como vários invertebrados do solo ( Dorn et
desigual para degradação bacteriana quer aumentando a mobilidade bacteriana e pelo transporte de al., 1998; Saterbak et al., 1999 ). Os efeitos sobre plantas são fatores importantes na avaliação da
compostos PAH dentro de micélio fúngico. As bactérias podem usar líquido fi LMS cerca de hifas qualidade do solo ou ef remediação fi Cacy, e para tomada de decisão sobre a eventual utilização do
fúngicas para colmatar ar material remediado. Quando o solo é destinado a paisagismo, várias espécies de plantas deve ser
testado, e ensaios de crescimento de plantas seria de valor adicional.

fi poros se encheram e penetrantes agregados do solo ( Kohlmeier et al., 2005 ). Fungos também
podem assumir e translocar ativamente PAHs através de suas hifas via streaming citoplasmática ( Furuno
et al., 2012 ).

Uma vez que não se observou diferença entre o tratamento dos fungos e o tratamento de
controlo, que em comparação com os nossos resultados resíduos compostados verde (pilha de
controlo, sem inoculo) para outras duas experiências de compostagem relatados em fi escala campo ( tabela
6 ). Existem duas abordagens como utilizar adubo na biorremediação: 1) adição de ingredientes de
compostagem primárias ou 2) adicionar composto maduro para solos contaminados ( Semple et al.,
2001 ). Quando os ingredientes de compostagem primárias, por exemplo, palha de trigo, e estrume
de galinha, são misturados com o solo contaminado um aumento da temperatura e da quantidade de
microrganismos termofílicos segue. Quando composto maduro é adicionado ao solo contaminado
quase nenhum aumento
Nós demonstramos 94% de degradação de HAP num fi experimento em escala campo com
resíduos verdes compostagem e com ou sem inóculo do fungo. A concentração residual de no total
16 PAHs foi 80 e 100 mg kg 1. Mesmo com um processo de biorremediação eficaz alguma
contaminação residual é deixado no solo, mas este é comparável à fracção bioaccessible de PAH no
solo ( Reichenberg et al., 2010 ). No entanto, o risco de exposição real é mais importante do que a
concentração total. A avaliação para a reutilização desse solo, por exemplo em vários paisagismo,
deve ser com base em testes e análises ecotoxicológicas biodisponibilidade.

tabela 6
Comparação de fi expericias escala eld, onde o composto foi utilizado para a biorremediação de solo
contaminado-HAP.
Agradecimentos
Cajthaml et al., Sa sek et al., 2003 Este trabalho

2002b
Os autores agradecem Petr Baldrian (Instituto de Microbiologia, Academia de Ciências da
Origem do solo Tar planta produtora planta de gás Serraria República Checa), por sua cooperação no desenvolvimento de um identi DNA fi método para catião P.
fabricado
velutina.
Composto composto de composto de resíduos verdes
Agradecemos também a Laura Häkkinen, Ilse Heiskanen e Minna Sepponen (finlandês Instituto do
cogumelos cogumelos compostagem

Solo para compostagem 1: 4 1: 4 1: 1 Ambiente) para obter assistência técnica com os métodos de DNA e análises ecotoxicológicas, Siiri
razão de diluição Viljanen (Aalto University School of Tecnologia Química) para a assistência com as medições de
concentração depois 1800 600 1400 atividade enzimática, e Seppo Jääskeläinen e Pekka Koivulaakso (Escola Aalto University de
diluição (mg kg 1)
Tecnologia química) para tomar parte na concepção e construção do sistema de aeração usado na fi experimento
escala de trabalho (kg) 500 1000 2000
em escala campo. Esta pesquisa foi financiada pela Agência de Financiamento finlandesa de
Degradação: Total
PAHs (%) 64 69 94 Tecnologia e Inovação (TEKES) através do programa SYMBIO e pelas empresas que participaram
3-anel HAP (%) 80 88 92 no programa: Ekokem-palvelu Oy, Suomen
4-anel HAP (%) 65 61 95
5- / 6-anel HAP (%) 54 57 33
tempo de incubação (d) 142 154 92
246 E. Winquist et al. / Internacional Biodeterioração & Biodegradação 86 (2014) 238 e 247
Erityisjäte Oy (ex-Niska & Nyyssönen Oy), Soilrem Oy, Mzymes Oy, Ramboll Finland Oy, as Forças
de Defesa da Finlândia, e da cidade de Helsínquia. Particularmente, agradecemos Riina Rantsi de
Suomen Erityisjäte Oy por nos oferecer um lugar para realizar fi estudos escala ELD. O trabalho
também foi apoiado pelo Centro de Competência TE01020218 da Agência de Tecnologia Checa.
Referências
Alén, R., 2011. Estrutura química e composição de matérias-primas de biomassa. Dentro:
Alén, R. (Ed.), Biore fi ning dos Recursos Florestais. Bookwell Oy, Porvoo, Finlândia, pp. 18 e 54 .
Antizar-Ladislao, B., Lopez-Real, JM, Beck, AJ, 2004. Biorremediação de policíclicos
hidrocarboneto aromático (HAP) -contaminated resíduos utilizando abordagens de compostagem. Crit. Rev.
Environ. Sei. Technol. 34, 249 e 289 .
Cajthaml, T., Sa sek, V., 2005. A aplicação de supercrítico fl extracção uid (SFE) para
prever biorremediação ef fi Cacy de compostagem de longo prazo do solo PAH-contaminada. Environ. Sei.
Technol. 39, 8448 e 8452 .
Cajthaml, T., Moder, M., Ka cer, P., Sa SEK, V., Popp, P., 2002a. Estudo de fungos
produtos de degradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, utilizando cromatografia em fase gasosa com detecção
por espectrometria de massa de iões armadilha. J. Chromatogr. A 974, 213 e
222 .
Cajthaml, T., Bhatt, M., Sa SEK, V., ej Mat u, V., 2002b. Biorremediação de solos PAHcontaminated por compostagem:
um estudo de caso. Folia Microbiol. 47, 696 e 700 .
Cajthaml, T., Erbanová, P., Sa coroas suecas, V., Moder, M., 2006. produtos de degradação no
via metabólica de degradação de benz [a] antraceno por um fungo ligninolítica. Chemosphere 64, 560 e 564 .
Cebron, A., Norini, M., Beguiristain, T., Leyval, C., 2008. Real-time PCR quanti fi cação
de HAP-anel de hidroxilação dioxigenase (HAP-RHD a) genes de bactérias gram negativas e gram positivas em
amostras de solo e de sedimentos. J. Microbiol. Métodos. 73, 148 e 159 .
Covino, S., Svobodová, K., cvan carova, M., D ' Annibale, A., Petruccioli, M.,
Federici, F., K resinová, Z., Galli, E., Cajthaml, T., 2010. O inoculo transportador e biodisponibilidade
contaminante afectar desempenhos de degradação fúngicas de PAHcontaminated matrizes sólidas a partir de
uma planta de preservação da madeira. Chemosphere
79, 855 e 864 .
cvan carova, M., K resinová, Z., Cajthaml, T., 2013. Em fl uência do bioaccessible
fracção de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos no ecotoxicidade de solos contaminados historicamente. J.
Hazard. Mater. 254 e 255, 116 e 124 .
Davis, MW, Glaser, JA, Evans, JW, Lamar, RT, 1993. A avaliação de campo da lignina
fungo degradante Phanerochaete sordida para tratar solo contaminado com creosote. Environ. Sei. Technol. 27,
2572 e 2576 .
Dorn, PB, Vipond, TE, Salanitro, JP, Wisniewski, HL, 1998. Avaliação da
toxicidade aguda de petróleos brutos em solos usando minhocas, Microtox e plantas. Chemosphere 37, 845 e 860 .
Eggen, T., 1999. A aplicação do substrato de fungos a partir de pró-cogumelo comercial
dução e Pleurotus ostreatus e para biorremediação de creosoto solo contaminado. Int. Biodeterior. Biodegr. 44,
117 e 126 .
Comunidade Europeia, 2004. Regulamento n.º 850/2004 do Parlamento Europeu
e do Conselho, de 29 de Abril de 2004 sobre Poluentes Orgânicos Persistentes e da Directiva rectificativo
79/117 / CEE. online em http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/ LexUriServ.do?uri ¼ JO: L: 2004: 158: 0007: 0049:
EN: PDF .
Furuno, S., Foss, S., Wild, E., Jones, KJ, Semple, KT, Harms, H., Wick, LY, 2012.
Micélios promover o transporte activo e dispersão espacial de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Environ.
Sei. Technol. 46, 5463 e 5470 .
Haderlein, A., Legros, R., Ramsay, BA, 2006. O pireno in- capacidade mineralização
vincos com maturidade do composto. Biodegradação 17, 293 e 302 .
Harms, H., 2011. Biodisponibilidade e bioacessibilidade como factores fundamentais para biorremediação.
In: Moo-Young, M., Agathos, S. (Eds.), Comprehensive Biotechnology, segunda ed. Elsevier, Espanha, pp. 83 e 94
. 1997. A comparação de fenantreno e pireno degradação por vários tipos de fungos wooddecaying. Appl.
Harms, H., Schlosser, D., Wick, LY, 2011. potencial inexplorado: explorando em fungos
biorremediação de produtos químicos perigosos. Natureza Rev. Microbiol. 9, 177 e 192 .
Hatakka, A., 2001. Biodegradação de lignina. Em: Hofrichter, M., Steinbuchel, A., (Eds.)
Lignina, substâncias húmicas e Carvão, vol. 1. Wiley-VCH, Weinheim, Alemanha, pp. 129 e 180 .
Hofrichter, M., Scheibner, K., Schneegaß, I., Fritsche, W., 1998. Enzymatic combus-
ção de compostos aromáticos e alifáticos pelo peroxidase de manganês a partir de
frowardii Nematoloma. Appl. Environ. Microbiol. 64, 399 e 404 .
Organização Internacional de Normalização, 1993. ISO 11465: 1993 Qualidade do Solo e
Determinação da Matéria Seca e Água conteúdo em uma base Mass e Método gravimétrico .
Organização Internacional de Normalização, 2006. ISO 18287: 2006 Qualidade do Solo e
Determinação dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) e Cromatografia em fase gasosa com
detecção por espectrometria de massa (GC-MS) .
Organização Internacional de Normalização, 2008a. ISO 11268-1: Qualidade 2008 Soil e
Efeitos de poluentes nas minhocas e Parte 1: Determinação da Toxicidade Aguda de Eisenia fetida / Eisenia
andrei .
Organização Internacional de Normalização, 2008b. ISO 11268-2: Qualidade 2008 Soil e
Efeitos de poluentes nas minhocas e Parte 2: Determinação de Efeitos de Reprodução de Eisenia fetida /
Eisenia andrei .
Organização Internacional de Normalização, 2008c. ISO 11269-2: 2008 Soil
Qualidade e Determinação dos Efeitos de poluentes no solo Flora e Parte 2:
Efeitos de solo contaminado sobre a emergência eo crescimento inicial de plantas mais altas .
Organização Internacional de Normalização, 2008d. ISO 17126: 2008 Qualidade do Solo e
Determinação dos Efeitos de poluentes no solo Flora e Teste de triagem para a emergência de mudas de alface
(Lactuca sativa L.) .
Johnsen, Ar, Wick, LY, Harms, H., 2005. Princípios de HAP-degradação microbiana
no solo. Environ. Pollut. 133, 71 e 84 .
Jørgensen, KS, Puustinen, J., Suortti, AM, 2000. biorremediação de petróleo
hidrocarboneto solo contaminado por compostagem em biopilhas. Environ. Pollut. 107, 245 e 254 .
Kästner, M., Breuer-Jammali, M., Mahro, B., 1994. Enumeração e caracterização
de micro solo fl ora a partir de hidrocarbonetos contaminados locais do solo capazes de mineralizar os
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH). Appl. Microbiol. Biotechnol. 41, 267 e
273 .
Kästner, M., Streibich, S., Beyer, M., Richnow, HH, Fritsche, W., 1999. Formação de
resíduos ligados durante a degradação microbiana de [ 14 C] antraceno em solo. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65,
1834 e 1842 .
Khan, FI, Husain, T., Hejazi, R., 2004. Uma visão geral e análise de remediação
tecnologias. J. Environ. Gerir. 71, 95 e 122 .
Kitunen, V., Valo, RJ, Salkinoja-Salonen, M., 1987. A contaminação do solo ao redor
madeira-preservando instalações de compostos aromáticos policlorados. Environ. Sei. Technol. 21, 96 e 101 .
Kohlmeier, S., Smits, THM, Ford, RM, quilha, C., Harms, H., Wick, L., 2005. Tomando o
rodovia fúngica: mobilização de bactérias degradadoras de poluentes por fungos. Environ. Sei. Technol. 39,
4640 e 4646 .
Lane, DJ, 1991. 16S / 23S rDNA. Em: Stackebrandt, E., Goodfellow, M.
(Eds.), Técnicas de ácido nucleico em Systematic Bacterial. John Wiley & Sons Ltd, West Sussex, Reino Unido,
pp. 115 e 175 .
Leonardi, V., sek Sa, V., Petruccioli, M., D ' Annibale, A., Erbanova, P., Cajthaml, T.,
2007. Biodisponibilidade modi fi catião e biodegradação fúngica de PAH em solos industriais envelhecidos. Int.
Biodeter. Biodegr. 60, 165 e 170 .
Lladó, S., Solanas, AM, de Lapuente, J., Borras, M., Viñas, M., 2012. Um diversi fi ed
abordagem para avaliar estratégias de bioestimulação e bioaumento para o solo fortemente contaminados com
óleo. Sei. Total de Environ. 435 e 436, 262 e 269 .
López, Z., Vila, J., Ortega-Calvo, J.-J., Grifoll, M., 2008. biodegradação simultânea
de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos creosoto por um pireno-degradantes Mycobacterium. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 78, 165 e 172 .
Lundstedt, S., Branco, PA, Lemieux, CL, Lynes, KD, Lambert, IB, Oberg, L.,
Haglund, P., Tysklind, M., 2007. Fontes, o destino, e perigos tóxicos dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
oxigenada (PAHs) em locais de HAP-contaminados. Ambio 36, 475 e 485 .
Muyzer, G., Waal, E., Uitterlinden, A., 1993. Pro fi Ling de pop- microbiana complexo
ulations por desnaturação análise de electroforese em gel de gradiente de cadeia de polimerase reação-ampli fi ed
genes que codificam para ARNr 16S. Appl. Environ. Microbiol.
59, 695 e 700 .
Niku-Paavola, ML, Karhunen, E., Salola, P., Raunio, V., 1988. As enzimas ligninolíticas de
o fungo da podridão branca- radiata Phlebia. Biochem. J. 254, 877 e 883 .
Pozdnyakova, NN, de 2012. O envolvimento do sistema ligninolíticas de branco-rot e
maca-fungos decompositores na degradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Biotechnol. Res. Int.,
ID 20. O artigo 243217 .
Reichenberg, F., Gosewinkel Karlson, U., Gustafsson, Ö., Long, SM, Pritchard, PH,
Mayer, P., 2010. baixa acessibilidade e atividade química de PAHs restringir biorremediação e risco de
exposição em um solo planta de gás fabricado. Environ. Pollut.
158, 1214 e 1220 .
Snajdr, J., Dobiá SOVA, P., V etrovský, T., Valá sková, V., Alawi, A., Boddy, L., Baldrian, P.,
2011. mycelia basidiomicetos saprotrophic e sua interspeci fi c interacções afectar a distribuição espacial das
enzimas extracelulares no solo. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 80 e 90 .
Sa sek, V., Bhatt, M., Cajthaml, T., Malachová, K., Lednická, D., 2003. Compost-
remoção mediada por hidrocarbonetos aromáticos policíclicos de solo contaminado. Arco. Environ. Contam.
Toxico. 44, 336 e 342 .
Sack, U., Heinze, TM, Deck, J., Cerniglia, CE, Martens, R., Zadrazil, F., Fritsche, W.,
Environ. Microbiol. 63, 3913 e 3925 .
Saterbak, A., do brinquedo, RJ, Wong, DCL, McMain, BJ, Williams, MP, Dorn, PB,
Brzuzy, LP, Chai, EY, Salanitro, JP, 1999. ecotoxicológicos e avaliação analítica de solos contaminados com
hidrocarbonetos e aplicação para avaliação de risco ecológico. Environ. Toxico. Chem. 18, 1591 e 1607 .
Semple, KT, Reid, BJ, Fermor, TR, 2001. Impacto das estratégias de compostagem no trata-
mento de solos contaminatedwith poluentes orgânicos. Environ. Pollut. 112, 269 e 283 .
Steffen, KT, Tuomela, M., 2010. biorremediação do solo fúngica: desenvolvimento para grande
aplicações em escala. Em: Esser, K., Hofrichter, M., micota X, segunda ed (Eds.). Springer, Berlim, Heidelberg,
pp. 451 e 467 .
Tuomela, M., Hatakka, A., 2011. Oxidativa enzimas de fungos para biorremediação. Dentro:
Moo-Young, M., Agathos, S. (Eds.), Comprehensive Biotechnology, segunda ed. Elsevier, Espanha, pp. 183 e 196
.
United States Environmental Protection Agency, EPA US Método 3550C: 2007 Ultra-
Extração trasonic.
Valentin, L., Kluczek-Turpeinen, B., Oivanen, P., Hatakka, A., Steffen, KT,
Tuomela, M., 2009. Avaliação de fungos basidiomicetos para o pré-tratamento do solo contaminado. J. Chem.
Technol. Biotechnol. 84, 851 e 858 .
Valentin, L., Kluczek-Turpeinen, B., Willför, S., Hemming, J., Hatakka, A., Steffen, KT,
Tuomela, M., 2010. pinheiro-silvestre ( Pinus sylvestris) composição casca e degradação por fungos: substrato
potencial para a biorremediação. Bioresour. Technol. 101, 2203 e 2209 .
 E. Winquist et al. / Internacional Biodeterioração & Biodegradação 86 (2014) 238 e 247 247

Wariishi, H., Valli, K., ouro, MH, 1992. Manganês (II) oxidação por manganês
peroxidase do basidiomiceto chrysosporium Phanerochaete. mecanismo cinético e papel de quelantes. J. Biol.
Chem. 267, 23688 e 23695 .
Williamson, DG, Loehr, RC, Kimura, Y., 1998. liberação de produtos químicos de contam-
solos inated. J. solo Contam. 7, 543 e 558 .
Winquist, E., Valentin, L., Moilanen, U., Leisola, M., Hatakka, A., Tuomela, M.,
Steffen, KT, 2009. O desenvolvimento de um processo de pré-tratamento de fungos para a redução de matéria
orgânica no solo contaminado. J. Chem. Technol. Biotechnol. 84, 845 e
850 .

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