Alterações na atividade enzimática da Catalase e na expressão do gene

CAT2 sob estresses abióticos em feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.)

Fernanda Cassieri, Enéas Ricardo Konzen, Gustavo Henrique Recchia, Siu Mui Tsai
Laboratório de Biologia Celular e Molecular - CENA/USP
fernandacassieri@hotmail.com; erkonzen@cena.usp.br; ghrecchia@cena.usp.br; tsaicena@gmail.com

Objetivos
O feijão apresenta papel importante na nutrição humana, sendo fonte de proteínas, vitaminas e
minerais (BROUGHTON et al., 2003). O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é amplamente cultivado e
consumido no Brasil, com uma produtividade média estimada na Safra 2012/2013 de 914 kg.ha-1
(CONAB, 2013), valor aquém do seu potencial produtivo; sendo seu cultivo afetado severamente pela
seca, salinidade, frio e outros fatores abióticos. Estes levam à síntese de espécies reativas de oxigênio
que são degradadas por enzimas tais como a catalase, como um mecanismo de proteção. Neste estudo
objetivou-se analisar os efeitos da indução de estresses abióticos sobre a atividade enzimática da
catalase por método de espectrofotometria. Além disso, foi analisada a expressão do gene Catalase 2
(PvCAT2), utilizando a técnica de PCR Quantitativo em Tempo Real (qRT-PCR). Este constitui
apenas um representante dentre vários genes que estão envolvidos na via de síntese de isoformas de
catalases, tendo-se como hipótese de que é afetado por estresses abióticos.

Métodos/Procedimentos
Dois experimentos foram realizados em sala de crescimento climatizada (25oC) com genótipos
de feijoeiro diferindo para tolerância a estresses abióticos. Os tratamentos consistiram na indução de:
desidratação (estresse oxidativo - PEG 10%), frio (4ºC), sal (NaCl 250 mM), ABA (100 µM), e
controle (irrigação normal). No primeiro experimento foi analisado apenas o genótipo BAT 477
(tolerante à seca) com indução dos estresses por diferentes períodos de tempo. No segundo
experimento foram incluídos também: BAT 93 (tolerante ao déficit hídrico), Jalo EEP558 (suscetível),
IAC-Carioca 80SH (moderadamente tolerante) e RAB 96 (suscetível), com coleta em apenas um ponto
temporal (três horas). Os tratamentos foram aplicados no estágio fenológico V3. As folhas de cada
amostra foram coletadas e maceradas em nitrogênio líquido. A partir do tecido macerado, foi realizada
a extração de proteínas e o monitoramento da atividade enzimática da catalase do extrato em
espectrofotômetro (Nanodrop 2000) a 240 nm, após adição de peróxido de hidrogênio (adaptado de
Azevedo et al., 1998). Amostras de RNA foram obtidas com o kit Trizol (Invitrogen) e foi analisada
a expressão do gene CAT2 por meio de PCR quantitativo em Tempo Real com o sistema Step OnePlus
(Applied Biosystems). Os dados de atividade da Catalase foram analisados como ANOVA simples
com um fator. As médias foram comparadas por teste de Tukey (p < 0,05). Os dados de qPCR foram
analisados no software REST 2009, gerando-se os valores de expressão gênica relativa, considerando
dois genes de referência (PvSKIP16 e PvIDE).
Resultados
A atividade da Catalase foi alterada por todos os tratamentos, comparativamente ao controle
(sem indução de estresse), quando realizada a análise temporal (Figura 1). Após três horas de estresse,
a enzima apresentou maior atividade no tratamento com frio na maioria dos genótipos, exceto IAC-
Carioca 80SH. (Figura 2). No entanto, o perfil temporal da atividade da enzima sob frio mostra
oscilação, com tendência ao declínio da atividade desta enzima quando o período de frio é mais
prolongado (Figura 1).
O tratamento com PEG 10% alterou a atividade da enzima ao longo do tempo, levando a
aumento significativo. Após três horas, houve redução na atividade da enzima, exceto no genótipo
BAT 93.
O gene CAT2 foi induzido por PEG 10% após cerca de uma hora de estresse, sendo reprimido
posteriormente (Figura 3). A expressão deste e de outros genes pode ser alterada após indução de
estresses abióticos, pois os danos celulares levam ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio,
ativando diversas enzimas degradadoras destes produtos. Sob a condição controle (sem indução) as
catalases apresentaram nível basal de atividade. No entanto, possivelmente durante o estresse, foi
necessária a ativação de genes para nova síntese enzimática para o processo de reparação celular.

Atividade da catalase nos tempos no genótipo

Atividade CAT (µmol/min/mg

5 BAT 477
4
proteína)

3
PEG 10%
2
Sal
1 Frio

0 ABA
0 min 5 min 30 min 1h 3h 6h 12 h
Tempo de tratamento
Figura 1: Atividade da enzima catalase (CAT) no genótipo BAT 477 em diferentes tempos de tratamento (o
min, 5 min, 30 min, 1h, 3h, 6h e 12h.

Atividade da catalase nos genótipos

(µmol/min/µg proteína)

2,0
Atividade da catalase

1,5
Controle
1,0 Seca
Sal
0,5
Frio
0,0 ABA
BAT93 Jalo BAT 477 Carioca RAB 96
EEP558 80SH
Genótipos
Figura 2: Atividade da enzima catalase (CAT) nos genótipos sob diferentes tratamentos.
 Catalase 2 – Perfil de expressão do gene
(qRT-PCR) em BAT 477
2
Expressão relativa

1,5

0 5 min 30 min 1h 6h
0,5

0 Tempo de tratamento

Figura 3: Perfil de expressão do gene CAT2 no genótipo BAT 477 em diferentes tempos de indução de estresse
por PEG 10%, analisados por qRT-PCR.

Conclusões
Houve alterações na atividade enzimática da catalase e na expressão de um dos genes
representantes (PvCAT2). Os estresses abióticos afetaram a atividade enzimática diferencialmente ao
longo do tempo de estresse e entre diferentes genótipos. O estresse por PEG 10% afetou
significativamente a expressão do gene PvCAT2.
Referências Bibliográficas

AZEVEDO, R. A. et al. Response of antioxidant enzymes to transfer from elevated carbon dioxide to
air and ozone fumigation, in the leaves and roots of wild-type and a catalase-deficient mutant of
barley. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 104, n. 2, p. 280-292, 1998.

BROUGHTON, W. J.; HERNÁNDEZ, G.; BLAIR, M.; BEEBE, S.; GEPTS, P.; VANDERLEYDEN,
J. Beans (Phaseolus spp.)—model food legumes. Plant and Soil, 252, 55–128, 2003.

COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO (CONAB). Produção de feijão 2012-2013.

Brasília, DF, 2013.