NOÇÕES DE

ESPECTROMETRIA DE
The world leader in serving science
MASSA

José Felipe Lugão

felipe.lugao@novanalitica.com.br
Cromatografia Acoplada a Espectrometria de Massa

Responde às duas perguntas mais importantes da Química

Analítica:
• O que é ?
• Tempo de Retenção Cromatograma
• Peso molecular
• Estrutura molecular
• Quanto tem ?
• Área cromatográfica

Espectro MS
Qual é o espectrômetro de massa ideal ?

?
Entrada
de
Amostras
Componentes do Espectrômetro de Massa

Atmosfera
Sistema de
Vácuo

Analizador Sistema
Entrada da
Ionização de Massas Detector de
Amostra
Dados
Espectro X Cromatograma

?
Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?

TIC
100

Se ampliarmos
esta região do
%
cromatograma...

50
Time
1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25
Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?

100 TIC

Veremos que nesta

escala o pico é
feito por pontos
discretos...
%

78 Time
2.12 2.14 2.16 2.18 2.20 2.22 2.24 2.26 2.28
Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?

100
240
Cada ponto
representa uma
única varredura
(espectro) do
analisador de
%
massa...

241

0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?

Cada ponto do
cromatograma
possui um
espectro único
Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma ?

TIC - Cromatograma
produzido pela soma
espectro
do sinal de todas as
massas observadas
a cada varredura...
 TIC x RIC (Cromatograma de Massa Reconstruído)

C:\Documents and Settings\...\PPB006 30/9/2008 08:02:25

RT: 27,83 NL: RT: 27,83 NL:

Relative Abundance

Relative Abundance
80 RT: 28,16 RT: 31,66 1,68E8 80 RT: 28,16 RT: 31,66 1,68E8

60
RT: 26,13 RT: 28,41 TIC RT: 30,93
TIC MS ICIS
PPB006 60
RT: 26,13 RT: 28,41 TIC RT: 30,93
TIC MS ICIS
PPB006

40 40
RT: 29,60 RT: 30,43 RT: 29,60 RT: 30,43
20 RT: 26,82 20 RT: 26,82
0 0
26 27 28 29 30 31 32 26 27 28 29 30 31 32
Time (min) Time (min)

RT: 28,35 NL: 27,18 NL:

RT: 28,41
Relative Abundance

Relative Abundance
100 4,24E6 100 2,33E7
m/z= m/z=
26,13
27,83 RIC 93 31,66 93,11-94,11
MS PPB006
RIC 161 159,55-
163,26 MS
50 29,06 30,91 50 27,88
29,60 PPB006
26,30 27,20 28,95 27,35 29,06
29,85 30,43 30,91 31,66
26,95 31,10 26,28 26,82 29,85 30,43
0 0
26 27 28 29 30 31 32 26 27 28 29 30 31 32
Time (min) Time (min)

93,01 161,07
Relative Abundance

Relative Abundance
100 100

69,01 105,01
50 94,03 50
161,07 204,11 81,01 204,11
133,03 133,04
207,12 258,88 280,44 340,84 385,77 413,66 439,50 189,08 207,13 281,12 327,36 385,52 440,36
0 0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 50 100 150 200 250 300 350 400 450
m/z m/z
Modos de Ionização

API CI EI

Ionização

Sem fragmentos Com Fragmentos

Fontes de Íons

Filamento
GC/MS
• Ion Volume
EI
Removível
• CI

e- e+-e-
+
+

LC/MS
• ESI
• APCI Coluna

Lentes
Espectro EI

M + e- → M.+ + 2e- + fragmentos

Pico
Base

Ion
Molecular
Fonte de Íons

100,000
Molecular Weight

ESI

1000

APCI
EI/CI

Non-Polar Polar
ESI
APCI
Analizadores de Massa

Quadrupolo
Triplo Quadrupolo
Ion Trap 3D
Ion Trap Linear
Ion Ciclotron
Time Of Flight
Setor Magnetico
Orbitrap
Híbridos
....
 GC/MS
The world leader in serving science QUADRUPOLO
Quadrupolo

+
+

Os íons são varridos pela variação das

voltagens DC/RF aplicadas às barras do
quadrupolo.
Quadrupolo

+
Os íons são varridos pela variação das
voltagens DC/RF aplicadas às barras do
quadrupolo.
Full Scan X SIM CHBr3

Full Scan

SIM (173)
Full Scan + SIM na mesma corrida

SIM: Análise de traços de compostos alvos

Full Scan: Espectro de massa para identificação
de desconhecidos e confirmação dos alvos
encontrados

Exemplo:
• 14 Pesticidas
• EI, Full Scan + SIM
• Matriz: Morango/Espinafre/Pera
Método Full Scan + SIM
Método Full Scan + SIM
GCMS Quadrupolo– EI Full Scan + SIM

RT: 4.97 - 33.08

8.80 NL: 3.96E7
100
TIC MS data08
12.09 12.39
5.18 21.24
50
Raw
0
8.80 NL: 3.96E7
100
TIC F: + c Full ms
12.09 12.39 [ 50.00-500.00]
5.18 21.24
MS data08
Full Scan 50

0
21.82 NL: 7.57E4
Relative Abundance

100
TIC F: + c SIM ms
[ 131.50-132.50]
21.24 MS data08
50

3 dos 14 0
100
14.61 NL: 2.06E3
TIC F: + c SIM ms

segmentos 50 Methiocarb
[ 224.50-225.50]
MS data08

SIM
0
11.06 NL: 7.43E3
100
TIC F: + c SIM ms
11.35 [ 178.50-179.50,
263.50-264.50]
50 MS data08

0
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Time (min)
Pesticides analysed in strawberry/spinach/pea
extract at 5 pg/µl, 2ul injection
GC/MS Quadrupolo (ISQ) – Sensibilidade

m/z 272
Turbo 70L/s, EI Full Scan RT: 3.50 - 4.50
RT: 3.92 S/N 27:1 NL:

1pg OFN AA: 321 1.28E3

AH: 406 TIC MS
100
ICIS
500_ag
95

90

85

80

75

70

65

60

Relative Abundance
55

m/z 272 NCI, SIM

S/N > 600:1
500 ag OFN (5 x 10E-16g)
ISQ – Aplicação: Poluentes Semivoláteis em Águas

120 Compostos
20 minutos
1uL, Split 1:20

Average IDL = 0,023 ng/uL (~20pg on column)

Working Range: 0.05 to 200 ng/uL
ISQ – Aplicação: Poluentes Voláteis em Águas

84 compostos
EPA 524.3 18 min
5 ml amostra
30:1 split

Average IDL = 0,035 ug/L (~5pg on column)

Working Range: 0.05 to 200 ng/uL
Cocaína em Urina

(3) (1)

(4) (2)

1
3

4
2
Aplicação ISQ Toxicologia
 MS/MS
ION TRAP E
The world leader in serving science
TRIPLOQUADRUPOLO

Isolando a Matriz
?!
GC/MS – Organofosforado
MS/MS
GC/MS/MS Ion Trap – Organofosforado

251 > 169

MS/MS

Análise de composto-alvo
Coeluição de muitos picos
Matriz interferente
Confirmação
Caracterização Estrutural

MS/MSn continua
sendo necessário e
complementar à
informação de
massa exata

Esta informação coletivamente

define a estrutura da molécula
Fragmentação por LC/MS/MS

Cromatograma

[MH]+
ESI Full Scan MS

ESI Full Scan MS/MS

Ion Trap
Ion Trap Linear
 Why Linear (2D) Ion Traps?

A technology evolution based on basic principles

3-Dimensional vs. 2-Dimensional

RF Quadrupole Ion Trap
Trapping Efficiency (Effect of RF Phase)
760 kHz Successful Trapping of Injected Ions

~ 5%

~ 70%
1.2 MHz, 5kV
Ion Ejection – 2D vs 3D
Ion Transfer
Tube

Skimmer

Tube Lens
 Radial Detection ~ High Sensitivity
Linear Ion Trap ~ 100% of ions trapped are
detected due to radial ejection

Skimmer

Axial ejection allows for hybridization

– without compromise (FT)!

Hybrid Quadrupole Trap Majority of trapped ions

cannot be scanned out
~ 15% detected*

Axial ejection depends on fringe fields generated by grid –

this grid compromises triple quadrupole performance
*Hager, J., RCM., 2003, 17, 1389
Ion Trap Linear x 3D

LTQ 3D Traps Increase

•Trapping efficiency ~ 55-70% ~5% ~ 11-14x

•Detection efficiency ~ 50-100% ~50% ~ 1-2x
•Trapping capacity ~ 20,000 ions ~500 ions ~ 40x
Exemplo MS/MSn Flavonóide
Exemplo MS/MSn Flavonóide

Rhoifolin
Ion Trap - Aplicações
Triploquadrupolo
Fragmentando moléculas de mesma massa

100 60 40

100 80 20
Triploquadrupolo TSQ GC/MS/MS & LC/MS/MS

NPAMOZ – LANAGRO
0,025 ppb 0,250 ppb 2,0 ppb
C:\Xcalibur\...\231106\NPF_36 23/11/2006 14:21:13
2.0ng/mL NPFs/NPAHD3.0ng/mL ACE 3 C18 50 X 2 Acetato NH40.5mM/MeOH(50;50) 200uL/min.
RT : 0,00 - 9,00 SM : 7G RT : 0,00 - 9,00 SM : 7G RT : 0,00 - 9,00 SM: 7G
RT : 1,99 NL: 8,01E3 RT: 1,99 NL: 6,30E4 RT: 1,96 NL: 4,64E5
SN: 128 m /z= 290,50-291,50 SN: 1154 m /z= 290,50-291,50 SN: 8257 m/z= 290,50-291,50
8000 460000
F: + c sid=-10,00 F: + c si d=-10,00 F: + c sid=-10,00
SRM m s2 60000 SRM ms2 SRM m s2
440000
7500 335,10@-12,00 [ 335,10@-12,00 [ 335,10@-12,00 [
262,00-291,00] M S 262,00-291,00] M S 420000 262,00-291,00] MS
7000 NPF_39 55000 NPF_33 NPF_36
400000

6500 380000
50000
360000
6000
340000
45000
5500 320000

300000
5000 40000
280000

4500 35000 260000

Intensity

Intensity

Intensity
240000
4000
30000 220000
3500 200000
25000 180000
3000
160000
2500 20000
140000

2000 120000
15000
100000
1500
80000
10000
1000 60000

5000 40000
500
20000

0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8
T ime (m in) T im e (mi n) T im e (m in)

330 pesticidas em alimentos

Aplicações Triploquadrupolo
Multiresíduo – 32 pesticidas, 10ng/mL – Spike em Água
Amostra Real – Extrato Vegetal

?
? ? ?
?
?
?
?

Bitertanol Iprodione
Elemental composition

Calculations for : 250 amu Isolation Window

monoisotopic mass +-2 amu = 30.562
C 12.0000 - 1 to 20 +-1 amu = 15.278
H 1.0078 - 0 to 60 +-0.5 amu = 7.632
N 14.0030 - 0 to 10 +-0.2 amu = 3.704
O 15.9949 - 0 to 10 +-0.1 amu = 2.564
S 31.9720 - 0 to 5 35000
30562
Cl 34.9688 - 0 to 5 30000
25000
20000
15278
15000
10000 7832
5000 2564 3704
0
0,1 0,2 0,5 1 2
SRM with Unit Resolution

Q3

Q2
Q1

256.3

1 Da
256.2
408.6

408.1

1 Da
Improved Selectivity in H-SRM Mode

Q3
Q2
Q1

256.3

1 Da
408.6

408.1

0.2 Da
Iprodione
Bitertanol
MS/MS Triploquadrupolo – Análise de Composto Alvo
 Benefícios e Limitações da Técnica SRM Triploquadrupolo

Benefícios:
Baixos limites de detecção são alcançados
Excelente quantificação
Robustez

Limitações:
Apenas compostos alvos podem ser analisados
Não permite novos resultados após a aquisição
Limitado número de compostos por corrida
Não é possível buscar compostos desconhecidos
 Orbitrap: A new class of
Mass Spectrometer

The world leader in serving science

Resolução
Resolução
 Exact Mass and Isobaric Compounds

Element Exact Mass

H 1.007825
Is a simultaneous
C 12.000000 measurement
N 14.003074 possible?
O 15.994915

289.1424
289.1390
100
100 289.1314 289.1547
289.1022 289.1329
90
90 289.0514

80
80 288.0441 C9H21O2P1S3 Terbufos
289.1215
RR==100,000
10,000
20,000
70
70 288.0949 C13H21O3P1S1 Iprobenfos 289.1424
Relative Abundance

289.1021 289.1329
289.0514
60
60
288.1142 C15H17N4Cl1 Myclobutanil
0.1033 amu 50
50 289.1215
288.1256 C11H20N4O3S1 Epronaz
289.1329 289.1424
40
40 289.0513 289.1022

30
30
288.1351 C11H21N4O3P1 Pirimethaphos
289.1215

20
20 288.1474 C16H20N2O3 Imazamethabenz
10
10

00
289.00
289.00 289.05
289.05 289.10
289.10 289.15
289.15 289.20
289.20
m/z
m/z

Yes, at high resolution !

Resolução e Massa Exata

Exatidão de Massa (ppm) = 106 X (Mm – Mr) / Mr

1 ppm = 200.0000 +- 0,0002 m/z

100.000 FWHM @ 200 m/z =

0,002 m/z
Resolução = M / (M2 – M1)

250.000 250.005
199,99 m/z 200 m/z
Standard Pesticide Mixture in Horse Feed Matrix

Unusually high error of 6.5 ppm indicates the need for higher resolution
Reanalysis at 80,000 resolving power
239.15181
C 11 H 19 O 2 N 4
6.50 ppm
100
Relative Abundance

80

60 R = 15,000
40 Error = 6.50 ppm
20

0
239.00 239.05 239.10 239.15 239.20 239.25
m/z

239.15033
C 11 H 19 O 2 N 4
0.32 ppm
100
R = 80,000
Relative Abundance

80

60
Error = 0.32 ppm
40

20

0
239.00 239.05 239.10 239.15 239.20 239.25
m/z
Quadrupole Orbitrap (Qexactive)

140.000 FWHM
1 – 3 ppm
MS/MS
Lord of the ion rings: Retainment of the rings

k
ω=
m/ z

Frequencias são convertidas em m/z utilizando transformada de Fourier

Lord of the ion rings: Retainment of the rings

k
ω=
m/ z

Frequencias são convertidas em m/z utilizando transformada de Fourier

Aplicação Exactive
510 Pesticides Exactive
RIC (1 ppb)
Multiresíduos por LC-Full Scan MS – Targeted Screening

Análise Pós-Aquisição
• Busca por compostos-alvos – “Screening”
• Pesticidas
• Drogas Veterinárias
• Hormônios
• Toxinas
• Poluentes Orgânicos Persistentes
• PCBs
• Etc,
• Confirmação
• Distribuição Isotópica
• Full Scan MS/MS

Sample(s) Database(s) Result(s)

Relative mass errors at different resolving power settings of 151
compounds at the 25 ppb level in horsefeed and honey matrix.
Conclusion

Minimum 70,000 resolution is required

Mass Accuracy Should Cross the Peak
(not by averaging)
Orbitrap – Análise Antidoping
 QEXACTIVE - Quanfirmation Azoxystrobin 1.5ppb
Quantitation Number of scans across a peak doing MS/MS
RT: 0.00 - 18.00 RT: 7.50 - 7.90
7.32 NL: 2.39E7 7.69 NL: 3.88E6
100
100 Diuron m/z= 233.0231-233.0255 F: FTMS + p ESI Full TIC F: FTMS + p
ms [100.00-1000.00] MS cal5_02 ESI Full ms2
90
0 404.02@hcd40.00
7.68 NL: 6.40E6
100 [50.00-430.00]
Azoxystrobin m/z= 404.1221-404.1261 F: FTMS + p ESI Full 80 MS cal5_02
Relative Abundance

ms [100.00-1000.00] MS cal5_02
0 70
7.99 NL: 2.18E6

Relative Abundance
100
Boscalid m/z= 343.0382-343.0416 F: FTMS + p ESI Full
ms [100.00-1000.00] MS cal5_02
60
0
2.64 NL: 5.99E6 50
100
m/z= 163.0528-163.0544 F: FTMS + p ESI Full
Methomyl ms [100.00-1000.00] MS cal5_02 40
0
10.01 NL: 1.02E6
100 30
m/z= 746.4801-746.4875 F: FTMS + p ESI Full
Spinosad D ms [100.00-1000.00] MS cal5_02
20
0
9.70 NL: 5.03E6
100
m/z= 528.0754-528.0806 F: FTMS + p ESI Full 10
Indoxacarb ms [100.00-1000.00] MS cal5_02
0 0
0 5 10 15 7.55 7.60 7.65 7.70 7.75 7.80 7.85 7.90
Time (min) Time (min)

cal5_02 #1739 RT: 7.69 AV: 1 NL: 7.33E5

F: FTMS + p ESI Full ms2 404.02@hcd40.00 [50.00-430.00]

100 Azoxystrobin 329.0806

Confirmation
90
MH+ = 404.1242 344.1041
80

70
Relative Abundance

60
372.0992
50

40

30

20
134.0606 183.0560 216.0665 301.0852 316.1092
10 172.0399
187.0509 273.0899 287.0824
71.2217 82.0298 107.0499 129.0454 226.8040 242.0326 386.1146 401.8168 420.7813
0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420
m/z
Q Exactive Full Scan Quan (Azoxystrobin at 1.5ppb)

Direct comparison
of neat vs matrix
Q Exactive Quantitation Full Scan Targeted DD MS/MS
(Azoxystrobin at 1.5ppb)

Direct comparison
of neat vs matrix
Melamine-Tainted Milk Scandal
SIEVE Workflow
Unalign vs Align

Unaligned

Aligned
Incurred Orange Sample - Navel
Incurred Orange Sample - Navel

Imaverol
Isotope Ratio – Actual vs. Simulation

Mass Accuracy 0.454 ppm

Imaverol

Actual

Simulation
Obrigado

www.planetorbitrap.com

felipe.lugao@novanalitica.com.br