Aryl Hydrocarbon Receptor-Dependent Inductions of Omega-3 and Omega-6 Polyunsaturated Fatty Acid Metabolism Act Inversely On Tumor Progression - Scientific Reports

17/07/2020 Aryl Hydrocarbon Receptor-Dependent inductions of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acid metabolism act inversely on…
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As induções dependentes do receptor de hidrocarboneto aril do metabolismo de ácido… PDF
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Artigo Acesso livre Publicados: 12 de maio de 2020
As induções dependentes do receptor

de hidrocarboneto aril do
metabolismo de ácidos graxos
poliinsaturados ômega-3 e ômega-6
atuam inversamente na progressão
do tumor
Sara Huerta-Yepez ,Ana Tirado-Rodriguez ,Mayra R.
Montecillo-Aguado ,Jun Yang ,Bruce D. Hammock eOliver
Hankinson
Relatórios Científicos 10 , Número do artigo: 7843 ( 2020 )
408 Acessos Métricas
Resumo
A dieta ocidental contém uma alta proporção de

ácidos graxos poliinsaturados ômega-6 (ω6) para
ômega-3 (ω3) (PUFA). O ligante prototípico do
receptor de aril hidrocarboneto (AHR), 2,3,7,8-
Tetraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD), induz as
enzimas da família CYP1, que podem metabolizar o
PUFA em epóxidos. Os ratinhos alimentados com
dietas ricas em w3 ou r6 foram tratados com TCDD
e injectados subcutaneamente com células de
hepatoma Hepa1-GFP competentes em AHR ou
https://www.nature.com/articles/s41598-020-64146-6 1/63
células de cancro do pulmão LLC com deficiência

de AHR. O TCDD reduziu as taxas de crescimento
dos tumores resultantes em camundongos
alimentados com ω3 e inibiu sua metástase no
fígado e / ou pulmão, mas teve os efeitos opostos
em camundongos alimentados com PUFA com ω6.
Essas respostas provavelmente foram atribuíveis
aos correspondentes epóxidos de PUFA gerados
nas células tumorais e / ou no hospedeiro, pois
muitos dependiam da administração concomitante
de um inibidor solúvel em epóxido hidrolase
(EPHX2) em homens, e / ou foram associados a
aumentos nos níveis de epóxido em tumores e
locais de metástase. Efeitos equivalentes
ocorreram em mulheres na ausência de inibição de
EPHX2, provavelmente porque esse sexo expressou
níveis reduzidos de EPHX2. As respostas
desencadeadas pelo TCDD foram associadas a
efeitos na vascularização do tumor, proliferação de
células tumorais e / ou apoptose. Assim, os
agonistas ambientais de AHR e potencialmente
também agonistas endógenos, nutricionais e
derivados de microbiomas, podem reduzir ou
melhorar a progressão do câncer, dependendo da
composição do PUFA na dieta, particularmente em
mulheres. As respostas desencadeadas pelo TCDD
foram associadas a efeitos na vascularização do
tumor, proliferação de células tumorais e / ou
apoptose. Assim, os agonistas ambientais de AHR e
potencialmente também agonistas endógenos,
nutricionais e derivados de microbiomas, podem
reduzir ou melhorar a progressão do câncer,
dependendo da composição do PUFA na dieta,
particularmente em mulheres. As respostas

desencadeadas pelo TCDD foram associadas a
efeitos na vascularização do tumor, proliferação de
células tumorais e / ou apoptose. Assim, os
agonistas ambientais de AHR e potencialmente
também agonistas endógenos, nutricionais e
derivados de microbiomas, podem reduzir ou
melhorar a progressão do câncer, dependendo da
composição do PUFA na dieta, particularmente em
mulheres.
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Introdução
O receptor de hidrocarboneto de aril (AHR) liga

vários poluentes ambientais, incluindo 2,3,7,8-
tetraclorodibenzo-ρ-dioxina (TCDD), bifenilos
policlorados (PCBs) e certos hidrocarbonetos
aromáticos policíclicos (PAHs), alguns metabólitos
endógenos , incluindo o triptofano catabolito
quinurenina, certos produtos gerados por
micróbios comensais e componentes da dieta,
incluindo compostos encontrados em vegetais
crucíferos 1 , 2 , 3 , 4 . Após a ligação do TCDD e
outros ligantes, o AHR ativa a transcrição de um
grande número de genes. CYP1A1, CYP1A2 e CYP1B1
são induzidos em muitos tecidos em todos os
mamíferos e também são geralmente os genes mais
massivamente induzidos 5 , 6. Curiosamente, o
TCDD e outros agonistas do AHR podem melhorar
ou retardar o crescimento do tumor em modelos
experimentais de camundongos, dependendo do

contexto 7 , 8 .
A alta ingestão de ácidos graxos poliinsaturados

ômega-6 (ω6) (PUFA), como o ácido araquidônico
(ARA) e o ácido linoléico (LA), característicos da
dieta ocidental, está ligada a vários efeitos adversos
à saúde, incluindo o câncer. Por outro lado, os
PUFAs ômega 3 (ω3), o ácido α-linolênico (ALA), o
ácido eicosapentaenóico (EPA) e o ácido
docosahexaenóico (DHA) geralmente estão
correlacionados com efeitos benéficos à saúde 9 .
Os PUFA são metabolizados através de três vias: a
“ciclooxigenase”, “lipoxigenase” e as vias menos
estudadas “epoxidação / hidroxilação do
citocromo P450” (ver Fig. 1a para o metabolismo da
ARA). Os epóxidos de PUFA são ainda
metabolizados em dióis, geralmente considerados
menos biologicamente ativos, pela hidrolase de
epóxido solúvel (EPHX2) 10. O aumento dos níveis
de epóxidos do PUFA ω6 em camundongos
estimulou o crescimento tumoral, a angiogênese e
as metástases 11 , 12 . Por outro lado, a administração
sistêmica de derivados epóxidos de PUFA ω3 inibiu
o crescimento e a metástase de células tumorais
xenoenxertadas 13 . A estimulação da epoxidação do
ácido araquidônico nas células de câncer de mama
aumentou sua metástase para o pulmão 14 , 15 . A
síntese de epóxidos de PUFA nas células tumorais e
no hospedeiro pode, portanto, afetar
independentemente a progressão do tumor. No
entanto, nenhum receptor para epóxidos de PUFA
foi identificado sem ambiguidade e os mecanismos

de sua ação não são claros.
figura 1
Vias simplificadas do metabolismo da ARA ( a ) e

protocolo experimental generalizado ( b ). EpETrEs
(ácidos epoxieicosatrienóicos), DiHETrEs (ácidos
dihidroxieicosatrienóicos), HETEs (ácidos
hidroxieicosatretraenóicos), oxo-ETEs (ácidos oxo-
eicosatetraenóicos), DiHETEs (ácidos
dihidroxitetraenóicos).
Os membros da família CYP1 podem metabolizar o

PUFA in vitro 16 , 17 , 18 . Estudar se esse metabolismo
ocorre in vivo, medimos 67 oxilipinas (isto é,
metabólitos oxigenados do PUFA) em vários órgãos
de camundongos knockout para o tipo selvagem
C57BL / 6 ou AHR alimentados com uma dieta de
comida três dias após a injeção intraperitoneal de

TCDD. O TCDD aumentou os níveis de vários
epóxidos e dióis de ARA, ALA, EPA e DHA no fígado
e pulmão. O TCDD também aumentou os níveis de
alguns dos metabólitos hidroxilados desses PUFA.
Onde medido, o TCDD aumentou os níveis dos
metabólitos esterificados em paralelo com os
metabólitos livres correspondentes. O TCDD não
aumentou os níveis de oxilipina em camundongos
knockout para AHR, demonstrando que o AHR
medeia todos ou a maioria dos efeitos do TCDD nas
oxilipinas 19 , 20 .
Como o TCDD melhorou o metabolismo

dependente do citocromo P450 de ω3 e ω6 PUFA in
vivo , decidimos no presente estudo investigar o
efeito potencial desse metabolismo na progressão
do tumor.
Resultados
Abordagem experimental geral
O esquema geral das experiências é mostrado na

Fig. 1b. Detalhes dos métodos experimentais são
fornecidos na seção Métodos, enquanto detalhes
das experiências individuais são descritos nos
parágrafos relevantes da seção Resultados. Os ratos
foram tratados com ou sem TCDD e alimentados
com dietas experimentais de três semanas antes da
injeção subcutânea de células tumorais e durante
todo o restante do experimento. A taxa de
crescimento tumoral foi medida e, quando os
tumores atingiram o mesmo tamanho em todos os

grupos experimentais em um experimento
específico, os tumores foram ressecados. As
metástases hepáticas resultantes foram
enumeradas e a extensão das metástases
pulmonares determinada. (O número de
metástases de superfície e o peso do pulmão
forneceram duas medidas de metástase pulmonar.)
Acredita-se que o desenvolvimento de metástases
neste protocolo corresponda à reversão da
dormência do tumor,12 . Várias variáveis foram
abordadas em nossos experimentos:
Linhas de celular.
Foi utilizada a linha celular Hepa1-GFP ou a

linha celular Lewis de carcinoma de pulmão
(LLC).
Estirpes de rato.
As estirpes C57BL / 6 foram usadas porque o

camundongo C57BL / 6 é "responsivo a AHR"
(homozigoto para o alelo Ahr b-1 ) e altamente
indutível por TCDD para as enzimas da família
CYP1. As células Hepa1-GFP não geraram
tumores após injeção subcutânea em
camundongos C57BL / 6 de tipo selvagem.
Portanto, utilizamos C57BL / 6 nu / nu para
os experimentos com as células Hepa1-GFP. As
células LLC são singênicas com o mouse
C57BL / 6 e usamos a cepa do tipo selvagem
para essas células.
Dietas.
Foram utilizadas duas dietas altas de ω6

diferentes, uma dieta iso-específica de ω3 alta
(Tabela Suplementar S1 ) ou ração normal para
ratos. A dieta rica em ω6 28 continha 1,3% de
PUFA, com uma razão teórica de ω6 / ω3 de
60: 1, e uma razão ω6 / ω3 determinada
experimentalmente de 38. Essas relações se
assemelhavam à de uma dieta ocidental
extrema (Tabela 1 ). Em certos experimentos,
utilizamos dieta rica em ω6 21, possuindo uma
razão teórica de ω6 / ω3 de 20: 1 e uma razão
ω6 / ω3 determinada experimentalmente de
23 (Tabela 1) Essa dieta se assemelha mais à
razão ω6 / ω3 na dieta ocidental típica do que
a dieta 28 (Stoll et al., 2001). Nossa dieta rica
em ω3 (dieta 29) continha 1% de PUFA e tinha
uma razão de ω6 / ω3 de 1,1: 1 (teórica) ou 1,5: 1
(experimental). Essa relação ω6 / ω3 é
equivalente à proporção recomendada para o
ser humano por um painel de nutricionistas 21 .
A dieta de ração tem uma razão ω6 / ω3 de 5,8
e, portanto, é intermediária nesse aspecto
entre as dietas ω6 e ω3. No entanto, a maioria
dos PUFA ω3 na dieta da comida é na forma de
ácido alfa-linolênico, em vez de EPA e DHA,
que compõem a maior parte do PUFA ω3 em
nossa dieta rica em ω3, 29 (Tabela 1 ). É
importante ressaltar que os ratos cresceram
(ou mantiveram seus pesos) igualmente em
todas as dietas.
Tabela 1 Composição de ácidos graxos das

dietas
We found that the levels of ω6 and ω3 PUFA in

plasma rapidly changed within three days of
the commencement of the diets, and remained
relatively stable for a further 21 days (See
Fig. 2a for the ω6/ω3 ratio at different time
points and Supplementary Fig. S2 for the levels
of individual PUFA). Furthermore, analysis of
fatty acids twenty-four days after the
initiation of feeding at the site of primary
tumor formation (skin) and at the potential
sites of metastases (lung and liver), showed
that the levels of the PUFA reflected those in
the respective diets (See Fig. 2b for the ω6/ω3
ratio in the different organs and
Supplementary Table S2 for the levels of
individual PUFA). The resulting ω6/ω3 ratios in
the organs/tissues of the mice fed ω6-rich
diet 21 were only slightly less than those in
mice fed ω6-rich diet 28 except for skin,
where the ω6/ω3 ratio was even greater in
mice fed diet 21 (Fig. 2b and Supplementary
Table S2). The ω6/ω3 ratios in the
tissues/organs of mice fed the chow diet more
closely resembled the ratio in the mice fed the
ω6-rich diets than the ratio in mice fed the
with the ω3-rich diet
Figure 2
Proporção de ω6 a ω3 PUFA no plasma /

órgãos de camundongo. ( a ) Proporção no
plasma de camundongo após o início da
alimentação das dietas e ( b ) nos órgãos do
camundongo 24 dias após o início da
alimentação das dietas. * P <0,05, ** p
<0,01, *** p <0,001 para a dieta 29 com p
ared com as outras dietas. Os dados foram
analisados com um teste t bicaudal.
Concentração de TCDD.
A concentração de TCDD diferiu entre as

experiências Hepa1-GFP e LLC, conforme
descrito nas seções relevantes.
Sexo.
Os machos foram usados em alguns

experimentos e as fêmeas em outros.
Inibidor de EPHX2 (hidrolase de epóxido

solúvel).
A presença ou ausência do inibidor da EPHX2,

TPPU, representou uma variável em algumas
experiências.
Medições de oxilipina.
In certain experiments we measured the levels of

67 to 75 oxylipins in the tumors or organs of the
mice.
Effect of TCDD on the growth of primary tumors

arising from xenografted Hepa1-GFP cells and their
metastasis to the lung in male immunocompromised
mice fed either a ω3-rich or ω6-rich diet
We injected male nude C57BL/6 mice

intraperitoneally with 4 µg/kg TCDD prior to
injecting 106 Hepa1-GFP cells subcutaneously, and
injected the mice with 1 µg/kg TCDD weekly
thereafter. 4 µg/kg TCDD maximally induces
CYP1A1 and nearly maximally induces CYP1B1 in the
livers of C57BL/6 mice22. Hepa1-GFP cells express
the AHR and are highly inducible by TCDD for
CYP1A1, moderately inducible for CYP1A2, and are

not inducible for CYP1B1 (Supplementary Fig. S1).
Hepa1-GFP expressed negligible levels of EPHX2
mRNA, less than 0.01% of the levels present in
mouse liver, and fewer than 1 molecule of EPHX2
mRNA per 200 cells. This cell line allowed us to
assess the effect of AHR expression in both the
mouse host and the tumor cells to the effects of
TCDD. In all these experiments we also treated the
mice with the EPHX2 inhibitor, TPPU in their
water. Since Hepa1-GFP cells do not express
EPHX2, the effects of TPPU must be restricted to
the mouse host. The following observations were
made:
1. 1.
TCDD reduced the growth rate of tumors
derived from Hepa1-GFP cells when the mice
were fed the high ω3 diet (Fig. 3a).
Figure 3
Efeito do TCDD em tumores derivados de

Hepa1-GFP. ( a ) Efeito do TCDD no
crescimento do tumor em camundongos
alimentados com uma dieta rica em PUFAs
ω3. Os ratos machos C57BL / 6 nus foram
alimentados com dieta rica em w3 29 e
tratados com ou sem TCDD (n = 10 por
grupo). Ambos os grupos receberam TPPU.
Os camundongos foram injetados
subcutaneamente com células Hepa1-GFP e
o volume do tumor avaliado posteriormente.
Um experimento representativo é mostrado
em quatro experimentos independentes. Os
dados foram analisados pelo teste U de
Mann-Whitney bicaudal para comparação de
dois grupos independentes ( b ) Níveis de
oxilipinas afetadas pelo tratamento com
TCDD em tumores de camundongos

alimentados com dieta rica em ω3 ou rica em
ω6 e TPPU. Até cinco tumores foram
analisados por grupo experimental. Os dados
foram analisados por um teste t bicaudal. (c)
Efeito do TCDD na metástase pulmonar em
camundongos alimentados com uma dieta
rica em ω6. Camundongos machos C57BL / 6
nus foram alimentados com a dieta 28,
tratados ou não com TCDD e tratados com
TPPU. Os tumores foram ressecados quatro a
seis semanas após a injeção das células
Hepa1-GFP. Após mais cinco a seis semanas,
os ratos foram sacrificados e a frequência
dos ratos com metástases pulmonares foi
determinada e os pulmões pesados
(analisados pelo teste exato de Fisher e um
teste t bicaudal, respectivamente). Os dados
representam a soma de duas experiências
independentes. 15 ratos foram ressecados
por grupo experimental. O número de
camundongos sobreviventes ao ponto em
que as metástases podem ser medidas é
mostrado. Os níveis de significância são
indicados da seguinte forma: * p <0,05, ** p
<0,01, *** p <0,001.
2. 2)
O TCDD não afetou consistentemente a taxa
de crescimento do tumor em camundongos
alimentados com dieta rica em ω6 (dieta 28).
Dados não mostrados.
3. 3)
67 oxilipinas foram medidas no tecido dos
tumores (Fig. 3b ). Os únicos metabólitos que
foram afetados significativamente nos
tumores de camundongos alimentados com ω3
tratados com TCDD foram os epóxidos de
DHA (ω3), ARA (ω6), LA (ω6) e ALA (ω3) e os
dióis do EPA, que foram todos elevados nos
tumores de ratos alimentados com ω3. O
aumento nos níveis dos epóxidos de DHA
(EpDPEs) foi consideravelmente maior do que
nos demais epóxidos. Estes resultados são
consistentes com a noção de que o efeito
inibitório do TCDD no crescimento de
tumores em camundongos alimentados com
ω3 é devido à geração dos epóxidos
correspondentes. Observe que os epóxidos
nos tumores podem ter sido gerados tanto
pelas chamadas tumorais quanto pelas células
hospedeiras associadas ao tumor.
4. 4)
A única oxilipina aumentada pelo TCDD em
camundongos alimentados com ω6 foi o
produto lipoxigenase do ácido linoléico (ω6),
9-oxo-ODE). Estes dados são congruentes
com a nossa observação de que o TCDD não
aumentou o crescimento do tumor em
camundongos alimentados com a dieta rica
em ω6.
5. 5)
Os níveis de todas as 67 oxilipinas nos quatro

grupos de tratamento são apresentados na
Tabela Suplementar S3 . Os níveis dos
metabólitos ω3 nos tumores eram geralmente
consideravelmente maiores nos ratos
alimentados com ω3 do que nos ratos
alimentados com ω6, e os níveis dos
metabólitos ω6 eram geralmente maiores nos
tumores dos ratos alimentados com ω6,
refletindo as concentrações de o PUFA nas
dietas.
6. 6
Os tumores foram ressecados em vários
momentos após o início do tumor primário
(entre 26 e 33 dias) para garantir que o
tamanho médio dos tumores não variasse
consideravelmente entre os vários grupos
experimentais. (Veja a Tabela Suplementar S4
para o tamanho dos tumores em ratos
alimentados com ω6 no momento da
ressecção). Em média, 43% dos camundongos
ressecados puderam ser analisados em busca
de metástases após a ressecção: o restante
morreu prematuramente, foi sacrificado por
razões de saúde ou sacrificado devido ao
reaparecimento do tumor primário. Não foram
observadas metástases pulmonares em
camundongos alimentados com dietas ricas
em ω3 ou ω6 na ausência de TCDD. No
entanto, o tratamento com TCDD aumentou
significativamente o número de camundongos
com metástases pulmonares e também o peso
pulmonar em camundongos alimentados com

a dieta rica em ω6 (Fig. 3c ).
7. 7)
Como não foram obtidas metástases
pulmonares em camundongos alimentados
com dieta rica em ω3 na ausência de TCDD,
não foi possível avaliar se o TCDD reduziu a
metástase pulmonar nesses camundongos.
8. 8)
Não foram encontradas metástases hepáticas
em nenhum camundongo.
Essas experiências demonstraram, portanto, que

quando o TCDD ativa o AHR no hospedeiro e no
tumor, (i) aumenta os níveis de epóxidos ω3 nos
tumores de camundongos alimentados com ω3 e
inibe seu crescimento, e (ii) aprimora a metástase
pulmonar em alimentados com ω6 camundongos
(por um mecanismo desconhecido). Os resultados
de nossas experiências de tumorigênese e
metástase estão resumidos na Tabela 2 .
Tabela 2 Resumo dos efeitos do TCDD
Efeito do TCDD e das dietas ricas em ω3 e ω6 no

crescimento e metástase de células LLC
xenoenxertadas em camundongos machos
For these experiments, we injected C57BL/6 male

mice with 40 μg/kg of TCDD intraperitoneally
prior to subcutaneous injection of 2 × 105 LLC cells.
This TCDD dose is frequently used in studies with
mice, is not overtly toxic, and leads to sustained

levels of CYP1A1 for at least a week23. Importantly,
we previously showed that CYP1A1 and CYP1B1
mRNA levels were greatly increased in the liver and
lung by this dose of TCDD, and CYP1A2 mRNA was
increased in the liver. Furthermore, our studies on
oxylipin levels were obtained with this dose19,20. Os
camundongos também foram tratados com 10 µg /
kg de TCDD em intervalos semanais após a dose
inicial. As células LLC expressaram menos de 0,01%
dos níveis de mRNA de EPHX2 presentes no fígado
de camundongos e menos de 3 moléculas de mRNA
de EPHX2 por 200 células. Essas experiências nos
proporcionaram a oportunidade de estudar os
efeitos do TCDD no hospedeiro, na ausência de
efeitos diretos nas células tumorais. Os seguintes
dados foram obtidos:
1. 1
O TCDD reduziu a taxa de crescimento de
tumores derivados de LLC em camundongos
machos alimentados com dieta ω3 alta na
presença do inibidor de epóxido hidrolase,
TPPU. O crescimento de tumores não foi
inibido na ausência de TPPU (Fig. 4a ).
Figura 4
Efeito do TCDD no crescimento e metástase

de tumores derivados de LLC em
camundongos machos alimentados com
dieta ou comida rica em w3 ou w6 na
presença ou na ausência do TPPU, inibidor
solúvel em epóxido hidrolase. ( a ) Uma
experiência representativa de crescimento de
tumores com 8 a 10 camundongos por
grupo é mostrada em quatro (+ TPPU) ou
duas (-TPPU) experiências independentes em
camundongos alimentados com ω3. ( b ) É
mostrada uma experiência representativa de
duas experiências independentes em ratos
alimentados com ω6 (10 ratos por grupo
experimental). ( c, d) Frequências de
camundongos com metástases pulmonares e
pesos pulmonares em camundongos machos
alimentados com dieta rica em ω3 29 na
presença e ausência de TPPU. Os dados

representam a soma de três experimentos
independentes. 32 ratos foram ressecados
por grupo experimental. O número de
camundongos sobreviventes ao ponto em
que as metástases podem ser medidas é
mostrado. ( e ) Metástase pulmonar e
hepática de tumores derivados de LLC. Os
dados representam a soma dos resultados de
seis experiências diferentes das
representadas na Fig. C, d. 76 ratos foram
ressecados por grupo experimental. ( f, g )
Pesos pulmonares e frequências de
camundongos com metástases hepáticas em
camundongos alimentados com dieta rica
em ω6. Os dados representam o somatório
de duas experiências independentes. 24 a 27
camundongos foram ressecados por grupo
experimental. ( h) Um experimento
representativo de crescimento de tumores
com camundongos alimentados com dieta
alimentar e randomizados em quatro grupos
(n = 10 / grupo): tratados ou não tratados
com TCDD e fornecidos ou não com TPPU,
conforme indicado. Uma experiência
representativa é mostrada em duas
experiências independentes.
2. 2)
Ao contrário do seu efeito em camundongos
alimentados com dieta com ω3 alto, o TCDD
acelerou o crescimento de tumores derivados
de LLC em camundongos machos alimentados

com dieta com ω6 alto 21 quando foram
tratados com TPPU (Fig. 4b ).
3. 3)
Os dados acima sugerem que os efeitos do
TCDD no crescimento do tumor são mediados,
pelo menos em parte, por epóxidos do PUFA.
4. 4)
In the absence of treatment with TCDD, the
growth rate of LLC-derived tumors in male
mice fed the high ω3 diet did not differ from
the growth rate of mice fed the high ω6 diet
(Supplementary Fig. S3). Thus our results were
not confounded by any differential growth
rates of tumors in mice fed the high ω3 or ω6
diets in the absence of TCDD.
5. 5.
LLC-derived tumors in male mice fed the ω3-
rich diet were resected when they were
approximately 3,000 mm3 in size
(Supplementary Table S4). In individual
experiments, tumors were excised various
times after tumor cell injection (varying
between 19 and 34 days) to ensure that the
average size of the tumors did not vary
appreciably between different experimental
groups. Unlike the case with mice injected
with Hepa1-GFP cells, the great majority of
male mice fed the ω3-rich diet and treated
with (or without) TPPU in the absence of
TCDD were found to have lung metastases.
This number was significantly decreased in

mice treated with TCDD and TPPU (Fig. 4c).
Lung weight was also decreased by TCDD in
these mice (Fig. 4d). TCDD did not inhibit the
development of metastases in the absence of
TPPU. These data suggest that the TCDD-
mediated reduction in lung metastasis
occurring in ω3-fed mice is dependent upon
the generation of the corresponding epoxides.
6. 6.
Figure 4e presents a summation of the results
from a total of six separate experiments (that
are different from those represented in
Fig. 4c,d) in which we tested the effect of
TCDD on metastasis in ω3-fed mice in the
presence of TPPU. With this increased number
of mice, we were able to observe a significant
decrease in the number of liver as well as lung
metastases in mice treated with TCDD.
7. 7.
Since the great majority of mice developed
lung metastases even in mice untreated with
TCDD, we could not assess whether TCDD
increased the number of lung metastases in
ω6-fed mice. However, we did observe
increased lung weight in TCDD-treated ω6-
fed mice (reflecting an increase in metastatic
load), and interestingly this occurred in both
TPPU-treated and untreated animals (Fig. 4f).
8. 8.
TCDD increased the number of liver

metastases in ω6-fed mice, and this also
occurred both in mice treated or untreated
with TPPU (Fig. 4g). (In order to minimize
lethality, we resected the LLC-derived tumors
in the ω6-fed mice when they were smaller
{2,500 mm3; Supplementary Table S4} than the
corresponding tumors in ω3-fed mice, and
also euthanized the former mice sooner after
resection than the latter mice. This probably
explains why the lung weights and frequency
of mice with liver metastases were lower in
the ω6-fed mice untreated with TCDD
compared with these parameters in the
equivalent ω3-fed mice.
9. 9.
The above data suggest either that sufficient
levels of ω6 epoxides were generated for
metastasis to occur in the lungs and livers of
ω6-fed mice even in the presence of active
EPHX2, or that other metabolites of ω6 PUFA
are responsible for enhancing metastasis.
10. 10.
The levels of 77 and 75 oxylipins were
measured in the lungs and livers, respectively,
of male C57BL/6 mice fed with either the ω3-
rich diet (diet 29) or the ω6-rich diet (diet 21)
for 4 weeks, maintained with TPPU, and
injected intraperitoneally with 40 µg/kg TCDD
or vehicle (1,4-dioxane) four days prior to
euthanasia.
11. 11.
A large number of oxylipins were increased by
TCDD treatment in the lungs of mice fed the
ω6 diet (Fig. 5). Of note, TCDD increased the
levels of the epoxides (EpETrEs) and diols
(DiHETrEs) of the ω6 PUFA, ARA, and to a
much lesser degree, the epoxides (EpETEs)
and diols (DiHETEs) of the ω3 PUFA, EPA.
These data are consistent with the notion that
the enhancement of metastasis to the lungs of
LLC cells in ω6-fed mice depended upon the
generation of ARA epoxides in this organ.
However, 11,12,15-TriHETrE, and many
lipoxygenase metabolites of ARA: HETEs,
oxoeicosatetraenoic acids {oxo-ETEs, 6-trans-
leukotriene B4 (6-trans-LTB4), and
lipoxygenase A4 were also increased by TCDD
treatment in the lung, as were several
cyclooxygenase products of ARA
(thromboxane B2, and all five prostaglandins
that were measured: PGD2, PGE2, PGF2α, PGJ2,
and keto-PGF1α), entertaining the possibility
that one or more of these metabolites may
contribute to the stimulatory effect of TCDD
on metastasis in the lung of ω6-fed mice.
Figure 5
Oxylipins affected by six day treatment with

40 µg/kg TCDD and TPPU in the lung of mice
fed with ω3-rich diet 29 or ω6-rich 21. Five
mice were analyzed per experimental group.
TriHETrE (Trihydroxyeicosatrienoic acid).
Oxylipins levels are in pmol/gram of tissue.
12. 12.
We did not observe any pronounced changes
in lung oxylipin levels induced by TCDD in ω3-
fed mice that might suggest any roles in
mediating the inhibition by TCDD of LLC
metastasis in ω3-fed mice.
13. 13.
The levels of all 77 oxylipins in the lungs of the
four experimental groups of mice are
presented in Supplementary Table S3.
14. 14.
In the liver, TCDD increased the levels of EPA
and DHA epoxides and DHA diols in the ω3-fed
mice, consistent with the notion that ω3
epoxides are responsible for the decrease in
liver metastases induced by TCDD in mice fed
the ω3 diet (Fig. 6). TCDD treatment also lead
to less marked increases in ARA and LA diols,
11,12,15-TriHETrE, and EPA-derived
prostaglandins in the ω3-fed mice.
Figure 6
Oxilipinas afetadas pelo tratamento de seis

dias com 40 µg / kg de TCDD e TPPU no
fígado. Cinco ratos foram analisados por
grupo experimental. DiHETEs, DiHDPEs,
DiHETrEs, DiHOMEs {ácidos di-
hidroxioctadecaenóicos} (dióis de EPA, DHA,
ARA e LA, respectivamente). HODEs {ácidos
hidroxioctadecaenóicos} e TriHOMEs {ácidos

trihidroxioctadecaenóicos} (metabólitos
dihidroxi e trihidroxi do LA).
15. 15
O tratamento com TCDD em camundongos
alimentados com ω6 aumentou os níveis
hepáticos dos dióis de ARA, LA e EPA, 11,12,15-
TriHETrE e os metabólitos hidroxi
lipoxigenase de LA (ácidos
hidroxioctadecaenóicos {HODEs} e ácidos
trihidroxioctadecaenóicos {TriHOMEs}). É
possível que um ou mais desses metabólitos
do citocromo P450, ou seus precursores de
epóxido e / ou metabolitos da lipoxigenase,
tenham contribuído para o efeito estimulador
do TCDD nas metástases das células LLC no
fígado de camundongos alimentados com ω6.
16. 16
Os dados para todas as oxilipinas no fígado
são apresentados na Tabela Suplementar S3 .
17. 17
Os níveis dos metabólitos ω6 foram em geral
consideravelmente maiores nos fígados dos
camundongos alimentados com ω6, e os
metabólitos ω3 foram maiores nos fígados dos
camundongos alimentados com ω3, como
esperado. (Tabela Suplementar S3 ).
18. 18
Também investigamos os efeitos do TCDD na

taxa de crescimento do tumor e no nível de
metástase após a ressecção do tumor em
camundongos alimentados com uma dieta de
ração normal, uma vez que a maioria dos
experimentos com camundongos é realizada
com essa dieta. Similar aos resultados obtidos
com a dieta ω6, e congruente com as nossas
observações de que a dieta chow gerou
proporções ω6 / ω3 no plasma e órgãos
semelhantes aos de ratos alimentados com ω6,
o TCDD acelerou a taxa de crescimento de
ratos machos alimentados com a dieta de
chow na presença de TPPU (Fig. 4h ).
Resultados equivalentes foram obtidos em
dois experimentos.
Em resumo, esses dados demonstram que o TCDD

inibe o crescimento de tumores e as metástases
pulmonares e hepáticas de células LLC com
deficiência de AHR em camundongos alimentados
com uma dieta rica em ω3, mas estimula esses
parâmetros em camundongos alimentados com ω6
e fornece evidências de que esses efeitos são
mediados por os epóxidos correspondentes,
embora outros metabólitos do PUFA também
possam estar envolvidos.
Efeito do TCDD e das dietas ricas em ω3 e ω6 no

crescimento e metástase de células LLC
xenoenxertadas em camundongas fêmeas
1. 1
O TCDD reduziu a taxa de crescimento de

tumores derivados de LLC em camundongos
fêmeas C57BL / 6 alimentados com a dieta
rica em ω3, assim como em camundongos
machos. No entanto, ao contrário dos
camundongos machos, essa redução também
ocorreu na ausência de TPPU (Fig. 7a )
Figura 7
Efeito do TCDD no crescimento e metástase

de tumores derivados de LLC em
camundongas fêmeas. Camundongos C57BL
/ 6 fêmeas foram alimentados com dieta rica
em ω3 29, fornecida com ou sem TPPU, e
tratados ou não tratados com TCDD. ( a ) O
volume do tumor foi avaliado após injeção
com células LLC (n = 14 a 21 / grupo). ( b )
Os pesos pulmonares foram determinados
aproximadamente cinco semanas após a
ressecção de tumores de aproximadamente

3.700 mm3 de tamanho (ver Tabela
Suplementar S4d ). Os dados em aeb são
derivados de duas experiências
independentes. ( c ) Camundongos fêmeas
foram alimentados com dieta rica em ω6 28,
e o crescimento do tumor foi determinado (n
= 9 a 15 por grupo). ( d ) O peso pulmonar
foi medido após ressecção de tumores de
aproximadamente 2.400 mm3 em tamanho.
(Veja a Tabela Suplementar S4e .) Os dados
em c e d são derivados de duas experiências
independentes. * p <0,05, ** p <0,01, * p
<0,001 em comparação com os grupos –
TCDD correspondentes. ( e ) Os níveis de
mRNA de EPHX2 foram avaliados no tecido
pulmonar normal de camundongos fêmeas e
machos (n = 4 / grupo) alimentados com
dieta rica em ômega 3 29 por RT-PCR (média
± SEM, *** p = 0,001). ( F ). A proteína EPHX2
foi detectada nos mesmos camundongos por
imunocitoquímica.
2. 2)
O TCDD diminuiu o grau de metástase
pulmonar após a ressecção do tumor
(conforme determinado pelo peso do pulmão)
em camundongas alimentadas com a dieta rica
em ω3 e, diferentemente dos camundongos
machos, isso também ocorreu na ausência de
TPPU e na sua presença (Fig. 7b ).
3. 3)
O TCDD aumentou a taxa de crescimento de
tumores derivados de LLC em camundongas
alimentadas com dieta rica em ω6 e,
novamente, em contraste com os machos,
essas respostas ocorreram na ausência de
TPPU (Fig. 7c ).
4. 4)
O TCDD aumentou o grau de metástase
pulmonar (conforme determinado pelo peso
do pulmão) em camundongas fêmeas
alimentadas com ω6 na presença e na ausência
de TPPU (Fig. 7d ), da mesma forma que os
machos. Para minimizar a letalidade,
ressecamos os tumores derivados de LLC nos
camundongos alimentados com ω6 quando
eles eram menores {~ 2.400 mm 3 , Tabela
Suplementar S4e } do que os tumores
correspondentes nos camundongos
alimentados com ω3 {3.700 mm 3 , Tabela
Suplementar S4d }) e também sacrificou os
primeiros ratos logo após a ressecção do que
os últimos. Isso provavelmente explica por que
os pesos pulmonares foram mais baixos nos
ratos alimentados com ω6 não tratados com
TCDD em comparação com os ratos
alimentados com ω3 equivalentes.
5. 5)
Os níveis de mRNA de EPHX2 foram 28 vezes
mais baixos nos pulmões de fêmeas que
camundongos machos alimentados com dieta
rica em ω3 29 (Fig. 7e ), e as fêmeas também

expressaram níveis consideravelmente mais
baixos de proteína EPHX2 no pulmão do que
os machos, conforme determinado por análise
imuno-histoquímica (Fig. . 7F ). Isso é
consistente com um relatório recente de que a
metilação dependente de receptor de
estrogênio / estrogênio do gene Ephx2
diminui a expressão desse gene em tecidos de
camundongos e células humanas 24 .
Thus all responses to TCDD in female mice

occurred in the absence of TPPU. This is important
because this represents a more real-world setting
than the inclusion of an EPHX2 inhibitor. The
reduced expression of EPHX2 in females provides a
possible explanation for our observation that all
responses to TCDD in females occurred in the
absence of TPPU.
Effect of TCDD on vascular cell density, VEGF and

apoptosis in LLC-derived tumor tissue and tumor-
associated tissues, and on plasma VEGF in male mice
fed either an ω3-rich or an ω6-rich diet
Para investigar os meios pelos quais o TCDD afetou

diferencialmente o crescimento do tumor e as
metástases em camundongos machos alimentados
com dieta alta ω3 ou alta ω6, analisamos vários
parâmetros associados a esses processos em
camundongos selvagens C57BL / 6 alimentados
com dieta 29 ou dieta 31, tratado com ou sem
TCDD e com ou sem TPPU e injetado com células
LLC. Os seguintes resultados foram obtidos:
1. 1
O tratamento com TCDD não aumentou os
níveis da proteína CYP1A1 nos tecidos
tumorais de camundongos alimentados com a
dieta ω3 ou ω6, consistente com a observação
de que as células LLC cultivadas não são
induzíveis ao CYP1A1 (Fig. S4a, b ).
2. 2)
O TCDD aumentou os níveis de CYP1A1 nos
segmentos pulmonares não metastáticos, mas
não não metastáticos, desses mesmos
camundongos, confirmando que nosso
protocolo de tratamento com TCDD é eficaz
na indução dessa enzima em camundongos
(Fig. S4c, d ).
3. 3)
O TCDD não afetou os níveis de EPHX2 nos
pulmões de camundongos alimentados com
ω3 ou ω6 (Fig. S5 complementar ), consistente
com nossas observações anteriores sobre a
expressão do mRNA de EPHX2 em
camundongos alimentados com comida 19 .
4. 4)
O TCDD diminuiu a densidade dos vasos
sanguíneos e os níveis de VEGF em tumores
de camundongos alimentados com a dieta ω3,
mas apenas quando eles também foram
tratados com TPPU (Fig. 8a, b ).
Figura 8
Vasos sanguíneos, níveis de VEGF,

proliferação e apoptose em tumores
derivados de LLC. Densidade dos vasos
sanguíneos ( a ) e níveis de VEGF em tumores
derivados de LLC ( b, d ) e plasma ( c ). Níveis
de MCM2 ( e ) e índices mitóticos ( f ) nos
núcleos de tumores derivados de LLC de
camundongos machos alimentados com ω6.
Apoptose em tumores derivados de LLC de
camundongos machos alimentados com ω3 (
g ). Os dados são representativos de duas ou
três experiências independentes. * p <0,05, **
p <0,01 em comparação com o grupo –TCDD
correspondente.
5. 5)
Na presença de TPPU, o TCDD diminuiu os

níveis de VEGF no soro de camundongos
alimentados com a dieta rica em ω3 (Fig. 8c ).
Assim, o efeito de TCDD mais TPPU em
camundongos alimentados com dieta ω3 alta
pode ser parcialmente mediado por uma
diminuição na angiogênese que ocorre como
resultado de níveis localmente reduzidos de
VEGF.
6. 6
O TCDD aumentou os níveis de VEGF no soro
de camundongos alimentados com a dieta ω6
(Fig. 8c ) e aumentou a expressão de VEGF
nos tumores de camundongos alimentados
com ω6 (Fig. 8d ), sugerindo que o aumento de
VEGF pode ser, pelo menos em parte,
responsável pelo efeito no TCDD na dieta ω6.
7. 7)
O TCDD aumentou os níveis de expressão do
marcador de proliferação celular MCM2 e
também o índice mitótico em tumores
derivados de camundongos alimentados com
dieta rica em ω6 (Fig. 8e, f ), sugerindo que um
aumento na proliferação de células tumorais
contribui para o efeito estimulador do TCDD
no presença da dieta ω6.
8. 8)
O TCDD aumentou a apoptose no tecido
tumoral de camundongos alimentados com
dieta rica em ω3 na presença de TPPU (Fig. 8g
), sugerindo que a apoptose pode contribuir
para o efeito do TCDD no crescimento do

tumor sob essas condições.
Discussão
Using two tumor transplantation models, we

demonstrate that TCDD generally retards primary
tumor growth and metastasis when mice are fed an
ω3-rich diet, but enhances these parameters in
mice fed ω6-rich diets. This represents a novel
process whereby TCDD (and presumably other
AHR ligands) can impact tumor progression. Our
studies also break new ground in showing effects
of TCDD on both tumor growth and metastasis.
Certain of the effects of TCDD were observed in
nude mice, indicating that they do not depend
upon a T cell-dependent immune response. It is
likely that PUFA epoxides are primarily responsible
for the effects of TCDD on tumor progression. As
indicated by our following observations:
In combination with an EPHX2 inhibitor,

TCDD inhibited the growth of Hepa1-GFP
derived tumors in ω3-fed male mice and also
increased the levels of ω3 PUFA epoxides in
these tumors.
In male mice the negative effects of TCDD on

the growth and lung metastasis of tumors
derived from the AHR-negative LLC cells in
mice fed the ω3 diet and the positive effect of
TCDD on LLC tumor growth in ω6-fed mice
occurred only when the mice were fed an

EPHX2 inhibitor.
TCDD decreased metastasis to the livers of

LLC-derived tumors in ω3-fed male mice in
the presence of TPPU, and increased the levels
of ω3 epoxides and diols in the livers of
equivalently treated mice.
TCDD increased lung metastasis of LLC-

derived tumors in ω6-fed and TPPU-treated
male mice and also increased the levels of ARA
epoxides in the lungs of such mice.
TCDD treatment in ω6-fed mice increased

liver metastasis and also the levels of the diols
of ARA, LA and EPA in the liver.
Nevertheless, it should be noted that certain PUFA

metabolites other than epoxides and diols were
also increased in some of the above experiments,
opening up the notion that they may also
contribute to the observed effects of TCDD.
As with male mice, TCDD inhibited tumor growth

and lung metastasis of LLC-derived tumors in ω3-
fed female mice and enhanced tumor growth and
lung metastasis in ω6-fed female mice. However,
these responses occurred even in the absence of
TPPU, in contrast to the situation in male mice
(except for lung metastasis in ω6-fed male mice,
which also occurred in the absence of TPPU). This
suggests either that non-epoxide metabolites of
the PUFA are responsible for effecting these
changes in tumor progression, or more likely, that

because of reduced levels of EPHX2 in females,
TCDD treatment induces sufficient increases in
PUFA epoxides even in the absence of EPHX2
inhibition to impact tumor growth and metastasis.
Most importantly, the lack of a requirement for
TPPU to see effects of TCDD in female mice
reflects a real-world situation.
The positive effects of TCDD on the growth of LLC

tumors in mice fed the chow diet resembled its
effects in mice fed the ω6-rich diet, reflecting the
similar levels of the ω3 and ω6 PUFA generated by
these diets in the tissues of the host. Since most
studies on the effects of AHR agonists in mice have
been performed on animals fed a chow diet, it is
likely that any resulting PUFA metabolism that
occurred was stimulatory towards tumor
progression.
Of interest, TCDD and other PCDDs can increase

the levels of PUFA in the liver25,26 and such
increases may further enhance the role of the
metabolism of these PUFA in tumor growth and
metastasis.
Our data indicate that that the effects of TCDD on

metastasis in the presence of the ω3 and ω6 diets
occur independently of its effects on tumor
growth, consistent with the observations of other
investigators with regard to the corresponding
effects of the PUFA epoxides11,12,13,15 and suggesting
that TCDD impacts the metastatic cascade directly
under these circumstances.
We investigated various parameters associated

with tumor growth and metastasis in tumors
and/or stromal cells in the LLC experiments.
Previous studies indicated that the VEGF pathway
may contribute the effects of ω3 epoxides on
tumor progression13. In concordance with these
observations, we found that in mice fed the ω3-rich
diet, TCDD decreased plasma VEGF levels, and
both VEGF expression and blood vessel density in
LLC-derived tumors, suggesting that the VEGF
pathway may contribute to the effects of TCDD
that we observed. We also observed that apoptosis
was increased by TCDD (+TPPU) treatment in LLC-
derived tumors in mice fed the high ω3 diet,
suggesting that alterations in apoptotic rates may
contribute to the effects we observed in the male
mice fed this diet. TCDD increased plasma VEGF
levels and VEGF levels in the LLC-derived tumors
of mice fed the high ω6 diet, suggesting that
increased VEGF levels may contribute to the
stimulating effect of TCDD on tumor growth, and
tumor cell proliferation and metastasis that we
observed in mice fed the ω6 diet (plus TPPU).
Our observations are potentially relevant to the

etiology of several types of human cancer. For
example, environmental exposure to PAHs (e.g. via
tobacco and open-fire smoke and smog), which are
potent AHR agonists, and occupational exposure to
these compounds (e.g. in coke oven workers) are
known to cause lung, skin, gastrointestinal, and
bladder cancer27,28. PAHs generated in barbecued
meat can induce CYP1 family members in the small
intestine and liver of humans29 that thereby

metabolically activate the PAHs themselves and
also carcinogenic heterocyclic amines in the
cooked meat30. Natural products, including
phytochemicals found in common vegetables, and
also certain products generated by commensal
microbes, are potent AHR agonists1,2. The
endogenous tryptophan metabolite, kynurenine (or
one or more of its metabolites31) can promote
human glioblastoma via activation of the AHR32.
Importantly, the AHR is also constitutively active
and overexpressed in many types of cancer, and
CYP1A1 and CYP1B1 are overexpressed in many
cancers4,33,34,35. It is very possible, therefore, that a
high ω6 consumption (as in a typical Western diet)
will exacerbate progression of the tumors in the
above situations, while a high ω3 diet may be
protective.
O EPHX2 é a principal enzima envolvida no

metabolismo adicional dos epóxidos de PUFA. No
entanto, certas observações indicam que o EPHX2
pode ter um efeito limitado nos níveis de epóxidos
PUFA durante o desenvolvimento de certos
tumores, em certos indivíduos ou em contextos
particulares. Assim, a expressão de EPHX2 diminui
em muitos tipos de tumores à medida que crescem,
diminui nas células endoteliais associadas a
tumores, é suprimida em metástases e é eliminada
ou reduzida em vários tipos de cânceres humanos e
freqüentemente também no tecido normal
adjacente 10 , 12 , 36 . Além disso, polimorfismos no
gene EPHX2 levam a grandes diferenças na
atividade da hidrolase solúvel em epóxido no ser

humano 37. A proporção de dióis PUFA e epóxidos
diminui substancialmente no plasma de ratos logo
após uma refeição, sugerindo um declínio na
atividade do EPHX2 38 . Hipóxia diminui a
expressão de EPHX2 no pulmão de camundongo 39.
É importante ressaltar que observamos que o
TCDD inibiu o crescimento tumoral e a metástase
pulmonar em camundongas alimentadas com a
dieta ω3 e aprimorou esses parâmetros em
camundongas alimentadas com a dieta ω6, mesmo
na ausência de TPPU. Esses efeitos podem estar
relacionados à redução nos níveis de EPHX2 em
camundongos fêmeas que observamos, que
provavelmente são mediados pelo estrogênio. A
ausência de um inibidor de EPHX2 reflete um
cenário do mundo real, e os dados acima sugerem
que mulheres na pré-menopausa podem ser
particularmente responsivas aos efeitos (positivos
e negativos) dos agonistas de PUFA e AHR na dieta
no crescimento e progressão do tumor.
Curiosamente, as mulheres são mais capazes do
que os homens de metabolizar ALA em EPA e DHA
40
, e a expressão de CYP1A1 e CYP1B1 nos pulmões
de mulheres fumantes (ou seja, sob condições de
indução) é consideravelmente maior do que nos
pulmões de homens fumantes 41 , 42 , sugerindo
ainda que os efeitos do PUFA ω3 na dieta podem
ser mais eficazes na inibição de AHR dependente
progressão do câncer em mulheres que homens.
Em conclusão, mostramos que o TCDD afeta o

crescimento e as metástases dos tumores de
maneira positiva ou negativa, dependendo dos

níveis de ω3 e ω6 PUFA na dieta. Nossos estudos,
portanto, revelam um novo mecanismo pelo qual a
ativação do AHR e as enzimas CYP1 podem afetar a
progressão do câncer. O papel das enzimas CYP1
no desenvolvimento e progressão do câncer até
agora se concentrou em sua capacidade de
metabolizar o HAP e outros carcinógenos
ambientais. Nossos estudos indicam que a
capacidade das enzimas CYP1 de metabolizar o
PUFA também pode contribuir para suas atividades
relacionadas ao câncer. Nossos estudos também
apontam para os benefícios de uma dieta rica em
ω3 PUFA. Certos peixes de água fria representam a
principal fonte alimentar de DHA e EPA, e estes
representam um recurso limitado. Contudo,43 .
Métodos
Produtos químicos
A 1-trifluorometoxifenil-3- (1-propionilpiperidin-4-
il) ureia (TPPU) foi sintetizada como descrito 44 . As
soluções de reserva foram preparadas em
polietileno glicol 400 a 6,9 mg / L e diluídas 1 em
1.000 na água fornecida aos ratos. O TCDD
dissolvido em 1,4-dioxano foi obtido da
AccuStandard (New Haven, Connecticut). Os
camundongos foram injetados
intraperitonealmente com 10 mL de diluições
apropriadas desta solução-mãe.
Linhas de células e ensaios de cultura de células
A linha celular Hepa1-GFP de hepatoma murino foi

gerada em nosso laboratório a partir de células
Hepa-1c1c7 45 por infecção com o vetor de
expressão retroviral pMSCV-ires / Green
Fluorescent Protein (GFP) descrito anteriormente
46
. A linha celular LLC (ATCC # CRL-1642) foi
adquirida na American Type Culture Collection
(Manassas, VA). As linhas celulares foram cultivadas
em meio mínimo essencial alfa (α-MEM) (Gibco,
Carlsbad, CA), suplementado com soro fetal bovino
a 10% (FBS, Omega Scientific, Tarzana, CA) e
penicilina-estreptomicina e fungicona (Gibco).
Células in vivo As injeções apresentaram
viabilidade superior a 90% e foram colhidas de
culturas sub-confluentes usando tripsina-EDTA a
0,05%, depois neutralizadas com meio de cultura a
4 ° C e lavadas 3 vezes em meio alfa isento de soro
antes da ressuspensão em alfa isento de soro
médio.
Protocolo de criação e alimentação de ratos
C57BL / 6 selvagem ou nu (B6.Cg- Foxn1 nu / J)

camundongos com cinco semanas de idade foram
adquiridos no Jackson Laboratory (Bar Harbor,
Maine). Os camundongos foram alojados até cinco
por gaiola em gaiolas ventiladas de forma
independente a uma temperatura constante (20 ~
22 ° C) e um ciclo de 12 h claro / 12 h escuro em um
ambiente livre de patógenos específico nas
instalações animais da UCLA. Os camundongos
foram mantidos na dieta NIH-31 Open Formula
Mouse / Rat 7013 de Envigo, Madison, Wisconsin

(doravante referida como dieta de "comida"). 72
horas após a aclimatação, iniciou-se a alimentação
com uma dieta rica em ω6 (dieta 28 ou 21, conforme
indicado) ou com a dieta rica em ω3 (dieta 29).
Essas dietas isocaloríficas foram modificações da
dieta de ratos AIN-93G e foram formuladas para
conter 3,8 Kcal / g com 19% de calorias da proteína
(caseína), 64% de carboidratos e 17% de gordura
(Envigo Teklad, Madison WI) . S1 . Os ratos
consumiram quantidades iguais de calorias por dia
em cada dieta. A comida era trocada duas vezes por
semana. As dietas foram armazenadas em bolsas
seladas a vácuo a -80 ° C até serem usadas. A água
foi fornecida ad libitum. Todos os animais foram
mantidos em um ambiente livre de patógenos na
instalação animal.
Modelos de tumor em camundongos
Os ratos foram divididos aleatoriamente em

grupos. Eles foram alimentados ad libitum com as
dietas experimentais por 3 semanas antes da
injeção celular. Onde indicado, o TPPU foi incluído
na água a 6,7 μg / L e a água foi trocada duas vezes
por semana durante o experimento. Camundongos
nus C57BL / 6 com 8 semanas de idade e
camundongos do tipo selvagem C57BL / 6 foram
injetados ip com TCDD (nas doses descritas abaixo)
em 10 μL1,4-dioxano ou com veículo três dias antes
da injeção celular. O 1,4 dioxano foi usado como
solvente para o TCDD, em vez do óleo de milho
comumente usado, pois este contém altos níveis de
ω6 PUFA e seu uso distorceria seriamente a
ingestão de ω6 / ω3 nos camundongos.

Camundongos nus ou do tipo selvagem C57BL / 6
foram injetados subcutaneamente no flanco direito
com suspensões unicelulares de 10 6 células Hepa1-
GFP ou 2 × 10 5Células LLC, respectivamente.
Camundongos nus C57BL / 6 tratados com Hepa1-
GFP e camundongos selvagens C57BL / 6 tratados
com LLC foram injetados ip semanalmente
posteriormente com 10 μL de TCDD em 1,4-
dioxano ou veículo até o final do experimento,
começando aproximadamente duas semanas após
Na injeção celular, o volume do tumor foi avaliado
com um paquímetro eletrônico todos os dias até o
término do experimento ou até a ressecção do
tumor. Se um camundongo de qualquer grupo
morreu ou teve que ser ressecado, os dados de
volume do tumor de todos os camundongos do
experimento foram excluídos das curvas de
crescimento tumoral daquele momento em diante,
a fim de impedir o viés das curvas de crescimento.
Os volumes tumorais foram determinados pela
fórmula: volume = (o menor diâmetro) 2× (o maior
diâmetro) / 2 × (4,19). Para determinações de
metástases, os tumores primários completos foram
removidos cirurgicamente sob anestesia com
isoflurano quando os volumes tumorais foram de
2000 a 3500 mm 3. (O intervalo de volumes para
qualquer experiência em particular é indicado no
texto). As feridas foram fechadas com grampos
cirúrgicos e os tumores foram pesados.
Gabapentina (100 mg / kg por via oral) mais
caprofeno (5 mg / kg por via subcutânea) foram
usados como analgésicos imediatamente após a
cirurgia, diariamente depois por três dias e depois

conforme necessário. Os ratos foram sacrificados
aproximadamente três a cinco semanas após a
cirurgia, seus pulmões foram pesados e seus
tecidos examinados quanto a metástases (a menos
que tenham sido sacrificados por motivos de saúde
ou por causa da recorrência do tumor primário,
caso em que não contribuíram para os dados de
metástases). O tecido tumoral foi fixado em solução
salina tamponada com formalina (Fisherbrand,
Pittsburg, PA) e embebido em parafina para análise
imuno-histoquímica. Os experimentos foram
aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e
Uso de Animais da UCLA (IACUC),Relatórios
científicos no link a seguir
www.nature.com/srep/policies/index.html#exper
imental-subjects
Análise lipídica
Os ácidos graxos foram analisados após conversão

em ésteres metílicos (FAME) por cromatografia
gasosa (GC) 47 . A extração de oxilipinas e sua
medição por cromatografia líquida com
espectrometria de massa em tandem foram
realizadas conforme descrito anteriormente 20 .
PCR quantitativo em tempo real e PCR digital de

gotículas
Quantitative real time PCR, RNA was performed as

previously described46. Means of three technical
replicates were calculated and the data are
presented for one of two or more representative
independent experiments. Primers for qPCR were
designed using Primer Express 3.0 software

(Applied Biosystems, CA), and were synthesized by
Thermo Fisher Scientific, Inc. (Waltham, MA). The
primers for real time PCR are presented in
Supplementary Table S5. Digital droplet PCR
(ddPCR) was used to determine the amount of
EPHX2 mRNA in the cells. 36B4 was used as a
positive control. This procedure gives absolute
numbers of molecules allowing one to express RNA
concentrations as molecules of RNA per cell.
cDNAs were generated using Clontech RNA to
cDNA EcoDry Premix (Cat# 639549 Clontech,
Mountain View, CA), and amplification droplets
were generated on a Bio-Rad QX200 Droplet
Generator using Bio-Rad ddPCR Supermix for
Probes (no dUTP) (Cat# 1863024 Bio-Rad, Hercules,
CA) and TaqMan hydrolysis probes labeled with
fluorescein (FAM) or hexachlorofluorescein (HEX)
reporter fluorophores purchased from Integrated
DNA Technologies (IDT, Coralville, Iowa). PCR was
performed on a deep well Bio Rad thermocycler
using standard amplification procedures, and
droplets were read on a BioRad QX200 Droplet
Reader. Each cell extract was assayed at three
different concentrations and the data calculated as
the mean of these determinations. Dilutions that
generated readings outside of the dynamic range
were excluded. The primers and probes for ddPCR
are presented in Supplementary Table S5.
Immunohistochemical (IHC) analysis
Os blocos de tecidos foram cortados e corados

usando o Vectastain Elite ABC HRP Kit (Vector;
Burlingame, CA). As seções foram desparafinizadas

em xileno e desidratadas com álcool. Foi utilizado
peróxido de hidrogênio a 3% para bloquear a
atividade endógena da peroxidase. A recuperação
do antígeno foi realizada e as lâminas foram
tratadas com anticorpos primários contra CYP1A1
(diluição 1: 1000) da Invitrogen (Carlsbad, CA),
EPHX2 (diluição 1: 750) da Novus Biologicals
(Littleton, CO), VEGF (1: 1500) da Abcam
(Cambridge, MA), CD31 (1: 1000) de Abcam, MCM2
(1: 1500) de Abcam. Finalmente, as seções foram
incubadas com o Anticorpo Secundário Vectastain
Elite ABC HRP Kit e sistema de detecção DAB da
Vector Laboratories, Burlingame, CA, contra-
coradas com hematoxilina, desidratadas, limpas e
montadas. A otimização do protocolo IHC envolveu
três condições de recuperação de antígeno e uma
diluição em série do anticorpo para estabelecer a
concentração ideal de coloração. O controle de IgG
foi realizado usando Millipore de coelho IgG
normal (Temecula, CA). A apotose foi avaliada em
amostras de tecido tumoral usando oKit de
detecção de morte celular in situ , (HRP) (Roche
Applied Science, Mannheim, Alemanha).
As seções coradas com IHC foram digitalizadas

usando um Aperio ScanScope CS (Leica, Nussloch,
Alemanha), que produz imagens digitais 40 × com
alta resolução (0,45 um / pixel), conforme descrito
anteriormente 48 . As imagens foram visualizadas e
quantificadas usando um ImageScope (Aperio) 49 .
Os dados são apresentados como densidade total /
um 2 analisados em uma área total de 10.000 µm 2 .
ELISA VEGF
Utilizou-se o kit Quantikine Mouse VEGF ELISA

(R&D Systems, Minneapolis, MN). As medições
foram realizadas em três amostras para cada
condição experimental. A concentração de VEGF
foi determinada espectrofotometricamente
(Microplate Reader 680 XR; Bio-Rad, Hercules, CA)
a 450 nm. Em cada experimento, todas as amostras
e padrões foram medidos duas vezes. Os dados
foram coletados como densidade óptica para cada
soro de camundongo (5 camundongos por grupo) e
a média.
Análise estatística
Os dados contínuos das experiências com ratos são

apresentados como o erro médio +/− padrão da
média e analisados usando um teste U de Mann-
Whitney bicaudal para comparação de dois grupos
independentes. O teste exato de Fisher foi utilizado
para análise de tabelas de contingência. Foi
utilizado o software GraphPad Prism (San Diego,
CA). Os níveis de significância são indicados da
seguinte forma: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Disponibilidade de dados
Todos os dados gerados ou analisados durante este

estudo estão incluídos no artigo publicado (e em
seus arquivos de informações suplementares) ou
estão disponíveis com o autor correspondente,
mediante solicitação razoável.
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Acknowledgements
Supported by NIEHS grant R01 ESO24434,

NIEHS/Superfund Research Program P42
ES004699, the NIEHS RIVER Award 1 R35
ES030443-01, the West Coast Central
Comprehensive Metabolomics Resources Core
NIH-NIDDK/U24 DK097154 and a fellowship from
UC-MEXUS-CONACYT to A.T.-R. We thank Dr.
Susanne Henning, Dr. Christopher Sundberg, Dr.
Dipak Panigrahy, Zhen Tong, Owen Vega, and UCLA
undergraduates Tim Chiang, Shaheen Abkenari,
Austin Tedman, Nicole Poladian, Alexis Rojas,
Crystal Quiros and Wanpeng Meng for help and
advice.
Author information
Affiliations
1. Department of Pathology & Laboratory

Medicine, University of California, Los
Angeles, CA, 90095, USA
Sara Huerta-Yepez, Ana Tirado-Rodriguez & Oliver

Hankinson
2. Research Unit of Oncology Diseases. Hospital

Infantil de Mexico, Federico Gomez, Mexico
City, Mexico
Mayra R. Montecillo-Aguado
3. Department of Entomology and

Comprehensive Cancer Center, University of
California, Davis, CA, 95616, USA
Jun Yang & Bruce D. Hammock
4. Molecular Toxicology Interdepartmental

Program and Department of Environmental
Health Sciences, University of California, Los
Angeles, CA, 90095, USA
Oliver Hankinson
Contributions
S.H.-Y. designed and performed most of the mouse

experiments, analyzed the data, and prepared the
figures. A.T-R. performed some of the mouse
experiments and helped analyze some of the data.
M.R.M.-A. performed immunohistochemistry
experiments. J.Y. performed the oxylipin analyses.
B.D. H. provided input regarding the overall
experimental approach and interpretation. O.H.
conceived and coordinated the project, designed
experiments, helped perform some of the
experiments, wrote the paper, and analyzed the
data.
Corresponding author
Correspondence to Oliver Hankinson.
Ethics declarations
Competing interests
B.D.H and J.Y. are co-inventors on several patents

through the University of California Davis to treat
pain and inflammation with 1-
Trifluoromethoxyphenyl-3-(1-propionylpiperidin-
4-yl) urea (TPPU). Otherwise the authors declare
they have no actual or potential competing
financial interests. The content is the responsibility
of the authors and does not necessarily represent
the official views of the National Institutes of
Health. S.H-Y, A.T.-R., M.R.M.-, and O.H. do not
have competing interests.
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with regard to jurisdictional claims in published
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Huerta-Yepez, S., Tirado-Rodriguez, A., Montecillo-

Aguado, M.R. et al. Aryl Hydrocarbon Receptor-
Dependent inductions of omega-3 and omega-6
polyunsaturated fatty acid metabolism act
inversely on tumor progression. Sci Rep 10, 7843
(2020). https://doi.org/10.1038/s41598-020-64146-
6
Received02 January 2020Accepted13 April 2020
Published12 May 2020
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41598-020-64146-6
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Cancer • Cancer microenvironment • Cancer

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Relatórios Científicos
ISSN 2045-2322 (online)
© 2020 Springer Nature Limited

Aryl Hydrocarbon Receptor-Dependent Inductions of Omega-3 and Omega-6 Polyunsaturated Fatty Acid Metabolism Act Inversely On Tumor Progression - Scientific Reports

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17/07/2020 Aryl Hydrocarbon Receptor-Dependent inductions of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acid metabolism act inversely on…

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As induções dependentes do receptor de hidrocarboneto aril do metabolismo de ácido… PDF

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Artigo Acesso livre Publicados: 12 de maio de 2020

As induções dependentes do receptor

Relatórios Científicos 10 , Número do artigo: 7843 ( 2020 )

408 Acessos Métricas

A dieta ocidental contém uma alta proporção de

células de cancro do pulmão LLC com deﬁciência

particularmente em mulheres. As respostas

O receptor de hidrocarboneto de aril (AHR) liga

experimentais de camundongos, dependendo do

A alta ingestão de ácidos graxos poliinsaturados

foi identiﬁcado sem ambiguidade e os mecanismos

Vias simplificadas do metabolismo da ARA ( a ) e

Os membros da família CYP1 podem metabolizar o

comida três dias após a injeção intraperitoneal de

Como o TCDD melhorou o metabolismo

Abordagem experimental geral

O esquema geral das experiências é mostrado na

tumores atingiram o mesmo tamanho em todos os

Foi utilizada a linha celular Hepa1-GFP ou a

As estirpes C57BL / 6 foram usadas porque o

Foram utilizadas duas dietas altas de ω6

Tabela 1 Composição de ácidos graxos das

We found that the levels of ω6 and ω3 PUFA in

Proporção de ω6 a ω3 PUFA no plasma /

A concentração de TCDD diferiu entre as

Os machos foram usados em alguns

Inibidor de EPHX2 (hidrolase de epóxido

A presença ou ausência do inibidor da EPHX2,

In certain experiments we measured the levels of

Effect of TCDD on the growth of primary tumors

We injected male nude C57BL/6 mice

CYP1A1, moderately inducible for CYP1A2, and are

Efeito do TCDD em tumores derivados de

TCDD em tumores de camundongos

Os níveis de todas as 67 oxilipinas nos quatro

pulmonar em camundongos alimentados com

Essas experiências demonstraram, portanto, que

Tabela 2 Resumo dos efeitos do TCDD

Efeito do TCDD e das dietas ricas em ω3 e ω6 no

For these experiments, we injected C57BL/6 male

mice, is not overtly toxic, and leads to sustained

Efeito do TCDD no crescimento e metástase

presença e ausência de TPPU. Os dados

de LLC em camundongos machos alimentados

This number was signiﬁcantly decreased in

TCDD increased the number of liver

Oxylipins affected by six day treatment with

Oxilipinas afetadas pelo tratamento de seis

hidroxioctadecaenóicos} e TriHOMEs {ácidos

Também investigamos os efeitos do TCDD na

Em resumo, esses dados demonstram que o TCDD

Efeito do TCDD e das dietas ricas em ω3 e ω6 no

O TCDD reduziu a taxa de crescimento de

Efeito do TCDD no crescimento e metástase

ressecção de tumores de aproximadamente

rica em ω3 29 (Fig. 7e ), e as fêmeas também

Thus all responses to TCDD in female mice

Effect of TCDD on vascular cell density, VEGF and

Para investigar os meios pelos quais o TCDD afetou