Aula - 3 - Cinética Microbiana - 2016

Engenharia Bioquímica
AULA 3
Profª Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato

Sumário
Cinética microbiana
Conceitos fundamentais de cinética microbiana

Definição de parâmetros
Cálculo das velocidades
Curva de crescimento microbiano
Classificação dos processos fermentativos
Modelos cinéticos
Efeito das condições ambientais
Cinética
É a parte que estuda a velocidade das reações de um processo e os
fatores que as influenciam
Investigações de como diferentes condições experimentais

podem influenciar na velocidade de uma reação
Informações de rendimento sobre o mecanismo de reação e
estados de transição
Construção de modelos matemáticos que possam descrever as
características de uma reação
Conceito
Consiste na análise da evolução dos valores de concentração de um

ou mais componentes do sistema de cultivo, em função do tempo
de fermentação
Ciniciais e Cfinais tem pouco valor

Componentes do sistema de cultivo
Microrganismo (biomassa) – X
Produtos do metabolismo (metabólitos) – P
Nutrientes do meio de cultivo (substratos) - S
Obtenção de valores experimentais
Métodos de obtenção dos valores experimentais de concentração

Microrganismo (biomassa) – X
Métodos diretos - Massa seca, turbidimetria com espectrofotômetro, volume do material celular
após centrifugação
Métodos indiretos – Dosagem de componentes celulares (nitrogênio-Kjeldahl; proteínas-Lowry),
medidas de componentes resultante da atividade microbiana (açúcares, O2, CO2, ácidos
orgânicos...)
Produtos do metabolismo (metabólitos) – P
HPLC
Nutrientes do meio de cultivo (substratos) – S

Açúcares – Métodos colorimétricos (DNS) ou HPLC
Valores experimentais de concentração (X, P e S) – f(t) → curvas de ajustes

Curvas de ajuste
Xm
Xm e Pm valores máximo de X e P X
X0 , S0, P0 valores iniciais de X, S, P
X0
Sf valor final de substrato
S0
tf tempo final de fermentação
S
Produto de interesse econômico

Substrato limitante Sf ≈ 0
Pm
P
P0
0 t tf tempo
Importância
É fundamental para a transposição de escala

Comparação quantitativa entre diferentes condições de cultivo
(parâmetros cinéticos)
pH,T, aeração, concentração de nutrientes, espécies de microrganismo...
Velocidades de transformação, fatores de conversão, produtividade
Parâmetros de transformação
Velocidades instantâneas
Produtividade
Velocidades específicas
Fatores de conversão
Velocidades instantâneas de transformação
(inclinações das tangentes)
Xm
Crescimento do microrganismo
dX X
rX =
dt X0
Consumo de substrato
S0
dS
rS = − S
dt
Formação de produto
Sf ≈ 0
dP
rP = Pm
dt
Unidade: M/V.t P
Não são os melhores parâmetros para se
avaliar o estado em que se encontram o
sistema. P0
0 t tf tempo
Avaliação de desempenho
Produtividade em biomassa (PX) Produtividade do produto (PP)

Xm − X0 Pm − P0
PX = PP =
tf t fp
Velocidade média de crescimento
tfp ≠ ou = tf
P0 é geralmente desprezível
Xm e Pm valores máximo de X e P
X0 e S0 valores iniciais de X e P
P0 valores iniciais de P
tf tempo final de fermentação
tfp tempo onde ocorre Pm
Cinética de processos fermentativos
Velocidades específicas de transformação (GADEN)

Devido a concentração microbiana aumentar durante um cultivo descontínuo é
importante especificar as velocidades com respeito ao valor de X em um
determinado instante.
1 dX
Crescimento do microrganismo µX = .
X dt
1  dS 
Consumo de substrato µS = − 
X  dt 
1 dP
Formação de produto µP =
X dt
Unidade: t-1
Fatores de conversão
(num determinado t de fermentação)
Substrato à célula
g células produzidas X − X0 dX dt µ
YX / S = = = = X
g substrato consumido S 0 − S − dS dt µ S
Produto à célula
g células produzidas X − X 0 dX dt µ X
YX / P = = = =
g produto formado P − P0 dP dt µ P
Substrato à produto
g produto formado P − P0 dP dt µ
YP / S = = = = P
g substrato consumido S 0 − S − dS dt µ S
Coeficiente de manutenção
Importante lembrar que o substrato consumido tem vários “destinos”
rS = (rS ) X + (rS )m + (rS )P
(rS )X = velocidade de consumo de substrato devido ao crescimento

(rS )m = velocidade de consumo de substrato devida a manutenção
(rS )P = velocidade de consumo de substrato devido a formação de produto
Manutenção
Trabalho osmótico visando manter os gradientes de concentração de
substâncias entre o interior da célula e seu meio ambiente;
Renovação de componentes celulares que requeiram energia;
Mobilidade celular
Pirt – Consumo específico para manutenção
( rs ) m = m.X
rX r
rS = + P + m.X
rS = (rS ) X + (rS )m + (rS )P YX S " YP S '
µX µP
µS = + +m
YX S " YP S '
YX S " = fator de conversão destinado apenas ao crescimento

YP S ' = fator de conversão destinado apenas a formação de produto
m = coeficiente de manutenção (kg substrato/kg célula.h)
Coeficientes de manutenção de alguns microrganismos
Espécie m Condições da cultura Fonte de energia
(kg substrato/kg células.h)
Lactobacillus casei 0,135 Cultura anaeróbica Glicose
Aerobacter 0,054 Cultura aeróbica Glicose

aerogenes
0,076 Cultura aeróbica Glicerol
0,058 Cultura aeróbica Citrato
Azotobacter 0,15 Cultura descontínua, pressão parcial de Glicose

vinelandii O2 de 0,02 atm
1,5 Cultura descontínua, pressão parcial de Glicose
O2 de 0,2 atm
Saccharomyces 0,036 Cultura descontínua anaeróbica Glicose
cerevisiae
0,360 Cultura descontínua anaeróbica 1,0M Glicose
NaCl
Penicillium 0,022 Cultura aeróbica Glicose
chrysogenum
Fonte: Fonseca e Teixeira, 2007

Cálculos das velocidades
Traçados das curvas a partir de pontos experimentais

Manualmente; Programas; Modelos
Experiência para conhecer os perfis característicos das curvas
Levar em consideração que nem sempre os instantes em que P e X são
máximos coincidem
Exercício: Baseado nos resultados experimentais obtidos em uma fermentação

alcoólica descontínua mostrado na Figura a seguir, calcule:
a) Velocidades instantâneas de crescimento celular, consumo de substrato e
formação de produto
b) Velocidades específicas de crescimento celular, consumo de substrato e
formação de produto
c) Fatores de conversão de substrato à célula, substrato à produto, célula à
produto
No tempo de fermentação de 5 horas.
Exercício 100 40
S P
P (g/L)
a) rX , rS , rP 80
20
b) µ X , µS , µ P
S (g/L)
60
c) yX S, yP S, yX P X
0
4
40
X (g/L)
3
20
2
0
0
2 4 6 8 10
Tempo (h)
Resultados obtidos em uma fermentação alcoólica.
Fonte: Borzani, 2001.
Resolução:
100 A 40
a) Velocidade instantâneas S P
I. Consumo de substrato
P (g/L)
80 D 20
dS 100 − 70 30 g / L θ
rS = − = tgθ = = = 9,1g / L.h
dt 6,8 − 3,5 3,3h B
φ
S (g/L)
60 0
C F X 4
II. Produção de etanol 40
X (g/L)
dP 20 − 0,0 20 g / L
rP = = tgφ = = = 3,84 g / L.h 3
dt 7,9 − 2,7 5,2h
20
E β
2
III.Crescimento da levedura 0
dX 4,0 − 2,2 1,8 g / L 0
rX = = tgβ = = = 0,47 g / L.h 2 4 6 8 10
dt 6,0 − 2,2 3,8h
Tempo (h)
Resolução:
100 40
b) Velocidade específicas S P
I. Consumo de substrato
P (g/L)
80
20
1  dS  rS 9,1g / L.h
µS = − = = = 2,6h −1
X  dt  X 3,5 g / L
S (g/L)
60 0
X 4
II. Produção de etanol 40
X (g/L)
1 dP rP 3,84 g / L.h
µP = = = = 1,1h −1 3
X dt X 3,5 g / L 20
2
III.Crescimento da levedura 0
1 dX rX 0,47 g / L.h 0
µX = . = = = 0,13h −1 2 4 6 8 10
X dt X 3,5 g / L Tempo (h)
Resolução:
c) Fatores de conversão
I. Substrato à célula µ X 0,13
yX = = = 0,05
µS
S
2,6
II. Substrato à produto

µ P 1,1
yP S = = = 0,42
µ S 2,6
µ X 0,13
III. Produto à célula
yX = = = 0,12
µP
P
1,1
Fases Curva de crescimento microbiano
1. Lag
X=X0=constante Xm
Síntese das enzimas
Xd
f(CI, IMO, fisiologia, MI) A
2. Transição
Início da reprodução microbiana
3. Log
µx = µm=constante
XC
4. Linear
rx = rk =constante
µx ↓←↑X Xi
X0
5. Desaceleração 0
1 2 3 4 5 6 7
Esgotamento de S e/ou acúmulo P inibidores Xm
µx, rx→↓ 0 – tf
6. Estacionária Log X XC
X = Xm =constante B
7. Declínio
Xi
Lise celular, autólise ou rompimento
X0
MO – enzimas intracelulares
0 ti tC td tf
Gaden (µ = µ(t))
Formação de produto está associada ao crescimento
Formação de produto parcialmente associada ao crescimento
Formação de produto não está associada ao crescimento

Formação de produto está associada ao crescimento

Perfis semelhantes
Formação do produto – reações do catabolismo
Produção de vitaminas, aminoácidos e etanol
µs ↔ µp↔ µx
Consumo de
Velocidade específica
açúcar
Produção de
etanol
Crescimento
Tempo
Formação de produto parcialmente associada ao crescimento

Duas fases distintas
Formação do produto não está ligada diretamente ao caminho metabólico de
produção de energia
Produção de ácido cítrico e ácido lático
1ªFase 2ªFase
µs ↔ µx≠µp µs ↔ µx ↔ µp
Produção de
ácido
Consumo de
açúcar
Crescimento
Tempo
Formação de produto não está associada ao crescimento

Formação do produto ocorre quando as demais velocidades sofrem uma redução
significativa
Metabolismo secundário
Produção de antibióticos
µx ≠ µp
Produção de
Consumo de açúcar antibiótico
Consumo de
oxigênio
Crescimento
Tempo
Cinética de formação de produto

Correlação empírica (Luedeking e Piret, 1959)
Formação de ácido lático por Lactobacillus delbrueckii
rP = α .rX + β . X
µ P = α .µ X + β
rX = µ X . X
rP = µ P . X
α e β – ctes (T, pH, MOs, meio)

Cinética de formação de produto
µ P = α .µ X + β
Primário - β=0 – Associado ao crescimento

Ácido glucônico
Secundário – α=0 – Sua síntese inicia-se depois do crescimento cessado
Antibiótico, proteínas recombinantes
Intermediário – Ambos os parâmetros são positivos
Ácido lático, ácido cítrico
Modelos de crescimento e morte celular
Modelos de crescimento e morte celular

Na ausência de inibição
Com inibição pelo substrato
Com inibição pelo produto ou compostos tóxicos
Morte celular
Modelos na ausência de inibição
Na ausência de inibição
Monod – Propôs um modelo para descrever o efeito do substrato
limitante em função de μX
µ m .S
µX =
KS + S µm
µm = Máxima velocidade específica de crescimento
μX (h-1)
K S = Constante de saturação ou de Monod µm/2
S = Concentração do substrato limitante
KS
S (mg/L)
Modelos na ausência de inibição
Crescimento em um único substrato limitante sem levar em

conta o fenômeno de inibição
S
-
Equação de Teissier µ X = µ m .(1 − e KS
)
Sn
Moser µ X = µm .
KS + S n
S
Contois e Fujimoto µ X = µm .
K S .X + S
Modelos com inibição
Com inibição pelo substrato
Crescimento num único substrato limitante levando em conta o fenômeno de inibição
S K I ,S
µ X = µm . .
K S + S K I ,S + S µm
μX (h-1)
K I , S = constante de inibição pelo substrato µm/2
K S K S .K I ,S K I , S
S (mg/L)
Modelos com inibição
Com inibição pelo produto ou por compostos tóxicos
S K I ,P
µ X = µm . .
K S + S K I ,P + P
K I , P = constante de inibição pelo produto ou produto tóxico
Ex.: Inibição do crescimento de Saccharomyces cerevisiae em glicose pelo etanol

Modelos morte celular
Morte celular
rd = K d . X
K d = velocidade específica de morte (kg de células mortas/kg células vivas)

rd = velocidade volumétrica de morte celular (kg de células mortas(kg células vivas)-1 h −1 )
X = concentração de células viáveis (kg. m -3 )
Kd – MOs, meio, T
Na fase exponencial – geralmente desprezada
Biorreator com recirculação de biomassa – quantificação é necessária
Efeito das condições ambientais na cinética MOs
Temperatura
pH
Pressão osmótica
Efeito da temperatura
Parâmetros da cinética de crescimento - µmax e KS
Fase 1: ↑ T→↑velocidade da reação
Fase 2: T mais elevadas → desativação térmica das proteínas→↓velocidade da reação
Hinshelwood (1946) – Lei de Arrhenius
1,2
µ max (T ) = A1.e − E RT
− Ad .e − Ed RT 1,0
μmax (h-1)
1
0,8
0,6
A1 e Ad = constantes num meio com uma determinada composição
E1 = Energia de ativação de crescimento celular 0,4
Ed = Energia de ativação de morte celular térmica 20 25 30 35 40 45
T (oC)
Efeito da T em μmax de E. Coli

Fonte: Fonseca & Teixeira, 2007.
Efeito da temperatura
Efeito do pH
Existe uma gama de uma ou duas unidades de pH – pouca variação de μmax
Alguns valores típicos de pH ótimo de crescimento
Células bacterinas- 7
Fungos filamentosos – 4-5
Muitos MOs tem mecanismos de manter o pH intracelular constante quando ocorre flutuação
deste no meio
2
μmax (h-1)
1
Efeito do pH em μmax de E. Coli cultivada a 37oC
Fonte: Fonseca & Teixeira, 2007.
4 5 6 7 8 9 10
pH
Efeito da pressão osmótica

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Profª Ana Katerine de Carvalho Lima Lobato

Conceitos fundamentais de cinética microbiana

Investigações de como diferentes condições experimentais

Consiste na análise da evolução dos valores de concentração de um

Ciniciais e Cfinais tem pouco valor

Métodos de obtenção dos valores experimentais de concentração

Nutrientes do meio de cultivo (substratos) – S

Valores experimentais de concentração (X, P e S) – f(t) → curvas de ajustes

Produto de interesse econômico

É fundamental para a transposição de escala

Produtividade em biomassa (PX) Produtividade do produto (PP)

Velocidades específicas de transformação (GADEN)

rS = (rS ) X + (rS )m + (rS )P

(rS )X = velocidade de consumo de substrato devido ao crescimento

Pirt – Consumo específico para manutenção

YX S " = fator de conversão destinado apenas ao crescimento

Aerobacter 0,054 Cultura aeróbica Glicose

0,058 Cultura aeróbica Citrato

Azotobacter 0,15 Cultura descontínua, pressão parcial de Glicose

Fonte: Fonseca e Teixeira, 2007

Cálculos das velocidades

Traçados das curvas a partir de pontos experimentais

Exercício: Baseado nos resultados experimentais obtidos em uma fermentação

II. Substrato à produto

Formação de produto está associada ao crescimento

Formação de produto parcialmente associada ao crescimento

Formação de produto não está associada ao crescimento

Formação de produto está associada ao crescimento

Formação de produto parcialmente associada ao crescimento

Formação de produto não está associada ao crescimento

Cinética de formação de produto

α e β – ctes (T, pH, MOs, meio)

Cinética de formação de produto

Primário - β=0 – Associado ao crescimento

Modelos de crescimento e morte celular

Com inibição pelo substrato

Com inibição pelo produto ou compostos tóxicos

µm = Máxima velocidade específica de crescimento

Crescimento em um único substrato limitante sem levar em

K I , P = constante de inibição pelo produto ou produto tóxico

Ex.: Inibição do crescimento de Saccharomyces cerevisiae em glicose pelo etanol

K d = velocidade específica de morte (kg de células mortas/kg células vivas)

Efeito da T em μmax de E. Coli

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