UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI

Engenharia de Bioprocessos

Cinética Enzimática

Aline de Cássia Campos Pena

Anna Carolina Ameno A. Silva
Iasmine Queiroga de Paula
Pedro Henrique G. A. Lacerda

Campus Alto Paraopeba

Novembro 2010
Introdução

As enzimas são catalisadores biológicos, com alto grau de especificidade, que

quebram moléculas para formar novos compostos. Elas diminuem a energia de ativação
nas reações químicas vitais, não afetando a energia livre de Gibbs (ΔG) ou a constante
de equilíbrio (Keq). Simplesmente aceleram a velocidade da reação [1].
A cinética enzimática é a análise quantitativa do efeito causado por fatores que
influenciam a atividade enzimática. Os principais fatores são: concentração da enzima,
pH e temperatura. A velocidade de transferência do substrato depende da concentração
da enzima de forma proporcional. No entanto, podem ocorrer alguns desvios da
linearidade devido à presença de inibidores, substâncias tóxicas, ou de um ativador que
dissocia a enzima [1].
Ao variar o pH, ocorrem variações no estado de ionização dos componentes do
sistema. Como as enzimas contém muitos grupos ionizáveis, elas apresentam diferentes
estados de ionização, o que leva a uma atividade catalítica restrita a uma faixa pequena
de pH [1].
Os catalisadores convencionais dependem da temperatura: à medida que
aumenta a temperatura pode ocorrer elevação da taxa de reação ou pode ocorrer
diminuição na estabilidade da proteína por causa da desativação térmica. Toda enzima
tem uma temperatura em que atinge sua atividade máxima (temperatura ótima). Quando
ela é desnaturada, ocorre perda de atividade biológica [1].
Na reação enzimática, a enzima e o substrato formam um composto
intermediário denominado complexo enzima-substrato, que pode se decompor, voltando
aos reagentes iniciais ou pode reagir, formando produtos. A reação abaixo mostra a
sequência da reação: [1]

Na reação acima, k é a constante de velocidade referente a reação que se segue.

A equação de Michaelis-Menten fornece a relação quantitativa entre a
velocidade da reação enzimática e a concentração de substrato: [2]
 Onde:
vo = velocidade inicial (relacionada a mudança na concentração de reagente ou produtos
nos primeiros segundos da reação)
vmáx = velocidade máxima (atingida sob condições de saturação da enzima)
[S] = concentração de substrato
Km = constante de Michaelis (reflete a afinidade da enzima pelo substrato)

Se a velocidade inicial for metade da velocidade máxima, o K m será equivalente

a [S].
O modelo do gráfico de velocidade inicial versus concentração do substrato é
mostrado na Figura 1. Através dele, é possível encontrar o valor de K m, que é a
concentração do substrato (mol L-1) na qual a velocidade inicial é metade da velocidade
máxima da reação [2].

Figura 1. Gráfico de vo x [S]

O inverso da equação é dado por:

A Figura 2 faz a representação gráfica para a equação dada acima. Através do

mesmo, encontra-se o valor de Km e Vmáx, determinados pela medida das inclinações e
interseções [2].
 Figura 2. Gráfico de 1/vo x 1/[S]
Baseado nas informações acima, realizou-se a prática de cinética enzimática, a
fim de determinar o valor de Km e Vmáx da enzima invertase de Saccharomyces
cerevisiae.
Os principais métodos utilizados na analise de açúcares redutores tem como base
a redução de íons cobre em soluções alcalinas.Existem métodos que desidratação os
açúcares utilizando ácidos concentrados, esses processos formam compostos de
coloração visível.
O método de Somogyi-Nelson determina a quantidade de açucares redutor
através da intensidade da cor azul. O procedimento é baseado no aquecimento de
glicídios em meio básico, que são transformados em enodiois, que reduzem o íon
cúprico em cuproso. Através dessa reação é formado oxido cuproso que é responsável
pela redução de arsênio-molibídico a oxido de molibdênio de cor azul.

Materiais e métodos

Primeiramente enumerou-se de 1 a 11 os tubos de ensaio, em seguida foi

colocado 4 mL de sacarose em cada um do tubos com as seguintes concentrações: para
o tubo 1 colocou-se 1g/L, para o 2 colocou-se 2g/L, para 3colocou-se 3g/L, e assim
sucessivamente até o tubo de número 10. No tubo 11 repetiu-se a concentração de
10g/L. Estes tubos foram reservados por 3 minutos em banho maria a 40°C.
Em seguida foi adicionado 1,0 mL de solução enzimática (extrato bruto diluído
1:30) em todos tubos, em intervalos regulares de 30s, com exceção do tubo 11. Foram
mantidos por exatamente 10 minutos a 40°C. No tubo 11, foi adicionado 1,0 mL de
água destilada.
Após aguardar exatamente 10 minutos, transferiu-se de cada um dos tubos uma
alíquota de 0,05 mL para tubos menores (em intervalos regulares de 30s) e adicionou-se
em seguida 1 mL de reagente SNI, agitou-se e em seguida foi reservado no banho em
ebulição por 6 minutos, com o intuito de inibir a atividade enzimática.
Retirou-se todos os tubos do banho em ebulição e foi colocado em banho de gelo
até que atingissem a temperatura ambiente.
Ao final retirou-se os tubos do banho de gelo, adicionou-se 1 mL do reagente
SNII, agitou-se. Então, foi acrescentado 1 mL de água destilada e agitou-se novamente.
Ligou-se o espectrofotômetro, e com a solução branca (tubo 11) o equipamento
foi calibrado. Foram adicionadas as amostras em tubos específicos para o
espectrofotômetro, e realizou-se a leitura da absorbância das amostras no aparelho a 540
nm.

Resultados e discussão

Para a determinação de açúcares redutores foi utilizado o teste de Somogyi-

Nelson, o qual é um teste quantitativo.
Os resultados obtidos após a leitura do espectrofotômetro estão apresentados na
Tabela 1.

Tabela1: Absorbância obtida a partir das concentrações de glicose

Concentração de glicose
Absorbância a 540 nm
(g/L)
1 0,094
2 0,209
3 0,244
4 0,169
5 0,371
6 0,430
7 0,552
8 0,686
9 0,665
 10 0,781

Para os dados tabelados anteriormente, obteve-se o gráfico apresentado na

Figura 3.

Figura 3: Gráfico da absorbância em função da concentração de glicose

A equação de 1º grau encontrada para a figura acima com seus respectivos

coeficientes é dada por:

y = bx + a

a = 0,01752
b = 0,49442
AR = açúcar redutor
ABS = b[AR] + a
0,094 = 0,49442 [AR] + 0,01752
0,49442 [AR] = 0,07648
[AR] = 0,1547g/L

Para o cálculo do número de mols da sacarose (C12H22O11), tem-se:

 n = m / MM

n = 1 / 342,3

n = 2,92 x 10-3

As contas foram efetuadas do mesmo modo para os tubos de concentrações

diferentes. Para isso, substitui-se o valor correspondente da massa. Os resultados são
mostrados na Tabela 3, junto a valores posteriormente demonstrados.
Calculou-se a concentração da glicose em número de mols, realizando a seguinte
regra de três:

1 mol glicose ------------- 180,16 g

X ------------- 0,1547g

X = 8,59 x 10-4 mol/L

X =8,59 x 10-10 μmol/L

8,59 x 10 -10 μmol------------- 1L

X ------------- 0,005L

X = 4,29 x 10-12 μmol

1 mL de enzima ------------ 30 mL
X ------------ 1 mL
X = 0,033 mL de enzima

Para determinar a velocidade correspondente a cada tubo de ensaio, foi utilizada

a fórmula abaixo:

V = μmol açúcar redutor / (min . mL)

Para o tubo 1,

V = 4,29 x 10-12 / (10 . 0,033)

V = 1,3 x 10-11 μmol / min.mL
 Os demais tubos seguiram o mesmo raciocínio, os resultados estão apresentados
na Tabela 3, juntamente com as concentrações dos açúcares.

Tabela 3: Efeito da concentração de substrato na atividade da invertase

Tubo Conc. de Conc. açúcares V (μmol / 1/S 1/V (min .
sacarose [S] redutores min.mL) (1/mol) mL/μmol)
(mol/L) (μmol)
1 2,92 x 10-3 6,15 x 10-12 1,87 x 10-11 342,465 5,35 x 1010
2 5,84 x 10-3 1,23 x 10-11 3,73 x 10-11 171,232 2,68 x 1010
3 8,76 x 10-3 1,42 x 10-11 4,29 x 10-11 114,155 2,33 x 1010
4 1,17 x10-2 1,02 x 10-11 3,08 x 10-11 85,470 3,25 x 1010
5 1,46 x 10-2 2,10 x 10-11 6,34 x 10-11 68,493 1,58 x 1010
6 1,75 x 10-2 2,41 x 10-11 7,30 x 10-11 57,142 1,37 x 1010
7 2,04 x 10-2 3,06 x 10-11 9,27 x 10-11 49,019 1,08 x 1010
8 2,34 x 10-2 3,77 x 10-11 1,14 x 10-11 42,735 8,75 x 109
9 2,62 x 10-2 3,66 x 10-11 1,11 x 10-11 38,167 9,01 x 109
10 2,92 x 10-2 4,28 x 10-11 1,30 x 10-11 34,246 7,71 x 109

A Figura 4 mostra o gráfico de 1/V em função de 1/[S] obtido para os valores

tabelados anteriormente.

Figura 4: Gráfico de 1/V x 1/[S] para dados experimentais

Pelo gráfico acima, calculou-se o valor de Vmáx e Km:

1/ Vmáx =1
Vmáx = 1 g / L. min

Inclinação = Km / Vmáx
Inclinação = 0,0239
0,02039 = Km / 1
Km = 0,0239 g / L

De acordo com os resultados encontrados, observa-se que o gráfico de 1/V por

1/[S] é semelhante ao da referência. Através desse gráfico, encontrou-se o valor de K m e
Vmáx que foi próximo ao esperado.

Referências Bibliográficas

[1] FURIGO JR, A., PEREIRA, E. B. Enzimas e suas aplicações - Cinética

enzimática. Disponível em:
<http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/lista_exerc/cinetica_enzimatica.pdf
>. Acesso em: 04 dezembro 2010.

[2] MOTTA, V. T. Bioquimica básica - Autolab. Disponível em:

<http://www.ebah.com.br/introducao-a-bioquimica-pdf-a14042.html>. Acesso em: 04
dezembro 2010.