Cromatografia

Líquida de Alta
Eficiência

Carla B. G. Bottoli
Instituto de Química
UNICAMP
 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(HPLC)

É uma técnica cromatográfica que utiliza como FM um
líquido e equipamentos sofisticados para separar os
componentes de uma amostra pela interação com a FE e
com a FM.

Utiliza-se colunas metálicas e FM pressurizada, obtida

com auxílio de bombas de alta pressão, para permitir uma
vazão mais rápida da FM.

É também conhecida como HPLC, ou de Alta Velocidade,

ou de Alta Pressão ou de Alto Desempenho ou, ainda, de
Alta Performance. Do Inglês HPLC – High Performance
Liquid Chromatography
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Vantagens

FE é utilizada várias vezes.

Versatilidade: único requisito é a solubilidade da amostra na FM.

Tempo reduzido de análise.

Alta resolução.

Boa para análise qualitativa:
Parâmetros para identificação: tR, espectro de absorção no UV (detector
de arranjo de diodos), espectro de massas

Bons resultados quantitativos: desvios inferiores a 5%.

Boa detectabilidade:
Absorção UV-Vis de λ variável: 10-10 g;
Fluorescência: 10-12 g.

Automação.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
Desvantagens

Alto custo do equipamento.

Alto custo de manutenção do equipamento.

Não existe um detector universal com boa detectabilidade e

baixo custo:
Índice de refração: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco
estável.
Espectrômetro de massas: ~ US$ 150.000

Experiência do operador.
 Aplicabilidade de HPLC
Requer somente que a amostra seja solúvel na fase móvel.

Aminoácidos
Toxicologia Pesticidas

Corantes
Polímeros Fármacos Proteínas

Cosméticos Alimentos Vitaminas

Sistema de HPLC
Instrumentos Comerciais
Instrumentos Comerciais
Sistema de HPLC
 Reservatório para Fase Móvel
Bomba

Filtro do Reservatório:
 Captar a FM e evitar que
partículas suspensas na FM
obstruam os capilares ou Filtro Solvente
contaminem a bomba.
 Filtros de 10 a 40 µm.

Limpeza periódica do
filtro é essencial !!!!
 Fase Móvel - Solventes
DEVE TER ALTO GRAU DE PUREZA.
As impurezas da fase móvel podem absorver e diminuir a
sensibilidade do detector.
DISSOLVER A AMOSTRA SEM DECOMPOR SEUS COMPONENTES.
O solvente da amostra, normalmente, é a própria FM ou um dos seus
componentes.

TER POLARIDADE E VISCOSIDADE ADEQUADAS.

NÃO DEGRADAR A FASE ESTACIONÁRIA.

Não utilizar fases móveis agressivas.

SER COMPATÍVEL COM O DETECTOR UTILIZADO.

 Fase Móvel - Água

ÁGUA MONO-DESTILADA E DEIONIZADA

COMUM SÃO INADEQUADAS.
Contaminação de orgânicos voláteis e de orgânicos da resina

ÁGUA DEVE SER GRAU HPLC .

Purificada com resinas de troca iônica, carvão ativado,
filtros de membrana (livre de bactérias). Produzida no
momento de uso pois é facilmente recontaminável.
Filtração da Fase Móvel

Essencial.

Degaseificação da Fase Móvel

Indispensável para o bom funcionamento do sistema.

Garante:
 Reprodutibilidade da vazão: retira ar dissolvido na FM e evita
bolhas na bomba;
 Estabilidade na linha de base: bolhas no detector causam
instabilidade da linha de base;
Métodos de Degaseificação

Ultra-Som:
 Muito lento, pouco eficiente, requer agitação, em geral o pior método quando
usado sozinho.

Vácuo + Ultra-Som
 Rápido, eficiente, refazer de 12 em 12 horas.

Purga com Hélio:

 Contínuo, hélio é razoavelmente caro, leva a aumento de vazamentos, maior custo
operacional.

Degaseificador “on-line”:
 Contínuo, remove o ar logo antes de entrar na bomba, investimento alto inicial
(melhor opção a longo prazo).
Sistema de HPLC
Bombas de Alta Pressão

Têm por finalidade enviar um fluxo constante e
reprodutível de FM para o sistema
cromatográfico.

Requisitos:
1. Ser de material inerte;
2. Devem gerar altas pressões: 0,01 a 35 MPa (para
análises).
3. Versatilidade: permitir eluição por gradiente
 Eluição
É o desenvolvimento da amostra no sistema cromatográfico.

Isocrática:
 Mesma composição de fase móvel durante a eluição.
Exemplo: Hexano ou Metanol/Água 80:20 (v/v)

Gradiente:
 Composição da fase móvel varia durante a eluição.
 Utilizado na separação de misturas complexas com diferentes funções
químicas.

Exemplo: Tempo Fluxo %A %B

Inicial 1.00 80 20
10 1.00 0 100
14 1.50 0 100
18 1.00 80 20
25 1.00 80 20
Sistema de HPLC
Injetores Manuais
Posição LOAD Posição INJECT
 Sobrecarga de Volume da
Amostra
Para aproveitar de todos o pratos que uma coluna
possui, não se deve injetar um volume maior que 1 % do
volume da coluna vazia.
µL) = π (raio)2(comprimento)(0,01)
Vmáximo (µ

Dimensão da coluna Vmáximo de injeção

7,8 mm x 30 cm 140 µL
3,9 mm x 30 cm 35 µL
3,9 mm x 15 cm 18 µL
4,6 mm x 10 cm 16 µL
Sistema de HPLC
Colunas Cromatográficas
 Coluna de Guarda

Localizada entre o injetor e
a coluna de separação.

Colunas de 2 a 5 cm e d.i.
igual ao da coluna de
separação.

5 cm

Mesma FE da coluna de
separação.

Protege a coluna de
separação, aumentando
seu tempo de vida.
 Coluna de Separação
Preparativa d.i. > 10 mm

Convencional d.i. 2 - 5 mm

Microbore d.i. 1 ou 2 mm

Capilar d.i. 0,075 – 0,5 mm

Coluna de Separação

15 cm
 Condicionamento da Coluna
Necessário para que haja um perfeito equilíbrio da FM e da FE.

Coluna nova: 4 – 8 horas.

Coluna parada há alguns dias: 2 horas.

Coluna de uso diário: 15 minutos.

Coluna deve ser guardada

em solvente orgânico ou fase móvel
 Partículas de Recheio
 Porosas (3 a 10 µm)

 Não Porosas (1-2 µm)

 Monolíticas Formada cilindricamente em forma de haste.

 Partículas Não Porosas
Separação de benzodiazepínicos

Condições:
Coluna: 3 cm x 4,6 mm d. i.
FE: ChromSphere UOP C18,
1,5 µm (não-porosa)
FM: ACN: H2O (85:15 v/v)
Vazão: 3,5 mL min-1
Temperatura: 35 ºC
Detector: UV, 254 nm

1: bromazepam, 2: nitrazepam, 3: clonazepam, 4: oxazepam, 5: flunitrazepam,

6: hidroxidiazepam, 7: nordazepam, 8: diazepam
 Sílica
Ligação de
Hidrogênio
Silanóis
Vicinais
Silanol
H H Isolado
Silanóis Ligação
O Geminais Siloxano
O OH
HO OH
O
Si Si Si Si Si
O Si Si
O O O O O
O O O O O O
Si Si Si Si Si Si Si
 Cromatografia Líquida com
Fase Ligada

FE:
 Suporte (SiO2)
Reação
+
Química
 Líquido estacionário

Vantagens:

Alta estabilidade química.

Liberdade de escolha da
FM, vazão e temperatura.

Eluição por gradiente.
Desvantagens:

Preparo (síntese) é trabalhoso.

Menor recobrimento da
superfície (apenas 50% dos
silanóis)
 Impedimento estéreo.
 Mecanismo duplo de retenção.

Restrição ao pH: 2< pH < 8.
 Fases Estacionárias
Quimicamente Ligadas
FASE NORMAL FASE REVERSA

Amino NH2
N-aquil C18

Diol (CH2OH)2 C8

Ciano – CN C4

Nitro – NO2
Fenil

FE + polar: FM + apolar FE + apolar: FM + polar

 Reação Siloxano
CH3
Agente sililante
OH monofuncional O Si R
Superfície da Sílica

OH OH CH3
CH3
CH3
OH X Si R O Si R

CH3 CH3

OH OH CH3
OH R = C8, C18 O Si R
X = Cl, OR CH3
 Efeito do Comprimento da
Cadeia na Retenção

(1)acetona, (2) p-metoxifenol, (3) fenol, (4) m-cresol, (5) 3,5-xilenol, (6) anisol, (7) fenilfenol
 Fases Móveis

FASE NORMAL FASE REVERSA

Hexano
Metanol

Diclorometano
Acetonitrila

Tetraidrofurano

Polaridade alterada com

Polaridade alterada com água ou tampão
isopropanol, acetato de etila,
tert-butilmetil éter
 HPLC – Fase Reversa

Vantagens: Desvantagens:

Fases Móveis menos tóxicas e
Silanóis Residuais:

de menor custo: modificador  Mecanismo duplo de
orgânico + água. retenção.

Boa estabilidade frente aos  Problema na separação de
compostos básicos.
vários solventes.

Intervalo de pH: 2<pH<8

Rápido equilíbrio após a troca
do solvente.  Devido ao uso da sílica.

Compatível com gradiente.

Análises rápidas.

Vasto campo de aplicação.
 Ajuste da Força Cromatográfica

Separação de álcool benzílico (1), fenol (2), 3,4-dimetoxiacetofenona (3),

benzoína (4), benzoato de etila (5), tolueno (6), 2,6-dimetoxitolueno(7), o-metoxibifenila (8).
B refere-se ao solvente orgânico Acetonitrila
Ajuste da Força Cromatográfica

Baixa resolução entre

os picos 2 e 3
Ajuste da Força Cromatográfica
Boa resolução mas tempo
de análise muito longo
Ajuste da Força Cromatográfica
com Gradiente
 FE Aplicação de FEQL
C4-Butil Separação de Peptídeos e proteínas
C8 -Octil Solutos pouco ou altamente polares (peptídeos
pequenos, proteínas, esteróides, nucleosídeos, fármacos
polares, etc... )
C18 -Octadecil Solutos apolares ou moderadamente polares, ácidos
graxos, glicerídeos, hidrocarbonetos aromáticos
polinucleares, estéres, vitaminas solúveis, aminoácidos,
fármacos, etc...
-C6H5 Fenil Compostos moderadamente polares
-CN Ciano ou FN :comportamento semelhante à sílica
Nitrila
FR : seletividade diferente de C8, C18, ou fenil
-NH2 Amina FN : compostos polares (anilinas substituídas, ésteres,
pesticidas, etc.)
FR :carboidratos
Separação de carotenóides da
pimenta vermelha
Condições cromatográficas:
Coluna (25 cm x 4,6 mm d. i.)
Fase estacionária: Spherisorb 5 µm
Fase móvel: Éter de petróleo – acetona,
gradiente linear de 5 a 25 % acetona
em 30 minutos, 1 mL min-1
Detector: UV-Vis 460 nm.

1 = β-caroteno, 2 = criptocapsina
3 = criptoflavina, 4 = β-criptoxantina
5 = anteraxantina, 6 = capsoluteína,
7 = luteoxantina, 8 = zeaxantina,
9 = mutatoxantina, 10 = capsantina,11
= capsantina-5,6-epoxido,
12 = violaxantina, 13 = capsorubina,
14 = isomêro capsorubina,
15 = neoxantina
 Separação de Antidepressivos Tricíclicos a Partir do Extrato de
Soro de um Paciente que Recebeu Clomipramina

Condições cromatográficas: coluna (25 cm x 4,6 mm) Zorbax cianopropila,

fase móvel: 1,2 mL min-1, água-acetonitrila-ácido acético-n-butilamina 600:400:2,5:1,5, v/v/v/v,
temperatura: 45 °C, detector: UV, 254 nm.

M = metabólitos da clomipramina, 1 = trimipramina (padrão interno) 2 = metilclomipramina,

3 = clomipramina
 Separação de Tranquilizantes

Condições cromatográficas: coluna (25 cm x 4 mm) LiChrosorb RP-8, 10 µm,

Fase móvel: eluição por gradiente, 30 % acetonitrila em água até 90 % de acetonitrila em
água, 16 min, detector: UV 254 nm.

1 = bromural, 2 = carbromal, 3 = acetocarbromal, 4 = benzil mandelato

Sistema de HPLC
 Detectores

Dispositivos que examinam continuamente o
material eluído, gerando sinal quando da
passagem de substâncias.

Idealmente:
cada substância
separada aparece
como um PICO no
cromatograma.
 Detectores

Absorção:
 Fotométrico:λ fixo.
 Espectrofotométrico: λ variável.
 Espectrofotométrico por arranjo de diodos.

Índice de Refração

Fluorescência

Espalhamento de Luz

Espectrometria de Massas

Dicroísmo Circular

Eletroquímico
70 % de análises publicadas utilizam HPLC com detectores UV/Vis
 Detectores: Absorção
Espectrofotométrico por Arranjo de Diodos
ESPECTROS TRIDIMENSIONAIS
 Detectores: Absorção
Espectrofotométrico por Arranjo de Diodos

DETERMINAÇÃO DA PUREZA DO PICO

Comparar os espectros
de absorvância do
composto obtidos no
início, máximo e fim
do pico.
 Dicas do que não fazer
em HPLC!
• Lavar um sistema com tampão usando orgânico puro: precipitação.

• Injetar amostras que podem precipitar na fase móvel: testar miscibilidade.

• Usar HCl, H2SO4 ou CCl3 degradado em sistema de aço inox: corrosão

do sistema.

• Deixar a bomba trabalhar seca: danificação dos selos.

• Usar fita de Teflon para vedar conexões: sem efeito e pode causar
entupimento.
• Deixar o sistema parado com fase móvel contendo tampão ou ácidos/bases
fortes: cristalização = danificação dos selos da bomba, injetor, entupimento
do detector.

• PERDER A PACIÊNCIA!!!!
Referências

CAROL H. COLLINS, GILBERTO L. BRAGA, PIERINA S. BONATO (coordenadores),
Fundamentos de Cromatografia, Editora da Unicamp, Campinas, 2006.

L.R. SNYDER, J. J. KIRKLAND, J. L. GLAJCH, Practical HPLC Method Development, 2º ed.,

John Wiley & Sons, 1997.

V.R. MEYER, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4o ed., John Wiley & Sons,
2004.

D. A. SKOOG, F. J. HOLLER, T. A. NIEMAN, Princípios de Análise Instrumental, 5° ed.,

Bookman, 2002.

F.R. de AQUINO NETO, D.S.S. NUNES, Cromatografia Princípios Básicos e Técnicas Afins,
Interciência, Rio de Janeiro, RJ, 2003.

D. C. HARRIS. Análise Química Quantitativa, LTC, Rio de Janeiro, 2005.