EFPM

Visita de estudo ao IPATIMUP

Sara Moreira nº22 10ºA

18/02/2019
Esta última quarta, dia 13 de fevereiro de 2019, realizou-se uma visita de
estuda ao Laboratório Aberto do Instituto de Patologia e Imunologia Molecular
da Universidade do Porto (IPATIMUP), no âmbito da disciplina de Biologia, com
os objetivos de aumentar os nossos conhecimentos sobre a biologia, incitar o
gosto pela biologia e fomentar o nosso contacto com laboratórios científicos.
Foram realizadas as atividades experimentais “Bactérias fluorescentes” e
“Técnica de coloração de Gram” onde tivemos a oportunidade de utilizar
materiais e técnicas laboratoriais utilizados nas investigações das áreas da
Biologia, da Saúde e da Engenharia Genética. Foram abordados os conteúdos
relativos a bactérias, antibióticos, ADN recombinante, plasmídeos e coloração
de Gram.

Bactérias fluorescentes
Esta atividade tem como finalidade esclarecer o conceito de técnica do ADN
recombinante e de como esta permite induzir novas características fenotípicas
em certas bactérias, utilizando como vetor, geneticamente modificado através
de enzimas de restrição, o plasmídeo pGLO; e o gene responsável pela
fluorescência. Utilizando esta técnica foi possível a observação de bactérias
fluorescentes quando em contacto com a luz ultravioleta, sendo este o principal
objetivo da atividade laboratorial.

Formaram-se 4 grupos cada grupo preparou solução diferente em cada

microtubo, um primeiro com a colonia apenas, um segundo com Amp
(Ampicilina) , um terceiro com o plasmídeo pGLO e Amp e um último com o
plasmídeo pGLO, Amp e ARA (arabinose).
Depois dos microtubos preparados foram colocados em gelo por alguns
minutos, de seguida incubados no bloco térmico a 42º durante
aproximadamente 1 minuto. Colocamos novamente os microtubos em gelo
durante 2 minutos e adicionamos o meio LB a cada um dos microtubos e foram
deixados por 3 minutos à temperatura ambiente. Agitarem-se os microtubos e
adicionou-se uma certa quantidade de cada microtubo à respetiva placa de
Petri, espalhando-o uniformemente com recurso a uma ansa esterilizada.
Incubaram-se então as placas de Petri durante 12-24 horas.
Resultados:
Conteúdo da Reação das bactérias
placa de Petri +pGLO -pGLO
Crescimento Fluorescência Crescimento Fluorescência
LB+Amp Sim Não Não Não
LB Não testado Sim Não
LB+Amp+AR Sim Sim Não testado
A

Após a observação dos resultados é possível afirmar que o único meio de

cultura em que os genes presentes no plasmídeo recombinante se expressam
na totalidade é o que é constituído por LB, Ampicilina e Arabinose. Foi possível
observar também estas bactérias não possuem o gene que lhes confere
resistência à Ampicilina uma vez que na caixa de Petri que continha o meio
nutritivo LB e Ampicilina não se verificou crescimento, e como no meio que
continha apenas LB se deu o crescimento e formação de colonias, a morte da
outra montagem terá sido devido à presença de Ampicilina. Por outro lado,
ambas as montagens que continham as células modificadas, tinham presente
Ampicilina, e em ambas se verifico o crescimento populacional das bactérias.
Estes resultados permitem concluir que as bactérias modificadas através da
incorporação do plasmídeo pGLO adquirem resistência à Ampicilina. Estes ao
serem observados à luz ultravioleta, verificou-se que que apenas o meio que
continha Arabinose emitia fluorescência. Isto veio provar que a expressão de
GFP (green fluorescente protein) depende de Arabinose.

Conclusão:
As bactérias geneticamente modificadas, ou seja, que incorporam o plasmídeo
recombinante, emitem fluorescência quando observadas à lua ultravioleta se
estiverem na presença de Arabinose; expostas ao antibiótico (Ampicilina),
estas bactérias sobrevivem.
As bactérias que não foram postas em contacto com o plasmídeo
recombinante, não o incorporaram logo não sobreviverão em meios de cultura
onde esteja presente o antibiótico. Da mesmo forma não apresentarão
fluorescência devido à ausência do GFP.
Técnica de coloração de Gram

Esta atividade tem como objetivo a diferenciação das bactérias em dois grupos:
bactérias de Gram positivo e bactérias de Gram negativo. A coloração de Gram
baseia-se nas características físicas e químicas da parede celular dos
microrganismos, sendo que certas bactérias possuem a capacidade de reter o
corante primário após a descoloração com álcool-acetona. Esta capacidade
deve-se sobretudo ao conteúdo de peptidoglicano presente na parede celular.

Procedimento:
-Colocar uma gota de água sobre a lâmina
-Com ajuda de uma ansa retirar uma colonia de bactérias e espalhar bem
sobre a lâmina.
-Secar a lamina com o auxílio de uma lamparina de álcool
-Efetuar a coloração de Gram
-Colocar a lamela sobre a lamina e observar sobre o microscópio

Resultados:
As bactérias aparecerão coloradas de violeta quando Gram positivo, ou
coloradas de rosa no caso de serem Gram negativo. Isto acontece devido às
bactérias de Gram positivo possuírem uma camada externa de peptidoglicano
espessa. As bactérias de Gram negativo também possuem peptidoglicano, mas
numa camada muito mais fina; para além disso, possuem uma membrana
externa constituída por lipopolissacarídeos e fosfolípidos. Assim, as bactérias
de Gram positivo mantêm a coloração roxa do corante primário, enquanto que
as bactérias de Gram negativo sofrem descoloração e incorporam depois o
corante secundário, adquirindo uma coloração rosa-avermelhada.