UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC/UFPA, PIBIC/UFPA CAMPI DO

INTERIOR, PIBIC/UFPA EBTT, PIBIC-AF/UFPA, PIBIC-UFPA/PcD, PIBIC/CNPq, PIBIC-AF/CNPq,
PIBITI/CNPq, PIBIC-EM, PIVIC, PRODOUTOR e PRODOUTOR RENOVAÇÃO.
PROGRAMA VOLUNTÁRIO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA - PIVIC

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO FINAL

Período: agosto de 2019 a setembro de 2020

Título do Projeto de Pesquisa (ao qual está vinculado o Plano de Trabalho): Detecção e produção de
Glicosidases e Celulases de leveduras isoladas do fruto do Açaí (Euterpe oleracea)

Nome do Orientador: Agenor Valadares Santos

Titulação do Orientador: Doutorado

Faculdade: Faculdade de Biotecnologia

Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas, UFPA

Laboratório: Laboratório de Biotecnologia de Enzimas e Biotransformações (LaBEB)

Título do Plano de Trabalho: Produção de Celulases de leveduras provenientes do Açaí

Nome do Bolsista: Gustavo Marques Serra

Tipo de Bolsa: PIBIC-AF/UFPA

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 RESUMO

Biomoléculas derivadas de recursos naturais estão cada vez mais presentes em processos de fabricação de
produtos necessários para o cotidiano. As enzimas são, em suma, biocatalisadores naturais responsáveis
por controlar reações bioquímicas como no metabolismo humano, microbiano e vegetal. Atualmente, o
Brasil tem destaque por ser um dos maiores produtores de etanol no mundo e que surge ferramentas
alternativas que possa melhorar a produção de biocombustíveis. A obtenção de etanol a partir da atividade
enzimática vem ganhando cada vez mais interesse devido às amplas vantagens de se utilizar enzimas, são
biodegradáveis, com alta seletividade e com possibilidade de produção em larga. Dessa forma, o objetivo
deste trabalho foi identificar e caracterizar a celulase, enzima responsável pela clivagem da celulose,
produzidas por cepas isoladas do caroço do açaí a fim de investigar potenciais características enzimáticas
de resíduos do caroço do açaí com aplicabilidade à indústria. Realizou-se o isolamento de leveduras isoladas
do caroço do açaí e em seguinte identificação. Posteriormente, foi realizado o screening para a identificação
de produtoras de celulases no meio extracelular com a utilização de três meios de cultura diferentes, com
variação nas concentrações de fontes de carbonos. Além disso, foi realizado a determinação de açúcares
redutores pelo método de DNS a fim de se confirmar a produção da enzima de interesse. Não foi observado
a presença do halo de degradação com os substratos utilizados, após a revelação das placas com leveduras.
No entanto, notou-se o crescimento microbiano de um isolado de Pichia kudriavzevii em meio
suplementado com sais e como fonte de carbono a carboximetilcelulose. Faz-se necessário continuar o
estudo com o resíduo de caroço de Açaí e cultivar a microbiota visando o interesse biotecnológico de se
obter um produto valioso e de se utilizar processos inovadores de fonte enzimática microbiana da
microbiota do caroço do Açaí.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Enzimas
Enzimas são definidas como proteínas biocatalisadoras específicas, sendo assim, responsáveis por
catalisar reações bioquímicas sob respectivas condições de temperatura e pH (CUESTA et al., 2016). As
enzimas são classificadas e nomeadas segundo a reação de catálise que exercem, segundo o esquema de
classificação numérica EC (Enzyme Comission Numbers) que consiste em sete classes de enzimas:
Oxidorredutases (EC 1), Transferases (EC 2), Hidrolases (EC 3), Liases (EC 4), Isomerases (EC 5), Ligases
(EC 6), e recente criada a nova classe de enzimas Translocases (EC 7) (MATSUTA, 2013; KEITH, 2018).
Nos últimos anos, enzimas desenvolveram seu próprio caminho em consequência de suas funções únicas
e, ainda, em soluções de problemas ambientais. A demanda por novas enzimas tem rapidamente crescido
devido a (OGAWA, 1972; KIRK et al. 2002; SINGH et al., 2016):

2
 1) Especificidade: permitindo o controle dos produtos produzidos, aumentando o seu rendimento,
reduzindo o número de produtos indesejáveis.
2) Condições amenas: para a redução de custo de equipamentos, tratamentos residuais entre outras
coisas.
3) Menor taxa de toxicidade e de impacto ambiental: fatores que levaram a ser buscados cada vez
mais para minimizar problemas ambientais.
A produção enzimática atual utilizada em escala industrial é proveniente de estirpes microbianas,
como leveduras e fungos, e o restante de fontes animais e vegetais (SANCHEZ et al., 2012). O mercado de
enzimas global tem crescido e grande número de enzimas são empregadas em diversos setores como na
indústria têxtil (lipases e celulases), alimentícia (tripsina, amilase, pectinase), farmacêutica (lipases), de
detergentes (proteases, amilases, celulases) e etc. (CHAMNIPA et al., 2018). É de grande importância
industrial a utilização de enzimas como a celulase que tem atraído cada vez mais olhares devido à alta
especificidade com o seu substrato, a celulose.

1.2. Complexo Enzimático Celulase

Celulase é um múltiplo sistema de enzimas que catalisam a decomposição do polissacarídeo de
celulose clivando as ligações glicosídicas ß-1,4. Formado principalmente por três tipos de enzimas que
funcionam em sinergia - sinergia refere-se à atividade simultânea de duas ou mais enzimas, resultando em
uma atividade coletiva maior do que a soma das atividades das enzimas individuais (MANSFIELD et al.,
1999) - sendo estas: endoglucanases, exoglucanases e ß-glicosidases (AHMED et al., 2017. As
Endoglucanases, EGB (EC 3.2.1.4) cliva randomicamente dentro da cadeia, atuando em áreas amorfas da
celulose; onde esse ataque aleatório resulta em uma rápida diminuição do comprimento da cadeia e novas
extremidades na cadeia (WOOD et al, 1979; JAYASEKARA et al, 2018).
Exoglucanases, celobiohidrolases ou CBH (EC 3.2.1.91), degrada celulose ao separar dímero de
celobiose presente nas extremidades (redutora ou não-redutora) da cadeia celulósica de forma eficaz
(BERGHEM et al, 1972; DIVINE et al, 1994). Posteriormente, a celobiose separada é convertida em glicose
pela ação da ß-glicosidase (EC 3.2.1.21) diminuindo a ação inibitória da celobiose nas atividades das exo
e endo glucanases necessária para se ter uma degradação completa da celulose (ZHAO et al, 2004).
Celulose, o substrato da enzima celulase, é o biopolímero mais abundante encontrado na terra.
Principalmente por ser o componente estrutural que constitui células vegetais. Tipicamente, a celulose está
presente entre 35 a 50%, em termos de peso seco da planta. Em alguns casos, a celulose é encontrada no
seu estado puro, notável em celulose algodão. No entanto, é encontrada fibras de celuloses em matrizes
com outros biopolímeros, como a hemicelulose e lignina (LYND et al, 2002; MARCHESSAULT et al,
1993). A composição química da celulose é simples, consistindo de moléculas de D-glicopiranose ligados

3
por ligações glicosídicas ß -1,4 formando uma cadeia polimérica linear com grau polimérico de 10.000
resíduos de glicose, em média (O’SULLIVAN et al, 1997; TEERI et al, 1997).

1.3. As celulases e o combustível de segunda geração

As celulases têm mostrado o seu potencial biotecnológico em diversos setores industriais, como em
alimentos e na alimentação animal, fermentação de vinho e cervejaria, refinaria de biomassa,
biocombustíveis e entre outros. Onde essa enzima tem sido interessante alvo em pesquisa e
desenvolvimento. (KUHAD, 2011; SINGH, 2007; SINGH, 1999).
Na indústria têxtil, a celulase tem sido a enzima mais bem-sucedida, usada em processamentos de
roupas à base de celulose. Um dos procedimentos que tem se dado o sucesso é o chamado biostoning de
jeans, em que as enzimas atuam no tecido de algodão e que ocorre a quebra das pequenas fibras presentes
na superfície do tecido, soltando assim o corante que é facilmente removido por abrasão mecânica durante
os ciclos de lavagens. As vantagens estão na substituição de pedra-pomes e de agentes químicos agressivos
por um tratamento enzimático menos danoso às fibras, ao meio ambiente e em que há aumento da
produtividade das máquinas (IMRAN, 2017; SINGH, 2007; SUKAMARAN, 2005).
Na área de biocombustíveis o interesse está em pesquisa em bioprospecção de novas celulases
capazes de hidrolisar a biomassa celulósica com geração de açúcares que podem ser fermentados para
produzir etanol - etanol de segunda geração (AHMED, 2017; WYK, 2001). O Brasil está avançando quando
se trata na substituição de combustíveis fósseis, como a gasolina, por bioetanol; uma alternativa para se
aumentar a produtividade e diminuir a poluição ao meio ambiente. Pode se dizer que a obtenção do etanol
de segunda geração envolve duas etapas principais. A primeira etapa consiste na hidrólise dos
polissacarídeos, gerando o açúcar. A segunda etapa envolve a fermentação microbiana do açúcar a álcool
(OLSSON et al, 2005). No entanto urge a necessidade de obter microrganismos capazes de promover a
degradação do material celulósico, barateando a produção nacional e elevando a produtividade. E além
disso, na melhoria de celulases mais adaptadas às condições no processo de produção de biocombustíveis
(ARAUJO, 2013; ROSA, 2009; LEITE, 2007).
A região Amazônica destaca-se devido a sua grande diversidade biológica, e cada vez mais atraído
interesse pela sua perspectiva de aplicação industrial, principalmente alimentícia (MIRANDA et al, 2012).
Atividades de bioprospecção podem contribuir para o desenvolvimento mais sustentável, como a
exploração de leveduras selvagens com potenciais, ainda pouco elucidadas, para produzir um produto de
interesse para larga escala industrial. (DICKSON, 2018; HASHEM, 2014).

1.4. A microbiota do caroço do Açaí (Euterpe oleraceae Mart.)

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 O açaizeiro (Euterpe oleracea Martius) é uma Arecaceae típica do Norte do Brasil, cuja é
popularmente conhecido no Brasil e no exterior devido ao seu suco. O suco do açaí é comumente consumido
por seus valores energéticos e um alimento relativamente rico em minerais principalmente em potássio,
cálcio, fósforo, magnésio e ferro e em vitaminas E e B1 (ROGEZ et al., 2012). O Pará é o maior produtor
de açaí, demonstrando grande relevância social e econômica deste fruto para o Estado do Pará. Contudo o
Açaí gera muitos rejeitos que acabam por trazer diversos tipos de danos para a coletividade, pois o caroço
representa cerca 83% do fruto e é uma fonte rica em carbono (MARINS, 2014; MENEZES, 2008).
O resíduo do fruto que é rico em celulose (53,20%), hemicelulose (12,26%) e lignina (22,30%)
(RODRÍGUEZ-ZÚÑIGA et al., 2008). Apesar da complexidade e de difícil degradação dos componentes
encontrados no fruto, na literatura é reportada a fermentação do Açaí pós-colheita, por motivo de mau
armazenamento do fruto do açaí e gerando a contaminação. O que se pode concluir como a existência de
microrganismos capazes de assimilar a celulose como fonte de carbono, indicando a presença da enzima
celulolítica de interesse. Então, há a necessidade de uma melhor bioprospecção da microbiota do caroço do
Açaí a fim de se elucidar e caracterizar seus compostos e moléculas para aplicá-los à novas tecnologias e
processos biotecnológicos (ARCHNA, 2015; ROGEZ, 2000).

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Identificar e avaliar as celulases extracelulares produzidas por microrganismos isolados do caroço
do açaí.

2.2 Objetivos Específicos

a) Isolar as leveduras do caroço do Açaí (resíduo);
b) Obter extrato celulolítico do Açaí;
c) Avaliar atividade enzimática das enzimas previamente detectadas frente à variação de pH e
temperatura;
d) Otimizar a produção de celulases;

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 3. METODOLOGIA

3.1. Isolamento e manutenção das culturas

Os caroços de açaí foram obtidos em estabelecimento comercial no município de Belém, Pará, e
inoculados em meio Sabouraud contendo clorofenicol, para enriquecimento das leveduras. Posteriormente,
alíquotas deste cultivo de enriquecimento foram inoculadas em diluição seriada em meio Ágar Sabouraud
para isolamento das leveduras. As leveduras isoladas foram mantidas em cultivo de YPD (2% de Peptona,
2% de Glicose, 1% de Extrato de levedura) com 1,5% de ágar.

3.2. Teste qualitativo para celulases

Cultivou-se os isolados do resíduo de Açaí em três diferentes meios sólidos como fonte de carbono
o CMC (carboximetilcelulose):
a) YNB (base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos) na presença de CMC nas
concentrações de 0,1% e 0,5% (HATANO et al., 1991).
b) YPD na presença de CMC, concentração de 0,1% (YUANGSAARD et al., 2012).
c) CMC suplementado com sais, concentração de 0,1% (BEHERA et al., 2016).
As medições dos diâmetros de halos de hidrólise e das cepas foram realizadas com paquímetro
(mm) pós-coloração com vermelho congo (0,2%) por 15 minutos, seguido de duas lavagens com cloreto de
sódio 1 M por 15 minutos cada (WOOD; ERFLE; TEATHER, 1988).

3.3. Teste quantitativo para celulases

Realizou-se o experimento de dosagem de açúcar redutor utilizando o método de DNS, adaptado
(MILLER, 1959). Para determinar a curva padrão de glicose, fez-se diluição da solução padrão de glicose
de 1,0 mg/mL com água destilada em tubos de ensaio. Determinado com concentrações de glicose entre
0,4 a 4 mmol.mL-1. O gráfico foi construído, em planilha, com a concentração de glicose (g/L) no eixo Y
e a absorbância (ABS) no eixo X.
A reação utilizou 600 µL do reagente DNS, 300 µL da amostra e 300 µL de tampão acetato a 50
mM pH 5. Incubou-se em banho maria à 100°C (ebulição) por 5 minutos. Então, após 5 minutos de
resfriamento, fez-se a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 540 nm. A partir da equação de reta,
calculamos a concentração de açúcar redutor na amostra (EMBRAPA, 2013).

3.4.Avaliação da atividade enzimática

A atividade hidrolítica total de celulases é mensurada utilizando como substrato filtro de papel
(MANDELS et al, 1976). Para o método de FPase, as leveduras que forem selecionadas, são incubadas em

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meio líquido YPD por 24h a 35°C e depois centrifugadas, o sobrenadante é extraído e considerado como
extrato enzimático bruto. Na reação são usados microdiscos de filtro de papel Whatman n°1 (1 cm x 6 cm)
em placas, e adicionados 300 µL de extrato enzimático, 200 µL de tampão acetato 50 mM pH 5, incubados
por 1 hora em banho-maria e a reação é interrompida pela adição de ácido 3,5-dinitrosalicílico.
Posteriormente, as amostras são medidas pelo ensaio de açúcares redutores (DNS) a 550 nm. Para
caracterizar a enzima quanto ao pH e temperaturas ótimas, o mesmo ensaio ocorreu utilizando diferente
soluções tampões com diferentes valores de pH (4,5 a 10, na concentração de 50 mM) e utilizando
temperaturas de 25 a 70°C para incubação, no valor de pH previamente determinado.

4. RESULTADOS

4.1. Isolamento das leveduras e teste qualitativo para celulases

As leveduras isoladas foram previamente identificadas em período anterior, apresentado em
relatório final PIBIC 2018-2019. Através do método de diluição, foi possível isolar 13 cepas de
leveduras. Após este, as cepas foram identificadas, por meio de sequenciamento do rRNA 26S, como
leveduras das espécies: Pichia kudriavzevii e Candida tropicalis (Tabela 1). Estas leveduras foram
submetidas às análises qualitativas com os meios, já explicados neste trabalho, na presença de CMC
(carboximetilcelulose).
Obteve-se resultado negativo para celulase em todas as 13 leveduras do caroço do açaí (Tabela 1).
Contudo nas placas contendo sais minerais e CMC como fonte de carbono, observou-se crescimento das
colônias de ambos os gêneros de leveduras o que pode significar um consumo desta fonte de carbono
(Figura 1) e uma possível presença da atividade celulolítica, não detectada nas condições dos testes
realizados

Tabela 1. Leveduras isoladas do caroço do açaí identificadas e teste qualitativo em placas. (+) quando o resultado
for positivo para celulase e (-) quando for negativo.

Leveduras Código de Atividade

Coleção Celulolítica
Pichia kudriavzevii LCA1 -
Não identificada LCA2 -
Não identificada LCA3 -
Candida tropicalis LCA4 -
Candida tropicalis LCA5 -
Não identificada LCA6 -
Pichia kudriavzevii LCA7 -

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 Pichia kudriavzevii LCA1ag -
Não identificada LCA2ag -
Pichia kudriavzevii LCA3ag -
Pichia kudriavzevii LCA4ag -
Candida tropicalis LCA5ag -
Candida tropicalis LCA6ag -

No meio de cultivo com os sais KH2PO4, Na2HPO4, MgSO4 e CaCl2, FeSO4 e suplementado com
CMC se observou o crescimento de algumas colônias em que pode se ter tido a assimilação do CMC devido
ser a única fonte de carbono presente no meio de cultura da placa. Entretanto, após a revelação, não foi
possível visualizar claramente a formação de halo de degradação, gerando dúvidas, o que levou a considerar
como resultado negativo para atividade celulolítica (Figura 1).

Figura 1. Imagens mostram as placas contendo o meio de cultura CMC suplementado com sais acrescido de ágar
1,5% com substrato CMC após revelação com Congo red.

A B

As cepas Pichia kudriavzevii LCA1ag, Pichia kudriavzevii LCA4ag, Pichia kudriavzevii LCA7,
Candida tropicalis LCA5, Candida tropicalis LCA5ag tiveram o perfil de crescimento em placas após os
três dias de incubação, e foram escolhidas duas de cada espécie para os ensaios quantitativos de açúcares
redutores pelo método de DNS. As cepas de Pichia kudriavzevii, conhecida também como Issatchenkia
orientalis e Candida krusei, já foram relacionadas com a fermentação de comidas e frutas, como pães e
manteigas caseiras, grãos de cacau fermentado, sucos de abacaxi, uva e laranja (ONGOL, 2009; MEROTH,
2003; ARIAS, 2002).

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 Além destes, P. kudriavzevii foi responsável por 30% das leveduras isoladas de uma fermentação
de grãos de cacau e pode estar envolvida na assimilação de citrato durante a fermentação (DANIEL et al,
2009). P. kudriavzevii foi relatada por participar da fermentação alcoólica de uma bebida tradicional da
Costa do Marfim, chamada tchapalo, e por inibir o crescimento de fungos produtores de micotoxinas
(N’GUESSAN et al., 2011).
Cepas selvagens de P. kudriavzevii são reconhecidas pelas suas capacidades termotolerantes,
osmotolerante, tolerante à ácidos, tolerância à compostos tóxicos, que são características importantes que
diminuem a taxa de contaminação e de custo de esterilização em processos de fermentação e produção de
álcool (DÍAZ-NAVA, 2017; ISONO, 2012). A levedura destaca-se, principalmente, na elevada quantidade
de produção de etanol e a sua alta eficiência em temperaturas acima de 40°C (DHALIWAL, 2011;
OBEROI., 2012; YUANGSAARD, 2013).
Na literatura, cepas de Candida tropicalis são conhecidas por produzir etanol a partir do amido, em
baixa taxa (JAMAI et al., 2007). Além disso, outros estudos afirmam que a C. tropicalis é um agente
promissor para a produção de etanol a partir de recursos naturais, onde a maior vantagem de sua utilização
está no não uso do processo de sacarificação e o etanol resultante do processo sendo, cerca, de 56 g/L
(ETTAYEBI, 2003; KLINKE, 2004).

4.2. Quantificação do açúcar redutor

Para a determinação da curva padrão de glicose, utilizou-se as concentrações de glicose entre 0,4 e
4 mmol.mL-1, variando 0,5 mmol.mL-1 de glicose, A equação da curva padrão de glicose foi obtida y =
0.5181x – 0.0375, r2 = 0.999, onde x representa a absorbância obtida da amostra (Figura 2). Padronizou-se
as culturas em que houve o crescimento em placa para os testes, sendo no total quatro cepas. As cepas
foram cultivadas por 72 h a 35°C. Alíquotas foram coletadas pós-centrifugação e analisadas pelo método
de DNS descrito.

Figura 2. Curva padrão de determinação de glicose pelo método DNS.

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 Na figura 3, pôde-se observar um aumento na quantidade de açúcares redutores entre os dias 3 e 6
de cultivo, onde a cepa Pichia kudriavzevii LCA5ag se aproximou do controle. O controle demonstrou uma
alta elevada quantidade de açúcares redutores já presentes, contudo nenhuma das cepas foram capazes de
ultrapassar esse valor. Portanto, não há atividade celulolítica nas cepas isoladas. Em um estudo de 2012,
Lone e Wani, foram isoladas leveduras rizosfera de nogueira-comum, Junglas regia, cujo fruto se denomina
noz inglesa. Nesse estudo, a incubação dos microrganismos se deu dentro de uma semana a 32°C para que
se obtivesse o extrato celulolítico para o ensaio de DNS. Acredita-se que segundos os dados obtidos aqui,
após a mensuração de 6 dias poderia ocorrer de se detectar a presença de atividade celulolítica.

Há possibilidades, ainda, de que o CMC nesse caso estivesse atuando como um inibidor de
crescimento das leveduras e atuando de duas formas: a) dificultando o acesso das leveduras à outras fonte
de carbono devido a viscosidade do meio ou b) ausência de condições de pré-tratamento, liberação de
moléculas que causem a desativação enzimática ou diminuam a fermentação de substrato (ZHAI, 2018).

Figura 3. Quantificação da quantidade de açúcares redutos com o meio YM com CMC. (ctrl – grupo controle. LCA5
- Candida tropicalis; LCA 7 – Pichia kudriavzevii; LCA 4ag – Pichia kudriavzevii; LCA 5ag – Candida tropicalis).

Outra observação para o comportamento destas leveduras no teste para celulase é que comparando
o controle, meio de cultura livre de células com CMC, com os valores dos ensaio com os microrganismos
observamos uma queda na concentração de glicose no meio de cultivo, o que evidencia o consumo
diferencial da glicose do meio, para cada levedura ensaiada, durante o período de crescimento.
O aproveitamento útil do resíduo como o processamento é um desafio a ser batido haja vista que
poucas alternativas tecnológicas capazes de transformar esta biomassa em geração de produtos que sejam
inovadores, de grande valor econômico e de pouco impacto ambiental (SILVA e ROCHA, 2003). O estudo

10
de enzimas celulolíticas de microrganismos, e principalmente oriundas do caroço de açaí (resíduo
agroindustrial), é inovador e se mostra como uma alternativa futura potencial para o aproveitamento de
resíduos.

5. PERPECTIVAS

Realização do novo isolamento de microrganismos alterando o tempo de incubação para as culturas

e analisar a atividade enzimática no extrato livre de leveduras e de celulases intracelulares.

6. DIFICULDADES

A ausência da produção de celulases e o distanciamento social devido a pandemia dificultou a

progressão dos testes a serem realizados como planejado, dificultando a obtenção de novos resultados.
Houve também a quebra de um dos equipamentos necessários para se realizar o crescimento em culturas
dos microrganismos.

7. CONCLUSÕES

As cepas de leveduras isoladas do caroço do Açaí não demonstraram o perfil de atividade

celulolítica nos meios e temperaturas utilizadas, o que pode significar a ausência de atividade enzimática
nas condições analisadas. Porém, foi possível visualizar o crescimento de algumas colônias nos meios após
72 h de incubação, sugerindo a capacidade de assimilar a carboximetilcelulose. Ainda são necessários mais
estudos e um novo isolamento para se determinar a produção de celulases da microbiota presente no caroço
do açaí.

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PARECER DO ORIENTADOR: Manifestação do orientador sobre o desenvolvimento das atividades do

aluno (o parecer deve ser cadastrado no SIGAA).
DATA: 25/09/2020

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